CN108473994A

CN108473994A - 来自芽孢杆菌的经修饰的双向过氧化氢酶启动子

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Publication number: CN108473994A
Application number: CN201680071561.8A
Authority: CN
Inventors: M·F·菲勒; S·耶内维因; K·哈格; H·哈特曼
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2036-12-08
Also published as: WO2017102523A1; CA3006593A1; EP3390639A1; CN108473994B; US20190112612A1; JP2018537130A; BR112018011896A2; MX2018007325A; US11788094B2; KR20180086206A

Abstract

本发明大体涉及发酵技术领域和可用于这种发酵的微生物。本发明还涉及包含可用于改变微生物发酵特征的核酸和蛋白质的材料，并涉及包含此类核酸和/或蛋白质的微生物。

Description

来自芽孢杆菌的经修饰的双向过氧化氢酶启动子

技术领域

本发明大体涉及发酵技术的领域和可用于这种发酵的微生物。本发明还涉及包含可用于改变微生物发酵特征的核酸和蛋白质的材料，并涉及包含此类核酸和/或蛋白质的微生物。具体而言，本发明涉及用于赋予、修饰或减少针对氧化胁迫的微生物胁迫抗性的材料和方法。

背景技术

目的物质的生物技术生产在工业规模上通常通过在液体培养基中培养微生物来进行，其中所述微生物能够在培养条件下生产所述目的物质。在这种液体发酵过程中，单个微生物细胞经历的条件随时间而发生巨大且以复杂方式的变化。响应于这种变化的条件，微生物细胞可能通过改变基因表达来反应，这继而可能导致目的物质的不期望的低产量。相应地需要提供具有针对不利发酵条件的改善的恢复力，从而与可比较的微生物相比，允许增加目的物质的产生的微生物。

因此经常尝试确定发酵过程中的胁迫条件并修饰微生物的基因组成以改善它们对这种胁迫条件的恢复力。遗憾的是，个体微生物细胞经历的发酵条件的分析及其对这种条件的遗传反应是非常困难的。Wiegand等人(Fermentation stage-dependentadaptations of Bacillus licheniformis during enzyme production；Microbial CellFactories 2013,12:120)尝试了这种分析。然而，对发酵条件的理解仍然大部分不完整。

虽然Wiegand等人报道了在枯草杆菌蛋白酶的液体发酵生产过程中，在地衣芽孢杆菌中未观察到随时间推移的营养过氧化氢酶(KatA)蛋白积累，本发明人令人惊奇地发现增加的过氧化氢酶活性改善了例如蛋白酶的液体发酵生产中例如地衣芽孢杆菌的整体发酵特性。这是更令人惊奇的，因为根据Wiegand等人的说法，在这种发酵的基本上所有阶段，O2分压(pO2)严重降低。因此，不期望作为主要胁迫物的过氧化氢的形成。

因此，本发明的目的是提供用于改善发酵的材料和方法。本发明的另一个目的是提供用于赋予、修饰或减少针对氧化胁迫的微生物胁迫抗性的材料和方法。

发明内容

因此，本发明提供了包含通过接头部分彼此分开的-10型盒和-35型盒的启动子，其中每个盒由各自的核苷酸序列组成，所述盒具有通过对于-10型盒根据表1且对于-35型盒根据表2在每个位置给每个核苷酸赋值所获得的各自的得分，并且其中-10型盒的得分至少为471，而-35型盒的得分至少为159，并且其中接头部分具有至少14个核苷酸的长度和至少57％的A/T含量。

表1：

表2

本发明的启动子优选是双向启动子。

本发明还提供了包含根据本发明的启动子的核酸和包含所述核酸的原核宿主细胞。

本发明还提供了用于生产发酵产物的发酵方法，包括以下步骤

a)提供原核宿主细胞，其包含与编码发酵产物的基因有效连接的包含根据本发明的启动子的核酸，和

b)在允许所述编码发酵产物的基因表达的条件下培养原核宿主细胞。

a)提供包含含有与编码过氧化氢酶的基因有效连接的本发明启动子的核酸的原核宿主细胞，和

b)在允许所述编码过氧化氢酶的基因表达的条件下培养原核宿主细胞。

a)提供包含含有本发明双向启动子的核酸的原核宿主细胞，所述核酸在一条链上有效连接至编码发酵产物的基因并且同时在反向链上有效连接至编码过氧化氢酶的基因，和

b)在允许所述编码发酵产物的基因和所述编码过氧化氢酶的基因表达的条件下培养原核宿主。

本发明还提供了在原核宿主细胞中增加过氧化氢酶表达和/或过氧化氢酶活性的方法，包括将根据本发明的启动子有效连接编码过氧化氢酶的基因的步骤。

附图简述

图1示出了地衣芽孢杆菌的野生型KatA启动子与本发明的优选启动子的比对。

图2示出了具有野生型启动子和根据本发明的启动子的地衣芽孢杆菌中的KatA和KatX基因的基因表达特征。

图3示出了野生型地衣芽孢杆菌(标记为“WT”)和地衣芽孢杆菌(其中KatA基因的启动子已被图1中描绘的根据本发明的优选启动子替代)(标记为“突变体”)中总过氧化氢酶活性的比较。

图4示出了野生型地衣芽孢杆菌中KatA/KatX启动子的组织。

图5示出了启动子序列SEQ ID NO.1(不是根据本发明)和SEQ ID NO.56-71的序列比对。只表示出SEQ ID NO.1的完整序列。对于所有其他序列，点表示在相应的位置与SEQID NO.1中相同的核苷酸，拼出了在相应的位置不同于SEQ ID NO.1的核苷酸。例如，SEQ IDNO.71与SEQ ID NO.1有5个核苷酸不同。

图6示出了启动子序列SEQ ID NO.2(不是根据本发明)和SEQ ID NO72-87的序列比对。只表示出SEQ ID NO.2的完整序列。对于所有其他序列，点表示在相应的位置与SEQID NO.2中相同的核苷酸，拼出了在相应的位置不同于SEQ ID NO.2的核苷酸。例如，SEQ IDNO.87与SEQ ID NO.2有5个核苷酸不同。

发明详述

本发明特别涉及下文所述的原核宿主细胞的启动子。本发明的启动子包含通过接头部分相互分离的-10型盒和-35型盒。这种通用启动子结构对于原核细胞是常见的，并且已经由例如Jarmer等人，Microbiology 2001，2417-2424进行了分析。

