CN111909850B - 基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花cbfd与hbfd的产虾青素工程菌及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌及其构建与应用。本发明采用杜氏盐藻为材料，通过插入外源基因‑夏侧金盏花虾青素合成相关基因CBFD与HBFD，使得CBFD与HBFD可在该重组藻细胞内稳定表达，实现杜氏盐藻由β‑胡萝卜素到虾青素的转化，进一步实现虾青素在杜氏盐藻中的积累，为天然虾青素的生产开辟了一条新的途径。

Description

基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素 工程菌及其构建与应用

技术领域

本发明涉及分子克隆领域，具体涉及基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌及其构建与应用。

背景技术

通过代谢工程提高生物合成虾青素逐渐成为近些年研究热点。由于虾青素在生物体内合成的主要合成途径及代谢过程已基本上被详细描述，且编码虾青素合成路线中不同酶的基因已经从细菌、植物、藻类和真菌的细胞中克隆出来，这为采用代谢工程技术构建工程菌种和优化虾青素合成代谢网络提供了基础。可以采用本身可以合成虾青素的雨生红球藻或红发夫酵母等为代谢工程的受体，通过改变虾青素合成酶的数量、活力以及调控机制，实现虾青素的高效表达。也可以将外源虾青素合成基因导入本身不合成虾青素的受体。

在高等植物中普遍存在虾青素合成的前体β-胡萝卜素以及β-胡萝卜素羟化酶，但没有β-胡萝卜素酮化酶，因此不能进行虾青素合成。通过导入微生物中的β-胡萝卜素酮化酶，已成功在烟草、拟南芥、番茄和玉米等植物中表达了虾青素。而作为特例的夏侧金盏花(Adonis aestivalis)的花瓣中含有虾青素含量为花瓣干重的1％左右，且虾青素占类胡萝卜素总量的80％以上。

杜氏盐藻Dunaliella salina是一种高产β-胡萝卜素的绿藻，是合成虾青素的前体物质，但是在杜氏盐藻中目前并没有产虾青素的相关报道。因此，构建一种稳定高产的产虾青素的杜氏盐藻是一项具有重大意义的工作。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌。该工程菌以杜氏盐藻为材料，通过插入外源基因-夏侧金盏花虾青素合成相关基因CBFD与HBFD，使CBFD与HBFD在该重组藻细胞内稳定表达，可实现杜氏盐藻由β-胡萝卜素到虾青素的转化，进一步实现虾青素在杜氏盐藻中的积累。

本发明的另一目的在于提供上述基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌，所述的产虾青素工程菌中含有夏侧金盏花CBFD与HBFD的编码基因。

所述的CBFD的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的HBFD的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的CBFD的编码基因如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第2764位至第3690位核苷酸所示。

所述的HBFD的编码基因如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第3721位至第4941位核苷酸所示。

所述的杜氏盐藻优选为杜氏盐藻CCAP 19/18。

所述的夏侧金盏花CBFD与HBFD的编码基因的导入优选为通过同源重组技术实现；具体操作为将含有夏侧金盏花CBFD与HBFD的编码基因的重组质粒导入杜氏盐藻。

所述的重组质粒为以pCR2.1为骨架载体，将杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列(Dbgpdhpro)、叶绿体定位肽RBS2基因序列、CBFD基因序列、HBFD基因序列、2A剪切肽基因序列(2A)、博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列(ble-EGFP)，以及杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列(Dbpsyter)按转录方向依次连接在一起得到。

所述的启动子基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第294位至第2559位核苷酸所示。

所述的叶绿体定位肽RBS2基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第2566位至第2763位核苷酸所示。

所述的2A剪切肽基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第4942位至第5016位核苷酸所示。

所述的博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第5017位至第6315位核苷酸所示。

所述的终止子基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第6322位至第7423位核苷酸所示。

优选的，所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)利用相关基因工程手段从杜氏巴氏藻中克隆到启动子基因序列和终止子基因序列，合成CBFD基因序列、HBFD基因序列、叶绿体定位肽RBS2基因序列、2A剪切肽基因序列和博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列；

(2)将启动子基因序列、叶绿体定位肽RBS2基因序列、CBFD基因序列、HBFD基因序列、2A剪切肽序列基因序列和博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列按转录方向依次连接到pCR2.1载体上，得到重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到大肠杆菌中扩大培养，提取质粒并转化到杜氏盐藻中，获得基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌。

步骤(2)中所述的连接的优选通过In-Fusion克隆技术实现。

步骤(3)中所述的转化的方法优选为电击转化法。

上述基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌在制备虾青素中的应用。

一种制备虾青素的方法，为将上述基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌置于培养基中培养10～30天，收集培养物，即得到虾青素。

