CN112266935A - 一种人iPS细胞基因编辑和筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人iPS细胞基因编辑和筛选方法，将编辑质粒通过电转方法导入iPS细胞；通过抗性筛选富集产生基因编辑的细胞；低密度传代，挑取单克隆细胞集落进行扩大培养和鉴定。由EF1α启动子启动能在人iPS细胞内同时启动Cas9和筛选抗性蛋白表达的游离型质粒，此质粒进入人iPS细胞中后，可在细胞中短暂而稳定的同时表达Cas9蛋白和抗性蛋白，在质粒转录表达最旺盛的时间段，在培养环境中添加筛选物，获得外源质粒并表达抗性蛋白的iPS细胞得以存活，同时表达的Cas9蛋白在sgRNA的引导下在基因组目的序列位置进行双链切割进行基因编辑，而未获得外源质粒或质粒未表达的细胞则因不含有抗性而死亡。避免流式细胞分选仪的使用或外源基因插入到细胞基因组中。
Description
技术领域
本发明涉及对细胞进行基因编辑和筛选的方法，尤其是一种人iPS细胞基因编辑和筛选方法，具体地说，进行CRISPR/Cas9介导的基因敲除的方法和利用抗性筛选进行富集，再进行细胞筛选的方法。
背景技术
CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。Cas9酶蛋白可在gRNA的引导下在基因组特定位置产生双链断裂，从而激发细胞内的DNA损伤修复机制，胞内修复 DNA双链断裂的机制主要有两条：一条是非同源末端连接途径(Non-homologous End Joining，NHEJ)，在该途径中细胞对DNA断裂处进行部分酶切，使之产生粘性末端，再将两个末端连接起来，这个过程中会导致随机数目碱基丢失，使得该相应基因缺乏几个氨基酸或者发生移码突变甚至大片段的基因丢失而被敲除。另一条是同源重组途径 (Homology-directedRecombination，HDR)，若DNA损伤时的同时恰好遇到与该损伤位点同源性很高的另一条完整的DNA时，损伤位点会以同源的DNA为模板进行损伤修复，若同源基因中被人为引入了其它基因、元件或者点突变则可凭此修改细胞基因组。
诱导性多能干(iPS)细胞是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞恢复到全能性状态所形成的干细胞系。iPS细胞具有无限增殖潜能和三胚层分化能力，可以分化为各种类型的成熟细胞。利用CRISPR/Cas9技术对iPS细胞进行基因编辑可以通过单克隆挑选和扩增，建立稳定的细胞系，长久的保留基因改变，解决成熟细胞基因编辑后增殖能力有限，无法稳定保存，无法进行单克隆纯化的问题，并且其来源的分化细胞也携带有基因改变，是一种简便快捷制备基因修饰细胞的方案。
但人类的iPS细胞属于难编辑细胞，相对于人成熟细胞，人iPS细胞更难导入并表达外源基因，转化效率、基因编辑效率都较低，编辑效率一般在1％以下，进行单克隆筛选工作量大，难以进行。为了筛选出经过基因编辑的细胞主要使用流式分选技术，或稳转抗性筛选技术，来富集出经过基因编辑的iPS细胞，再进行单克隆挑取和建系扩增。流式分选需要昂贵的流式分选仪器和极高的实验条件，且所编辑的基因需在iPS细胞上为阳性表达以便于筛选出编辑后表达阴性的细胞，对于在iPS细胞中不表达或低表达的基因则无因无法进行区分而无法筛选，为此需要在编辑的同时插入组成性表达的抗性或荧光蛋白基因，以此作为筛选标记，这需要在编辑位置插入较长的外源基因序列，对人类基因组可能带来未知的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种不需要使用流式分选，不在基因组内插入外源筛选标志基因的人iPS细胞基因编辑和筛选方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种人iPS细胞基因编辑和筛选方法，包括以下步骤：(1)将编辑质粒通过电转方法导入iPS细胞；(2)通过抗性筛选富集产生基因编辑的细胞；(3)低密度传代，挑取单克隆细胞集落进行扩大培养和鉴定。
所述电转方法为：将iPS细胞使用ACCUTASE分散为单细胞，重悬于20ul Lonza P3电转buffer中，加入基因编辑质粒，在Lonza 4D-Nucleofector上使用CA-137程序进行电转。每次电转的iPS细胞数量为1*105到5*105。
所述编辑质粒为EF1α-espCas9-PuroR(seq ID No：1)，质粒上含EF1a启动子(seqID No：2)，其能在iPS细胞内启动通过espCas9(seq ID No：3)和PuroR(seq ID No： 4)两种蛋白编码序列的转录并在iPS细胞内表达这两种蛋白。
所述编辑质粒的添加剂量为100-1000ng。
所述步骤(2)包括：1)将电转后细胞悬于含ROCK抑制剂的培养基中接种到feeder或基质上，二氧化碳细胞培养箱中进行细胞恢复培养；2)加入筛选物质进行抗性筛选；
3)抗性筛选结束后更换为含ROCK抑制剂培养基进行细胞培养扩增。
所述细胞恢复培养时间为2-24小时，抗性筛选时间为12-24小时。所述筛选物质为嘌呤霉素，添加终浓度为0.4-2ug/mL。所述抗性筛选结束后，培养基中ROCK抑制剂的添加时长为0-5天。
优选，每次电转的iPS细胞数量为2*105，编辑质粒的添加剂量为300ng，细胞恢复培养时间为6小时，抗性筛选时间为18小时，筛选物质嘌呤霉素添加终浓度为0.8ug/mL，养基中ROCK抑制剂的添加时长为2天。
本发明的有益效果是：无需使用流式分选仪器，即可实现人iPS细胞基因敲除编辑。可以对iPS细胞不表达的基因进行基因编辑敲除。无需在基因组上插入组成性表达的筛选抗性，避免大片段外源基因插入对基因组稳定性的影响。基因编辑率大幅提高，便于单克隆挑选和建系。
附图说明
图1是实施例1中构建的用于人iPS细胞基因编辑的质粒， hU6-sgRNA-EF1a-eSPCas9(1.1)-2A-Puro。
图2是实施例3中基因编辑后B2M完全敲除的iPS细胞系EK33的B2M基因测序结果。
图3是实施例3中基因编辑后B2M完全敲除的iPS细胞系EK33的流式检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进行调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本发明的人iPS细胞基因编辑和筛选方法，包括以下步骤：(1)将编辑质粒通过电转方法导入iPS细胞；(2)通过抗性筛选富集产生基因编辑的细胞；(3)低密度传代，挑取单克隆细胞集落进行扩大培养和鉴定。
所述电转方法为：将iPS细胞使用ACCUTASE分散为单细胞，重悬于20ul Lonza P3电转buffer中，加入基因编辑质粒，在Lonza 4D-Nucleofector上使用CA-137程序进行电转。每次电转的iPS细胞数量为1*105到5*105。
所述编辑质粒为EF1α-espCas9-PuroR(seq ID No：1)，质粒上含EF1a启动子(seqID No：2)，其能在iPS细胞内启动通过espCas9(seq ID No：3)和PuroR(seq ID No： 4)两种蛋白编码序列的转录并在iPS细胞内表达这两种蛋白。所述编辑质粒的添加剂量为100-1000ng。