举例来说，本发明人现令人惊奇地发现，通过改变连接所述启动子的-10型盒和-35型盒的接头部分的长度，可以显著提高与地衣芽孢杆菌KatA基因的启动子有效连接的基因的表达。这特别令人惊奇，因为地衣芽孢杆菌中的启动子与指导KatX基因表达的启动子在反向(“负”)链上重叠，如图4所示。因此，KatA启动子核苷酸序列的任何改变都带来了减少或消除所述KatX过氧化氢酶的表达的风险，由此潜在地降低地衣芽孢杆菌中总体过氧化氢酶的表达，这将对发酵特性，特别是通过在发酵中使用所述芽孢杆菌属通常可获得的期望的发酵产物的产量具有不希望的影响。

本发明的启动子通常属于σ-A依赖启动子的类别。正如Jarmer等人所描述的，这样的启动子包含两个或多或少保守的核苷酸序列基序，也称为“盒”，它们是RNA聚合酶启动转录所需的。尽管细菌基因组和例如枯草芽孢杆菌的基因组已经完全且重复测序，但这些细菌中的基因数量和相应的启动子数量仍然难以捉摸。通常也不可能可靠地预测核苷酸序列是否在给定的宿主细胞中起到σ-A型启动子的功能。本发明为克服或减轻这种不可预测性提供了指导。

根据本发明，-10型盒和-35型盒各由具有相应得分的各自核苷酸序列组成。通过在5'到3'方向上没有任何空位地给每个位置上的每个核苷酸赋值可获得得分。对于-10型盒的核苷酸序列，根据表1选择值，而对于-35型盒，根据表2选择值。-10型盒的得分至少为497，并且-35型盒的得分至少为170。因此，鉴于-10型盒和-35型盒的相应核苷酸序列考虑到期望的或可容忍的启动子可变性，本发明的启动子允许有限的灵活性而通常不会降低所述启动子的表达强度。

本领域技术人员理解，根据本发明的启动子的-10型盒比例如枯草芽孢杆菌启动子的常规-10型盒长。这种扩展的-10型盒已经由Helmann描述为枯草芽孢杆菌启动子(Nucleic Acids Research，1995，2351至2360)。然而，该作者已经确定扩展的-10型盒的出现或不出现与接头部分的长度之间没有明显的相关性。因此令人惊奇的是，通过增加接头部分的长度，可以显著增加与根据本发明启动子有效连接的基因的表达。必须预期，本发明首先实施的启动子不会受益于接头部分长度的任何改变，因为该启动子指导地衣芽孢杆菌的组成型过氧化氢酶的表达，对于这种微生物在氧胁迫条件下存活至关重要。因此，必须期望这种启动子已经通过进化到其最大表达强度而被优化。与这些担忧相反，发明人已经表明，即使是指导地衣芽孢杆菌KatA基因表达的启动子，也能从根据本发明所述的接头部分的增加的长度中受益。

接头部分与-10型盒和-35型盒相邻并连接。根据本发明，接头部分具有至少14个核苷酸的长度和至少73％的A/T含量。与相应的启动子相比，这种长度的接头允许增加基因表达，其中接头部分具有仅13个核苷酸的长度。

优选地，接头部分的核苷酸序列与序列SEQ ID NO.3-18中任一个差异在于在所述各个序列的任何核苷酸位置1至5之前插入一个或多个胸苷和/或腺苷核苷。这样，可以保持或甚至增加接头部分所需的A/T含量，促进从本发明启动子的基因表达的增加。特别优选的是，接头部分的核苷酸序列与前述序列SEQ ID NO.3-18中任一个差异在于在任何核苷酸位置1至5之前插入一个或多个胸苷核苷。此外，优选的是接头部分按5'至3'方向计数在接头部分的前5个和最后3个核苷酸内不包含鸟苷或胞苷核苷。

还优选地，接头部分的核苷酸序列与序列SEQ ID NO.3-18中的任一个差异在于在所述各个序列的最后一个核苷酸位置之前或之后紧接插入一个或多个胸苷和/或腺苷核苷酸。这样，接头部分所需的A/T含量也可以保持或甚至增加。在本发明的启动子是如本文所述的包含在负链上的-35型盒的双向启动子的情况下，在接头部分的末端(即“正链”接头部分)的腺苷和/或胸苷核苷的插入允许增加所述接头部分的长度而不改变负链上的-10型盒和-35型盒的距离。

本发明启动子的接头部分优选具有至多18个核苷酸的长度。对于较长的接头部分，-10型盒和-35型盒之间的分离太大而不允许RNA转录的有效启动。优选地，接头部分具有14至16个核苷酸的长度，甚至更优选具有14或15个核苷酸的长度。对于这种接头长度，-10型盒和-35型盒之间的分离对于由σ-A型的原核RNA聚合酶启动RNA转录接近最佳的。最优选地，接头部分具有14个核苷酸的长度。

接头部分的A/T含量优选为至少57％，甚至更优选至少69％，甚至更优选至少71％，甚至更优选至少76％，甚至更优选至少77％，甚至更优选57％至92％，甚至更优选69％至92％，甚至更优选71％至92％，甚至更优选76％至92％，甚至更优选77％至92％，甚至更优选85％至92％，甚至更优选为57％至85％，甚至更优选69％至85％，甚至更优选71％至85％，甚至更优选76％至85％，甚至更优选77％至85％。甚至更优选地，A/T含量为88％，或者最优选77％。

在根据本发明的启动子中，-10型盒的核苷酸序列与序列SEQ ID NO.19至31中任一个差异至多一个核苷酸，并且甚至更优选选自序列SEQ ID NO.19至31。最优选地，-10型盒的核苷酸序列与序列SEQ ID NO.19差异至多一个核苷酸。或甚至更优选由序列SEQ IDNO.19组成。该序列在地衣芽孢杆菌KatA基因的野生型启动子序列中遇到并且显示出有效。

因此，-10型盒的得分优选为至少497，甚至更优选至少508，甚至更优选至少601，甚至更优选至少620，甚至更优选至少632，甚至更优选至少640，甚至更优选497至708，甚至更优选508至708，甚至更优选601至708，甚至更优选620至708，甚至更优选632至708，甚至更优选640至708，甚至更优选660至708，甚至更优选620至660，甚至更优选632至660，甚至更优选640至660。甚至更优选得分为508或最优选640。

