CN110218667B

CN110218667B - 一株产海藻酸裂解酶的菌株sh-1及其应用

Info

Publication number: CN110218667B
Application number: CN201910406996.9A
Authority: CN
Inventors: 沈宏; 杨锦
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110218667A

Abstract

本发明提供了一株产海藻酸裂解酶的菌株SH‑1及其应用；所述的产海藻酸裂解酶命名为Microbulbifer sp.SH‑1，于2018年12月7日保藏于位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16906，该菌可用于发酵生产海藻酸裂解酶，也可直接降解褐藻。本发明还提供了一种具有外切酶活性的海藻酸裂解酶，由菌株SH‑1发酵得到，其酶活性可达757.90U/mL，稳定性好、活性高。本发明同时还提供了海藻提取物制备方法，保留了海藻中的活性成分的同时高效降解褐藻胶为活性寡糖，且增加了部分微生物次生代谢产物，海藻提取物产率可达78～92％，具有良好的工业化前景。

Description

一株产海藻酸裂解酶的菌株SH-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物菌株及其应用技术领域，涉及一株产海藻酸裂解酶的菌株SH-1及其应用，特别涉及一株产海藻酸裂解酶的菌株Microbulbifer sp.SH-1及其应用。

背景技术

化学肥料对维持土壤肥力、提高作物产量和品质具有重要作用，然而，长期大量施用化学肥料导致土壤退化、水体富营养化以及空气污染等诸多问题，严重制约了现代农业可持续的发展。海藻提取物作为一种天然生物刺激素，不仅富含海藻酸、海藻多糖、褐藻多酚、甘露醇、氨基酸、天然植物激素以及植物必须矿物养分等多种活性成分，而且具有生物可降解、无毒、无污染、环境友好的特点。海藻提取物可以部分替代化学肥料，减少化学肥料的施用量，此外，还可以提高化学肥料的利用率，提升作物的生育潜能，具有减肥增效的特性。海藻提取物在农业中的应用将为在不增加环境压力的基础上，保障日益增长的人口对粮食的需求提供了一条有效途径。

海藻提取物的主要来源为褐藻，包括海带(Laminaria japonica)、昆布(Eckloniakurome)、巨藻(Durvillaea potatorum)、马尾藻(Sargassum fusiforme)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)以及墨角藻(Fucus serratus)等大型藻类。褐藻中含有褐藻胶、海带淀粉和褐藻糖胶等多糖，其中褐藻胶含量最为丰富，约占褐藻干重的30～50％。褐藻胶由α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronate)和其C5差向异构体β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate)通过1-4糖苷键连接，随机组合形成的线性多糖。褐藻胶为海藻提供了机械强度，同时其分子量大，组成复杂，不易降解为褐藻的资源化利用造成了障碍。近年来，如何高效降解褐藻制备高活性的海藻提取物或海藻生物肥料成为植物营养领域研究的热点。

通常来讲，海藻提取物的制备方法包括3种：物理提取法、化学提取法和生物提取法。物理法主要依赖高温、高压、低温爆破、超临界CO₂萃取等方法获得，提取技术复杂，装备精度要求高，提取率低。化学方法依靠无机酸碱试剂或有机溶剂对海藻细胞进行消解从而获得提取物，该方法操作简单，成本低廉，是目前应用较为广泛的提取方法，然而该方法容易引进有毒溶剂且对提取物中活性物质易造成破坏。生物提取法则是利用海藻酸裂解酶通过β-消除反应断裂褐藻胶的糖苷键，实现对褐藻的降解，该方法具有提取效率高，反应条件温和，降解产物不易被破坏，不污染环境等优势，为褐藻的资源化利用和高活性海藻提取物的制备提供了新的技术手段。

海藻酸裂解酶种类多样，按照产酶位置可分为胞内酶和胞外酶，按照酶切方式可分为内切酶和外切酶，按照作用位点可分为聚古罗糖醛酸专一性酶、聚甘露糖醛酸专一性酶和双功能酶。海藻裂解酶来源广泛，主要包括：海洋藻类、海洋无脊椎动物(如鲍鱼、海参、海螺等)、海洋细菌和土壤细菌等。此外，还有部分海藻酸裂解酶从真菌和病毒中被分离。海洋细菌和土壤细菌是海藻酸裂解酶最主要的来源，随着研究的深入，大量的产海藻酸裂解酶细菌被发现，如黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、海洋弧菌(Vibrio sp.)、白蚁菌属(Isoptericola sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)、紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber sp.)等。然而，目前报道的微生物源海藻酸裂解酶依然存在着酶活性较低、降解位点单一等缺陷，限制了酶解法制备海藻提取物的发展。因此，筛选高效降解褐藻胶的新菌种，寻找适合海藻提取物生产的褐藻胶裂解酶，是开发褐藻胶资源，探索高值化利用新途径的必然要求。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株高产海藻酸裂解酶的菌株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株高产海藻酸裂解酶的菌株，命名为微泡菌Microbulbifer sp.SH-1，于2018年12月7日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16906。

本发明将采集于福建沿海海带养殖区的沙土与灭菌的人工海水混合，然后通过富集、初筛、复筛获得海藻酸裂解酶高产菌株SH-1。该菌株在以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上形成的单菌落为规则的圆形，呈乳白色，边缘整齐，菌苔隆起，表面湿润光滑，不易挑起。在显微镜下观察，该细菌呈长杆状，革兰氏染色结果为革兰氏阴性。以菌株SH-1的基因组DNA为模板，将细菌16SrDNA的通用引物扩增得到的序列信息提交到NCBI数据库进行BLAST比对，结果表明该菌株与微泡菌Microbulbifer sp.BN3序列同源性最高，相似度达到99％。结合菌株SH-1的形态学特征，初步鉴定其属于微泡菌属(Microbulbifer sp.)，并命名为Microbulbifer sp.SH-1。

