CN107475272B

CN107475272B - 一种具热稳定性且耐高盐的琼脂水解酶

Info

Publication number: CN107475272B
Application number: CN201710565548.4A
Authority: CN
Inventors: 陈煜沛; 王贵弘; 吴黉坦; 吴岱颖; 庞海月
Original assignee: Xiamen Medical College
Current assignee: Xiamen Medical College
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN107475272A

Abstract

本发明公开了一种具热稳定性且耐高盐的琼脂水解酶，本发明自微泡菌(Microbulbifer sp.)中发现可水解琼脂的基因，将此基因克隆至大肠杆菌中，可表达出约88kDa大小的蛋白质，此水解琼脂酶在60℃及pH7的条件下可达最优化的水解琼脂效果，并且对于高浓度盐类及金属螯合剂具有相当的耐受性，置于70℃高温下3小时，此琼脂水解酶仍可维持92％以上的活性，分析其水解后的产物为新琼二糖，此种糖类化合物在美容保养品中可作为保湿及美白功效的成分。

Description

一种具热稳定性且耐高盐的琼脂水解酶

技术领域

本发明涉及一种具热稳定性且耐高盐的琼脂水解酶。

背景技术

琼脂(agar)可从红藻的细胞壁中提取出来，其中的琼脂糖(agarose)可被琼脂水解酶(α -agarase及β-agarase)水解成琼寡糖(agaro-oligosaccharides)及新琼寡糖(neoagaro-oligosaccharides)，这些寡糖类的物质已被报导具有多种不同的功能，包含抗氧化、抗炎、抗癌、保湿及美白等多种用途，另外琼寡糖具有低热量的特性，可减缓饮食淀粉的代谢，并促进乳酸菌等益生菌的生长，所以是一种非常良好的食品添加剂，可作为保健食品用途。

琼脂水解酶(β-agarase)根据目前的基因家族分类共分成四群，分别为糖苷水解酶 -16(glycoside hydrolase-16)，糖苷水解酶-50(glycoside hydrolase-50)，糖苷水解酶-86(glycoside hydrolase-86)及糖苷水解酶-118(glycoside hydrolase-118)。糖苷水解酶 -50的β-agarase可针对琼脂糖的β-1,4glycosidic bonds进行催化反应，产生新琼脂双糖(neoagarobiose)，新琼脂四糖(neoagarotetraose)或新琼脂六糖(neoagarohexaose)，目前自微生物Saccharophagusdegradans及Vibrio sp.中分别发现Aga50A，Aga50D及Aga50B 三种酶属于糖苷水解酶-50族群的exo-β-agarases。

具热稳定的酶可提高其在商业化的开发，延长酶本身的寿命，增加反应效率并节省成本，因此从微生物中找寻可耐热且具功能性的蛋白质为研究酶的发展方向，根据文献的搜索，具热稳定性的琼脂水解酶目前只在MicrobulbiferthermotoleransJAMB-A94及Flammeovirgasp. OC4此两种微生物中发现到的MtAgaA与Aga4436酶拥有较好的耐热特性，此两种酶皆属于糖苷水解酶-16家族，分别在60℃及50℃较为稳定。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一个琼脂水解基因AgaL4，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1。

本发明还提供琼脂水解基因AgaL4，在琼脂水解和/或获得琼寡糖中的应用。

本发明的另一目的在于提供琼脂水解基因AgaL4编码的琼脂水解酶，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供前述的琼脂水解酶，在琼脂水解和/或获得琼寡糖中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种重组质粒，其包括前述的琼脂水解酶基因。

作为优选，质粒载体为pET151/D-TOPO。

作为优选，该质粒为pAgaL4﹙SEQ ID NO:3﹚，如图1所示，此质粒包含序列编号1﹙SEQ ID NO:1﹚，具有琼脂水解酶活性之核甘酸序列质粒，此质粒可克隆至大肠杆菌中，并利用大肠杆菌生产表达AgaL4琼脂水解酶。

本发明的再一目的在于提供一种重组微生物，其包括前述的琼脂水解基因。

作为优选，该微生物为E.coli。进一步优选，为E.coli 43(DE3)。

本发明的再一目的在于提供一种重组微生物，其包括所述的重组质粒。

作为优选，该微生物为E.coli。进一步优选，为E.coli 43(DE3)。

本发明的有益效果是：

1、本发明自微泡菌(Microbulbifer sp.)发现琼脂水解基因，命名为AgaL4，此琼脂水解酶属于糖苷水解酶-50家族的β-agaras。此酶对琼脂(agar)及琼脂糖(agarose)都具有水解活性。

