CN107338241A - 一种对基因启动子进行定向进化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对基因启动子进行定向进化的方法，该方法包括：用易错PCR技术扩增启动子，获得一组突变频率较高的启动子序列；用DNA改组技术去除有害突变，集合有益突变，获得改组的启动子；重组启动子和半乳糖苷酶基因组成表达盒转化宿主细胞，通过蓝白斑筛选和酶活测定获得目标突变启动子。本发明的方法不需要分析基因启动子的功能区域，成本低，高效快捷，操作简便，成功率高，适合于对大肠杆菌或其他细菌、真菌和哺乳动物细胞的基因启动子定向进化。
Description
技术领域
本发明是关于一种对基因启动子进行定向进化的方法，具体而言，是关于一种利用DNA改组技术结合易错PCR技术对大肠杆菌的基因启动子进行定向进化的方法。
背景技术
启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。原核启动子有三个重要的区域：-10序列、-35序列和两者之间的核苷酸。-10序列即TATA盒，控制转录的起始，-35序列在转录时结合RNA聚合酶，而-10区和-35区之间核苷酸数目的变动也会影响基因转录活性。改造这些控制元件能够改变启动子的效率和性质。
目前对基因启动子的遗传工程改造主要是通过引入或敲除控制元件改善启动子的效率和性质。例如，Rushton等人通过合理的设计，将多个能在病原体攻击时调控基因表达的控制元件引入CaMV 35S启动子中，构建了一个病原体诱导的植物启动子(Rushton PJ,Reintadler A,Lipka V,Lippok B,Somssich IE.Synthetic plant promoterscontaining defined regulatory elements provide novel insights into pathogen-and wound-inducedsignaling.Plant Cell.2002,14:749-762)。Cazzonelli等人在CaMV 35S启动子的上游加入了同向重复的增强子序列提高了启动子的效率(Cazzonelli CI,Velten EJ.In vivocharacterization of plant promoter element interaction using synthetic promoters.Trans Res 2008,17:437-457)。Mehrotra等人把两个调控元件ACGT框或一个GT框放在启动子的TATA框上游时，分别提高了6倍和2倍的启动子效率(Mehrotra R,Panwar J.Dimerization of GT element interferes negatively with gene activation.J Genet.2009,88:257-260；Mehrotra R,Mehrotra S.Promoter activation by ACGT in response to salicylic and abscisic acids isdifferentially regulated by the spacing between two copies of the motif.J Plant Physiol.2010,167:1214-1218)。但是这些重构启动子的方法往往需要了解启动子的功能区域才能合理设计出顺式作用元件引入的方案，而且操作繁琐复杂，耗时长，成功概率低，启动子效率提高幅度不大。
近年来，也有一些研究通过对基因启动子的定向进化优化启动子的效率。定向进化指的是利用分子的生物学手段，在分子水平上创造分子的多样性，在事先不了解启动子的功能区域的情况下，通过模拟自然进化，在体外改造基因启动子，以改进的诱变技术结合灵敏的筛选方法，定向选择有价值的基因启动子。目前，定向进化技术在酵母菌和大肠杆菌等单细胞微生物的代谢工程改造中得到成功应用，其中主要是通过易错PCR技术或DNA改组技术对启动子进行定向进化。
易错PCR是在采用DNA聚合酶进行启动子序列扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向启动子中随机引入突变，获得启动子的随机突变体。Go Kagiya等人利用易错PCR将随机点突变引入到一条本身没有启动子活性但是有类似原核启动子-10和-35序列的DNA片段中。突变的DNA片段含有了更多的-10和-35序列，将其与lacZ基因连接后转入到大肠杆菌中发现，重组菌不加诱导物也能表达半乳糖苷酶，而且酶活比tac启动子调控lacZ基因表达的半乳糖苷酶的酶活大1.94倍(Kagiya G,Ogawa R,Hatashita M,Takagi K,Kodaki T,Hiroshi S,Yamamoto K.Generation of a strong promoter for Escherichia colifrom eukaryotic genome DNA.Journal of Biotechnology.2005,115:239-248)。但是，易错PCR技术建立的启动子文库含有较多的有害突变，获得强启动子的成功率较低，而且往往需要经过多轮的易错PCR，费时费力。
DNA改组是指启动子序列的体外重组，首先用低保真酶扩增一组启动子序列，经过超声波处理或用DNA酶I(DNase I)消化产生一系列随机切割的DNA片段，然后在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成。随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前的启动子长度。最后，用启动子两侧的引物合成全长的启动子。将重组启动子与报告基因组成表达盒转化大肠杆菌，定向筛选一个高效的重组启动子。这个启动子可认为是有益突变的集合体。沈国妙等人利用DNA改组技术改造aacC1基因启动子，效率提高了3倍(沈国妙,姚泉洪,张铭,彭日荷,熊爱生.利用DNA改组技术改造aacC1基因启动子活性的研究.微生物学报.2004,44(1):58-61)。但是如果野生型启动子序列不经过突变或经过突变率较低的方法扩增，那么DNA改组后的重组启动子所含的有益突变很少，导致文库中大部分都是野生型群体，大大增加了筛选的难度。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种改进的对基因启动子进行定向进化的方法。