所述的高产海藻酸裂解酶的菌株的生理生化特征为：

本发明的第二目的在于提供一种海藻酸裂解酶，由所述的高产海藻酸裂解酶的菌株发酵得到；所述的海藻酸裂解酶具有外切酶活性。

所述的海藻酸裂解酶(命名为AlgSH1)的分子量约为82kDa；其最适反应温度为40℃，最适pH为9，此外，所述的海藻酸裂解酶在30℃以下及pH 5～9范围内较稳定。

本发明的第三目的在于提供所述的高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻酸裂解酶的方法，包括如下步骤：将Microbulbifer sp.SH-1菌液接种到发酵培养基中，在25～35℃、180～240rpm条件下振荡培养，得到含海藻酸裂解酶的发酵液。

所述的发酵的培养基的配方优选为：海藻酸钠10g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸亚铁0.02g/L，氯化钠5g/L，pH＝7.5～8.5；所述的pH优选为7.5。

所述的接种的接种量优选为1～4％(v/v)；进一步优选为1％(v/v)。

所述的发酵培养基的体积优选为占发酵容器体积的6％～20％。

所述的培养的温度优选为28～35℃。

所述的培养的条件优选为32℃，240rpm。

所述的培养的时间优选为20～28h；更优选为20～24h。

所述的Microbulbifer sp.SH-1菌液优选为处于对数生长期的Microbulbifersp.SH-1菌液；优选通过将Microbulbifer sp.SH-1接种于种子培养基，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h，得到所述的处于对数生长期的Microbulbifer sp.SH-1菌液。

所述的种子培养基的配方优选为：海藻酸钠10g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 7。

所述的制备海藻酸裂解酶的方法还可以包括将含海藻酸裂解酶的发酵液离心收集上清液后，过膜等操作步骤，得到海藻酸裂解酶粗酶液。

所述的离心的具体操作优选为所述的含海藻酸裂解酶的发酵液在10000～12000rpm下离心15～20min，收集上清液。

所述的通过高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻酸裂解酶的方法，还可以包括进一步纯化操作：将所述的海藻酸裂解酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀得到第一产物，将第一产物进行离子交换层析得到第二产物，将第二产物进行凝胶过滤层析得到纯化后的海藻酸裂解酶。

所述的硫酸铵分级沉淀的具体操作优选为：在所述的海藻酸裂解酶粗酶液中入硫酸铵至30％饱和度，4℃第一次静置后离心去沉淀，收集上清液，然后加硫酸铵至80％饱和度，4℃静置过夜后离心弃去上清液，收集沉淀后透析即得到所述的第一产物。

所述的第一次静置的时间优选为4h。

所述的离心的转速优选为12000rpm。

所述的滤膜优选为孔径0.22μm的滤膜。

所述的透析的具体操作为：将沉淀溶于20mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液，置于透析袋(MW:14000)并在20mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液透析过夜。

所述的离子交换层析与凝胶过滤层析均优选利用

pure蛋白纯化系统(美国通用电气公司)进行。

所述的离子交换层析优选为DEAE-Sepharose FF层析；所述的DEAE-Sepharose FF层析的具体操作为：将第一产物上样于DEAE Sepharose Fast Flow(1.6×20cm)柱，采用0～1mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，收集A₂₈₀大于5mAU的组分，得到第二产物。

所述的梯度洗脱的流速优先为2mL/min。

所述的凝胶过滤层析优选为Sephadex G-75层析；所述的Sephadex G-75(1.6×60cm)层析的具体操作优选为：将第二产物上样于Superdex G-75柱，以平衡液洗脱，收集A₂₈₀大于5mAU的组分，即为所述的海藻酸裂解酶。

所述的洗脱的流速优选为1mL/min。

本发明的第四目的在于提供所述的高产海藻酸裂解酶的菌株或所述的海藻酸裂解酶在肥料或生物燃料的生产中的应用。

所述的应用优选为在制备海藻提取物中的应用；可实现快速、高效地降解海藻。

本发明的第五目的在于提供一种利用高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)在海藻中加入无机盐溶液，调节pH至7.5，得到菌解底物；

(2)将所述的Microbulbifer sp.SH-1菌株接种于步骤(1)得到的菌解底物中，在28℃～32℃，180～240rpm条件下发酵，得到发酵液；

(3)去除步骤(2)的发酵液中的未降解的海藻渣和菌体，收集上清液，即得所述的海藻提取物。

所述的制备方法还可以包括浓缩和/或喷雾干燥的操作，进一步制备得到浓缩海藻提取物和/或海藻提取物干粉产品。

步骤(1)中的海藻优选为海带(Laminaria japonica)、昆布(Ecklonia kurome)、巨藻(Durvillaea potatorum)、马尾藻(Sargassum fusiforme)、泡叶藻(Ascophyllumnodosum)、面条藻(Durvillaea antarctica)、树皮藻(Ecklonia maxima)、F藻(LessoniaTrabeculata(Flavicans))、N藻(Lessonia Nigrescens)以及墨角藻(Fucus serratus)中的一种或几种。

步骤(1)中所述的无机盐溶液的配方优选含有如下终浓度的物质NaCl：15～30g/L，(NH₄)₂SO₄：5～10g/L，MgSO₄：0.2～0.8g/L，K₂HPO₄：1～2g/L，FeSO₄：0.01～0.02g/L，pH＝7.5；所述的无机盐溶液的溶剂优选为水；所述的水的添加量优选为按所述的海藻的3～4倍重量份加入。

