CN113913347B - 一种巴伦氏类芽孢杆菌tz-1及其应用 - Google Patents

一种巴伦氏类芽孢杆菌tz-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种巴伦氏类芽孢杆菌TZ‑1及其应用。所述巴伦氏类芽孢杆菌TZ‑1的保藏编号为CGMCC No.23696，该巴伦氏类芽孢杆菌TZ‑1可用于制备脂肪酶。本发明提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ‑1能在40～50℃的条件下正常生长，其产生的脂肪酶酶活可达到17.31U/ml，油脂降解率可达到87.19％，在污泥、餐厨垃圾等固体废弃物资源化利用领域具有极大的应用价值。

Description

一种巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1及其应用。
背景技术
好氧堆肥是实现有机固体废弃物资源化利用的主流处理方式，堆肥腐熟是由微生物主导的生理生化过程。高油脂含量的固体废物，物料表面会被大量油脂包裹，阻碍微生物对有机物降解，从而抑制好氧堆肥的启动。
脂肪酶(EC 3.1.l.3)又称为三酰基甘油酯水解酶，可以催化甘油三酯或脂肪酸酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外，还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶和胆固醇酯酶活性等。目前，脂肪酶已成为领先的生物催化剂之一，应用于食品、医药、洗涤剂、皮革和环境保护等多个工业领域。
近年来，我国在微生物产脂肪酶的菌种筛选、工业发酵条件等方面的优化均有深入研究。但目前对温度有很好的耐受性且可达到良好的油脂降解效果的微生物较少，因此，筛选具有活力高、产量高及成本低的脂肪酶嗜热菌种，开发脂肪酶新品种仍需深入研究，以拓宽其应用领域，满足基于生物强化技术的污泥、餐厨垃圾等固体废弃物资源化利用处理工艺的技术需求。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1及应用，该菌株能在较高的温度下能生产高活性的脂肪酶，达到良好的油脂降解效果。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1，其分类名称为巴伦氏类芽孢杆菌(Paenibacillusbarengoltzii)，于2021年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.23696；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供了一种嗜热巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1。该菌株能在40～50℃的条件下正常生长，其产生的脂肪酶酶活可达到17.31U/ml，油脂降解率可达到87.19％，在污泥、餐厨垃圾等固体废弃物资源化利用领域具有极大的应用价值。
本发明还提供了所述巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养方法，将生长至对数生长期的巴伦式芽孢杆菌TZ-1种子液，按3％～5％的接种体积接种至发酵培养基中，在40～50℃下培养56～64h。
优选地，所述巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养温度为45℃，培养时间为60h。
优选地，所述巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养方法还包括培养pH为7.0～8.0。
优选地，所述巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养方法还包括在180～220r/min的条件下进行摇培。
优选地，每升所述发酵培养基中包括以下组分：葡萄糖5g，蛋白胨2g，尿素6g，三水磷酸氢二钾1g，硫酸铵1g，七水硫酸镁0.5g，三丁酸甘油酯10mL。
上述优选的培养方法可以进一步提高巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的繁殖速度和产脂肪酶效率。
本发明还提供了所述巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1在制备脂肪酶中的应用。本发明提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1具有高温条件下正常生长及合成高活性脂肪酶的能力，可日后作为微生物菌种资源应用于污泥、餐厨垃圾等固体废弃物资源化利用领域。
本发明还提供了由巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1产生的脂肪酶。将本发明提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1种子液以4％的接种体积接种到发酵培养基中，在45℃下培养至48h时，经检测发酵液中脂肪酶酶活可达17.31U/ml。
本发明还提供了利用所述的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1生产脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1接种到LB液体培养基中进行培养，制备成种子液；
步骤二、将所述种子液接种到发酵培养基中在40～50℃进行培养，得发酵液，所述发酵液中含有所述脂肪酶。
优选地，步骤二中，每升所述发酵培养基中包括以下组分：葡萄糖5g，蛋白胨2g，尿素6g，三水磷酸氢二钾1g，硫酸铵1g，七水硫酸镁0.5g，三丁酸甘油酯10mL。
本发明提供的生产脂肪酶方法简单、高效，将本发明提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1种子液分别接种到发酵培养基、油脂降解能力测定培养基中进行培养，经检测得到脂肪酶酶活可达到17.31U/ml，油脂降解率可达到87.19％，表明本发明生产方法制备得到的脂肪酶酶活高，而且具有优异的油脂降解率，在污泥、餐厨垃圾等固体废弃物资源化利用领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的生长曲线；
图2为实施例1提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的菌落形态图；
图3为实施例1提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的菌株扫描电镜图；
图4为实施例1提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1基于16S rDNA序列构建的系统发育树；
图5为实施例2和3提供的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1在摇瓶水平发酵过程脂肪酶活力、油脂降解率变化曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例所用培养基的配方及配制方法如下：
初筛罗丹明B培养基：取硫酸铵0.5g，氯化钠4g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，琼脂粉15g，三丁酸甘油酯乳化液100ml(4％PVA：三丁酸甘油酯＝3:1，超声乳化)，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min后，待温度降至60℃时加入1ml罗丹明B溶液(质量浓度<10mg/mL)，混匀后倒平板；
LB培养基：取蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min；
发酵培养基：取葡萄糖5g，蛋白胨2g，尿素6g，三水磷酸氢二钾1g，硫酸铵1g，七水硫酸镁0.5g，三丁酸甘油酯10mL，用蒸馏水定容至1L，115℃灭菌15min；
油脂降解能力测定培养基：取大豆油10g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硫酸铵1g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠5g，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。
实施例1
菌株的筛选和鉴定
1.1菌株的筛选
采集样品：在牛粪好氧堆肥后的堆肥基质中深度0.5m取样；
样品预处理：取上述样品10g，加入到装有90mL无菌水的无菌三角瓶中，封口膜密封后，150r/min摇床上摇动20min，静置10min后取悬浮液得到菌悬液，备用；
梯度稀释：利用无菌水对上述菌悬液进行10倍梯度稀释，得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的菌悬液。
平板涂布：在超净操作台中，分别取10-3、10-4和10-5的菌悬液0.1mL滴加到初筛罗丹明B培养基上，进行平板涂布分离，并将接种好的培养基50℃倒置培养48～60h。
选定菌种：罗丹明B能与脂肪酶降解油脂产生的脂肪酸特异结合，产酶菌落周围会生成玫红色，在波长365mm紫外灯下呈橙黄色。筛选挑取橙黄色圈较大的菌株于50℃培养基上进行划线纯化，并保存备用。
1.2菌株的生长特性及鉴定