DNA改组技术结合易错PCR技术在蛋白的定向进化中有广泛的应用，但是在启动子的定向进化中却鲜有报道。
本发明中，利用DNA改组技术结合易错PCR技术对大肠杆菌的基因启动子进行定向进化，来高效、快捷提高基因启动子的效率和蛋白质的产量。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供了一种对基因启动子进行定向进化的方法，该方法包括：
用易错PCR技术扩增启动子，获得一组突变频率较高的启动子序列；
用DNA改组技术去除有害突变，集合有益突变，获得改组的启动子(重组的启动子突变库)；
将重组启动子和半乳糖苷酶基因组成表达盒转化宿主细胞，通过蓝白斑筛选和酶活测定获得目标突变启动子。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述宿主细胞为大肠杆菌、其他细菌、真菌或哺乳动物细胞。
本方法不需要分析基因启动子的功能区域，成本低，高效快捷，操作简单，成功率高，适合于大肠杆菌乃至真菌、哺乳动物细胞等的基因启动子定向进化。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，易错PCR技术以1％-2％的突变频率引点突变到宿主细胞的启动子中。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，通过降解启动子序列和回收小片段，经过Primerless PCR和Primer PCR获得重组的突变启动子，并将之克隆到带有半乳糖苷酶报告基因的表达载体中，转化宿主细胞，获得启动子突变库。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，将库涂布在含有X-gal的LB平板上，提取蓝色最深的克隆扩大培养，分别进行β-半乳糖苷酶的酶活测定和改组启动子的克隆测序分析。
在本发明的一具体实施方案中，本发明的方法是对大肠杆菌的tac启动子进行定向进化。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，易错PCR的反应体系含有0.5mM的MnCl2、50mM的KCl、2.5mM的MgCl2、5U的Taq酶、10mM的Tri-Cl(pH 8.3)和1.0μM的引物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法包括按照以下操作建立突变启动子文库：
以Psv-β-galactosidase为模板，扩增报告基因β-半乳糖苷酶基因；扩增产物回收纯化后经Sal1和Sap1双酶切，插入经同样酶切的质粒pUC19中，获得质粒pUC19-lacZ；
改组后的启动子片段经BamHI和SalI双酶切，插入经相同酶切的pUC19-lacZ中，获得重组质粒pUC19-MPtac-lacZ；
制备感受态细胞，向感受态细胞中加入重组质粒pUC19-MPtac-lacZ，于含有X-Gal的LB平板中培养，获得克隆文库。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法包括按照以下操作筛选突变启动子：挑取蓝色显示快、深的多个克隆进行液体培养，测定β-半乳糖苷酶酶活。
本发明还提供了按照所述的方法得到的改组后的启动子。
在本发明的一具体实施方案中，本发明首先通过易错PCR技术以1％-2％的突变频率引点突变到大肠杆菌的tac启动子中，再用DNase I降解启动子序列和回收小片段，经过Primerless PCR和Primer PCR获得重组的突变tac启动子，并将之克隆到带有半乳糖苷酶报告基因的表达载体中，转化大肠杆菌，获得启动子突变库。
在本发明的一具体实施方案中，是将获得的启动子突变库涂布在含有80mg/mlX-gal的LB平板上，提取蓝色最深的克隆扩大培养，分别进行β-半乳糖苷酶的酶活测定和改组启动子的克隆测序分析。
在本发明的一具体实施方案中，是对tac启动子进行定向进化。通过易错PCR扩增tac启动子，建立MPtac(突变tac启动子)文库，筛选得到β-半乳糖苷酶酶活高的强突变启动子。
本发明将DNA改组技术与易错PCR技术有机结合，对大肠杆菌的基因启动子进行定向进化，来高效提高基因启动子的效率和蛋白质的产量。这种方法不需要分析基因启动子的功能区域，成本低，高效快捷，操作简便，成功率高，也适合于其他细菌、真菌和哺乳动物细胞的基因启动子定向进化。
附图说明
图1为本发明一具体实施例中的Ptac和MPtac的序列比对。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1
本发明首先通过易错PCR技术以1％-2％的突变频率引点突变到大肠杆菌的tac启动子中，再用DNase I降解启动子序列和回收小片段，经过Primerless PCR和Primer PCR获得重组的突变tac启动子，并将之克隆到带有半乳糖苷酶报告基因的表达载体中，转化大肠杆菌，获得启动子突变库。将库涂布在含有80mg/ml X-gal的LB平板上，提取蓝色最深的克隆扩大培养，分别进行β-半乳糖苷酶的酶活测定和改组tac启动子的克隆测序分析。
(1)tac启动子的改组