步骤(1)所述的海藻优选新鲜海藻。

步骤(1)中所述的海藻优选为浸泡后的海藻；所述的海藻在浸泡前优选先剔除杂质后，用清水清洗干净，再进行浸泡；所述的浸泡使海藻充分吸水，浸泡的时间优选为5～6小时。

步骤(1)中所述的海藻在加入无机盐溶液前，优选先将所述的浸泡的海藻切碎。

步骤(1)中所述的菌解底物优选为海藻浆；优选通过匀浆机制得。

步骤(2)中所述的Microbulbifer sp.SH-1菌株的接种量优选为2％(v/v)。

步骤(2)中所述的发酵的时间优选为12～36h。

当所述的海藻为海带时，所述的发酵时间优选为12～24h。

步骤(3)中所述的去除步骤(2)的发酵液中的未降解的海藻渣和菌体的操作优选为离心。

本发明的第六目的在于提供一种利用所述的海藻酸裂解酶制备海藻提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)在海藻加入无机盐溶液，调节pH至8～10，此时所述的海藻酸裂解酶可保持80％以上活力，得到酶解底物；

(2)将所述的海藻酸裂解酶加入到步骤(1)所述的酶解底物中，在35℃～40℃，180～240rpm条件下酶解，得到酶解液；

(3)去除步骤(2)的酶解液中的未降解的海藻渣，收集上清液，即得所述的海藻提取物。

步骤(1)中优选的海藻为海带、昆布、巨藻、马尾藻、泡叶藻、面条藻、树皮藻、F藻、N藻以及墨角藻中的一种或几种。

步骤(1)所述的海藻优选新鲜海藻。

步骤(1)中所述的酶解底物优选为海藻浆；优选通过匀浆机制得。

步骤(1)中所述的pH优选调至9。

步骤(2)中所述的酶解的时间优选为24～36h。

步骤(2)中所述的海藻酸裂解酶添加量优选为按海藻浆液体积的2～5％进行添加。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明提供了一株新型的胞外高产海藻酸裂解酶的微泡菌菌株SH-1，该菌可以用于发酵生产海藻酸裂解酶，也可以直接用于褐藻生物降解。

2.本发明所述Microbulbifer sp.SH-1菌株所产的海藻酸裂解酶为胞外酶，易于分离，其酶活性可达757.90U/mL；用作海藻酸裂解酶生产菌或生产酶，具有产品稳定性好、活性高、生产周期短、成本低的特点，适于工业化生产。

3.本发明所述Microbulbifer sp.SH-1菌株及其海藻酸裂解酶能够在不添加其它细菌或酶的条件下，高效降解褐藻制备海藻提取物，工艺成熟，提取效率高，能够获得大量的海藻提取物；同时，所述的海藻酸裂解酶具有外切酶活性，能够高效降解海藻酸钠为单糖、二糖和三糖，并且海藻提取物产率可达78～92％。

4.本发明所述的海藻提取物制备方法，在最大限度的保留了海藻中的活性成分的同时，降解褐藻胶为活性寡糖，且增加了部分微生物次生代谢产物，进一步提升了海藻提取物的生物刺激效果。

附图说明

图1为Microbulbifer sp.SH-1菌落形态及革兰氏染色图。

图2为Microbulbifer sp.SH-1系统发育进化树图。

图3为Microbulbifer sp.SH-1产酶曲线图。

图4为AlgSH1的SDS-PAGE凝胶电泳结果图及不同纯化步骤分离得到的海藻酸裂解酶产物的酶学性质结果分析图。

图5为AlgSH1降解海藻酸钠过程中粘度变化及酶解液还原糖变化的结果分析图。

图6为AlgSH1降解海藻酸钠产物TLC色谱图。

图7为AlgSH1降解海藻酸钠产物ESI-MS图谱。

图8为Microbulbifer sp.SH-1对不同褐藻降解效果图。

图9为Microbulbifer sp.SH-1发酵制备海藻提取物过程海藻酸及还原糖变化结果分析图；其中，A为实施例8的结果，B为实施例9的结果。

图10为Microbulbifer sp.SH-1利用不同褐藻制备海藻提取物产品效果图。

图11为AlgSH1酶解不同底物的相对酶活分析图。

图12是初始pH对Microbulbifer sp.SH-1培养影响的结果分析图。

图13是温度对Microbulbifer sp.SH-1培养影响的结果分析图。

图14是装瓶量对Microbulbifer sp.SH-1培养影响的结果分析图。

图15是接种量对Microbulbifer sp.SH-1培养影响的结果分析图。

图16是摇床转速对Microbulbifer sp.SH-1培养影响的结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 Microbulbifer sp.SH-1分离、筛选及鉴定

1.培养基的配制

(1)富集培养基：海藻酸钠5g/L，蛋白胨1g/L，NaCl 15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，pH 7.5。

(2)初筛培养基：海藻酸钠10g/L，NaCl 15g/L，(NH4)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，pH 7.5。固体培养基中添加1.8％(w/v)的琼脂。

(3)复筛培养基与初筛培养基成分相同，只是不加入琼脂。

2.菌株的筛选

(1)富集：称取采自福建海藻养殖区附近的沙土5g与100mL灭菌水混合均匀。吸取1mL所述的沙土和灭菌水混合均匀后的上清液接种于50mL/250mL富集培养基中，28℃、180rpm条件下摇瓶富集培养48h。