菌株生长特性：
将1.1所得菌株分别接种到pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB培养基，50℃，180r/min，摇床培养24h，测定在600nm处的OD值，得到该菌株生长的pH范围为7.0～8.0，最适合生长的pH为7.5。
将1.1所得菌株接种到pH为7.5的LB培养基，温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的不同条件下，180r/min，摇床培养24h，测定在600nm处OD值，得到该菌株生长的温度范围为40～50℃，最适合生长的温度为45℃。
将1.1所得菌株接种到pH为7.5的LB培养基，摇床转速设置150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min、210r/min、220r/min，在45℃摇床培养24h，测定在600nm处OD值，得到该菌株生长的摇床转速范围为180～220r/min，最适摇床转速为200r/min。
生长曲线测定：将1.1所得菌株接种在pH为7.5的LB培养基，45℃，200r/min摇床培养48h，每隔2h取培养基，测定在600nm处OD值，绘制生长曲线，如图1所示。
形态学鉴定：1.1所得菌株在LB琼脂培养基上培养24h后，菌落呈圆形扁平且边缘整齐，白色不透明，表面粗糙褶皱，直径1.5～2.0mm，如图2所示。革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态和排列呈长杆状，产芽孢、有鞭毛，无荚膜，如图3所示。
生物学鉴定：细菌基因组DNA采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取，采用细菌16S rDNA通过引物27F和1492R进行PCR扩增，将PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果显示所述的16S rDNA序列长度为1448bP，具体序列如SEQIDNO:1所示。
其中，PCR反应体系(25μL)如下：
试剂 体积(μL)
10X PCR Buffer 2.5
dNTP(each 10mM) 0.25
Taq Plus DNA Polymerase(5U/μl) 0.25
50mM MgSO4 9.5
引物27F(10μM) 1
引物1492R(10μM) 1
Template(DNA) 1
ddH2O 9.5
上游引物的27F的序列为：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQIDNO:2)
下游引物的1492R的序列为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQIDNO:3)
PCR扩增的条件为：
通过BLAST工具将扩增序列结果在NCBI网站上进行同源性比对分析，数据库比较分析发现，其16S rRNA序列与巴伦氏类芽孢杆菌Paenibacillusbarengoltzii的同源性高达99.72％，同时基于16S rRNA序列构建的系统发育树，如图4所示，通过BLAST比对和系统发育树构建可知，上述分离所得的菌株在分类上属于巴伦氏类芽孢杆菌，因此将其命名为巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1(Paenibacillusbarengoltzii TZ-1)，于2021年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23696，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
利用实施例1筛选得到的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1生产脂肪酶并测定酶活力测定。
2.1生产脂肪酶的方法包括以下步骤：
步骤一、将巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1接种到LB液体培养基中，45℃、200r/min摇床中培养24h，制备成种子液。
步骤二、将种子液以4％接种量加入到发酵培养基中，45℃、200r/min摇床培养60h，制备成发酵液。
步骤三、将发酵液在4℃、5500r/min条件下离心15min去除菌体，取上清液过0.22μm滤膜过滤，收集得到含有脂肪酶的粗酶液。
2.2脂肪酶活力的测定方法
根据《GBT23535-2009》采用动态滴定法测定脂肪酶活力，脂肪酶水解甘油三酯生成脂肪酸，使反应体系的pH不断下降，通过连续加入碱的方法保持反应体系的pH恒定，碱滴定的速率与酶活力成比例。脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示，定义为1mL液体酶，在一定温度和pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
标准曲线：称取0.0001g的已知活力酶标准品，用甘氨酸缓冲液(0，75g/L)溶解并稀释，制成标准储备液(20U/mL)。分别吸取1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL、15.00mL、20.00mL标准储备液于100mL比色管中，用水定容至100mL。随样品一同在滴定仪上进行滴定，以标准品酶活力为横坐标，滴定反应的平均斜率(mL/min)为纵坐标，绘制标准曲线。
每隔12h采用2.2的测定方法测定2.1中发酵液的脂肪酶含量，结果显示，在发酵0h、12h、24h、36h时，酶活力分别为0U/ml、3.69U/ml、6.74U/ml、13.83U/ml，48h时，脂肪酶酶活为17.31U/ml，如图5所示。
实施例3
测定实施例1筛选得到的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的油脂降解率。
参考水质中《HJ 637-2018》油脂的测定方法，其规定了用红外分光光度法测定其油脂含量。本实施例用四氯乙烯萃取油脂降解能力测定培养基中油脂，用红外分光光度计进行测定，通过计算得到油脂降解率。具体操作如下：
萃取液制备：以5％接种量将种子液加入到油脂降解能力测定培养基中，45℃、200r/min摇床中培养72h。从中取250mL加入1+1盐酸溶液酸化至pH≤2，并量取四氯乙烯25mL，全部转移至500mL聚四氟乙烯旋塞的分液玻璃漏斗，充分震荡2min，排气，静置分层。取玻璃棉置于玻璃漏斗，并将适量无水硫酸钠铺于上面，使下层有机相萃取液通过玻璃漏斗放至25mL比色管中，用四氯乙烯润洗定容至刻度。
将萃取液转移至4cm带盖石英比色皿，以四氯乙烯作参比，采用红外分光光度计在2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1处测量吸光度。
通过计算，巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1在以10g/L大豆油为唯一碳源和能源的培养基中连续培养发酵48h时，油脂降解率为87.19％，如图5所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北科技大学
<120> 一种巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> Paenibacillus barengoltzii
<400> 1
catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggagtttatc 60
gggagcttgc tcctgataaa cttagcggcg gacgggtgag taacacgtag gcaacctgcc 120
cgtaagactg ggataactac cggaaacggt agctaatacc ggatacgcaa gtctctcgca 180
tgaggggctt gggaaaggcg gagcaatctg tcacttacgg atgggcctgc ggcgcattag 240
ctagttggtg gggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgaa 300
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cttcgggaca ggggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg actttagttg ccagcaagta aggctgggca 1140
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ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga agcgaaggag 1260
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gcatgaagtc ggaattgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1380
gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttacaa cacccgaagt cggtgaggta 1440
accgcaag 1448