2、此酶即使在高浓度氯化钠600mM环境下，仍可维持86％的相对活性，对于金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)，在4.8mM浓度下可维持75％的相对活性(图5)。

3、将AgaL4水解琼脂的产物进行液相色谱质谱(LC/MSMS)分析，根据其裂解波峰及分子量推估其催化后产物为新琼脂双糖，此糖类物质具有保湿及美白功效，可用于保养品的添加应用。

4、本发明的质粒，此质粒可克隆至大肠杆菌中，并利用大肠杆菌生产表达AgaL4琼脂水解酶。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1、AgaL4琼脂水解基因质粒。

图2、AgaL4琼脂水解基因在大肠杆菌中表达，表达后的蛋白质经含有镍金属树脂的管柱纯化后，进行SDS-PAGE分析，箭头为纯化的AgaL4琼脂水解酶。

图3、利用粘度计分析2.5％琼脂经AgaL4琼脂水解酶催化后的粘度结果。

图4、AgaL4琼脂水解酶最优化的(A)温度及(B)酸碱度。

图5、AgaL4琼脂水解酶在不同(A)氯化钠及(B)乙二胺四乙酸(EDTA)浓度下之相对活性分析。

图6、AgaL4琼脂水解酶在50mM不同离子、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)与过氧化氢(H₂O₂) 浓度下之相对活性分析。

图7、AgaL4琼脂水解酶在50℃(◆)及70℃(◇)下之热稳定性分析。

图8、利用液相色谱质谱(LC/MSMS)分析AgaL4水解琼脂后的产物。

具体实施方式

实施例1基因的获得

微泡菌(Microbulbifer sp.)来源于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编码为BCRC81085，可通过商业购买方式得到。本发明从微泡菌(Microbulbifer sp.)中进行大量的基因组分析，从基因组序列中注释发现琼脂水解基因。

1.1细菌基因组总DNA的提取

将微泡菌(Microbulbifer sp.)在25℃下培养于MARINE AGAR 2216(DIFCO 0979)培养基中，培养3天后收集菌体，利用WelPrep DNA Isolation kit(WelgeneBiotech.Taiwan) 提取试剂盒，根据制造商的说明方式提取基因组DNA，并以分光光度计侦测样品的 OD260/OD280，使其比例达到1.8-2.0之间。

1.2基因核苷酸序列测定

将提取的总基因组DNA送交威健股份有限公司(台湾)进行总基因组的序列测定，测序完的总基因组再进行每个基因的注释，发现其中有参与琼脂水解的基因，将该琼脂水解基因命名为AgaL4，此琼脂水解酶属于糖苷水解酶-50家族的β-agarase，其DNA序列如序列编号1 ﹙SEQ ID NO:1﹚所示，转译成氨基酸序列如序列编号2﹙SEQ ID NO:2﹚所示。

实施例2AgaL4基因质粒建构

根据AgaL4基因序列，设计一组引物进行PCR反应。

agaL4-F(正向引物):CACCGTGGCCGCGGAAAATAACG

agaL4-R(反向引物):TCAGTGAGCCTCGCTACTGGAAC

从Microbulbifer sp.的DNA基因组中进行PCR扩增反应，获得AgaL4琼脂酶基因片段。 PCR扩增体系包含:Takara Ex Taq 0.25μl，10X Ex Taq Buffer 5μl，dNTP mixture(各2.5 mM)4μl，提取的DNA基因组2μl，正向引物1μl，反向引物1μl，加无菌水至50μl。

PCR扩增程序包含:

a.95℃变性5min

b.95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环

c.72℃ 10min，冷却至室温

PCR反应所得产物为序列编号1﹙SEQ ID NO:1﹚，

将此产物与质粒pET151/D-TOPO(Invitrogen)进行接合反应(ligation)，接合反应根据厂商赛默飞世尔所提供的pET151/D-TOPO操作流程进行接合，取PCR产物与厂商赛默飞世尔所提供的Salt Solution，TOPO vector及无菌水在室温中静置5分钟即完成接合反应，混合后的接合反应产物再转化到大肠杆菌中。