此外，-35型盒的核苷酸序列优选与序列SEQ ID NO.32至41中任一个相差至多一个核苷酸，甚至更优选由序列SEQ ID NO.32至41中任一个组成。序列SEQ ID NO.32在地衣芽孢杆菌KatA野生型启动子中遇到。因此，优选的是-35型盒的核苷酸序列与该序列相差至多一个核苷酸，并且优选由该序列SEQ ID NO.32组成。

另外，-35型盒的得分优选为至少179，甚至更优选至少280，甚至更优选至少317，甚至更优选至少322，甚至更优选至少329，甚至更优选179至439，甚至更优选280至439，甚至更优选317至439，甚至更优选322至439，甚至更优选329至439，甚至更优选280至414，甚至更优选317至414，甚至更优选322至414，甚至更优选329至414，甚至更优选317至367，甚至更优选322至367，甚至更优选329至367。甚至更优选得分为322或最优选329。

启动子可变性的界限也可以用-35和-10型盒的得分之和来表示。这个参数解释如下观察：低得分-35型盒可以被较高得分-10型盒补偿，反之亦然。得分之和优选为至少826，甚至更优选至少830，甚至更优选至少931，甚至更优选至少960，甚至更优选至少969，甚至更优选826至1139，甚至更优选830至1139，甚至更优选931至1139，甚至更优选960至1139，甚至更优选969至1139，甚至更优选826至1043，甚至更优选830至1043，甚至更优选931至1043，甚至更优选960至1043，甚至更优选969至1043，甚至更优选830至998，甚至更优选931至998，甚至更优选960至998，甚至更优选969至998，甚至更优选830或最优选969。得分之和增加时，启动子核苷酸序列与地衣芽孢杆菌KatA野生型启动子的核苷酸序列的相似性增加。因此，本领域技术人员可以更确信所选择的启动子序列将起作用并且将允许实现本发明的益处。

相应地，-10型盒的核苷酸序列优选选自根据SEQ ID NO.19至22的序列并且同时-35型盒的核苷酸序列优选地选自根据SEQ ID NO.32至34的序列。

除了-10型盒、接头部分和-35型盒之外，本发明的启动子优选包含具有20个核苷酸长度的上游部分。上游部分位于-35型盒上游的5'方向并邻近-35型盒。上游部分的A/T含量至少为70％并且上游部分的A含量至少为35％。如此高的A/T含量特别有助于有效连接至启动子的基因的强表达。优选地，上游部分的A/T含量为至少77％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少87％，甚至更优选至少89％。进一步优选地，上游区域的A/T含量为至多100％，较少优选地，上游区域的A/T含量为至多95％，甚至较少优选地A/T含量为至多90％。相应地，上游部分优选地由完全由腺苷和胸苷核苷酸组成的核苷酸序列组成，较少优选地，上游部分包含不是腺苷或胸苷的1、2或3个核苷酸。在上游部分，既不是腺苷也不是胸苷的核苷酸优选彼此不相邻。进一步优选地，上游部分的核苷酸序列优选使得不连续重复的核苷酸数至多为10且至少为5，更优选为至多8且至少6。例如，根据SEQ ID NO.42的优选的上游部分序列在序列位置1、2、5、10、11、15、19和20处具有8个此类分离的核苷酸。对于序列SEQ ID NO.55，该数目会是11，并且分离的核苷酸的相应位置为1、2、3、4、7、12、13、17、18、19和20。通过考虑分离或非重复核苷酸的这些边界，确保了上游部分核苷酸序列将包含约5个区段的2个或更多个重复核苷酸，其中优选地至少4个是重复腺苷核苷酸的区段。这样的重复有利于RNA聚合酶的结合，并因此允许与本发明的启动子有效连接的基因的高表达。出于同样的原因，上游部分的A含量优选为至少45％，甚至更优选至少52％，甚至更优选至少60％。为了避免疑问，本发明的术语“A含量”意指相对于没有任何空位的总序列长度的腺苷核苷酸的数量，对于上游部分为20。相应地，术语“A/T含量”表示以总序列长度的百分比表示的腺苷或胸苷的核苷酸数目。优选的上游部分序列在本文中作为SEQ ID NO.42至55给出，其中根据SEQ ID NO.42的上游部分序列是最优选的。较少优选的是与根据SEQ IDNO.42的序列相差一个核苷酸的这种上游序列。甚至较少优选的是与序列SEQ ID NO.42相差2个核苷酸的上游部分的序列。甚至较少优选的是与序列SEQ ID NO.42相差3个核苷酸的上游序列。特别优选的上游序列是根据SEQ ID NO.43、44、45、46和47中的任一个的序列。

可选的但优选的是，在上游部分的5'方向上游延伸46个核苷酸的序列(“引入部分”)的A/T含量为至少70％。在根据SEQ ID NO.2的序列中，该46个核苷酸序列位于核苷酸56至101。

根据本发明的特别优选的启动子与根据SEQ ID NO.1的序列相差至多15个核苷酸，甚至更优选至多14个核苷酸，甚至更优选至多13个核苷酸，甚至更优选至多12个核苷酸，甚至更优选至多11个核苷酸，甚至更优选至多10个核苷酸，甚至更优选至多9个核苷酸，甚至更优选至多8个核苷酸，甚至更优选至多7个核苷酸，甚至更优选至多6个核苷酸，甚至更优选至多5个核苷酸，甚至更优选至多4个核苷酸，甚至更优选至多3个核苷酸，甚至更优选至多2个核苷酸，甚至更优选一个核苷酸，其中在每种情况下，一个这样的不同核苷酸是在位置70至85中任一个插入腺苷或胸苷核苷酸，优选地在根据SEQ ID NO.1的位置70至76中的任何位置。最优选地，插入的核苷酸是胸苷，使得SEQ ID NO.1或2的7个连续胸苷核苷酸的区段扩展成8个胸苷核苷酸的区段。这种序列的例子在本文中作为SEQ ID NO.56给出。如下面关于双向启动子所描述的，核苷酸也可以在接头部分的最后一个核苷酸之前或之后插入。如上所述，-10型盒、-35型盒和接头部分的核苷酸序列也可以变化，相应序列的例子在本文中作为SEQ ID NO.57至71给出。也如上所述，上游部分的序列和上游部分上游延伸46个核苷酸的序列也可以不同于序列SEQ ID NO.56至71的相应部分。根据本发明，由根据SEQ ID NO.56的核苷酸序列组成的启动子是特别优选的并且在实施例中进一步详细描述。同样优选的是可通过在根据SEQ ID NO.2的序列中用根据SEQ ID NO.56的序列替代根据SEQ ID NO.1的子序列可获得的启动子。