(2)将富集的菌液按照10^-1～10^-7梯度稀释，然后将10^-4～10^-7稀释度的菌液涂布到初筛培养基平板上，28℃恒温培养48天，观察平板上的菌落形态，挑取生长状况较好的单菌落平板划线，进一步纯化，利用10％(w/v)氯代十六烷基吡啶对已纯化的菌落染色，根据透明圈与菌落直径比值，初步判断菌株降解褐藻胶的能力。

(3)复筛：挑选透明圈与菌落直径比值较大的菌株，接入50mL复筛培养基中，28℃，180rpm培养24h后，将发酵液于4℃、10000rpm条件下离心15min，取上清液利用DNS法测定酶活，从而筛选出酶活性较高的菌种。然后将菌株与甘油混合使其终浓度为20％，保藏于-80℃的冰箱中备用。

其中一株菌株如图1A所示，28℃培养48h后该菌株单菌落为规则的圆形，呈乳白色，边缘整齐，菌苔隆起，表面湿润光滑，不易挑起。图1B所示，十六烷基吡啶(CPC)染色结果表明，该菌株的透明圈直径D为29.49mm，菌落直径d为7.14mm，D/d为4.13。图1C所示，该细菌呈长杆状，革兰氏染色结果为阴性。将该菌株命名为SH-1。

3.Microbulbifer sp.SH-1的16S rDNA鉴定

采用细菌基因组快速抽提试剂盒(购自宝生物公司，货号DV810A)抽提该细菌的基因组，然后采用细菌16S rDNA通用引物(正向引物5’-TGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT-3’，反向引物5’-TGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCC-3’)进行16S rDNA的PCR扩增，扩增程序为：①1循环(预变性：94℃5min)；②35循环(变性：98℃10sec；退火：55℃30sec；延伸：72℃1kb/1min)；③1循环(延伸：72℃10min)；④1循环(保存：12℃)。获得的PCR产物经割胶回收试剂盒纯化后与TA克隆载体连接，连接液转化感受态细胞后，挑选阳性克隆由广州伯信生物科技有限公司测序。菌株SH-1的16S rDNA序列长度为1398bp(SEQ ID NO:3)，该序列信息利用Blast软件在NCBI数据库中进行同源性比对，选出同源性高的典型菌株的16S rDNA序列为参比对象。经同源性比较发现该菌株与Microbulbifer sp.BN3的相似性为99％，结合菌株SH-1的形态学特征，初步鉴定其属于微泡菌属(Microbulbifer sp.)，并命名为Microbulbifer sp.SH-1。该菌与其近源菌株16S rDNA序列构建的系统发育进化树如图2所示。

4.菌株SH-1的生理生化特征分析

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠)对菌株SH-1进行生理生化实验监测，结果如表1所示。

表1 Microbulbifer sp.SH-1的生理生化特征

菌株Microbulbifer sp.SH-1于2018年12月7日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16906。

实施例2 Microbulbifer sp.SH-1的培养条件研究

(1)将甘油保存的Microbulbifer sp.SH-1接种于种子培养基(海藻酸钠10g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 7.0)，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h，得到处于生长对数生长期(OD₆₀₀＝0.6～0.8)的种子液。

(2)将步骤(1)所得到的种子液接种于液体发酵培养基(海藻酸钠10g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸亚铁0.02g/L，氯化钠5g/L)，分别研究液体发酵培养基的pH(4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)、培养温度(25、28、32、35、40℃)、装液量(15、30、50、60、75、90mL，容器体积为250mL)、接种量(1、2、3、4、5％(v/v)、摇床转速(120、150、180、210、240rpm)等培养条件对菌株SH-1产酶的影响。

结果如图12～16所示，在pH 4.5～7.5范围内，海藻酸裂解酶活性随pH的上升而增大；pH为7.5时，酶活力达到最大；当pH大于7.5时，酶活力开始下降。因此，SH-1产酶最适pH为7.5(图12)。温度是影响菌株生长代谢的重要环境因子。在上述优化条件下，选择25、28、32、35、40℃进行发酵培养，结果如图13所示，菌株SH-1的最适产酶温度为32℃。装瓶量是制约菌株生长及产酶的重要因素，装瓶过少，水分易于蒸发，装瓶过多溶氧减少，不利于菌体生长。试验发现当250mL锥形瓶装液量为50mL时，菌株SH-1产酶能力最强(图14)。如图15所示，接种量较低时，其对细菌生长及产酶无明显影响，当接种量过高时由于细菌间的竞争，造成产酶能力的下降，考虑到节约成本，最佳的接种量为1％。测定了摇床不同转速对菌株产酶的影响，结果发现，随着摇床转速的提高，菌株SH-1发酵产酶活性增强，最佳的摇床转速为240r/min(图16)。

实施例3 Microbulbifer sp.SH-1制备海藻酸裂解酶

应用实施例1筛选得到的Microbulbifer sp.SH-1菌株制备海藻酸裂解酶的方法，包括以下步骤：

(1)将甘油保存的Microbulbifer sp.SH-1接种于种子培养基，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h，得到处于生长对数生长期(OD₆₀₀＝0.6～0.8)的种子液。

(2)将步骤(1)所得到的种子液按照1％(v/v)的接种量接种于50mL/250mL液体发酵培养基中，在32℃、240rpm条件下振荡培养20～24h，得到含海藻酸裂解酶的发酵液。

(3)将步骤(2)含海藻酸裂解酶的发酵液在10000～12000rpm下离心15～20min，收集上清液过0.22μm孔径滤膜除菌体，即可得到海藻酸裂解酶粗酶液。