所述的培养基优选为含1～2mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液；更优选为含1.5mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液。

所述的杜氏盐藻培养液的配方如下：NaNO₃ 0.420g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.156g/L，NaHCO₃ 0.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO₄·7H₂O 1.230g/L，CaCl₂·2H₂O 0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L；A5微量元素溶液1mL/L，pH 7.5；其中，Fe-EDTA液成分如下：Na₂EDTA0.189g/L，FeCl₃·6H₂O 0.244g/L；A5微量元素溶液成分如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L，CuSO₄·5H₂O 0.08g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.04g/L。

所述的培养的时间优选为20天。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

现有技术只在大肠杆菌中验证过，在夏侧金盏花中基因CBFD与HBFD共同作用可以将β-胡萝卜素转化为虾青素，发掘和利用夏侧金盏花的虾青素合成相关基因CBFD和HBFD，能为构建高产虾青素的菌株和植株打下理论基础，为天然虾青素的生产开辟了一条新的途径。

本发明利用杜氏盐藻的内源性启动子Dbgpdhpro和终止子Dbpsyter，将夏侧金盏花CBFD和HBFD基因通过酶切连接的方法构建成外源载体pCR2.1-Dbgpdhpro-RBS2-CBFD-HBFD-2A-ble-EGFP-Dbpsyter，最后将质粒通过电击法转化至杜氏盐藻中，将含有藻细胞的培养液经离心分离，超声破碎后，再用有机溶剂提取藻细胞中的类胡萝卜素，提取液用高效液相色谱法(HPLC)分离测定，从而测定杜氏盐藻中虾青素和其它色素的含量，实现杜氏盐藻由β-胡萝卜素到虾青素的转化，筛选出了产虾青素的藻株，为天然虾青素的生产开辟了一条新的途径。其中，杜氏盐藻是一种高产β-胡萝卜素的绿藻，其积累的β-胡萝卜素能够为生成虾青素提供丰富的底物。此外，杜氏盐藻能够在高盐浓度下生存，不容易染菌，杜氏盐藻不具有细胞壁，在发酵和提取虾青素的过程中具有简化工序的好处。

附图说明

图1是杜氏盐藻虾青素表达载体的质粒图谱。

图2是杜氏盐藻野生型和突变株的培养结果图；其中，(a)为对照组和突变株的细胞图；(b)为对照组和突变株的藻液图。

图3是突变株的液相图谱。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所用的杜氏盐藻(Dunaliella salina)，购自英国Culture Collectionof Algae and Protozoa藻种库，编号CCAP 19/18。

实施例1

1、杜氏盐藻培养液配制

配制不含氯化钠的盐藻培养液，培养液的配方如下：NaNO₃ 0.420g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.156g/L，NaHCO₃ 0.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO₄·7H₂O 1.230g/L，CaCl₂·2H₂O0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L。向培养液中加入A5微量元素溶液1mL/L，调pH至7.5。其中，Fe-EDTA液成分如下：Na₂EDTA 0.189g/L，FeCl₃·6H₂O 0.244g/L；A5微量元素溶液成分如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L，CuSO₄·5H₂O 0.08g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.04g/L。

2、杜氏盐藻虾青素表达载体的构建

将pCR2.1载体序列、Dbgapdhpro启动子序列、RBS2序列(叶绿体定位肽)、夏侧金盏花CBFD基因序列、夏侧金盏花HBFD基因序列、2A剪切肽序列、ble-EGFP序列(博来霉素和绿色荧光蛋白基因)以及Dbpsyter终止子(即Dbpsyterminator)序列这些序列按转录方向依次连接在一起，构建方式如图1，构建得到的杜氏盐藻虾青素表达载体的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。其中，2A序列是保证表达框CBFD-HBFD和ble-EGFP是保证能够顺利分开表达，在细胞体内实现自剪切，行驶独立蛋白功能的作用。ble是保证通过博来霉素抗性筛选后，能够得到单克隆突变株。

ble-EGFP来自质粒pZBET(在文献“doi:10.1104/pp.114.235390”中公开)；Dbgapdhpro启动子(即Dbgapdh promoter)和Dbpsyter终止子(即Dbpsyterminator)来自杜氏巴氏藻(在专利“CN201910773769.X”中公开)；pCR2.1载体骨架购自invitrogen公司；RBS2(NCBI ID：AY530156.1)-CBFD(NCBI ID：AY644758.1)-HBFD(NCBI ID：DQ902556.1)-2A的片段序列由通用生物公司合成得到。克隆和构建的引物如下表：