所述步骤(2)包括：1)将电转后细胞悬于含ROCK抑制剂的培养基中接种到feeder或基质上，二氧化碳细胞培养箱中进行细胞恢复培养；2)加入筛选物质进行抗性筛选； 3)抗性筛选结束后更换为含ROCK抑制剂培养基进行细胞培养扩增。
所述细胞恢复培养时间为2-24小时，抗性筛选时间为12-24小时。所述筛选物质为嘌呤霉素，添加终浓度为0.4-2ug/mL。所述抗性筛选结束后，培养基中ROCK抑制剂的添加时长为0-5天。
优选，每次电转的iPS细胞数量为2*105，编辑质粒的添加剂量为300ng，细胞恢复培养时间为6小时，抗性筛选时间为18小时，筛选物质嘌呤霉素添加终浓度为0.8ug/mL，养基中ROCK抑制剂的添加时长为2天。
本发明由EF1α启动子启动能在人iPS细胞内同时启动Cas9和筛选抗性蛋白表达的游离型质粒，此质粒进入人iPS细胞中后，可在细胞中短暂而稳定的同时表达Cas9蛋白和抗性蛋白，在质粒转录表达最旺盛的时间段，在培养环境中添加筛选物，获得外源质粒并表达抗性蛋白的iPS细胞得以存活，同时表达的Cas9蛋白在sgRNA的引导下在基因组目的序列位置进行双链切割进行基因编辑，而未获得外源质粒或质粒未表达的细胞则因不含有抗性而死亡。经过抗性筛选可大幅提高基因编辑细胞的比例，从文献报道的不足1％，提升到40％以上，之后再进行低密度传代和单克隆细胞集落挑选，即可获得基因编辑后的细胞系。利用通过对瞬时表达质粒上抗性基因进行筛选，提高存活细胞中编辑效率，在通过单克隆筛选挑选基因编辑后细胞系的基因编辑和筛选方案，避免流式细胞分选仪的使用或外源基因插入到细胞基因组中。
实施例1用于人iPS细胞基因编辑质粒的构建
构建一个由EF1a启动子同时引导高特异性Cas9蛋白基因和嘌呤霉素抗性基因表达，并具有hU6启动子启动sgRNA合成的一体化质粒 (hU6-sgRNA-EF1a-eSPCas9(1.1)-2A-Puro)，质粒主体框架为#64139质粒，eSPCas9(1.1) 来源于#71814质粒，EF1a启动子序列来源于#60599质粒。(所用质粒采购自ADDGENE，内切酶采购自Thermo，一步法克隆试剂盒采购子诺唯赞)
1.1更改为eSPCas9(1.1)，构建质粒B002
1.1.1#64139质粒线性化
| 64139质粒 | 1ug |
| Buffer R | 2ul |
| Bsm I | 1ul |
| EcoR V | 1ul |
| ddH2O | Upto 20ul |
37℃酶切过夜，80℃灭活20分钟
1.1.2插入片断PCR
| #71814质粒 | 1ug |
| EcoR I Buffer | 2ul |
| EcoR I | 1ul |
| ddH2O | Upto 20ul |
37℃酶切过夜，80℃灭活20分钟，取1ul酶切产物加入到1mlddH2O中稀释模板，使用下列引物进行PCR扩增，产物长度1836bp
| HSCas9-F | TGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGAT | seq ID No：5 |
| HSCas9-R | GCAGTTCGCCGGCAGAGG | seq ID No：6 |
1.1.3一步法克隆
| 64139酶切产物 | 2ul |
| PCR产物 | 2ul |
| 5×CE II buffer | 4ul |
| Exnase | 2ul |
| ddH2O | 10ul |
37℃孵育30分钟，立刻进行转化
1.1.4转化
产物转化进DH5a感受态细胞，在氨苄青霉素LB平板上涂板，37℃过夜培养，挑取单菌落小摇菌液进行测序验证，测序正确的菌液建库冻存、扩大培养提取质粒。
1.2更换EF1a启动子(B003)
1.2.1质粒B002线性化
| B002质粒 | 1ug |
| Buffer ango | 2ul |
| NcoI | 1ul |
| XbaI | 1ul |
| ddH2O | Upto 20ul |
37℃酶切过夜，65℃灭活20分钟
1.2.2插入片断PCR
| #60599质粒 | 1ug |
| EcoR I Buffer | 2ul |
| EcoR I | 1ul |
| ddH2O | Upto 20ul |
37℃酶切过夜，65℃灭活20分钟，取1ul酶切产物加入到1mlddH2O中稀释模板，使用下列引物进行PCR扩增，产物长度1295bp
| EF1a-F | tgcagacaaatggctctagaGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACC | seq ID No：7 |
| EF1a-R | cgtggtccttatagtccatggtggcGCCGCCACCGCTAATTCTCAC | seq ID No：8 |
1.2.3一步法克隆
| B002酶切产物 | 2ul |
| PCR产物 | 2ul |
| 5×CE II buffer | 4ul |
| Exnase | 2ul |
| ddH2O | 10ul |
37℃孵育30分钟，立刻进行转化
1.2.4转化
产物转化进DH5a感受态细胞，在氨苄青霉素LB平板上涂板，37℃过夜培养，挑取单菌落小摇菌液进行测序验证，测序正确的菌液建库冻存、扩大培养提取质粒。
构建的质粒图谱如图1所示。
实施例2人iPS细胞B2M基因敲除
内切酶、连接酶购自Thermo，mTeSR1、CloneR、ACCUTASE、Metrigel购自STEMCELL，电转试剂购自Lonza。
2.1插入B2M sgRNA序列，构造B2M敲除工作质粒(C003)，
2.1.1 sgRNA序列引物合成:合成下列引物
| B2Msg-F | CACCGCGCGAGCACAGCTAAGGCCA | seq ID No：9 |
| B2Msg-R | AAACTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGC | seq ID No：10 |
ddH2O溶解引物到10uM，
2.1.2 B003质粒线性化
| B003质粒 | 1ug |
| FastDigest BpiI | 1ul |
| 10×FastDigest buffer | 2ul |
| ddH2O | Upto 20ul |
37℃处理30分钟
2.1.3 sgRNA序列退火稀释
| B2Msg-F(10uM) | 4.5ul |
| B2Msg-R(10uM) | 4.5ul |
| 10×PCR buffer | 1ul |
将装有混合物的PCR管放入装有沸水的烧杯中，室温放置到沸水自然冷却。
88ul ddH2O中加入2ul退火后的sgRNA混匀，稀释到100nM。
2.1.4质粒连接
| 线性化B003(50ng/ul) | 2ul |
| sgRNA退火引物稀释液(100nM) | 2ul |
| 10×T4 buffer | 2ul |
| Fast T4 ligase | 1ul |
| ddH2O | 13ul |
混匀后室温放置10分钟
2.1.5转化
连接产物转化DH5a感受态细胞，在氨苄青霉素LB平板上涂板，37℃过夜培养，挑取单菌落小摇菌液，进行测序验证，测序正确的菌液建库冻存、扩大培养提取质粒
2.2电转质粒
2.2.1 iPS单细胞悬液制备
人iPS细胞在6孔板内生长到覆盖度约70％时，吸弃培养基，每孔用1ml DPBS冲洗残留培养基后吸弃，加入1ml ACCUTASE 37℃培养6分钟，加入2ml DPBS终止反应，反复吹打细胞到形成单细胞悬液，进行细胞计数。