其中，步骤(1)中的种子培养基配方为：海藻酸钠10g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 7.0。

步骤(2)中液体发酵培养基配方为：海藻酸钠10g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸亚铁0.02g/L，氯化钠5g/L，pH 7.5。

实施例4海藻酸裂解酶活测定

取0.1mL实施例3制得的海藻酸裂解酶粗酶液，加入到盛有0.9mL 0.8％(w/v)海藻酸钠(用pH 7.5的PBS缓冲液配制)底物的比色管中，充分混匀，40℃水浴条件下反应10min后，加入0.5mL DNS溶液，然后迅速于沸水浴煮沸5min，冷却后定容至10mL，作为试验管；空白管由灭活的酶液代替粗酶液，其他步骤同试验管；然后于540nm下测定各管吸光度；每个处理设3次重复。以葡萄糖作标准曲线，根据试验管和空白管吸光值的差计算还原糖的产生量。酶活力单位(U)定义为：每分钟产生1μg还原糖所需的酶量。发酵液酶活力单位定义为每毫升发酵液含酶活单位(U/mL)。

如图3所示，Microbulbifer sp.SH-1在培养至20～28h时达到产酶高峰，发酵24h时酶活性最高，为757.90U/mL，超过28h后发酵液中海藻酸裂解酶活性迅速降低。

实施例5海藻酸裂解酶AlgSH1的分离纯化及酶学性质

1.硫酸铵分级沉淀

实施例3制得的海藻酸裂解酶的粗酶液中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度，4℃静置4h后，12000rpm离心去沉淀，收集上清液，然后加硫酸铵至80％饱和度，4℃静置过夜，12000rpm离心弃去上清液，沉淀溶于20mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液，置于透析袋(MW:14000)并在20mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液透析过夜。

2.DEAE-Sepharose FF层析

利用

pure蛋白纯化系统(美国通用电气公司)将步骤1得到的蛋白样品上样于20mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液预先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱进行离子交换层析。层析柱体积为20mL(1.6×20cm)，采用0～1mol/L NaCl梯度洗脱(自动梯度)，流速为2mL/min，收集A₂₈₀大于5mAU的组分，并对其活性进行测定，保留活性峰部分，得到活性组分。

3.Sephadex G-75层析

将步骤2得到的活性组分进行凝胶过滤层析，Superdex G-75(1.6×60cm)柱用20mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液平衡，上样后以平衡液(20mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集A₂₈₀大于5mAU的组分，并对其活性进行测定，保留活性峰部分，得到AlgSH1纯酶液。

如图4所示，采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF和Sephadex G-75层析等方法分离纯化海藻酸裂解酶的粗酶液得到纯酶AlgSH1的SDS-PAGE凝胶电泳结果表明(图4-A)，AlgSH1分子量约为82kDa；如图4-B所示，温度对AlgSH1的酶活的影响结果表明，在25～40℃的温度范围内该酶酶活随着温度升高而增加，当反应温度高于40℃后酶活迅速降低，故其最适反应温度为40℃。热稳定性试验表明(图4-C)，该酶在30℃以下相对稳定，残留酶活力大于90％；AlgSH1在35℃的体系中保温30min时，残留酶活力降至80％以下，保温120min时残留酶活力降至80％以下；当其在40、45、50℃体系中保温30min时，该酶几乎完全失活，表明此时酶结构受到严重破坏。

由如图4-D可见，在分别在柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢钠-磷酸氢二钠、Tris-HCl、甘氨酸-氢氧化钠构成的不同pH缓冲体系中考察海藻酸裂解酶AlgSH1的稳定性，该酶在pH小于9.0时，酶活力随pH的升高而升高，当pH大于9.0时酶活呈下降趋势，最适反应pH为9.0。将该酶在不同pH缓冲体系溶液混合后，25℃孵育60min，如图4-E所示，AlgSH1在pH 5.0～9.0条件下保持稳定，残留酶活性大于85％，表明该酶具有较为宽泛的pH稳定范围。

4.分别向900μL含0.3％聚甘露糖醛酸、0.3％聚古罗糖醛酸和0.3％海藻酸钠的底物中加入100μL AlgSH1纯酶液，置于40℃条件下反应10min。DNS法测定AlgSH1对不同底物的酶活，以确定其底物特异性。结果如图11所示，海藻酸裂解酶AlgSH1对不同结构的海藻酸降解能力有着明显的差异，当以海藻酸钠和聚甘露糖醛酸(polyM)为底物时，AlgSH1表现出明显的降解效果，特别是对聚甘露糖醛酸(polyM)底物特异性作用显著。然而，AlgSH1在聚甘露糖醛酸(polyG)片段中活性较弱。表明该酶为聚甘露糖醛酸底物偏好型的海藻酸裂解酶。

实施例6 Microbulbifer sp.SH-1粗酶液对海藻酸钠的降解

以实施例3制得的海藻酸裂解酶的粗酶液对海藻酸钠进行降解，并对降解产物进行分析。用20mmol/L，pH 7.5的磷酸缓冲液配置质量分数为1％的海藻酸钠溶液，按照底物溶液体积2～5％的添加量，将粗酶液加入到海藻酸钠溶液中，然后在40℃，180rpm条件下进行降解。降解过程中观察粘度变化，降解1、2、4、8、12、24、36、48h时分别取样5mL，煮沸5min终止反应，测定OD₂₃₅值；粘度通过NDJ-1旋转式粘度计测定得到；并利用薄层层析(TLC)方法对降解产物进行分析。