本发明的启动子优选是双向启动子。如本文所述，在mRNA转录机制的情境下，启动子控制RNA聚合酶与通常双链DNA的结合，从而启动mRNA转录并且位于启动子3'方向下游的基因序列转录成相应核苷酸序列的mRNA分子。由于DNA的双链，启动子可以位于DNA的任何链上。根据本发明，术语“双向启动子”用于表示重叠核苷酸序列的2个启动子的集合，其中一个启动子控制与其有效连接的基因在一条DNA链(也称为“正链”)上的mRNA转录和第二启动子控制与其有效连接并且位于相对链(也称为“反向链”或“负链”)上的第二基因的表达。除非在此特别指出，否则所有对启动子、序列、-10型盒、-35型盒、接头部分、上游部分等的引用都指正链。

双向启动子的实例是根据SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的核酸，它是地衣芽孢杆菌KatA和KatX基因的野生型启动子。在这些序列中，负链上启动子的-35盒落入如上所定义的正链的接头部分。因此，通过增加本发明的启动子中的(正链)接头部分的长度，也可以增加在反向链上的-35型盒和-10型盒之间的距离。由于RNA聚合酶对于-10型盒和-35型盒之间的距离的敏感性，必须预期这些盒之间的距离变化会导致在负链上的启动子的RNA转录强度的减小。然而，令人惊奇的是，这种负链启动子的转录效率的不希望的降低没有被观察到，或者至少不是非常强。

本发明的双向启动子的负链启动子还包含-10型盒、接头部分和-35型盒。上述对这些元件表示的限制不一定也适用于负链启动子的相应元件。然而，在本发明的优选实施方案中，关于-10型盒和-35型盒的定义和限制也适用于负链启动子的这些元件。因此，负链启动子的-10型盒的得分优选为至少497，甚至更优选至少508，甚至更优选497至708，甚至更优选508至708，甚至更优选497至660，甚至更优选508至660，并且负链启动子的-35型盒的得分优选为至少179，甚至更优选至少280，甚至更优选至少317，甚至更优选至少322，甚至更优选至少329，甚至更优选179至439，甚至更优选280至439，甚至更优选317至439，甚至更优选322至439，甚至更优选280至414，甚至更优选317至414，甚至更优选322至414，甚至更优选317至367，甚至更优选322至367。最优选地，负链启动子的-10和-35型盒的得分之和小于正链启动子的-10和-35型盒的得分之和。

还优选地，负链启动子的-35型盒位于正链启动子的接头部分内。这样，获得紧凑的短长度双向启动子，其中正链启动子和负链启动子之间的干扰最小，并因此具有关于正链和负链启动子的-35型盒和-10型盒的正确序列的灵活性。

优选地，负链上的10型盒与-35型盒之间的距离不会通过增加(正链)接头部分的长度而增加。这可以通过将一个或多个核苷酸插入到负链上的-35盒“后面”的接头部分中来实现，例如紧接在正链上的-10型盒和接头部分之间。这也可以通过在正链的上游部分中缺失等于或大于插入接头部分的核苷酸数量的多个核苷酸来实现。

本发明还提供了包含与靶基因有效连接的本发明启动子的核酸。如本文所述，术语“有效连接”表示基因序列位于启动子的-10型盒的3'方向上，使得RNA聚合酶可以启动各个DNA链的转录以产生包含各个基因序列的转录物的mRNA。通常，mRNA转录从起始密码子的5'方向开始；因此-10型盒和起始密码子由优选包含核糖体结合位点的核酸连接。对于本发明的启动子，上述-10型盒与起始密码子分开长度优选为20至50个核苷酸的核酸。对于来自序列SEQ ID NO.2的启动子，起始密码子可以紧邻最后一个核苷酸附接，使得-10型盒的最后一个核苷酸(在序列SEQ ID NO.2中，在“...caT”上结束)与起始密码子的第一个核苷酸之间的距离为37。如实施例中所述，此类构型在地衣芽孢杆菌的KatA启动子中遇到，并且如实施例中所述，允许特别强地表达KatA基因。

因此，根据本发明的核酸包含表达盒，其包含本发明的启动子以及与其有效连接的靶基因。在本发明的启动子是双向启动子的情况下，对于每条链，本发明的核酸优选包含有效连接到各自链的启动子的一个基因。在这种构型中，本发明的启动子被“夹在”两个基因之间，即任一条链上一个基因。这种构型允许充分利用本发明启动子赋予的益处，并且特别允许在原核宿主细胞中使两种基因都强烈表达。

根据本发明的核酸是重组核酸，因为它不同于地衣芽孢杆菌的野生型KatA启动子之处在于本文所述的至少一个核苷酸的插入。

靶基因优选编码酶。酶优选选自过氧化氢酶、蛋白酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、纤维素酶、支链淀粉酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、过氧化物酶、异构酶、转移酶、激酶和磷酸酶，其中优选的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。特别优选的基因是编码过氧化氢酶的基因，其中芽孢杆菌属的过氧化氢酶基因KatA和KatX，甚至更优选编码短小芽孢杆菌KatX2过氧化氢酶的过氧化氢酶基因，其以检索号B4AFT4_BACPU、A8FBF9_BACP2、A0A063Z4T4_BACPU、A0A0B0QA43_9BACI、M5RKX5_9BACI、K2MHE7_9BACI、W8QL66_BACPU、W6ANB4_BACPU、A0A0B4S5R6_9BACI、A0A059NBL2_9BACI、A0A0C2PYN3_BACPU和A0A081LAW9_9BACI中的任一个记录在Uniprot数据库中，或编码与KatX2过氧化氢酶具有至少90％的氨基酸序列同一性的过氧化氢酶，其以任何前述Uniprot检索号记录。为避免疑问，相应的序列是2015年11月9日在数据库中记录的序列。