2.2.2质粒电转
取2×105个iPS细胞，200g离心去除上清，加入20ul P3电转液(Lonza)重悬，加入300ng C003质粒，使用Lonza 4D-Nucleofector进行电转，电转程序CA-137。电转结束后立即向电转杯中加入100ul mTeSR1(含10％CloneR)吹打均匀，37℃培养5分钟后转到含2mlmTeSR1(含10％CloneR)的Metrigel包被的6孔培养板中37℃培养。
2.3抗性筛选
接种6小时后，加入16ul 100ug/ml的嘌呤霉素，使终浓度达到0.8ug/ml,摇匀后继续37℃培养，18小时后，吸弃培养基，加入2ml mTeSR1(含10％CloneR)培养基，37 ℃培养2天，之后每日更换新鲜mTeSR1培养基，适当时进行传代培养，并建库冻存。
2.4单克隆筛选
2.4.1低密度传代
当iPS细胞生长到覆盖70％孔底时，使用ACCUTASE收集单细胞，按1：100，1：200 和1：500比例分别接种到含mTeSR1(含10％CloneR)Metrigel包被的6孔培养板中， 37℃培养，接种2天后更换为mTeSR1培养基37℃继续培养，每日更换培养基直到单克隆细胞集落形成。
2.4.2单克隆挑取
24孔板用matrigel包被，每孔加入600ul mTeSR 1培养基，倒置相差显微镜4倍镜下，挑取单克隆细胞集落到培养孔中，用1ml移液器吹洗5-6次吹散细胞，摇匀后37℃培养，第二天更换为mTeSR 1培养基，之后每日更换培养基到细胞覆盖度约70％后传代到 6孔培养板中，并进行后续传代培养和冻存。
实施例3编辑结果鉴定
3.1细胞系DNA提取
当iPS细胞生长到覆盖70％孔底时，吸弃培养基，每孔加入1ml DPBS冲洗残留培养基后吸弃，每孔加入1ml 0.5mM EDTA溶液，37℃培养10分钟，用1ml移液器反复吹打冲洗板底，转移全部液体到1.5ml离心管中，300g离心5分钟，去除上清。使用Tiangen 全血基因组DNA提取试剂盒，依说明操作提取DNA。
3.2编辑结果测序检测
使用引物B2M-F：CAGCAAGGACATAGGGAGGAAC(seq ID No：11)和B2M-R:CACCAAGGAGAACTTGGAGAAG(seq ID No：12)进行扩增，产物进行sanger法测序。其中编号EK33的细胞系测序结果如图2所示，结果显示基因组在sgRNA识别位置被Cas9蛋白切断后丢失2个碱基并随机插入了6个碱基，在读码框内插入了终止密码子，提前终止了蛋白表达。
挑取单克隆细胞集落40个，共35个建系并测序成功，其中15个细胞系发生明显的基因序列改变或移码引起乱峰，未发生基因编辑的细胞系20个，基因编辑发生率42.8％。
3.3流式检测
用ACCUTAS处理回收细胞系为单细胞悬液，200g离心去除上清后重悬于DPBS，使用FITC Mouse Anti-Humanβ2-Microglobulin抗体(BD 551338)FITC Mouse IgM,κIsotypeControl抗体(BD 555583)分别进行标记，使用流式细胞仪收集数据后进行分析,检测细胞便面B2M分布。未经基因编辑的iPS细胞系和EK33细胞系流式分析结果如图3所示，未编辑iPS细胞系与同型对照相比，B2M分布呈阳性，EK16、EK26、EK33三个细胞系表面低表达B2M蛋白。
3.4基因编辑脱靶检测
利用表中引物，分别对8个潜在脱靶位点进行PCR扩增，之后进行sanger法测序检测，iPS细胞系在基因编辑前后，上述8个位置基因序列未发生改变，与数据库序列一致，基因编辑过程中未发生脱靶。
对比例1电转质粒48-72小时进行抗性筛选取2×105个iPS细胞，200g离心去除上清，加入20ul P3电转液(Lonza)重悬，加入300ng C003质粒，使用Lonza 4D-Nucleofector进行电转，电转程序CA-137。电转结束后立即向电转杯中加入100ul mTeSR1(含10％CloneR)吹打均匀，37℃培养5分钟后转到含2ml mTeSR1(含10％CloneR)的Metrigel包被的6孔培养板中37℃培养。接种48 小时后，吸弃孔中培养基，更换为2ml新鲜mTeSR 1培养基，加入16ul 100ug/ml的嘌呤霉素，使终浓度达到0.8ug/ml,摇匀后继续37℃培养，24小时后，吸弃培养基，加入 2ml mTeSR1(含10％CloneR)培养基，37℃培养2天。全部细胞悬浮死亡，无细胞存活。
对比例2不进行抗性筛选
取2×105个iPS细胞，200g离心去除上清，加入20ul P3电转液(Lonza)重悬，加入300ng C003质粒，使用Lonza 4D-Nucleofector进行电转，电转程序CA-137。电转结束后立即向电转杯中加入100ul mTeSR1(含10％CloneR)吹打均匀，37℃培养5分钟后转到含2mlmTeSR1(含10％CloneR)的Metrigel包被的6孔培养板中37℃培养。之后每日更换新鲜mTeSR1培养基，适当时进行传代培养，并建库冻存。
进行低密度传代和单克隆挑取，分别扩大培养，共挑取单克隆细胞系33个，全部细胞系提取DNA进行测序，未发现基因序列发生改变的细胞系。
对比例3使用#64139质粒进行编辑
64139质粒使用FastDigest BpiI酶切，连接入B2Msg-F(seq ID No：9)和B2Msg-R(seq ID No：10)引物的退火溶液，构建成sg3质粒，电转入人iPS细胞。电转后分别在6小时，12小时，24小时，48小时后进行嘌呤霉素筛选24小时，都无细胞存活。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
序列表
<110> 协和干细胞基因工程有限公司
<120> 一种人iPS细胞基因编辑和筛选方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9614
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agagagagga atctttgcag ctaatggacc ttctaggtct tgaaaggagt 480
gggaattggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 540
gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg 600
ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 660
aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaggt 720
aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc 780
ttgaattact tccacctggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc gggttggaag 840
tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg cttgagttga 900
ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc gcgcctgtct 960
cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg cgacgctttt 1020
tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta tttcggtttt 1080
tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg cgaggcgggg 1140
cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc ggcctgctct 1200
ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc tggcccggtc 1260
ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag ggagctcaaa 1320
atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaaaagggc 1380
ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc cgtccaggca 1440
cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg aggggtttta 1500
tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag cttggcactt 1560
gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca ttctcaagcc 1620
tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgagaat tagcggtggc 1680
ggcgccacca tggactataa ggaccacgac ggagactaca aggatcatga tattgattac 1740
aaagacgatg acgataagat ggccccaaag aagaagcgga aggtcggtat ccacggagtc 1800
ccagcagccg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaactc tgtgggctgg 1860
gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccc agcaagaaat tcaaggtgct gggcaacacc 1920
gaccggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggagccctgc tgttcgacag cggcgaaaca 1980
gccgaggcca cccggctgaa gagaaccgcc agaagaagat acaccagacg gaagaaccgg 2040
atctgctatc tgcaagagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga cagcttcttc 2100
cacagactgg aagagtcctt cctggtggaa gaggataaga agcacgagcg gcaccccatc 2160
ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt accccaccat ctaccacctg 2220
agaaagaaac tggtggacag caccgacaag gccgacctgc ggctgatcta tctggccctg 2280
gcccacatga tcaagttccg gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa ccccgacaac 2340
agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct gttcgaggaa 2400
aaccccatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgtctgccag actgagcaag 2460
agcagacggc tggaaaatct gatcgcccag ctgcccggcg agaagaagaa tggcctgttc 2520
ggaaacctga ttgccctgag cctgggcctg acccccaact tcaagagcaa cttcgacctg 2580
gccgaggatg ccaaactgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct ggacaacctg 2640
ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgtttctgg ccgccaagaa cctgtccgac 2700
gccatcctgc tgagcgacat cctgagagtg aacaccgaga tcaccaaggc ccccctgagc 2760
gcctctatga tcaagagata cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct gaaagctctc 2820
gtgcggcagc agctgcctga gaagtacaaa gagattttct tcgaccagag caagaacggc 2880
tacgccggct acattgacgg cggagccagc caggaagagt tctacaagtt catcaagccc 2940
atcctggaaa agatggacgg caccgaggaa ctgctcgtga agctgaacag agaggacctg 3000
ctgcggaagc agcggacctt cgacaacggc agcatccccc accagatcca cctgggagag 3060
ctgcacgcca ttctgcggcg gcaggaagat ttttacccat tcctgaagga caaccgggaa 3120
aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccctactacg tgggccctct ggccagggga 3180
aacagcagat tcgcctggat gaccagaaag agcgaggaaa ccatcacccc ctggaacttc 3240
gaggaagtgg tggacaaggg cgcttccgcc cagagcttca tcgagcggat gaccaacttc 3300
gataagaacc tgcccaacga gaaggtgctg cccaagcaca gcctgctgta cgagtacttc 3360
accgtgtata acgagctgac caaagtgaaa tacgtgaccg agggaatgag aaagcccgcc 3420
