CN111172082A - 一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株sg-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株SG‑1及其应用，属于微生物技术领域，所述产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus altitudinis)SG‑1，的保藏编号为GDMCC NO：60909；所述枯草芽孢杆菌菌株SG‑1不仅能够产碱性木聚糖酶，降解木聚糖，并且具有较强的耐碱性，在pH为11时所述枯草芽孢杆菌菌株SG‑1的酶活性达到最强。

Description

一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株SG-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株SG-1及其应用。

背景技术

近年来木聚糖酶在工业上的应用价值越来越大，引起了人们的广泛注意，其中碱性木聚糖酶是在碱性条件下具有较高酶活的木聚糖酶，碱性木聚糖酶最主要是应用于纸浆和造纸企业。碱性木聚糖酶在造纸行业中的应用包括：制浆、协助漂白、改纤维性质、废纸脱墨等方面。造纸常规漂白是采用次氯酸盐法，该方法向环境中排放大量的氯气，污染环境，采用碱性木聚糖酶代替次氯酸的漂白，环境友好。

能够产生木聚糖酶的微生物种类较多，主要是细菌产生，真菌也能产生但较少。不同来源的木聚糖酶的最适pH不一样，真菌则接近于酸性，大部分放线菌和细菌接近于中性，现有的产碱性木聚糖酶的菌株主要包括短小芽孢杆菌；这限制了碱性木聚糖酶在工业中高碱性环境下的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株SG-1及其应用，所述枯草芽孢杆菌菌株SG-1不仅能够产碱性木聚糖酶，降解木聚糖，并且具有较强的耐碱性，在pH为11时所述枯草芽孢杆菌菌株SG-1的酶活性达到最强。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillusaltitudinis)SG-1，其保藏编号为GDMCC NO：60909；。

本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌菌株SG-1在发酵生产碱性木聚糖酶中的应用。

优选的，所述发酵的pH值为8～11.5。

优选的，所述发酵的pH值为10.5～11。

优选的，所述发酵的初始接种量为3％～10％。

优选的，所述发酵的温度为35～40℃。

优选的，所述发酵的时间为2～5d。

优选的，所述发酵的转速为150～200rpm。

优选的，所述发酵的培养基，以1L计，包括以下组分KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母膏5g，木聚糖5g和余量的蒸馏水。

本发明的有益效果：本发明提供的产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株SG-1不仅能够产碱性木聚糖酶，降解木聚糖，并且具有较强的耐碱性，在pH为11时所述枯草芽孢杆菌菌株SG-1的酶活性达到最强，适于工业应用。

生物保藏说明

本发明涉及的产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus altitudinis SG-1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60909，保藏日期为2019年11月28日，保藏地址为中国广州先烈中路100号广东省微生物研究所实验大楼5楼。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌菌株SG-1的系统发育树；

图2为枯草芽孢杆菌菌株SG-1在刚果红培养基上的水解效果；

图3为枯草芽孢杆菌菌株SG-1发酵时间对酶活的影响；

图4为枯草芽孢杆菌菌株SG-1发酵初始pH值对酶活的影响；

图5为枯草芽孢杆菌菌株SG-1发酵温度对酶活的影响；

具体实施方式

本发明提供了一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillusaltitudinis)SG-1，其保藏编号为GDMCC NO：60909。

在本发明中，所述枯草芽孢杆菌菌株SG-1为从烟草废弃物中筛选获得的菌株。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌菌株SG-1的系统发育树如图1所示。本发明对所述筛选方法没有特殊限定，采用本领域常规的产碱性木聚糖酶菌株筛选方法即可。

在本发明中，以烟草秸秆为筛选原料，优选的将所述烟草秸秆自然晾干粉碎、过筛和干燥获得筛选原料。在本发明中，所述粉碎包括依次进行的剪碎和高速万能粉碎机粉碎；所述过筛的筛网孔径目数优选为60目；本发明在所述过筛后，收集晒下组分进行干燥，所述干燥优选为烘干，所述烘干的温度优选为75～85℃，更优选为80℃。

在本发明中，将所述筛选原料与水混合后，涂布至初筛培养基中进行筛选培养、分离纯化和酶活测定获得所述枯草芽孢杆菌菌株SG-1。在本发明中，所述筛选原料与水的质量比优选为1:99；所述筛选培养的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述筛选培养的时间优选为2d。在本发明中，所述初筛培养基，以1L计，优选的包括以下组成：KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，木聚糖2g，琼脂18g，余量的蒸馏水1000mL；所述初筛培养基的pH值优选为自然pH值，所述初筛培养基在使用前优选的121℃灭菌20min。

在本发明中，所述分离纯化优选的采用本领域常规的菌株分离纯化方法即可，在本发明具体实施过程中，采用平板划线的方法进行分离纯化。

在本发明中，所述酶活测定优选的采用刚果红平板定性筛选和DNS法进行定量筛选。本发明对所述刚果红平板定性筛选和DNS法进行定量筛选具体的方法没有特殊限定，采用本领域常规的刚果红平板和DNS法进行。