实施例3转化和表达

3.1转化

将建构好的质粒取3μl与100μl的大肠杆菌感受态细胞混合，置于冰上30min，之后将混合的质粒及感受态细胞置于42℃恒温水浴中热休克90s，再置于冰上10min，于混合物中加入LB液体培养基1mL，放入37℃培养1小时，取出培养后的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的LB平板培养基进行筛选，将筛选到的大肠杆菌抽取质粒并进行DNA序列测定确认，得到建构成功的质粒命名为pAgaL4(图1)，序列为SEQ ID NO： 3。此质粒可转化到大肠杆菌E.coliC43(DE3)进行蛋白质表达。

3.2AgaL4琼脂水解酶表达及纯化

将pAgaL4表达质粒转化入E.coli C43(DE3)，以LB培养基培养过夜，再将其稀释20倍转入LB培养基至OD600达到0.6，之后利用isopropylβ-D-thiogalactoside(IPTG)(0.5mM，最后浓度)诱导基因表达，于25℃下培养24小时，以离心的方式收集菌体。将得到的菌体回溶于Native buffer(50mM NaH2PO4,500mM NaCl,pH7)，并以超声波加以震碎破坏细胞，再以离心方式取得上清液，之后根据Ni-NTA Purification System(Invitrogen)以含有镍离子的树脂进行蛋白质纯化，纯化后得到的蛋白质在利用SDS-PAGE进行分析，并以考马斯蓝(CoomassieBrilliant Blue)染色。

实施例4

AgaL4琼脂水解酶活性分析

纯化后的酶将其置换于缓冲液(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7)中分别进行粘稠度、最优化温度、酸碱度、离子、金属螯合剂、表活剂及热稳定活性分析。

1.粘稠度分析:将AgaL4琼脂水解酶与0.25％琼脂于50℃下进行反应，并利用粘度计 (Brookfield DV-I Prime)监测其粘稠度的变化。

2.最优化温度分析:将AgaL4琼脂水解酶与0.3％琼脂于不同温度(30-70℃)下进行1小时的反应，反应后的混合物以100℃煮沸5分钟终止酶催化反应，并加入DNS(1％ 3,5-dinitrosalicylicacid,30％potassium sodium tartrate,1.5％NaOH)于100℃水浴加热5分钟，进行呈色反应，之后利用光谱仪(Spectrophotometer)在OD540条件下分析。

3.最优化酸碱度分析:将AgaL4琼脂水解酶与0.3％琼脂于不同酸碱度(pH4-5sodium acetate/acetic acid缓冲液，pH6-8Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，pH9glycine/NaOH缓冲液)下，于60℃进行1小时的反应，反应后的混合物以100℃煮沸5分钟终止酶催化反应，并加入DNS 于100℃水浴加热5分钟，进行呈色反应，之后利用光谱仪在OD540条件下分析。

4.离子、金属螯合剂及表活剂影响:将AgaL4琼脂水解酶与0.3％琼脂于不同浓度的盐类(50-600mM氯化钠(NaCl),50mM氯化钾(KCl),氯化钙(CaCl₂),氧化镁(MgO),氯化锌(ZnCl₂))、金属螯合剂乙二胺四乙酸(0-4.8mM EDTA)、表活剂十二烷基硫酸钠(0.1％ SDS)及过氧化氢(0.1％ H₂O₂)于60℃，pH7条件下进行1小时的反应，反应后的混合物以100℃煮沸5 分钟终止酶催化反应，并加入DNS于100℃水浴加热5分钟，进行呈色反应，之后利用光谱仪在OD540条件下分析。

5.热稳定性分析:将AgaL4琼脂水解酶于50℃及70℃中分别预热0-3小时，预热后的AgaL4琼脂水解酶与0.3％琼脂于60℃及pH7条件下进行1小时的反应，反应后的混合物以100℃煮沸5分钟终止酶催化反应，并加入DNS于100℃水浴加热5分钟，进行呈色反应，之后利用光谱仪在OD540条件下分析。