根据本发明的核酸优选是构建体或表达载体，使得可以用所述构建体或表达载体转化原核宿主细胞。转化后，可以将本发明的核酸整合到宿主细胞基因组中，例如通过同源重组。作为这种整合的结果，宿主细胞基因组包含处于根据本发明启动子控制下的靶基因。这样，即使在许多代的宿主细胞繁殖后，优选即使在不存在选择标记如抗生素抗性基因的情况下，宿主细胞也能实现靶基因的稳定表达。

根据本发明，核酸不必整合到宿主细胞基因组中，而是可以替代地保持与其分离。在这种情况下，根据本发明的核酸优选是质粒并且包含其自身的复制起点。这样，可以在宿主细胞中实现本发明核酸的高拷贝数，从而进一步增加靶基因的表达。

根据本发明的核酸也可能是原核宿主细胞的基因组。如上所述，这可以通过将构建体整合到原核宿主细胞的野生型基因组中来实现。优选地，整合使得与本发明的启动子类似的野生型启动子被本发明的所述启动子替代，优选通过同源重组。这样，本发明的益处，特别是与相应野生型相比靶基因表达强度的增加可以在宿主细胞中保持多代，优选甚至在缺乏选择标记的情况下。优选地，本发明的启动子替代地衣芽孢杆菌的野生型KatA启动子。如实施例中所述，此类替代允许增加过氧化氢酶基因KatA的表达，而不显著损害KatX过氧化氢酶基因的表达，并且有益地在地衣芽孢杆菌发酵过程中也不损害KatX过氧化氢酶表达的增加。

根据本发明的原核宿主细胞的基因组还可以包含与对应的靶基因有效连接的本发明的启动子的两个或更多个拷贝，其对于启动子-靶标基因组合的每个拷贝可以不同或可以相同。这允许在原核宿主细胞的发酵过程中保持靶基因的高表达强度。