本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌菌株SG-1在发酵生产碱性木聚糖酶中的应用。

在本发明中，将所述枯草芽孢杆菌菌株SG-1接种于种子培养基中活化后进行发酵培养获得碱性木聚糖酶。

在本发明中，所述种子培养基，以1L计，优选的包括以下组成：蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母膏5g和余量的蒸馏水。在本发明中，所述活化培养的温度优选为35～40℃，更优选为37℃，所述活化培养的时间优选为20～28h，更优选为24h。在本发明中，所述活化培养的转速优选为150～200rpm，更优选为170rpm。在本发明中，所述活化培养后的种子液的OD₆₀₀优选为1.4～1.8，更优选为1.6。

在本发明中，所述发酵的培养基，以1L计，优选的包括以下组分：KH₂PO₄ 1～1.5g，(NH₄)₂SO₄ 2～5g，MgSO₄·7H₂O 0.4～0.5g，酵母膏5～5.5g，木聚糖5g和余量的蒸馏水。在本发明中，发酵的初始pH值优选为8～11.5，更优选为10.5～11。在本发明中，所述发酵的初始接种量(以体积百分比计)优选为3％～10％，更优选为5％。在本发明中，所述发酵的温度优选为35～40℃，更优选为37℃，所述发酵的时间优选为2～5d，更优选为3d。在本发明中，所述发酵的转速优选为150～200rpm，更优选为170rpm。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

烟草秸秆样品：从安徽境内烟叶产区采集烟草秸秆，自然晾干后剪碎，用高速万能粉碎机粉碎，粉碎后的烟杆粉末过60目筛后置于80℃烘干至恒重，将其保存到自封袋中备用。

常用培养基及配置方法

初筛培养基配制(以1L计)：KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl0.5g，木聚糖2g，琼脂18g，蒸馏水补足1000mL，PH值自然，121℃灭菌20min。

LB液体培养基(以1L计)：蛋白胨10g，酵母菌膏5g，NaCl 10g，蒸馏水补足1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min。

LB固体培养基(以1L计)：蛋白胨10g，酵母菌膏5g，琼脂18g，NaCl10g，蒸馏水补足1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min。

种子培养基(以1L计)：蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母膏5g，蒸馏水补足1000mL。

产酶培养基(以1L计)：KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母膏5g，木聚糖5g，蒸馏水补足1000mL。

木聚糖产生菌的筛选及保存

富集

烟草秸杆样品处理：称取烟草秸杆样品1g到灭菌的试管中，然后加99mL灭菌的去离子水，震荡充分。

用移液枪吸取200μL烟草秸杆样品，在初筛培养基进行涂布培养，将平板置于37℃培养箱中，倒置，培养2d。

分离纯化

取两个灭菌后的锥形瓶、酒精灯、培养皿放入超净工作台中打开紫外灯照射20min后关闭，用75％的酒精清洗双手迅速放入超净工作台中将LB培养基倒入培养皿中厚度约为培养皿高度的一半，再打开紫外灯照射20min后关闭，冷却凝固，备用。

平板划线：待凝固完全后，用接种环挑取初筛培养基中的单菌落，划线，将平板置于37℃培养箱中，倒置，培养1d，并做好记录。

种子培养液的制备

挑取一环纯化后菌株接种到50mL(250mL三角瓶)种子培养基中，置于恒温振荡器中37℃、170rpm培养24h，即得种子培养液。

发酵液的制备

吸取5mL种子培养液至100mL(250mL三角瓶)产酶培养基中，于37℃、170rpm恒温振荡培养，即得发酵液。测定发酵液中木聚糖酶的酶活(做3组平行实验)，筛选活性最高的菌株命名为枯草芽孢杆菌菌株SG-1。

甘油保种

将30％的甘油和1.5mL的离心管(50个)放入高压灭菌锅中121.0℃，灭菌20min。在无菌超净工作台中取500μL的30％甘油和500μL的菌液(灭菌的30％甘油按菌液：甘油＝1:1)放入1.5mL的离心管中，充分混匀后，-70℃保藏。

16SrDNA鉴定

按照上海生工细菌基因组DNA快速提取试剂盒所述提取方法进行提取。

采用16SrDNA细菌通用引物1492R，27F进行扩增。

上游引物：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO.1)；

下游引物：1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO.2)。

表1 PCR反应体系

PCR反应条件：94℃变性5min；94变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃保温10min。PCR产物回收，由上海生工进行16SrDNA测序。测序结果如下：

>16S-SG-1基因序列(SEQ ID NO.3)

CGGAACCTGGCGGGCCTGCCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGTGCCAAGGGG

根据细菌16SrDNA测序对菌株SG-1进行PCR扩增后，得到一条大小为1.5kb条带，与预期结果大小基本相同。

构建系统发育树如图1所示。

实施例2

枯草芽孢杆菌菌株SG-1活性测定

主要试剂

木聚糖酶活测定所需试剂

刚果红溶液(1mg/mL)：称取刚果红1g，定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。

氯化钠溶液(1mol/L)：称取氯化钠58.5g，定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。

缓冲溶液：

柠檬酸：称取柠檬酸10.507g，定容至500mL的容量瓶中。

磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠35.81g，定容至500mL的容量瓶中。

将0.2mol/L的碳酸氢二钠9.86mL加入0.1mol/L的柠檬酸10.14mL配制缓冲溶液。

1％的木聚糖溶液：称取1g木聚糖用100mL的PH＝4.8的缓冲溶液定容。

DNS试剂：称取6.3g 3,5—二硝基水杨酸，21.0g NaOH于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解，以及500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，再加入5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，最后定容至1000mL，装入棕色试剂瓶中，保存一星期稳定后备用。