将AgaL4琼脂水解酶与0.3％琼脂于60℃，pH7条件下进行1小时的反应，反应后的混合物以100℃煮沸5分钟终止酶催化反应，混合物以10000xg离心10分钟后，取出上清液进行薄层层析法(TLC)分离纯化出产物，将酶催化后的样品置于TLC板上并浸于流动相中 (n-butanol/acetic acid/H2O(2:1:1))反应，将分离的产物自TLC板上刮离，以甲醇进行萃取，获得的提取物再以旋转蒸发仪浓缩，浓缩后的产物以少量的甲醇回溶作为液相色谱质谱(LC/MSMS)分析。液相色谱条件如下:

1.液相色谱使用管柱为C18 column(ThermoBiobasic 18，1.0x 150mm,2μm)

Time(min)	A％	B％	Flow(μL/min)
				0	99	1	60
1	99	1	60
				7	45	55	60
11	10	90	60
				14	10	90	60
16	99	1	60
				20	99	1	60

流动相A:0.1％FA

流动相B:95％ACN/0.1％FA

2.质谱型号为Q-Exactive mass spectrometer coupled with Ultimate3000RSLC system，离子化温度为275度，电压3500V。

利用大肠杆菌表达出的AgaL4琼脂水解酶可利用含有镍金属树脂的管柱纯化，如图2所示。此酶对琼脂(agar)及琼脂糖(agarose)都具有水解活性。在50℃，pH7环境下，与0.25％琼脂反应，可将具粘稠性的琼脂自粘稠度144cP在80分钟时降至28cP(图3)。分析AgaL4 琼脂水解酶优化的反应条件，发现其在60℃及pH7下，可达到最高活性(图4)。在不同的氯化钠浓度下(50mM至600mM)分析AgaL4对琼脂的水解活性，结果显示，即使在高浓度氯化钠 600mM环境下，仍可维持86％的相对活性，对于金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)，在4.8mM浓度下可维持75％的相对活性(图5)。根据不同的离子及表活剂对AgaL4琼脂水解酶的影响分析 (图6)，发现在50mM浓度下，氯化钾对AgaL4没有影响，氯化钙则稍为提升AgaL4的水解活性，氧化镁及氯化锌则会抑制AgaL4活性，但仍可维持61％以上的相对活性，在0.1％十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfonate，SDS)浓度下，AgaL4仍可维持71.6％的相对活性。热稳定测试(图7)，AgaL4在50℃及70℃预热3小时，仍可维持92.7％以上的相对活性，显示 AgaL4琼脂水解酶具有非常良好的热稳定效果。将AgaL4水解琼脂的产物进行液相色谱质谱 (LC/MSMS)分析(图8)，根据其裂解波峰及分子量推估其催化后产物为新琼脂双糖，此糖类物质具有保湿及美白功效，可用于保养品的添加应用。

<110>厦门医学院

<120>一种具热稳定性且耐高盐的琼脂水解酶

<160>3

210>1

<211>2241

<212>DNA

<213>微泡菌(Microbulbifersp.)

<400>1

gtggccgcgg aaaataacga tagcaatatc ctgtggacgt tcgaacaggg agaggtgccc 60

actgcaatcc agttggagca tacgagtgct cgaatgattg atggggagaa aggtaaggcg 120

ctggaagttc agttacagac caaatcccat tattcggcaa atgtcatctt cgctcctgag 180

cagccgtggg actggagtgg gttgggcgat tttgcctttg ctctggatat cgccaatccg 240

aaggcatctt cagttcacgt gtatgttact gcgactgaca agaatggaag ggcacacaac 300

cgcagctttg tggtgcctga gaattccagc ggcacctact ttatggagtt gaaaggaccg 360

gacctgacgg tagagaccgg gattcgctct aatccgccga gctgggattc ccagtttcag 420

gacatgattt accggtgggg tgagaaggaa ctggatgtca gtgcgattga gagcatcgcc 480

tttaccgtta ccggggtact tgaagacaaa gtcctgatta tcgataacgt gcgcctgatt 540

cagcccaagt cgctggacga aagctatctc aaaggtcttg tggatgagtt tggccagaac 600

aacaagctgg atttcgtaaa taaggtggat tcgctggagg agctgcgcgc aatctccgaa 660

gaagagcaat cacagctgcg caaaacacct atggatggcc gctctcgctt cggtggttgg 720

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acttttgcaa acggtgtcgc gctgaccgac ttcaacgatg ccatgatcga agacttctcc 1680

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tatatgccga atcatatgta cctgggagct cgctttgccg attggggtat gacgccggag 1800

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gtcagcgata agttctggca cttcctcgaa gaccttgatc ggccttccat tattggtgaa 1920

ttccacaacg gatcgctgga ttccggactg ctgaacccag gtctgatcca tgccagctca 1980

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tttgtcggcg cgcactggtt ccagtacatc gactccccgc taaccggccg cgcatacgac 2100

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gacgcggtca aggaagtgaa cgagaacctg taccaacgcc gattcggaaa agcggcgggt 2220

tccagtagcg aggctcactg a 2241

<210>2

<211>746

<212>PRT

<213>微泡菌(Microbulbifersp.)