(1)DNS比色法：取0.2mL酶解液补水至1mL，然后加入0.5mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)，沸水浴5min后迅速冷却，定容至10mL，摇匀后于540nm条件下比色。

(2)TLC层析：将酶解液1000rpm离心20min，取上清2μL点样于硅胶板，用1:1:1的正丁醇：乙酸：水为展开剂展开4～5h，晒干并于130℃左右加热显色。

(3)ESI-MS检测：负离子电离模式，电压：-4.0kV，喷雾气压：3.4Bar，气体流速：10L/min，气体温度180℃。

AlgSH1对海藻酸钠底物降解过程中，在反应前40min内迅速降低，由310Pa·S降至10Pa·S(图5A)，然后保持恒定，表明大分子海藻酸钠被酶剪切为不具有粘度效应的片段。然而，酶促反应并没有结束，在酶解前1小时内，产物中还原糖含量并未有明显变化，随着酶解时间的增长，产物中还原糖含量增加，在酶解24h达到最大值并保持恒定(图5B)。

由图6和图7的结果可知，海藻酸裂解酶粗酶液对海藻酸钠的降解产物为单糖、二糖和三塘，寡糖产率为42.3％。目前已报道海藻酸裂解酶多为内切酶，外切酶较为少见，降解产物中单糖的存在表明该海藻酸裂解酶具有外切酶活性。因此，其不仅可以简单应用于褐藻资源的降解，在褐藻资源生产生物燃料等过程中极具应用价值。

实施例7 Microbulbifer sp.SH-1菌株对不同褐藻的降解

将浸泡5～6h的不同褐藻：海带(Laminaria japonica)、马尾藻(Sargassumfusiforme)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、面条藻(Durvillaea antarctica)、树皮藻(Ecklonia maxima)、F藻(Lessonia Trabeculata(Flavicans))、N藻(LessoniaNigrescens)清洗干净，用剪刀将其剪为1×1cm大小的方块，然后加入至250mL锥形瓶中，并加入50mL无机盐溶液，无机盐成分和最终浓度为，NaCl：15～30g/L，(NH₄)₂SO₄：5～10g/L，MgSO₄：0.2～0.8g/L，K₂HPO₄：1～2g/L，FeSO₄：0.01～0.02g/L，pH 7.5；得到含有不同种类的褐藻的培养液。

按照2％(v/v)的接种量将菌株Microbulbifer sp.SH-1种子液，分别接种至上述培养液中，180rpm，32℃条件下培养24h，期间定点观察海带形态变化，并拍照记录。

记录结果如图8所示，12h时海藻变得破碎，溶液开始变浑浊；24h时海藻片主体变小，碎屑增多，溶液变得不透明；36h时海带主体完全被降解，溶液变为浊液。该结果表明，菌株Microbulbifer sp.SH-1能够在短时间内，能够高效降解褐藻，为褐藻资源化利用优势菌种，同时推断可得出，其在以海带为底物的培养基中可能会诱导除海藻酸裂解酶之外的其它多糖降解酶，如海带多糖降解酶、果胶酶等。

实施例8 Microbulbifer sp.SH-1菌株制备海藻提取物

应用实施例1中所述Microbulbifer sp.SH-1发酵制备海藻提取物的方法，包括以下步骤：

(1)新鲜海藻剔除杂质后，用清水清洗干净，并浸泡5～6小时；

(2)将步骤(1)中吸饱水的海藻切碎后，加入适量无机盐，并与3～4倍重量份的清水混合，然后用匀浆机将其打成匀浆，调节pH至7.5，得到海藻浆；

(3)按照2％(v/v)的接种量，将实施例1的Microbulbifer sp.SH-1菌株接种于步骤(2)所述的海藻浆中，在28℃～32℃，180～240rpm条件下发酵24h；

(4)将步骤(3)中得到的发酵液离心去掉未降解的海藻渣和菌体，收集上清液，经浓缩或喷雾干燥即可得到海藻提取液和海藻提取物干粉产品。

上述Microbulbifer sp.SH-1发酵制备海藻提取物的方法中：

步骤(1)中海藻的优选为海带、昆布、巨藻、马尾藻、泡叶藻、面条藻、树皮藻、F藻、N藻以及墨角藻中的一种或几种。

步骤(2)中优选的无机盐成分和终浓度为，NaCl：15～30g/L，(NH₄)₂SO₄：5～10g/L，MgSO₄：0.2～0.8g/L，K₂HPO₄：1～2g/L，FeSO₄：0.01～0.02g/L，pH 7.5。

通过采用DNS法测定还原糖含量，参照《NY/T 3174-2017水溶肥料海藻酸含量的测定》中的间羟联苯分光光度法测定海藻酸含量。以海带为例研究Microbulbifer sp.SH-1在降解海藻过程中(图9A)，经过细菌的降解，海藻中的海藻酸不断溶出，海藻酸含量逐渐增加，在发酵12h时海藻酸含量达到最大，间接过程中产生的还原性寡糖，随后达到最大值。然而，由于细菌数量逐渐的增多，继续发酵将带来对还原糖性寡糖的消耗。因此合适的发酵时间应控制在12～24h。