ttcctgagcg gcgagcagaa aaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac caaccggaaa 3480
gtgaccgtga agcagctgaa agaggactac ttcaagaaaa tcgagtgctt cgactccgtg 3540
gaaatctccg gcgtggaaga tcggttcaac gcctccctgg gcacatacca cgatctgctg 3600
aaaattatca aggacaagga cttcctggac aatgaggaaa acgaggacat tctggaagat 3660
atcgtgctga ccctgacact gtttgaggac agagagatga tcgaggaacg gctgaaaacc 3720
tatgcccacc tgttcgacga caaagtgatg aagcagctga agcggcggag atacaccggc 3780
tggggcaggc tgagccggaa gctgatcaac ggcatccggg acaagcagtc cggcaagaca 3840
atcctggatt tcctgaagtc cgacggcttc gccaacagaa acttcatgca gctgatccac 3900
gacgacagcc tgacctttaa agaggacatc cagaaagccc aggtgtccgg ccagggcgat 3960
agcctgcacg agcacattgc caatctggcc ggcagccccg ccattaagaa gggcatcctg 4020
cagacagtga aggtggtgga cgagctcgtg aaagtgatgg gccggcacaa gcccgagaac 4080
atcgtgatcg aaatggccag agagaaccag accacccaga agggacagaa gaacagccgc 4140
gagagaatga agcggatcga agagggcatc aaagagctgg gcagccagat cctgaaagaa 4200
caccccgtgg aaaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta cctgcagaat 4260
gggcgggata tgtacgtgga ccaggaactg gacatcaacc ggctgtccga ctacgatgtg 4320
gaccatatcg tgcctcagag ctttctggcc gacgactcca tcgacaacaa ggtgctgacc 4380
agaagcgaca agaaccgggg caagagcgac aacgtgccct ccgaagaggt cgtgaagaag 4440
atgaagaact actggcggca gctgctgaac gccaagctga ttacccagag aaagttcgac 4500
aatctgacca aggccgagag aggcggcctg agcgaactgg ataaggccgg cttcatcaag 4560
agacagctgg tggaaacccg gcagatcaca aagcacgtgg cacagatcct ggactcccgg 4620
atgaacacta agtacgacga gaatgacaag ctgatccggg aagtgaaagt gatcaccctg 4680
aagtccaagc tggtgtccga tttccggaag gatttccagt tttacaaagt gcgcgagatc 4740
aacaactacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tcgtgggaac cgccctgatc 4800
aaaaagtacc ctgcgctgga aagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt gtacgacgtg 4860
cggaagatga tcgccaagag cgagcaggaa atcggcaagg ctaccgccaa gtacttcttc 4920
tacagcaaca tcatgaactt tttcaagacc gagattaccc tggccaacgg cgagatccgg 4980
aaggcgcctc tgatcgagac aaacggcgaa accggggaga tcgtgtggga taagggccgg 5040
gattttgcca ccgtgcggaa agtgctgagc atgccccaag tgaatatcgt gaaaaagacc 5100
gaggtgcaga caggcggctt cagcaaagag tctatcctgc ccaagaggaa cagcgataag 5160
ctgatcgcca gaaagaagga ctgggaccct aagaagtacg gcggcttcga cagccccacc 5220
gtggcctatt ctgtgctggt ggtggccaaa gtggaaaagg gcaagtccaa gaaactgaag 5280
agtgtgaaag agctgctggg gatcaccatc atggaaagaa gcagcttcga gaagaatccc 5340
atcgactttc tggaagccaa gggctacaaa gaagtgaaaa aggacctgat catcaagctg 5400
cctaagtact ccctgttcga gctggaaaac ggccggaaga gaatgctggc ctctgccggc 5460
gaactgcaga agggaaacga actggccctg ccctccaaat atgtgaactt cctgtacctg 5520
gccagccact atgagaagct gaagggctcc cccgaggata atgagcagaa acagctgttt 5580
gtggaacagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga gttctccaag 5640
agagtgatcc tggccgacgc taatctggac aaagtgctgt ccgcctacaa caagcaccgg 5700
gataagccca tcagagagca ggccgagaat atcatccacc tgtttaccct gaccaatctg 5760
ggagcccctg ccgccttcaa gtactttgac accaccatcg accggaagag gtacaccagc 5820
accaaagagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct gtacgagaca 5880
cggatcgacc tgtctcagct gggaggcgac aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc 5940
caggcaaaaa agaaaaagga attcggcagt ggagagggca gaggaagtct gctaacatgc 6000