<400>2

Val Ala Ala Glu Asn Asn Asp Ser Asn Ile Leu Trp Thr Phe Glu

1 5 10 15

Gln Gly Glu Val Pro Thr Ala Ile Gln Leu Glu His Thr Ser Ala

20 25 30

Arg Met Ile Asp Gly Glu Lys Gly Lys Ala Leu Glu Val Gln Leu

35 40 45

Gln Thr Lys Ser His Tyr Ser Ala Asn Val Ile Phe Ala Pro Glu

50 55 60

Gln Pro Trp Asp Trp Ser Gly Leu Gly Asp Phe Ala Phe Ala Leu

65 70 75

Asp Ile Ala Asn Pro Lys Ala Ser Ser Val His Val Tyr Val Thr

80 85 90

Ala Thr Asp Lys Asn Gly Arg Ala His Asn Arg Ser Phe Val Val

95 100 105

Pro Glu Asn Ser Ser Gly Thr Tyr Phe Met Glu Leu Lys Gly Pro

110 115 120

Asp Leu Thr Val Glu Thr Gly Ile Arg Ser Asn Pro Pro Ser Trp

125 130 135

Asp Ser Gln Phe Gln Asp Met Ile Tyr Arg Trp Gly Glu Lys Glu

140 145 150

Leu Asp Val Ser Ala Ile Glu Ser Ile Ala Phe Thr Val Thr Gly

155 160 165

Val Leu Glu Asp Lys Val Leu Ile Ile Asp Asn Val Arg Leu Ile

170 175 180

Gln Pro Lys Ser Leu Asp Glu Ser Tyr Leu Lys Gly Leu Val Asp

185 190 195

Glu Phe Gly Gln Asn Asn Lys Leu Asp Phe Val Asn Lys Val Asp

200 205 210

Ser Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ile Ser Glu Glu Glu Gln Ser Gln

215 220 225

Leu Arg Lys Thr Pro Met Asp Gly Arg Ser Arg Phe Gly Gly Trp

230 235 240

Ala Asp Gly Pro Lys Leu Glu Ala Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Lys Val Asp Gly Lys Trp Ala Leu Val Asp Pro Glu Gly His Leu

260 265 270

Phe Phe Ser Thr Gly Ile Ala Asn Val Arg Leu Ala Asn Thr Ser

275 280 285

Thr Ile Thr Gly Tyr Asp Phe Asp Lys Ala Arg Val Pro Gln Arg

290 295 300

Thr Pro Gly Asp Leu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Gly Leu Asn Arg