试验过程：

用接种环挑选单菌落接种在初筛培养基中培养三天后，用1mg/L刚果红染色15min，倾去染液，再加入1mol/L的氯化钠溶液漂洗，15min后倒掉氯化钠溶液，测透明圈直径与菌落直径，通过透明圈的直径比值的大小比较菌株半纤维素降解能力的强弱。

实验结果：

木聚糖降解能力测定

(1)平板定性测定结果见图2和表2。

表2 菌株SG-1在刚果红培养基上的水解效果

菌株SG-1可在初筛培养基上生长，经刚果红染色后产生明显的降解木聚糖酶的透明圈，结果见图1，培养3d后降解圈直径与菌落直径的比值较大，达到7.50±0.35。

DNS法测定木聚糖酶的酶活采用

吸取稀释的发酵液(稀释后的OD₆₀₀在1.6～1.8之间)0.5mL，加到1.5mL用pH值为4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的1％木聚糖溶液中，50℃酶解30min；加入3mL DNS试剂，沸水浴中加热5min；用冰水浴迅速冷却，蒸馏水定容至25mL，540nm处测其吸光度。以高压锅灭活的发酵液作对照。

测定不同发酵时间、不同发酵初始pH值、不同发酵温度的酶活。

发酵时间

吸取菌悬液5mL接种于l00mL发酵产酶培养基中，于37℃、170r.min-¹条件下摇床振荡培养3d，发酵7d，每隔ld测一次酶活。

发酵初始pH

吸取菌悬液5mL接种于l00mL发酵产酶培养基中，调节发酵产酶培养基初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、11.5、12.0在37℃、170rpm条件下摇床振荡培养3d，测定酶活。

发酵温度

将菌液按5mL接种量接种于100mL发酵产酶培养基中，在初始pH值为11.0的条件下，分别在28℃、37℃、45℃、50℃、55℃发酵60h，测定酶活。

结果如图3～图5，由图3可知，随着发酵液发酵的天数，菌株产酶活性呈现先上升后下降的变化趋势，菌株在第三天时酶活性为100％；由图4可知随pH值的增大，菌株产酶活性呈现先上升后降低的趋势，菌株在pH值为11时酶活性最大为100％，在pH＝6～8之间酶活较稳定；其次由图5看出，随着发酵液温度增加，菌株产酶活性呈现先上升后下降并最终趋于平衡的变化趋势，菌株在37℃时酶活性最大为100％，即最适温度为37℃。

木聚糖酶的纯化

挑取一环纯化后的菌株SG-1放入液体LB培养基中，37℃、170rpm条件下恒温振荡过夜培养，将过夜培养的菌液于4℃备用。利用硫酸铵将粗酶液进行沉淀，经相对分子质量1.0×10⁴的透析袋在Na₂HPO₄-Na H₂PO₄缓冲液(0.2mmol/L，pH 4.8)中低温透析，再用DEAE-SepharoseFF离子交换层析，进行分管收集，最后采用SDS-PAGE进行木聚糖酶提纯。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 阜阳师范大学

<120> 一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株SG-1及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1460

<212> DNA

<213> Bacillus altitudinis

<400> 3

cggaacctgg cgggcctgcc ctaatacatg caagtcgagc ggacagaagg gagcttgctc 60

ccggatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120

aactccggga aaccggagct aataccggat agttccttga accgcatggt tcaaggatga 180

aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240

aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360

aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420

ttagggaaga acaagtgcaa gagtaactgc ttgcaccttg acggtaccta accagaaagc 480

cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat 540

tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca 600

accggggagg gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca 660

cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg 720

gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt 780

agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca 840

gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 900

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960

ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg gctttccctt cggggacaga 1020

gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080

aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcatttagtt gggcactcta aggtgactgc 1140

cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200

gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggctgcga gaccgcaagg tttagccaat 1260

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cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380

cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tatggagcca 1440

gccgccgaag tgccaagggg 1460

Claims (9)

1.一株产碱性木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus altitudinis)SG-1，其特征在于，其保藏编号为GDMCC NO：60909；。

2.权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌菌株SG-1在发酵生产碱性木聚糖酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵的pH值为8～11.5。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵的pH值为10.5～11。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述发酵的初始接种量为3％～10％。

6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为35～40℃。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵的时间为2～5d。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵的转速为150～200rpm。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵的培养基，以1L计，包括以下组分KH₂PO₄1～1.5g，(NH₄)₂SO₄2～5g，MgSO₄·7H₂O 0.4～0.5g，酵母膏5～5.5g，木聚糖5g和余量的蒸馏水。

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