根据本发明的原核宿主细胞优选属于芽孢杆菌的分类种类，优选地来自芽孢杆菌目或乳杆菌目，更优选选自脂环酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、李斯特氏菌科(Listeriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、巴斯德菌科(Pasteuriaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、芽孢乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和高温放线菌科(Thermoactinomycetacea)，最优选芽孢杆菌属。在该属中，本发明的原核宿主细胞优选属于以下属：深海芽孢杆菌(Bacillus abyssalis),嗜酸芽孢杆菌(Bacillus acidiceler)、酸居芽孢杆菌(Bacillus acidicola)、产酸芽孢杆菌(Bacillus acidiproducens)、嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)、Bacillus acidovorans、Bacillusaeolius、Bacillus aeris、Bacillus aerius、嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)、艾氏滨芽孢杆菌(Bacillus aestuarii)、艾丁湖芽孢杆菌(Bacillus aidingensis)、秋叶氏芽孢杆菌(Bacillus akibai)、Bacillus alcaliinulinus、嗜碱性芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)、藻居芽孢杆菌(Bacillus algicola)、Bacillus alkalinitrilicus、Bacillus alkalisediminis、碱土芽孢杆菌(Bacillus alkalitelluris)、Bacillusalkalitolerans、Bacillus alkalogaya、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、香鱼海槽芽孢杆菌(Bacillus alveayuensis)、Bacillus amiliensis、Bacillus andreesenii、海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)、Bacillus arbutinivorans、Bacillus aryabhattai、风井氏芽孢杆菌(Bacillus asahii)、金橙色芽孢杆菌(Bacillus aurantiacus)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、Bacillusbaekryungensis、巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)、北京芽孢杆菌(Bacillusbeijingensis)、食苯芽孢杆菌(Bacillus benzoevorans)、Bacillus beringensis、Bacillus berkeleyi、Bacillus beveridgei、博戈里亚芽孢杆菌(Bacillusbogoriensis)、Bacillus bombysepticus、嗜硼芽孢杆(Bacillus boroniphilus)、食丁酸芽孢杆菌(Bacillus butanolivorans)、Bacillus canaveralius、嗜碳芽孢杆菌(Bacilluscarboniphilus)、Bacillus casamancensis、Bacillus catenulatus、科研中心芽孢杆菌(Bacillus cecembensis)、解纤维芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)群，Bacillus cf.pumilus SG2、恰甘诺湖芽孢杆菌(Bacilluschagannorensis)、Bacillus chandigarhensis、长安芽孢杆菌(Bacilluschungangensis)、食物芽孢杆菌(Bacillus cibi)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、考卉那芽孢杆菌(Bacillus coahuilensis)、科氏芽孢杆菌(Bacillus cohnii)、Bacillus composti、Bacillus coniferum、Bacillus daliensis、Bacillus danangensis、腐叶芽孢杆菌(Bacillus decisifrondis)、脱色芽孢杆菌(Bacillus decolorationis)、Bacillusderamificans、Bacillus deserti、Bacillus djibelorensis、钻特省芽孢杆菌(Bacillusdrentensis)、Bacillus eiseniae、Bacillus endophyticus、Bacillus endoradicis、混料芽孢杆菌(Bacillus farraginis)、苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)、Bacillusferrariarum、Bacillus firmis、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、Bacillusflavocaldarius、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、小孔芽孢杆菌(Bacillusforaminis)、福氏芽孢杆菌(Bacillus fordii)、强壮芽孢杆菌(Bacillus fortis)、Bacillus fucosivorans、气孔芽孢杆菌(Bacillus fumarioli)、绳索状芽孢杆菌(Bacillus funiculus)、解半乳糖苷芽孢杆菌(Bacillus galactosidilyticus)、Bacillusgalliciensis、吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)、Bacillus ginsenggisoli、人参芽孢杆菌(Bacillus ginsengi)、人参土芽孢杆菌(Bacillus ginsengihumi)、Bacillusginsengisoli、Bacillus gottheilii、Bacillus graminis、Bacillus granadensis、Bacillus hackensackii、盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)、Bacillus halochares、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、Bacillus halosaccharovorans、解半纤维素芽孢杆菌(Bacillus hemicellulosilyticus)、Bacillus hemicentroti、黑布施泰因芽孢杆菌(Bacillus herbersteinensis)、崛越氏芽孢杆菌(Bacillus horikoshii)、Bacillushorneckiae、花园芽孢杆菌(Bacillus horti)、土地芽孢杆菌(Bacillus humi)、Bacillushunanensis、花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis)、病研所芽孢杆菌(Bacillusidriensis)、印度芽孢杆菌(Bacillus indicus)、婴儿芽孢杆菌(Bacillus infantis)、深层芽孢杆菌(Bacillus infernus)、Bacillus intermedius、Bacillus iranensis、深层芽孢杆菌(Bacillus isabeliae)、以色列芽孢杆菌(Bacillus israeli)、Bacillusisronensis、咸海鲜芽孢杆菌(Bacillus jeotgali)、Bacillus kochii、韩国芽孢杆菌(Bacillus koreensis)、Bacillus korlensis、韩研所芽孢杆菌(Bacillus kribbensis)、克鲁氏芽孢杆菌(Bacillus krulwichiae)、列城芽孢杆菌(Bacillus lehensis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、岸滨芽孢杆菌(Bacillus litoralis)、Bacillus locisalis、Bacillus longiquaesitum、Bacillus longisporus、坎德玛斯岛芽孢杆菌(Bacillusluciferensis)、Bacillus luteolus、Bacillus mangrovensis、解甘露糖醇芽孢杆菌(Bacillus mannanilyticus)、Bacillus marcorestinctum、黄海芽孢杆菌(Bacillusmarisflavi)、Bacillus marmarensis、Bacillus massilioanorexius、Bacillusmassiliosenegalensis、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、Bacillus meqaterium、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)、马丁教堂芽孢杆菌(Bacillusmurimartini)、Bacillus nanhaiisediminis、尼氏芽孢杆菌(Bacillus nealsonii)、Bacillus neizhouensis、Bacillus nematocida、农研所芽孢杆菌(Bacillus niabensis)、烟酸芽孢杆菌(Bacillus niacin)、Bacillus nitritophilus、休闲地芽孢杆菌(Bacillusnovalis)、海洋沉积芽孢杆菌(Bacillus oceanisediminis)、Bacillus ohbensis、奥哈芽孢杆菌(Bacillus okhensis)、Bacillus okuhidensis、蔬菜芽孢杆菌(Bacillusoleronius)、Bacillus olivae、Bacillus oryzae、大岛芽孢杆菌(Bacillus oshimensis)、巴基斯坦芽孢杆菌(Bacillus pakistanensis)、Bacillus panaciterrae、巴塔哥尼亚芽孢杆菌(Bacillus patagoniensis)、Bacillus persicus、Bacillus pervagus、皮基诺伊芽孢杆菌(Bacillus pichinotyi)、海绵芽孢杆菌(Bacillus plakortidis)、抱川芽孢杆菌(Bacillus pocheonensis)、Bacillus polyfermenticus、蓼属植物芽孢杆菌(Bacilluspolygoni)、假嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudalcaliphilus)、假坚强芽孢杆菌(Bacilluspseudofirmus)、假巨大芽孢杆菌(Bacillus pseudomegaterium)、假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、Bacillus purgationiresistens、青岛芽孢杆菌(Bacillus qingdaonensis)、Bacillus racemilacticus、Bacillus rhizosphaerae、农庄芽孢杆菌(Bacillus ruris)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、盐芽孢杆菌(Bacillussalarius)、嗜盐芽孢杆菌(Bacillus saliphilus)、Bacillus salsus、Bacillusselenatarsenatis、Bacillus senegalensis、西岸芽孢杆菌(Bacillus seohaeanensis)、沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)、Bacillus shandongensis、逼罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、Bacillus similis、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、青贮窖芽孢杆菌(Bacillus siralis)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、土壤芽孢杆菌(Bacillussoli)、Bacillus songklensis、耐热芽孢芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)、Bacillus stratosphericus、Bacillus stratosphericusi、地下芽孢杆菌(Bacillussubterraneus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)群，大安芽孢杆菌(Bacillustaeanensis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensi)、Bacillus thaonhiensis、热嗜血芽孢杆菌(Bacillus thermoalkalophilus)、嗜热解淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamyloliquefaciens)、热嗜淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)、Bacillus thermocopriae、Bacillus thermolactis、Bacillus thermophilus、嗜热蛋白分解杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)、Bacillus thermoterrestris、Bacillusthermotolerans、Bacillus thermozeamaize、产硫芽孢杆菌(Bacillus thioparans)、天目芽孢杆菌(Bacillus tianmuensis)、泰门芽孢杆菌(Bacillus timonensis)、Bacillustipchiralis、Bacillus trypoxylicola、越南芽孢杆菌(Bacillus vietnamensis)、原野芽孢杆菌(Bacillus vireti)、黏稠芽孢杆菌(Bacillus viscosus)、Bacillus vitellinus、和光芽孢杆菌(Bacillus wakoensis)、小溪芽孢杆菌(Bacillus xiaoxiensis)或湛江芽孢杆菌(Bacillus zhanjiangensis)，更优选解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)属，甚至更优选枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或短小芽孢杆菌属，并且最优选地衣芽孢杆菌种。其他优选的宿主细胞属于棒状杆菌属、毁丝霉属和巴斯夫菌属，优选谷氨酸棒杆菌，嗜热毁丝霉C1和产琥珀酸巴斯夫菌中的任何种类。

本发明还提供了用于生产发酵产物的发酵方法。发酵产物优选是至少5个氨基酸长度，甚至更优选至少20个氨基酸的蛋白质或多肽。特别地，发酵产物可以由如上所述的靶基因编码。然而，发酵产物也可以由位于别处并有效连接到除根据本发明的启动子之外的各自的启动子的一个或多个基因编码；这样的启动子-基因组合可以位于例如基因组中或位于基因组外的核酸中，例如位于发酵宿主细胞中的一个或多个质粒上。从经济角度来看，根据本发明的发酵方法的价值可能不在于如前所述的发酵产物，即蛋白质或多肽，而是通过所述蛋白质或多肽的作用可获得的或获得的代谢物。这种作用的例子是将一种物质转化为另一种物质，例如通过分解营养素(例如糖、脂肪酸和/或蛋白质)来产生能量等同物(例如ATP)。然而，这样的代谢过程取决于先前形成蛋白质或多肽以及典型的酶。因此，为了本发明的目的，确保称这些蛋白质或多肽，特别是这些酶为“发酵产物”。