305 310 315

Val Pro Asp Thr Ala Ile Pro Thr Arg His Ile Ser Ser Pro Leu

320 325 330

Arg Ala Asp Met Phe Asn Trp Leu Pro Glu Tyr Asp Glu Pro Leu

335 340 345

Gly Gln Asn Phe Gly Tyr Arg Arg Glu Val His Thr Gly Val Ile

350 355 360

Glu His Gly Glu Thr Phe Ser Phe Tyr Arg Ala Asn Leu Gln Arg

365 370 375

Lys Tyr Asp Ile Ala Asp Glu Glu Arg Leu Met Ala Lys Trp Arg

380 385 390

Glu Thr Thr Ile Asp Arg Met Leu Ser Trp Gly Phe Thr Ser Phe

395 400 405

Gly Asn Trp Ile Asp Pro Ala Tyr Tyr Gln Met Asn Arg Ile Pro

410 415 420

Tyr Phe Ala Asn Gly Trp Ile Ile Gly Asn Phe Lys Thr Val Ser

425 430 435

Ser Gly Asn Asp Tyr Trp Ser Pro Leu Pro Asp Pro Phe Asp Pro

440 445 450

Gln Phe Lys Glu Arg Ala Tyr Ile Thr Ala Glu Gln Ile Ala Lys

455 460 465

Glu Val Glu Asn Asn Pro Trp Cys Val Gly Val Phe Val Asp Asn

470 475 480

Glu Lys Ser Trp Gly Gln Glu Gly Ser Thr Ala Ser Gln Tyr Gly

485 490 495

Ile Val Ile Asn Thr Leu Ser Arg Ala Ala Gly Glu Ser Pro Thr

500 505 510

Lys Ala Gln Phe Val Gln Leu Met Gln Glu Lys Tyr Gly Glu Ile

515 520 525

Gly Lys Leu Asn Ser Ala Trp Asn Ile Gln Leu Thr Asp Trp Glu

530 535 540

Thr Phe Ala Asn Gly Val Ala Leu Thr Asp Phe Asn Asp Ala Met

545 550 555

Ile Glu Asp Phe Ser Thr Met Leu Glu His Tyr Thr Gly Gln Tyr

560 565 570

Phe Lys Ile Val Arg Glu Ala Val Lys His Tyr Met Pro Asn His

575 580 585

Met Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ala Asp Trp Gly Met Thr Pro Glu

590 595 600

Val Arg Arg Ala Ala Ala Lys Tyr Ala Asp Val Val Ser Tyr Asn

605 610 615

Tyr Tyr Lys Glu Gly Val Ser Asp Lys Phe Trp His Phe Leu Glu

620 625 630

Asp Leu Asp Arg Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Asn Gly Ser

635 640 645

Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Pro Gly Leu Ile His Ala Ser Ser

650 655 660

Gln Ala Asp Arg Gly Lys Lys Phe Ala Glu Tyr Met Asn Ser Val

665 670 675

Ile Asp Asn Pro Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Ile

680 685 690

Asp Ser Pro Leu Thr Gly Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Asn

695 700 705

Val Gly Phe Val Ser Val Thr Asp Thr Pro Tyr Gln Pro Leu Val

710 715 720

Asp Ala Val Lys Glu Val Asn Glu Asn Leu Tyr Gln Arg Arg Phe

725 730 735

Gly Lys Ala Ala Gly Ser Ser Ser Glu Ala His

740 745 746

<210>3

<211>8001

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>3

gtggccgcgg aaaataacga tagcaatatc ctgtggacgt tcgaacaggg agaggtgccc 60

actgcaatcc agttggagca tacgagtgct cgaatgattg atggggagaa aggtaaggcg 120

ctggaagttc agttacagac caaatcccat tattcggcaa atgtcatctt cgctcctgag 180

cagccgtggg actggagtgg gttgggcgat tttgcctttg ctctggatat cgccaatccg 240

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ctggccaata cctccaccat tacgggatat gactttgaca aagccagagt cccccagcgt 900