Microbulbifer sp.SH-1利用不同种类的海藻制备海藻提取物产品效果图如图10所示。

实施例9 Microbulbifer sp.SH-1粗酶液制备海藻提取物

应用实施例3中所述Microbulbifer sp.SH-1粗酶液制备海藻提取物的方法，包括以下步骤：

(2)将步骤(1)中吸饱水的海藻切碎后，与3～4倍重量份的清水混合，然后用匀浆机将其打成匀浆，调节pH至9.0，得到海藻浆；

(3)将实施例3所述的海藻酸裂解酶粗酶液加入到步骤(2)所述的海藻浆中，在35℃～40℃，180～240rpm条件下酶解36h；

(4)将步骤(3)中得到的发酵液离心去掉未降解的海藻渣，收集上清液，经浓缩或喷雾干燥即可得到海藻提取液和海藻提取物干粉产品。

上述利用Microbulbifer sp.SH-1粗酶液制备海藻提取物的方法中：

步骤(1)中的海藻优选为海带、昆布、巨藻、马尾藻、泡叶藻、面条藻、树皮藻、F藻、N藻以及墨角藻中的一种或几种。

步骤(3)中海藻酸裂解酶的添加量优选为海藻浆液体积的2～5％。

Microbulbifer sp.SH-1粗酶液对海藻降解过程与细菌类似(图9B)，然而由于没有细菌的存在，降解过程更加温和，海藻酸在降解24h时达到峰值，还原性寡糖在36h时达到峰值并保持稳定。对于酶降解工艺，合适的发酵时间应控制在24～36h。

综合实施例8和9，对Microbulbifer sp.SH-1菌解和酶解工艺产物进行比较，其中，海藻酸参照《NY/T 3174-2017水溶肥料海藻酸含量的测定》的“间羟基联苯分光光度法”测定；粗蛋白采用考马斯亮蓝法(聂昌宏,郑欣,阿依居来克·卡得尔等.考马斯亮蓝法检测不同乳中乳清蛋白含量[J].食品安全质量检测学报,2019,10(05):1138-1142)、褐藻多酚采用福林酚比色法(孙露川阳,任丹丹,王帅等.生物酶法提取铜藻中褐藻多酚的工艺优化[J].食品安全质量检测学报,2019,10(08):2201-2206)、甘露醇采用超高效液相色谱-串联质谱法(张文昔,田琼,崔卫国.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定海藻肥中的甘露醇和甜菜碱[J].中国农学通报,2015,31(11):177-181.)、粘度采用NDJ-1旋转粘度计进行测定。

结果如表2所示：

表2 Microbulbifer sp.SH-1发酵制备及其中粗酶液制备海藻提取物成分比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一株产海藻酸裂解酶的菌株SH-1及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 16S rDNA 正向引物

<400> 1

tggcggcgtg cctaatacat gcaagt 26

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 16S rDNA反向引物

<400> 2

tgctgatccg cgattactag cgattcc 27

<210> 3

<211> 1398

<212> DNA

<213>微泡菌Microbulbifer sp.SH-1(Microbulbifer sp.SH-1)

<220>

<223>菌株SH-1的16S rDNA核苷酸序列

<400> 3

ccccccgaag gttagactag ccacttctgg agcaacccac tcccatggtg tgacgggcgg 60

tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg tgacattctg attcacgatt actagcgatt 120

ccgacttcac ggagtcgagt tgcagactcc gatccggact acgactggtt ttttcggatt 180

agctccacct cgcggattcg caaccgtctg taccagccat tgtagcacgt gtgtagccca 240

ggtcgtaagg gccatgatga cttgacgtcg tccccacctt cctccggttt gtcaccggca 300

gtctccctag agttctcagc attacctgct agcaactagg gacaagggtt gcgctcgtta 360

cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtctca 420

gagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctct ggatgtcaag acctggtaag 480

gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540

ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg gtctacttat tgcgttagct 600

gcgttacaaa gtcctcaagg aaccctacaa ctagtagaca tcgtttacgg cgtggactac 660

cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tcagcgtcag tatcgagcca 720

ggcagtcgcc ttcgccactg atgttccttc ctatatctac gcatttcacc gctacacagg 780

aaattccact accctctctc gtactctagc cagccagttc tgaatgcagt tcccaggttg 840

agcccggggc tttcacatcc agcttaacta accgcctacg cgcgctttac gcccagtaat 900

tccgattaac gcttgcaccc tccgtattac cgcggctgct ggcacggagt tagccggtgc 960

ttcttctgta ggtaacgtca atcctgcaga gtattaatct acaggccttc ctccctactg 1020

aaagtgcttt acaacccgaa ggccttcttc acacacgcgg catggctgga tcagggttgc 1080

ccccattgtc caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc 1140

ccagtgtggc tgatcatcct ctcagaccag ctacggatcg tcgccttggt aggcctttac 1200

cctaccaact agctaatccg acgcgggcat atccaatagc acgaggtccg aagatccccc 1260

gctttccccc gtagggcgta tgcggtatta gcaaccgttt ccggttgttg tcccccacta 1320

ctgggcaatt tcccacgcgt tactcacccg tccgccgctc tactcagtcc gaagaccttt 1380

cgcgctcgac tgcatgtg 1398

Claims

1.一株高产海藻酸裂解酶的菌株，其特征为：

命名为微泡菌（Microbulbifer sp.）SH-1，于2018年12月7日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 16906。

2.一种由权利要求1所述的高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻酸裂解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将微泡菌（Microbulbifersp.）SH-1菌液接种到发酵培养基中，在25～35℃、180～240rpm条件下振荡培养，得到含海藻酸裂解酶的发酵液。

3.根据权利要求2的由所述的高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻酸裂解酶的方法，其特征在于：

所述的发酵的培养基的配方为：海藻酸钠10 g/L，硫酸铵5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸亚铁0.02 g/L，氯化钠5 g/L，pH=7.5～8.5；