表1克隆和构建的引物序列

构建方案为：

①pCR2.1+Dbgapdhpro(Dbgapdhpro通过TA克隆连接到PCR2.1)；

②pCR2.1+Dbgapdhpro+RBS2-CBFD-HBFD-2A(Eco RV和Xho I酶切)；

③pCR2.1+Dbgapdhpro+RBS2-CBFD-HBFD-2A+ble-EGFP(Eco RV和Xho I酶切)；

④pCR2.1+Dbgapdhpro+RBS2-CBFD-HBFD-2A+ble-EGFP(Eco RV和Xho I酶切)+Dbpsyter；

(1)制备线性化载体。

用所采用的限制性核酸内切酶(购自Thermo Fisher Scientific)。37℃水浴3h。酶切反应体系如下：

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

(3)酶切之后，采用PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。

3、PCR扩增目的片段

(1)使用Takara的Prime STAR HS DNA Polymerase(高保真酶，购自Takara)，进行两轮PCR反应。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

(3)用OMEGA公司的胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收目的片段，纯化PCR产物。

4、In-Fusion克隆

(1)建立In-Fusion(购自Takara)克隆反应体系：

(2)50℃孵育15min，然后置于冰上。

(3)连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有卡那酶素的平板上。在37℃生化培养箱中倒置培养12～16h。注意培养时间不宜过长，否则抗性失效，生长出卫星菌落，给筛选阳性克隆造成困难。

5、质粒的提取

参照OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒的说明书，提取质粒pSDS-DbCRTISO。

(1)10000g，1min离心，收集菌体。

(2)加入250μL SolutionⅠ，涡旋十几秒，混匀。

(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4～6次，室温放置2min。

(4)加入350μL SolutionⅢ，轻轻摇匀，10000g，10min离心。

(5)转上清至Hibind柱，10000g，1min离心。

(6)弃掉滤液，加入500μL Buffer HB，10000g，1min离心。

(7)弃掉滤液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000g，1min离心。

(8)重复洗一次(步骤(7))。

(9)10000g，空管离心2min。

(10)弃掉收集管将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管，加入50～100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA，静置1～2min后，10000g，1min离心。

6、电击转化杜氏盐藻虾青素表达载体

前期准备：

(1)对数期藻细胞：重新接种杜氏盐藻细胞，培养7天左右，杜氏盐藻生长至对数期，此时转化率最高。

(2)重组质粒：提前一天接种含重组质粒(构建方案④对应的重组质粒)的大肠杆菌，提取质粒，并测质粒浓度，备用。

(3)干净的电极杯。

电转化：

(1)收集处于对数生长期的杜氏盐藻细胞培养液，室温，离心2000rpm，5min，收集细胞，用新鲜培养基清洗2次。

(2)用2×HEPES缓冲液(NaCl 1mol/L，KCl 0.01mol/L，CaCl₂ 0.01mol/L，HEPES0.04mol/L，甘露醇0.4mol/L，山梨醇0.4mol/L)调整杜氏盐藻细胞浓度达到大约为1.2～2×10⁶个/mL；

(3)取400μL 2×HEPES缓冲液悬浮细胞，加入0.4cm电击杯内；

(4)加入1μg的质粒混匀后冰浴静置10～15min；

(5)采用电容25μF，电阻400Ω，电压0.8KV的电击条件转化杜氏盐藻。

(6)将电击杯置于冰浴中静置5min；

(7)将悬浮液转移至1.5mL离心管中，1000rpm离心10min；

(8)去除电击缓存液(用移液器吸取上清)，加入1mL 1.5mol/L盐度的杜氏藻盐藻培养液中；

(9)转移至试管内，暗培养12h后，转至光照培养箱中正常培养48h。

(10)博莱霉素(Zeocin)抗性培养基：在100mL含有11.7g(2.0mol/L)NaCl的盐藻培养基中加入0.75g的琼脂粉，在微波炉中4min，待冷却至60℃左右的时候加入10μL 100mg/mL的Zeocin，混匀，倒平板，培养基的Zeocin最终浓度为0.01mg/mL。

(11)在暗处恢复培养24h后的转化藻培养液，分别吸取500μL涂布于杜氏盐藻固体博莱霉素抗性培养基平板中，然后放置光照培养箱，给予14：10(光照：暗夜)的光照周期进行培养，经过约14d的光照培养，将平板上长出的单克隆藻落接种于杜氏盐藻液体博莱霉素抗性培养基中，按照常规培养至对数生长期，用于后续检测、验证。

7、挑选单克隆突变株，将已鉴定的单克隆突变株转移至含1.5mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液的培养基中培养20天，并观察细胞形态和培养形态，如图2所示。