根据本发明的优选发酵方法包括提供包含核酸的原核宿主细胞的步骤，其中所述核酸包含与编码发酵产物的基因有效连接的根据本发明的启动子。根据本发明的另一种优选的发酵方法包括提供包含核酸的原核宿主细胞的步骤，所述核酸包含与编码过氧化氢酶的基因有效连接的作为第一启动子的根据本发明的启动子，并且还包含，在相同或另一核酸分子上，或者在双向启动子的情况下在核酸分子的负链上，与编码发酵产物的基因有效连接的第二启动子。任一优选方法还包括在允许编码发酵产物的所述基因表达的条件下培养原核宿主细胞的步骤。在原核宿主细胞包含编码与本发明的启动子有效连接的过氧化氢酶的基因的那些情况下，培养原核宿主细胞还意味着在允许编码过氧化氢酶的所述基因表达的这种条件下培养。根据本发明的发酵方法允许利用由本发明的启动子赋予的益处，并且特别地允许在发酵期间产生大量的编码发酵产物的基因(其可以如前所述是过氧化氢酶)，特别是通过确保基因的高水平表达可以编码发酵产物。在发酵方法利用与过氧化氢酶基因有效连接的根据本发明的启动子的情况下，与地衣芽孢杆菌野生型KatA启动子相比，该发酵方法受益于过氧化氢酶基因表达和相应的过氧化氢酶活性的增加。就此而言，进一步的细节将通过所附实施例给出。

如上所述，本发明的启动子优选是双向启动子，例如根据序列SEQ ID NO.72至87的任一个。通过类似于地衣芽孢杆菌的KatA和KatX基因的野生型双向启动子描述本发明的启动子，本发明允许将两个独立的基因有效连接到双向启动子上，就好像编码KatA和/或KatX的基因将被替代。在实施例中描述的，启动子的“KatA侧”上的基因的表达特征不同于“KatX侧”上的基因的表达特征：“KatA侧”上的基因可以在发酵期间中以组成型高水平转录并表达，“KatX侧”的基因可以在发酵时间期间使其转录和表达增加，以达到“KatA侧”上基因的表达强度。因此，通过相对于本文所述的本发明启动子的序列将基因置于负链上(即“KatX侧”)，可以使该基因在发酵过程中以增加的强度表达，因此有效地延迟了相应基因产物的生产到发酵过程的后期阶段。当这种基因产物容易随时间而受到损害时，或者在发酵过程的早期阶段基因产物的形成会不期望地减少相应宿主细胞的生长时，这是特别有利的。因此，本发明有利地允许根据发酵方法的特定需要以及考虑到所讨论的发酵产物施加的限制来调整基因表达。

本发明相应地还提供了用于生产发酵产物的发酵方法，其包括以下步骤

a)提供原核宿主细胞，其包含含有本发明的双向启动子的核酸，所述核酸在一条链(正链)上有效连接到编码发酵产物的基因并同时在负链上有效连接到编码过氧化氢酶的基因，和

b)在允许表达所述编码发酵产物的基因和所述编码过氧化氢酶的基因的条件下培养原核宿主。

这样，本发明的发酵过程得益于两种基因(即编码发酵产物的基因和编码过氧化氢酶的基因)的强且及时的表达。通过本发明的启动子(在正链或负链上)表达编码过氧化氢酶的基因有益地增加了原核宿主细胞针对抗氧化胁迫的恢复力，并且由此通过赋予或增加宿主细胞针对氧化的保护帮助产生发酵产物、其任何代谢产物和/或发酵产物。

如上所述，本发明还提供了分别与野生型地衣芽孢杆菌中的过氧化氢酶表达和/或过氧化氢酶活性相比在原核宿主细胞中增加过氧化氢酶表达和/或过氧化氢酶活性的方法，其包括有效连接根据本发明的启动子与编码过氧化氢酶的基因的步骤。为避免疑问，生物化学上的“表达增加”意指与地衣芽孢杆菌野生型KatA启动子相比，相应mRNA浓度的增加。

在本发明上下文中提及的核酸序列具体为：

下面通过实施例进一步描述本发明；提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并不意图限制本发明或权利要求的范围。

实施例

实施例1：野生型地衣芽孢杆菌启动子和根据本发明的优选启动子的序列比较。图1描绘了野生型地衣芽孢杆菌启动子(SEQ ID NO.1)和根据SEQ ID NO.56的启动子的比对。根据Needleman-Wunsch算法进行比对，其空位开放罚分为16，并且空位延伸罚分为4。序列不同之处在于接头部分插入一个胸苷(也与图4比较)。

实施例2：野生型菌株和包含实施例1的根据本发明启动子的相应菌株的地衣芽孢杆菌中的KatA和KatX过氧化氢酶表达的比较

培养地衣芽孢杆菌野生型和突变菌株的发酵条件：

发酵过程在具有pH，pO2和温度探针的带挡板搅拌釜式反应器(STR，Dasgip)中在具有葡萄糖作为主要碳源和复杂化合物的培养基中进行。通过气体分析监测O2和CO2的浓度。对于培养，以起始工作体积为1L选择反馈模式。作为生物反应器，使用具有6叶片的3个rushton涡轮机的2L玻璃容器。

培养基：

用于种子和主培养物培养基的培养基制备和灭菌分别在摇瓶和生物反应器中发生。在所有的培养中使用PPG2000作为消泡剂。

培养基含有30g/L葡萄糖，120g/L复合植物蛋白，7.7g/L KH2PO4，2.8g/L(NH4)2SO4，0.09g/L Mn(II)SO4*H2O，0.05g/Fe(I)SO4*7H2O，0.3g/L CaCl2*2H2O，1.4mL7LPPG2000，0.025g/L卡那霉素。将pH调节至pH 8。将培养基在搅拌条件下(600rpm)在生物反应器中在123℃下灭菌60min。

种子培养：

在16小时过程期间(39℃，pH 7.5，200rpm)，在摇瓶中用与分批培养相同的培养基制备种子培养物。定期取样并测量pH、OD、糖和有机酸(HPLC)以及蛋白酶活性。将摇瓶从新鲜的LB平板接种并在16小时后在指数期结束时转移到主培养中。