acccccggcg acctgacgcc ggaggattct cttggtctca accgcgtgcc cgatacagcc 960

attccgacgc gtcatatcag ctcacctctg cgtgcggata tgtttaactg gttgccggag 1020

tacgatgagc ccctggggca gaactttggc tatcgccgtg aagtgcacac cggcgttatt 1080

gaacacggtg agacgttcag tttttaccgg gccaatttac agcgtaagta cgatattgct 1140

gatgaagaaa ggctgatggc gaagtggcgg gagactacga tcgatcgcat gctgagctgg 1200

ggattcactt ccttcggtaa ctggatcgac cccgcctact atcagatgaa tcgaattccg 1260

tattttgcta acggatggat catcggcaac ttcaagactg tgagtagcgg caatgattat 1320

tggagcccgt tgccggatcc gttcgatccg cagttcaaag aacgtgccta tattaccgcc 1380

gagcagattg ccaaagaagt cgaaaacaac ccctggtgcg tgggtgtatt tgtagacaat 1440

gagaagagct ggggccagga gggttctacc gcttctcagt acggcattgt gatcaatacc 1500

ttgagccgcg ccgctggcga aagtcccacc aaggcacagt ttgtacagct gatgcaggaa 1560

aaatacggag agattggcaa actgaatagt gcctggaata ttcaattgac ggattgggag 1620

acttttgcaa acggtgtcgc gctgaccgac ttcaacgatg ccatgatcga agacttctcc 1680

acaatgctgg agcattacac cgggcagtac ttcaagatcg tgcgggaagc cgtcaagcac 1740

tatatgccga atcatatgta cctgggagct cgctttgccg attggggtat gacgccggag 1800

gtacgccgtg ctgcggcgaa atacgccgat gtagtgagct acaactacta caaggaaggc 1860

gtcagcgata agttctggca cttcctcgaa gaccttgatc ggccttccat tattggtgaa 1920

ttccacaacg gatcgctgga ttccggactg ctgaacccag gtctgatcca tgccagctca 1980

caagcggacc gcggcaagaa attcgccgag tatatgaaca gcgtaatcga caatccttac 2040

tttgtcggcg cgcactggtt ccagtacatc gactccccgc taaccggccg cgcatacgac 2100

ggcgaaaact ataacgtggg cttcgtgtca gttactgaca ctccgtatca accattggtg 2160

gacgcggtca aggaagtgaa cgagaacctg taccaacgcc gattcggaaa agcggcgggt 2220

tccagtagcg aggctcactg aaagggcgag ctcagatccg gctgctaaca aagcccgaaa 2280

ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc 2340

taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat atcccgcaag 2400

aggcccggca gtaccggcat aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg 2460

aggatgacga tgagcgcatt gttagatttc atacacggtg cctgactgcg ttagcaattt 2520

aactgtgata aactaccgca ttaaagctag cttatcgatg ataagctgtc aaacatgaga 2580

attaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 2640

ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2700

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 2760

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 2820

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 2880

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 2940

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 3000

tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc 3060

ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 3120

catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 3180

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 3240

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 3300

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc 3360

aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 3420

gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 3480

gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 3540

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 3600

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 3660

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 3720

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3780

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 3840

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 3900

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 3960

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4020

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4080

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4140

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4200

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4260

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4320

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 4380

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 4440

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 4500

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 4560

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt 4620

acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 4680

atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc 4740

gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 4800

cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 4860

atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc 4920

acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt 4980

ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc 5040

ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat 5100

gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa 5160

acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg 5220

cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat 5280

ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa 5340

accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca 5400

cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag 5460

ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggccaggacc caacgctgcc 5520

cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg atggatatgt tctgccaagg 5580

gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg gctccaattc ttggagtggt 5640

gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg aggtggcccg gctccatgca 5700

ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg cgcctacaat ccatgccaac 5760

ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg tccagtgatc 5820

gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg gtcgtcatct 5880

acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga agcgagaaga 5940

atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac gtagcccagc 6000

gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt ggtggcggga 6060

ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag cgacaggccg 6120

atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag cgctgccggc 6180

acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac gatagtcatg 6240

ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat cggtcgagat 6300

cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 6360

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 6420

ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg 6480

attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc 6540

cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc 6600

ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat 6660

ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat 6720

gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc 6780

ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc cagccagacg 6840

cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa 6900

tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt 6960

gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga acattagtgc aggcagcttc 7020

cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg atcagcccac tgacgcgttg 7080

cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt ctaccatcga 7140

caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga caatttgcga 7200

cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc 7260

cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg cttccacttt 7320

ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata 7380

agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct 7440

gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc gccattcgat 7500

ggtgtccggg atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta 7560

gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag gagatggcgc 7620

ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga 7680

gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa 7740

ccgcacctgt ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atcgagatct 7800

cgatcccgcg aaattaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc 7860

tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatgcatca tcaccatcac 7920

catggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacggaaaa cctgtatttt 7980

cagggaattg atcccttcac c 8001

Claims

1.琼脂水解基因AgaL4，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.根据权利要求1所述的琼脂水解基因AgaL4在琼脂水解和/或获得琼寡糖中的应用。

3.权利要求1所述的琼脂水解基因AgaL4编码的琼脂水解酶，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

4.根据权利要求3所述的琼脂水解酶在琼脂水解和/或获得琼寡糖中的应用。

5.一种重组质粒，其特征在于，包括权利要求1所述的琼脂水解酶基因。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：该质粒为pAgaL4，其核苷酸序列为SEQID NO：3。

7.一种重组微生物，其特征在于，包括权利要求1所述的琼脂水解基因。

8.如权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，该微生物为E.coli。

9.一种重组微生物，其特征在于，包括权利要求5或6所述的重组质粒。

10.如权利要求9所述的一种重组微生物，其特征在于，该微生物为E.coli。