Claims (7)

1.一种巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1，其分类名称为巴伦氏类芽孢杆菌（Paenibacillus barengoltzii），其保藏编号为CGMCC No.23696。
2.权利要求1所述的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养方法，其特征在于，将生长至对数生长期的权利要求1所述的巴伦式芽孢杆菌TZ-1的种子液，按3%~5%的接种体积接种至发酵培养基中，在40~50℃下培养56~64h。
3.如权利要求2所述的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养方法，其特征在于，还包括培养pH为7.0~8.0。
4.如权利要求2所述的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养方法，其特征在于，还包括在180~220r/min的条件下进行摇培。
5.如权利要求2所述的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1的培养方法，其特征在于，每升所述发酵培养基中包括以下组分：葡萄糖5g，蛋白胨2g，尿素6g，三水磷酸氢二钾1g，硫酸铵1g，七水硫酸镁0.5g，三丁酸甘油酯10mL。
6.权利要求1所述的巴伦氏类芽孢杆菌TZ-1在制备脂肪酶中的应用。
7.一种脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将权利要求1所述的巴伦氏类芽孢杆菌 TZ-1接种到LB液体培养基中进行培养，制备成种子液；
步骤二、将所述种子液接种到发酵培养基中在40~50℃进行培养，得发酵液，所述发酵液中含有所述脂肪酶。
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