8、HPLC定性分析转化子的类胡萝卜素成分

(1)将流动相用0.22μm孔径滤膜进行抽滤处理，接着超声处理60min去除液体中的气泡。

(2)将类胡萝卜素提取物以及β-胡萝卜素标准品溶液，用0.2μm孔径的聚碳酸酯滤膜进行过滤处理。

(3)调节色谱柱(C30YMC carotenoid column，5μm，250*4.6mm)温度在25℃，以1.0mL/min的流速用甲醇冲洗至平衡(约2h)。

(4)改为用流动相甲基叔丁基醚(A相)/甲醇(B相)(梯度洗脱：0min，90％A相和10％B相；10min，60％A相和40％B相；20min 50％A相和50％B相；25min，10％A相和90％B相；29.5min，90％A相和10％B相)，以1mL/min的流速进行洗柱，直至平衡。

(5)将浓度为100μg/mL的虾青素标准品存储液稀释为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL等不同浓度的工作液，用HPLC仪测定473nm波长下工作液的峰面积，根据结果绘制标准曲线。

(6)上样20μL，在波长473nm下检测40min。

细胞形态分析如图2(a)所示，从图2(a)中可以看出野生型的藻细胞依然为绿色，而转化了夏侧金盏花的CBFD和HBFD基因的其藻细胞的颜色变为红色了，而且藻细胞也变大了，培养形态结果如图2(b)所示，从图2(b)可以看出藻液颜色有明显差别，野生型的藻液依旧为绿色，而转化的变为红黄色了。

通过液相色谱检测，我们在9.89min检测到虾青素的液相峰，如图3所示，经过计算分析得到虾青素的产量为276.53μg/g。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌及其构建与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11044