主培养：

2.7％的起始工作体积用于接种。主培养在39℃，30g/L起始葡萄糖浓度和从350-1400rpm的pO2依赖性搅拌级联和1.46vvm的通气速率下进行。

采样和总RNA分离：

在发酵过程中，取出10ml样品并与RNAlater Solution(Life Technologies)以1：1的比例混合并立即置于干冰上。仔细将样品在冰上解冻并通过离心使细胞沉淀。按照制造商的方案，使用peqGOLD Bacterial RNA Kit(peqlab)从细胞中分离总RNA。在稀释至100ng/μl的浓度后测量260nM处的吸光度，测定RNA浓度。RNA样品储存在-80℃。

逆转录

根据制造商的方案，用随机六聚体寡核苷酸与GoScript Reverse TranscriptionSystem(A5000)(Promega)以250ng总RNA进行逆转录。反应在ABI Genamp PCR System9700-Cycler中进行。

qPCR：

以每种20μLPCR反应体积和10pmol寡核苷酸，使用LightCycler480II(Roche)和Master Mix(A6001-Promega)进行定量PCR(qPCR)。SYBR Green在470nm处的FAM/SYBR通道中被激发，并且在510nm处检测到荧光。

循环程序

使用软件包Ideas 2.0(Roche版本1.5.1.62)进行数据评估。ct值由'二次导数最大值'的方法确定。指示的靶基因的相对ct值(-dCT)计算如下：

-dCT＝–(ct(TARGET)-ct(REF))

qPCR引物

图2示出了这个实施例的结果。在小图A中给出野生型地衣芽孢杆菌的表达特征，并且在小图B中给出重组地衣芽孢杆菌的表达特征，所述重组地衣芽孢杆菌不同于小图A的野生型菌株在于KatA基因的启动子已被图1中描绘的本发明的启动子序列替代。基因表达分别通过对编码KatA和KatX蛋白的mRNA进行定量PCR来确定。小图B证明，根据本发明的优选启动子导致KatA基因的组成型表达增加，而不会不当地降低KatX基因的表达，并且KatX基因的表达在发酵期间仍然被诱导。

实施例3：对于野生型菌株和包含实施例1的本发明的启动子的相应菌株的地衣芽孢杆菌的总过氧化氢酶活性的比较

离心后从培养物中取出1ml样品。将细胞用1mM PMSF(参见下文)重悬于测定缓冲液中并使用Ribolyser(MP Biomedicals)破碎。离心后，回收上清液并用于过氧化氢酶活性测定。

通过氨基安替比林-苯酚法测定过氧化氢酶活性。因此，将10μL含过氧化氢酶的样品在室温下用60μL溶解于166mM磷酸盐缓冲液(pH7)中的0.86mM H2O2温育5min。温育后，通过加入30μL含50mM苯酚，2,6mM4-氨基安替比林和90U/mL辣根过氧化物酶(Sigma 77332)的混合物，在微量滴定板读数器中用分光光度法在520nM检测残留的H2O2。为了校准，使用来自牛肝的过氧化氢酶(Sigma C40)，通过从500U/mL到0.5U/mL的连续稀释。为了归一化目的，将过氧化氢酶活性对通过微BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测量的总蛋白质浓度归一化。

该实施例的结果示于图3中。该图显示，与野生型菌株相比，整体过氧化氢酶活性增加至少10倍，并且在发酵启动后的前5小时，增加100倍。

Claims

1.启动子，其包含通过接头部分彼此分开的-10型盒和-35型盒，

其中每个盒由各自的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列具有通过对于-10型盒根据表1且对于-35型盒根据表2在每个位置给每个核苷酸赋值可获得的各自的得分，并且其中-10型盒的得分至少为497，并且-35型盒的得分至少为179，

并且其中接头部分具有至少14个核苷酸的长度和至少57％的A/T含量。

2.根据权利要求1所述的启动子，其中所述接头部分的核苷酸序列与序列SEQ ID NO.3至18中任一个差异在于在这些序列的位置1至5中任一个之前的胸苷插入。

3.根据前述权利要求中任一项所述的启动子，其中所述接头部分具有至多18个核苷酸的长度。

4.根据前述权利要求中任一项所述的启动子，其中所述-10型盒的核苷酸序列与序列SEQ ID NO.19至31中任一个相差至多1个核苷酸。

5.根据前述权利要求中任一项所述的启动子，其中所述-35型盒的核苷酸序列与序列SEQ ID NO.32至41中任一个相差至多1个核苷酸。

6.根据前述权利要求中任一项所述的启动子，其中具有20个核苷酸长度的上游部分位于-35型盒5'方向上游并与其相邻，其中上游部分的A/T含量为至少70％，并且上游区域的A含量为至少35％，并且其中优选在上游区域上游延伸46个核苷酸的序列(“引入序列”)的A/T含量具有至少70％的A/T含量，并且其中优选位于-10型盒下游并与-10型盒相邻并延伸至起始密码子的序列具有至少30个核苷酸的长度并且包含核糖体结合位点。

7.根据前述权利要求中任一项所述的启动子，其中所述启动子是双向启动子。

8.核酸，其包含与靶基因有效连接的根据前述权利要求中任一项的启动子。

9.根据权利要求8所述的核酸，其中所述靶基因编码酶，其中所述酶优选选自过氧化氢酶、蛋白酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、纤维素酶、支链淀粉酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、过氧化物酶、异构酶、转移酶、激酶和磷酸酶，其中优选的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。

10.包含权利要求9的核酸的原核宿主细胞，优选选自芽孢杆菌的分类种类，甚至更优选选自芽孢杆菌目或乳杆菌目，或选自棒状杆菌属、毁丝霉属和巴斯夫菌属的任何一种。

11.生产发酵产物的发酵方法，包括以下步骤：

i)提供包含核酸的原核宿主细胞，其中所述核酸包含与编码发酵产物的基因有效连接的根据权利要求1至7中任一项所述的启动子，和

ii)在允许表达编码发酵产物的基因的条件下培养宿主细胞，和

iii)任选地纯化发酵产物。

12.根据权利要求11所述的发酵方法，其中所述启动子是也有效连接至编码过氧化氢酶的基因的双向启动子，并且其中培养在允许过氧化氢酶基因表达的条件下进行。

13.增加原核宿主细胞中过氧化氢酶表达或活性的方法，包括将核酸导入宿主细胞中的步骤，所述核酸包含与编码过氧化氢酶的基因有效连接的根据权利要求1至7中任一项所述的启动子。