ggtgacgtcg aggagaatcc tggcccaatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc 6060
acccgcgacg acgtccccag ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc 6120
gccacgcgcc acaccgtcga tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa 6180
ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc 6240
gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc 6300
ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc 6360
ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg 6420
cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc 6480
gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccacaacct ccccttctac 6540
gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg 6600
tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgagaa ttctaactag agctcgctga tcagcctcga 6660
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 6720
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 6780
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 6840
gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg 6900
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 6960
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc 7020
gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa 7080
gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 7140
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 7200
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 7260
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc 7320
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 7380
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cgggctattc 7440
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 7500
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat ggtgcactct 7560
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 7620
tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 7680
ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 7740
gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 7800
gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 7860
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 7920
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 7980
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 8040
tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 8100
gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 8160
cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 8220
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 8280
agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 8340
tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 8400
tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 8460
tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 8520
acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 8580
accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 8640
tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 8700
cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 8760
tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 8820
actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 8880
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 8940
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 9000
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 9060
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 9120
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 9180
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 9240
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 9300
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 9360
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 9420
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 9480
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 9540
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 9600
ttttgctcac atgt 9614
<210> 2
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720
ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179
<210> 3
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 720
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520
gtgcctcaga gctttctggc cgacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000
cctgcgctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaaggcgcct 3180
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggcga c 4101
<210> 4
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60
cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120
cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180
atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccacaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaggaaaac gaggacattc tggaagat 28
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagttcgcc ggcagagg 18
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcagacaaa tggctctaga gagaggaatc tttgcagcta atggacc 47
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgtggtcctt atagtccatg gtggcgccgc caccgctaat tctcac 46
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgcgcga gcacagctaa ggcca 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaactggcct tagctgtgct cgcgc 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagcaaggac atagggagga ac 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caccaaggag aacttggaga ag 22
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaccgaaag caaatcattc aacgac 26
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgtccatgt aggagtggct gag 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggagcagtga aatctggtga ga 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
actttgtagc tgtctcagac acg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcctcaatgg acacctgctg tag 23
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgctgctgc tgggcact 18
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgagatccg cccctttgtc a 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccaaatccga cctccgaccc atg 23
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgcaggatgg aagagcgaa 19
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ataacagcct agcccgtgag t 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctgtaaccc cacgcacaag 20
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atctgcacac tagcaaggga aatag 25
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cactccagcc tggtgacaga g 21
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gactttggat tcagaacggg aga 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gagctgggag ggactgagtt agg 23
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cttggttctg cctgctggag tc 22