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>杜氏盐藻虾青素表达载体

<400> 1

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240

gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgg cttccttgcc 300

aatgtttccc ttctgacgaa cacctaaggt aaactgcatc cttggtgtta cacccataca 360

gggctctcga aactacacca tgtgttgcag accacactgt cctcacaagt tgctggttgg 420

catggaacgt aggcatggaa agtaagacat gcccaagagg gagaaaacaa tcaggagctc 480

aagcatgtta gctctgtagg ccatccttgc actaagagtg gagcccctcc ccccaaaagg 540

agcacccctg aagggtactt tttcaccaag cggagaaccc aaagtggagc accagagacg 600

caacaaagca gcagtgacct ttacctggaa catgtttcag ggtacagaag caaaaggcct 660

ttggtcagga acatggccgt gagcctgttc ataaaagaga gggggttttg caacaaagca 720

gcagtggcta cctggaacaa aggctctggc agcagcgccc aggagagtgg gcagcagcac 780

caccttggtg agctgggcga gcagggggcc tggctgcagg ccgctgctgc tgctgccccc 840

tacagcgctg cccagcaaca ctggcagtac caggggcatg gtgaagacgc ctgcaagatg 900

cagagatggc aaataaggag tgcccctcca tgcgagcaac ggacaatttt gactaacttt 960

ttacacacgc atcacctctc acagaagctt gcttgcatgc aagcgcacac aacacacaca 1020

tacatgcacg cacacccaca cacccacaca cccacacgca caaacttgac cgagagaaca 1080

caggagttac tgttggcaca tgcacctggc actcaacaga tgggcaatac ttggactttg 1140

ttactgctgt cgtgcttgag tattcatgaa acacagtagc aagaatgcaa cgggacgggc 1200

actattccgt gtactccagt gcgtagtaga gtcatccacg cagtagggtt tactttgcaa 1260

ttatttctca cagactcttc acaaaggaaa ggcatgccta ttgagacaag atggcgtgcc 1320

cacctaaaat gttggatgcc agggtcaaca aaatggccag cgctgtgctt ccacccacag 1380

ctgcggtcat gcttatacca gaggataggg tggttggcat acagcagaag acagctgcgc 1440

ccagtgcgat ggggagagag tggtccggca gtggcagcct cagcaacaca taagcgagca 1500

ggggcgtgag cagcaaaatg gagaccagcc cgaaggtcac gcagcctgca ggctcaagaa 1560

aaatgagcag tgtcagaacg tgctcctgcc atctgtatgc agatggcacg gaccagctgg 1620

tgtgcattca tatgcactca tgagcacaga tctggggctg ccatcagcaa gaagtgcatg 1680

taagtcctac gttgaagatt ggttagctgc caagagtttg gtttagcccc ccggtttgaa 1740

ttggagcttc acctgttgac tttgccgcag ctagcgcatc gccacgcttc agtggcagcc 1800

cactgatgac gaagatggca attgtgatca agtttgaaag gcccagctca taagctctta 1860

ggccctcttg ggggcggatc acacccagca ggatgaaaga aatcaaagcg aaagggagga 1920

tctgcttgtc aatggctctc agcacagaca gcactgcttt tgctggcgac tgcatgtttg 1980

ttggaccccc agcatggtcg tgatgctgcc cttgtgagag cacgtgggtc cgctgcttgg 2040

tttctttccc tgtgcagttc ctcctggaga gaatgcccca ttgcgcggat aaccggtgtt 2100

ggtggaaact gtgcacagag catgccctgc tcaacggcac agtttgccgt atctgaagca 2160

tcccagtcta tattcccaac tgctccttca attttgcact tattgacctc atgcttgcat 2220

gccgctcaag cttcacagga agcagcagct cggggtagca cagaggattt tccaacaaat 2280

gagaaatgca aacagtgaag cgctgtagca cttgcttgca ggggcttgct tctctcatga 2340

aagttcatga caagagcgaa gtgactccca ttgagcacaa tacgatggaa aatggatcat 2400

aagaagaaat cctctttgag taagtttgag tgcagacact tcggagcggt tggaacggac 2460

aaactcaagg agttttgatc ctactcacgc cgctcataaa tttttacgtt gtttcaattg 2520

tgaggtgtat ttgaacagtc ttggcagcag aacagtgagc ccgggatggc ctctctcatt 2580

gcaaagtccg cctccgtggc ccctgttgcc agccgcacct ccaccaaggt gcaggcctct 2640

ttgaagcctg ccgtgcgcgc cgtgcccaag gcccaggctc ccgctgtgcg cgccaaccag 2700

atgatggtgt ggcagcccat caacaacaag cagttcgaga ccttctccta cctgcccccc 2760

ctgatggcag cagcaatttc agtgttcagt tcaggttatt ctttctacaa gaatctcttg 2820

ttggactcaa aaccaaatat tctcaaaccc ccatgcctgc tattctctcc agttgtgatc 2880

atgtcgccta tgagaaagaa aaagaaacat ggtgatccat gtatctgctc cgttgcaggg 2940

agaacaagga accttgatat tcctcaaatt gaagaagagg aagagaatgt ggaagaacta 3000

atagaacaga ccgattctga catagtgcat ataaagaaaa cactaggggg gaaacaatca 3060

aaacggccca ctggctccat tgtcgcaccc gtatcttgtc ttgggatcct ttcaatgatt 3120

ggacctgctg tttacttcaa gttttcacgg ctaatggagg gtggagatat acctgtagca 3180

gaaatgggga ttacgtttgc cacctttgtt gctgctgctg ttggcacgga gtttttgtca 3240

gcatgggttc acaaagaact ctggcacgag tctttgtggt acattcacaa gtctcaccat 3300

cggtcacgaa aaggccgctt cgagttcaat gatgtgtttg ctattattaa cgcgcttccc 3360

gctattgctc ttatcaatta tggattctcc aatgaaggcc tccttcctgg agcgtgcttt 3420

ggtgtcggtc ttggaacaac agtctgtggt atggcttaca tttttcttca caatggccta 3480

tcacaccgaa ggttcccagt atggcttatt gcgaacgtcc cttatttcca caagctggct 3540

gcagctcacc aaatacacca ctcaggaaaa tttcagggtg taccatttgg cctgttcctt 3600

ggacccaagg aattggaaga agtaagagga ggcactgaag agttggagag ggtaatcagt 3660

cgtacaacta aacgaacgca accatctacc ggaggtggag gttcgggagg tggaggttcg 3720

atggctcctg ttctccttgg attgaaacca actctctcca ctggaagcgt cgtcaaagag 3780

actaatgtag gaagcacact tgctagtccc cttaacaaaa cccagaattc aagggttttg 3840