所述的接种的接种量为1～4%(v/v)；

所述的培养的温度为28～35℃；

所述的发酵培养基的体积为占发酵容器体积的6%～20%；

所述的微泡菌（Microbulbifer sp.）SH-1菌液先接种于种子培养基，在28℃、180 rpm条件下振荡培养12 h，得到处于对数生长期的微泡菌（Microbulbifer sp.）SH-1菌液再接种至所述的发酵培养基中；

所述的种子培养基的配方为：海藻酸钠10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，pH 7；

所述的制备海藻酸裂解酶的方法还包括将含海藻酸裂解酶的发酵液离心收集上清液后，过膜的操作步骤，得到海藻酸裂解酶粗酶液；

所述的制备海藻酸裂解酶的方法还包括进一步纯化操作：将所述的海藻酸裂解酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀得到第一产物，将第一产物进行离子交换层析得到第二产物，将第二产物进行凝胶过滤层析得到纯化后的海藻酸裂解酶。

4.根据权利要求3所述的由高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻酸裂解酶的方法，其特征在于：

所述的离心的具体操作为将所述的含海藻酸裂解酶的发酵液在10000～12000 rpm下离心15～20 min，收集上清液；

所述的发酵的培养基的pH为7.5；

所述的接种的接种量为1%(v/v)；

所述的培养的条件为32℃，240 rpm；

所述的硫酸铵分级沉淀的具体操作为：在所述的粗酶液中入硫酸铵至30%饱和度，4℃第一次静置后离心去沉淀，收集上清液，然后加硫酸铵至80%饱和度，4℃静置过夜后离心弃去上清液，收集沉淀后透析即得到所述的第一产物；

所述的透析的具体操作为：将沉淀溶于20 mmol/L pH7.5磷酸缓冲液，置于透析袋并在20 mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液透析过夜；

所述的离子交换层析为DEAE-Sepharose FF层析；所述的DEAE-Sepharose FF层析的具体操作为：将第一产物上样于DEAE Sepharose Fast Flow柱，采用0～1 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，收集A₂₈₀大于5 mAU的组分，得到收集第二产物；

所述的凝胶过滤层析为Sephadex G-75层析；所述的Sephadex G-75层析的具体操作为：将第二产物上样于Superdex G-75 柱，以平衡液洗脱，收集收集A₂₈₀大于5 mAU的组分，即为所述的海藻酸裂解酶。

5.一种海藻酸裂解酶粗酶液，其特征在于：

由权利要求1所述的高产海藻酸裂解酶的菌株发酵得到。

6.权利要求1所述的高产海藻酸裂解酶的菌株或权利要求5所述的海藻酸裂解酶粗酶液在肥料或生物燃料的生产中的应用。

7.一种利用高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）在海藻中加入无机盐溶液，调节pH至7.5，得到菌解底物；

（2）将权利要求1所述的微泡菌（Microbulbifersp.）SH-1菌株接种于步骤（1）得到的菌解底物中，在28℃～32℃，180～240 rpm条件下发酵，得到发酵液；

（3）去除步骤（2）的发酵液中的未降解的海藻渣和菌体，收集上清液，即得所述的海藻提取物。

8.根据权利要求7所述的利用高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻提取物的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的菌解底物为海藻浆；

步骤（2）中所述的微泡菌（Microbulbifersp.）SH-1菌株的接种量为2%(v/v)；

步骤（2）中所述的发酵的时间为12～36 h；

步骤（3）中所述的去除步骤（2）的发酵液中的未降解的海藻渣和菌体的操作为离心。

9.根据权利要求8所述的利用高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻提取物的制备方法，其特征在于：当所述的海藻为海带时，所述的发酵时间为12～24 h。

10.一种利用权利要求5所述的海藻酸裂解酶粗酶液制备海藻提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）在海藻中加入无机盐溶液，调节pH至8～10，得到酶解底物；

（2）将所述的海藻酸裂解酶粗酶液加入到步骤（1）所述的酶解底物中，在35℃～40℃，180～240 rpm条件下酶解，得到酶解液；

（3）去除步骤（2）的酶解液中的未降解的海藻渣，收集上清液，即得所述的海藻提取物。

11.根据权利要求10所述的海藻酸裂解酶粗酶液制备海藻提取物的制备方法，其特征在于，

步骤（1）中所述的酶解底物为海藻浆；

步骤（1）中所述的pH调至9；

步骤（2）中所述的酶解的时间为24～36 h；

步骤（2）中所述的海藻酸裂解酶粗酶液添加量为按海藻浆液体积的2%～5%进行添加。

12.权利要求7～9任一所述的利用高产海藻酸裂解酶的菌株制备海藻提取物的制备方法或权利要求10～11任一所述的利用所述的海藻酸裂解酶粗酶液制备海藻提取物的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中海藻为海带（Laminariajaponica）、昆布（Ecklonia kurome）、巨藻（Durvillaea potatorum）、马尾藻（Sargassum fusiforme）、泡叶藻（Ascophyllumnodosum）、面条藻（Durvillaea antarctica）、树皮藻（Ecklonia maxima）、F藻（Lessonia Trabeculata (Flavicans)）、N藻（Lessonia Nigrescens）以及墨角藻（Fucus serratus）中的一种或几种；

步骤（1）中所述的无机盐溶液的配方含有如下终浓度的物质 NaCl：15～30 g/L，(NH₄)₂SO₄：5～10 g/L，MgSO₄：0.2～0.8 g/L，K₂HPO₄：1～2 g/L，FeSO₄：0.01～0.02 g/L，pH=7.5；

步骤（1）中所述的无机盐溶液的溶剂为水；所述的水的添加量为按所述的海藻的3～4倍重量份加入；

步骤（1）所述的海藻为浸泡后的海藻。