Claims (10)
1.一种人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将编辑质粒通过电转方法导入iPS细胞；
(2)通过抗性筛选富集产生基因编辑的细胞；
(3)低密度传代，挑取单克隆细胞集落进行扩大培养和鉴定。
2.根据权利要求1所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，所述电转方法为：将iPS细胞使用ACCUTASE分散为单细胞，重悬于20ul Lonza P3电转buffer中，加入基因编辑质粒，在Lonza 4D-Nucleofector上使用CA-137程序进行电转。
3.根据权利要求2所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，每次电转的iPS细胞数量为1*105到5*105。
4.根据权利要求1所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，所述编辑质粒为EF1α-espCas9-PuroR(seq ID No：1)，质粒上含EF1a启动子(seq ID No：2)，其能在iPS细胞内启动通过espCas9(seq ID No：3)和PuroR(seq ID No：4)两种蛋白编码序列的转录并在iPS细胞内表达这两种蛋白。
5.根据权利要求4所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，所述编辑质粒的添加剂量为100-1000ng。
6.根据权利要求1所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：
1)将电转后细胞悬于含ROCK抑制剂的培养基中接种到feeder或基质上，二氧化碳细胞培养箱中进行细胞恢复培养；
2)加入筛选物质进行抗性筛选；
3)抗性筛选结束后更换为含ROCK抑制剂培养基进行细胞培养扩增。
7.根据权利要求6所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，所述细胞恢复培养时间为2-24小时，抗性筛选时间为12-24小时。
8.根据权利要求6所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，所述筛选物质为嘌呤霉素，添加终浓度为0.4-2ug/mL。
9.根据权利要求6所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，所述抗性筛选结束后，培养基中ROCK抑制剂的添加时长为0-5天。
10.根据权利要求1-9任一项所述人iPS细胞基因编辑和筛选方法，其特征在于，每次电转的iPS细胞数量为2*105，编辑质粒的添加剂量为300ng，细胞恢复培养时间为6小时，抗性筛选时间为18小时，筛选物质嘌呤霉素添加终浓度为0.8ug/mL，养基中ROCK抑制剂的添加时长为2天。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108103027A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-06-01 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法 |
| CN114277002A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-05 | 杭州荣谷生物科技有限公司 | 一种双突变溶瘤病毒、构建方法及其用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020067993A1 (en) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | National University Of Singapore | Engineered human mesenchymal stromal cells with low immunogenicity, methods and kits of generating the same |
| CN111254164A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种快速建立crispr基因编辑肝癌细胞株的方法及细胞株 |
| CN111662907A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-09-15 | 成都华西海圻医药科技有限公司 | 一种敲除诱导多能干细胞nans基因的方法和应用 |
-
2020
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020067993A1 (en) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | National University Of Singapore | Engineered human mesenchymal stromal cells with low immunogenicity, methods and kits of generating the same |
| CN111254164A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种快速建立crispr基因编辑肝癌细胞株的方法及细胞株 |
| CN111662907A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-09-15 | 成都华西海圻医药科技有限公司 | 一种敲除诱导多能干细胞nans基因的方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HONGMEI LISALI: "Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR–Cas9 system", 《METHODS》 * |
| 何琼: "CRISPR技术基因矫正乙型血友病来源iPS细胞的致病点突变并诱导肝系分化", 《CHINESE MEDICAL SCIENCES JOURNAL》 * |
| 张胜民: "《高等生物材料学实验》", 31 July 2019, 华中科技大学出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108103027A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-06-01 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法 |
| CN114277002A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-05 | 杭州荣谷生物科技有限公司 | 一种双突变溶瘤病毒、构建方法及其用途 |
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