gttttgggcg gaacagggaa ggtcggtggt tccacagctt tggctctctc caagttctca 3900

cctgacctca ggcttgtgat tggaggtcga aacagggaga aaggtgatgc tgtagtgtct 3960

aaactaggag aaaactccga gtttgttgaa gtcaacgttg acagtgtgag atctttagaa 4020

tctgctctcg aagatgtgga ccttgtagtt catgcagctg gaccttttca acaagcggag 4080

aagtgcactg ttctagaagc tgcaatatct accaggacgg cctatgtgga tgtatgtgat 4140

aatacaagtt attccatgca agcaaagtct tttcatgata aagcagtggc tgccaacgtt 4200

cctgccataa caactgctgg aattttccct ggagtgagca atgtgatagc agctgagcta 4260

gtgcgatcag caagagatga aaacactgaa cctcaaagac taagattctc ctattttacc 4320

gcgggttctg gtggtgctgg tccaacgtcg ttagttacta gcttcttgct tcttggtgaa 4380

gaggttgttg cttacagtga aggcgaaaaa gtcgaattaa agccttatac agggaagctt 4440

aacattgact tcgggaaggg agttgggaaa agagacgttt atttgtggaa cttgccggaa 4500

gtaagaagtg gtcatgagat cttaggagta ccaactgtga gtgctcgatt cggtactgca 4560

cctttcttct ggaattgggc gatggtagct atgacaactc tccttcctcc tggtattctg 4620

agagacagaa ataaaatcgg aatgttggca aattttgtgt acccttctgt acaaattttt 4680

gatgggattg caggagaatg tcttgcaatg cgggttgatt tagagtgcgc aaatgggcgc 4740

aatacttttg gtatactcag tcatgaacgt ctctctgtat tagtgggaac ttcaactgcg 4800

gtgtttgcta tggcaattct tgaaggaagt acgcagcctg gagtttggtt tccagaagag 4860

cctggaggga ttgcaataag tgacagagag ttacttctac aacgagcatc acaaggagcg 4920

attaacttca ttatgaagca gtctagagga gcttgtcaat tgttgaattt tgatttgttg 4980

aagttggctg gagatgttga atctaatcct ggacctatga gcccagaacg acgcccggcc 5040

gacatccgcc gtgccaccga ggcggacatg ccggcggtct gcaccatcgt caaccactac 5100

atcgagacaa gcacggtcaa cttccgtacc gagccgcagg aaccgcagga gtggacggac 5160

gacctcgtcc gtctgcggga gcgctatccc tggctcgtcg ccgaggtgga cggcgaggtc 5220

gccggcatcg cctacgcggg cccctggaag gcacgcaacg cctacgactg gacggccgag 5280

tcgaccgtgt acgtctcccc ccgccaccag cggacgggac tgggctccac gctctacacc 5340

cacctgctga agtccctgga ggcacagggc ttcaagagcg tggtcgctgt catcgggctg 5400

cccaacgacc cgagcgtgcg catgcacgag gcgctcggat atgccccccg cggcatgctg 5460

cgggcggccg gcttcaagca cgggaactgg catgacgtgg gtttctggca gctggacttc 5520

agcctgccgg taccgccccg tccggtcctg cccgtcaccg agattggagg tggaggttcg 5580

ggaggtggag gttcgatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 5640

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 5700

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 5760

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 5820

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 5880

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 5940

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 6000

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 6060

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 6120

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 6180

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 6240

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 6300

gagctgtaca agtaatacgt agcacagcct ctgtatggtt gcagccgctg gttgtgctgt 6360

agcccgtgcg cccacatggg tgctgggcga gcagggtttc agtgttgctg gctgactgac 6420

atgcaagtgc tcaggaactg agtgcaggct gtgggcgccc gcgaccaagc tatgtaacac 6480

tagattactg gtttgcaaga ctgccaagta gaactgcatg ctcagaaata tgtcgcaagg 6540

ggtggtgtgt gtgctggaca cgccacgcgc acctccagtg cagctctctg ccctgatgtt 6600

ttttggtaag tggtatatct tgaccttttg gctccttgcc gcttgcattg cccatcccac 6660

atgcattctg catacagtcc agcagacatg catggcgggc tcctgttggg gtgccaagca 6720

caccatgtga tttgtgagtg agagagcttt caaatccggc actcatggga atgttgagtg 6780

tgtgaatgcg atgcccctgc ttgaggtgtc cttgcttacc gtacttctcc cttctttctc 6840

ggactcccga ggagtgctta gcccaacgtt ggcagcgtat tccttgtcgc atcttcttca 6900

cgcctgaatg tatttgcgct gtggtttgta tgcatatata ggacagggtc atctgatatg 6960

atctgctctt tgagcggctt ctgtgcgggg gcatgaagga caagagtgct gagggactct 7020

ggctggtgct ctgtttgcgt cccccttaga gtcgctcacc tcctcaatac cttattttgc 7080

tgtcttcaag ccacttcgac ttgaaacccc actatgacga gcaatccctt gtatagtgcc 7140

ttgcaaggct tcaactcata gctttttgtt tattcattta agcaggcttg aatttttttg 7200

tcataattgt tttgcatgcc cgatttcttt ccgtggcatg cttgtttttt cctctcaagg 7260

ctttgcgctt agcttgcact tgatgtaaga cttgctttcg tgcatctgtc atgggatggc 7320

acttccccgc attgtacggc acataaaatg ctcaggaaag gttacaggtt acatgtgttg 7380

tgtttggata tacagtgtgt agtgatacaa gaagaaaggc agggatatcc atcacactgg 7440

cggccgctcg agcatgcatc tagagggccc aattcgccct atagtgagtc gtattacaat 7500

tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 7560

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 7620

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga cgcgccctgt agcggcgcat 7680

taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 7740

cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 7800

aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 7860

ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 7920

ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 7980

caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 8040

cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaattc 8100

agggcgcaag ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg 8160

ctgaccccgg atgaatgtca gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa 8220

gagaaagcag gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg 8280

gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg 8340

caaagtaaac tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc 8400

tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 8460

ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 8520

ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 8580

gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct 8640

ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 8700

ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatcccacc ttgctcctgc 8760

cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 8820

ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 8880

cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 8940

gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 9000

tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 9060

ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 9120

agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 9180

ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaattg aaaaaggaag 9240

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 9300

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 9360

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 9420

cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 9480

tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 9540

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 9600

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 9660

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 9720

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 9780

atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 9840

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 9900

cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 9960

tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 10020

tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 10080

gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 10140

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 10200

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 10260

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 10320

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 10380

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 10440

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 10500

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 10560

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 10620

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 10680

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 10740

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 10800

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 10860

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 10920

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 10980

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 11040

gaag 11044

<210> 2

<211> 306

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CBFD氨基酸序列

<400> 2

Ala Ile Ser Val Phe Ser Ser Gly Tyr Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Leu

1 5 10 15

Leu Asp Ser Lys Pro Asn Ile Leu Lys Pro Pro Cys Leu Leu Phe Ser

20 25 30

Pro Val Val Ile Met Ser Pro Met Arg Lys Lys Lys Lys His Gly Asp

35 40 45

Pro Cys Ile Cys Ser Val Ala Gly Arg Thr Arg Asn Leu Asp Ile Pro

50 55 60

Gln Ile Glu Glu Glu Glu Glu Asn Val Glu Glu Leu Ile Glu Gln Thr

65 70 75 80

Asp Ser Asp Ile Val His Ile Lys Lys Thr Leu Gly Gly Lys Gln Ser

85 90 95

Lys Arg Pro Thr Gly Ser Ile Val Ala Pro Val Ser Cys Leu Gly Ile

100 105 110

Leu Ser Met Ile Gly Pro Ala Val Tyr Phe Lys Phe Ser Arg Leu Met

115 120 125

Glu Gly Gly Asp Ile Pro Val Ala Glu Met Gly Ile Thr Phe Ala Thr

130 135 140

Phe Val Ala Ala Ala Val Gly Thr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Val His

145 150 155 160

Lys Glu Leu Trp His Glu Ser Leu Trp Tyr Ile His Lys Ser His His

165 170 175

Arg Ser Arg Lys Gly Arg Phe Glu Phe Asn Asp Val Phe Ala Ile Ile

180 185 190

Asn Ala Leu Pro Ala Ile Ala Leu Ile Asn Tyr Gly Phe Ser Asn Glu

195 200 205

Gly Leu Leu Pro Gly Ala Cys Phe Gly Val Gly Leu Gly Thr Thr Val

210 215 220

Cys Gly Met Ala Tyr Ile Phe Leu His Asn Gly Leu Ser His Arg Arg

225 230 235 240

Phe Pro Val Trp Leu Ile Ala Asn Val Pro Tyr Phe His Lys Leu Ala

245 250 255

Ala Ala His Gln Ile His His Ser Gly Lys Phe Gln Gly Val Pro Phe

260 265 270

Gly Leu Phe Leu Gly Pro Lys Glu Leu Glu Glu Val Arg Gly Gly Thr

275 280 285

Glu Glu Leu Glu Arg Val Ile Ser Arg Thr Thr Lys Arg Thr Gln Pro

290 295 300

Ser Thr

305

<210> 3

<211> 407

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HBFD氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Pro Val Leu Leu Gly Leu Lys Pro Thr Leu Ser Thr Gly Ser

1 5 10 15

Val Val Lys Glu Thr Asn Val Gly Ser Thr Leu Ala Ser Pro Leu Asn

20 25 30

Lys Thr Gln Asn Ser Arg Val Leu Val Leu Gly Gly Thr Gly Lys Val

35 40 45

Gly Gly Ser Thr Ala Leu Ala Leu Ser Lys Phe Ser Pro Asp Leu Arg

50 55 60

Leu Val Ile Gly Gly Arg Asn Arg Glu Lys Gly Asp Ala Val Val Ser

65 70 75 80

Lys Leu Gly Glu Asn Ser Glu Phe Val Glu Val Asn Val Asp Ser Val

85 90 95

Arg Ser Leu Glu Ser Ala Leu Glu Asp Val Asp Leu Val Val His Ala

100 105 110

Ala Gly Pro Phe Gln Gln Ala Glu Lys Cys Thr Val Leu Glu Ala Ala

115 120 125

Ile Ser Thr Arg Thr Ala Tyr Val Asp Val Cys Asp Asn Thr Ser Tyr

130 135 140

Ser Met Gln Ala Lys Ser Phe His Asp Lys Ala Val Ala Ala Asn Val

145 150 155 160

Pro Ala Ile Thr Thr Ala Gly Ile Phe Pro Gly Val Ser Asn Val Ile

165 170 175

Ala Ala Glu Leu Val Arg Ser Ala Arg Asp Glu Asn Thr Glu Pro Gln

180 185 190

Arg Leu Arg Phe Ser Tyr Phe Thr Ala Gly Ser Gly Gly Ala Gly Pro

195 200 205

Thr Ser Leu Val Thr Ser Phe Leu Leu Leu Gly Glu Glu Val Val Ala

210 215 220

Tyr Ser Glu Gly Glu Lys Val Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Gly Lys Leu

225 230 235 240

Asn Ile Asp Phe Gly Lys Gly Val Gly Lys Arg Asp Val Tyr Leu Trp

245 250 255

Asn Leu Pro Glu Val Arg Ser Gly His Glu Ile Leu Gly Val Pro Thr

260 265 270

Val Ser Ala Arg Phe Gly Thr Ala Pro Phe Phe Trp Asn Trp Ala Met

275 280 285

Val Ala Met Thr Thr Leu Leu Pro Pro Gly Ile Leu Arg Asp Arg Asn

290 295 300

Lys Ile Gly Met Leu Ala Asn Phe Val Tyr Pro Ser Val Gln Ile Phe

305 310 315 320

Asp Gly Ile Ala Gly Glu Cys Leu Ala Met Arg Val Asp Leu Glu Cys

325 330 335

Ala Asn Gly Arg Asn Thr Phe Gly Ile Leu Ser His Glu Arg Leu Ser

340 345 350

Val Leu Val Gly Thr Ser Thr Ala Val Phe Ala Met Ala Ile Leu Glu

355 360 365

Gly Ser Thr Gln Pro Gly Val Trp Phe Pro Glu Glu Pro Gly Gly Ile

370 375 380

Ala Ile Ser Asp Arg Glu Leu Leu Leu Gln Arg Ala Ser Gln Gly Ala

385 390 395 400

Ile Asn Phe Ile Met Lys Gln

405

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbgapdhpro-F

<400> 4

ccttgccaat gtttcccttc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbgapdhpro-R

<400> 5

ctcactgttc tgctgccaag ac 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbpsyter-F

<400> 6

gcacagcctc tgtatggttg 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbpsyter-R

<400> 7

cctgcctttc ttcttgtatc act 23

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RCH2-F

<400> 8

gtcttggcag cagaacagtg agcccgggat ggcctctctc at 42

<210> 9

<211> 62

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RCH2-R

<400> 9

ctagatgcat gctcgagcgg ccgccagtgt gatggatatc aggtccagga ttagattcaa 60

ca 62

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BE-F

<400> 10

tgttgaatct aatcctggac ctatgagccc agaacgacgc ccg 43

<210> 11

<211> 69

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BE-R

<400> 11

tctagatgca tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ctacgtatta cttgtacagc 60

tcgtccatg 69

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Db-F

<400> 12

tcggcatgga cgagctgtac aagtaatacg tagcacagcc tctgtatggt tgcag 55

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Db-R

<400> 13

tgcatgctcg agcggccgcc agtgtgatgg atatccctgc ctttcttctt gtatcact 58

Claims (4)

1.一种基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）利用相关基因工程手段从杜氏巴氏藻中克隆到启动子基因序列和终止子基因序列，合成CBFD基因序列、HBFD基因序列、叶绿体定位肽RBS2基因序列、2A剪切肽基因序列和博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列；

（2）将启动子基因序列、叶绿体定位肽RBS2基因序列、CBFD基因序列、HBFD基因序列、2A剪切肽序列基因序列和博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列按转录方向依次连接到pCR2.1载体上，得到重组质粒；所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（3）将步骤（2）得到的重组质粒转化到大肠杆菌中扩大培养，提取质粒并转化到杜氏盐藻中，获得基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌；

所述的CBFD的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的HBFD的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌，其特征在于：通过权利要求1中所述的制备方法制备得到。

3.权利要求2中所述的基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌在制备虾青素中的应用。

4.一种制备虾青素的方法，其特征在于：将权利要求2中所述的基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花CBFD与HBFD的产虾青素工程菌置于培养基中培养10～30天，收集培养物，即得到虾青素。

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