易错PCR扩增tac启动子。由于Mg2+在PCR过程中可以稳定非互补的碱基对；Mn2+能够降低聚合酶对模板的特异性，因而调整两种离子的浓度，并使用低保真Taq酶(TaKaRa)可以获得不同突变频率的多样性文库。本发明的易错PCR的反应体系含有0.5mM的MnCl2、50mM的KCl、2.5mM的MgCl2、5U的Taq酶、10mM的Tri-Cl(pH 8.3)和1.0uM的引物，突变频率为1％-2％。以pFLAG-Mac(Sigma-Aldrich)为模板，用tac启动子的上游引物为GCGCTCATGAGCCCGAAGTCGAGCCC(SEQ ID No.1)和下游引物为CCGGTGGACGTGTGAAATTGTTATCCGC(SEQ ID No.2)扩增tac启动子，反应程序为：94℃1min；55℃0.5min；72℃1min；35个循环。扩增片段回收纯化。
DNase 1降解DNA和小片段回收。回收纯化后的tac启动子用DNase 1buffer溶解后，加入0.001U的DNase 1 15℃处理15min，90℃10min使DNase1失活。15％聚丙烯酰胺电泳回收30bp以下的片段。
将500ng左右的降解小片段进行不加引物的PCR反应(Primerless PCR)。反应体系为0.8mM dNTPs+3mM MgCl2+50mM KCl+10mM Tri(pH9.0)+5U Taq酶+0.1％TritonX-100，补充ddH2O到50ul。反应程序为：94℃0.5min；55℃0.5min；72℃0.5min；35个循环；72℃延伸10分钟。
取Primerless PCR扩增后的产物5ul，加入引物F2和S2，常规PCR反应扩增。扩增产物回收纯化。
(2)构建载体，建立MPtac(突变tac启动子)文库
以Psv-β-galactosidase(Invitrogen)为模板，用上游引物CCGGTCGACATGCCTTCTGAACAATGG(SEQ ID No.3)A和下游引物GGCTTACCATCCAGCGCCACCATCCAGT(SEQ ID No.4)扩增报告基因β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。扩增产物回收纯化后经Sal1和Sap1双酶切，插入经同样酶切的pUC19中，获得质粒pUC19-lacZ。
改组后的启动子片段经BamHI和SalI双酶切，插入经相同酶切的pUC19-lacZ中，获得质粒pUC19-MPtac-lacZ。
用感受态细胞制备试剂盒(Competent Cell Preparation Kit，TaKaRa)制备大肠杆菌E.coli Top10的感受态细胞。向每200μL的感受态细胞中加入50ng重组质粒pUC19-MPtac-lacZ，轻轻混匀后冰中放置30分钟。接着42℃热激1min，冰上放置2min后加入800μL的LB培养液，37℃，200r/min，培养1小时。然后8000r/min，离心1min，倒掉上清液，用100μL LB培养液重悬沉淀，涂布于含有X-Gal的LB平板中，37℃培养箱中培养16个小时。本发明一共涂布了20个平板，每个平板大约长出1000个克隆，获得约2万个克隆的文库。
(3)强突变启动子的筛选
挑取蓝色显示最快、最深的数个克隆进行液体培养，测定β-半乳糖苷酶酶活。测定方法参见《分子克隆》(第三版)pp.1363-1366中的方法进行。一个酶活单位定义为37℃，1min内水解1μmol ONPG底物的酶量。酶活测定结果表明，最强突变启动子MPtac生产的半乳糖苷酶酶活是Ptac(野生型tac启动子)的1.86倍。
(4)强突变启动子MPtac序列分析
筛选β-半乳糖苷酶酶活最高的克隆送到生工公司测序，MPtac测序结果与野生型tac启动子序列进行比对。Ptac和MPtac的序列比对结果参见图1。
据文献报道，拥有共同序列-35和-10以及两者之间为17bp碱基的距离是强启动子的特征(de Boer H A,Comstock L J,Vasser M.The tac promoter:a functionalhybrid derived from the trp and lac promoters.Proc.NatL Acad.Sci.1983,80:21-25；Jensen P R,Hammer K.The Sequence of Spacers between the Consensus SequencesModulates the Strength of Prokaryotic Promoters.Appl Environ Microbiol.1998,64(1):82-87)。
如图1所示，改组后的tac启动子相比野生型tac启动子，有更为标准的-10序列TATAAA，其在-35和-10之间插入了一个碱基，使两者之间的距离达到17bp，成为一个典型的强大肠杆菌启动子。因此，它生产的半乳糖苷酶酶活比较高。
Claims (10)
1.一种对基因启动子进行定向进化的方法，该方法包括：
用易错PCR技术扩增启动子，获得一组突变的启动子序列；
用DNA改组技术去除有害突变，集合有益突变，获得改组的启动子；
将重组启动子和半乳糖苷酶基因组成表达盒转化宿主细胞，通过蓝白斑筛选和酶活测定获得目标突变启动子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌、其他细菌、真菌或哺乳动物细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，易错PCR技术以1％-2％的突变频率引点突变到宿主细胞的启动子中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，通过降解启动子序列和回收小片段，经过Primerless PCR和Primer PCR获得重组的突变启动子，并将之克隆到带有半乳糖苷酶报告基因的表达载体中，转化宿主细胞，获得启动子突变库。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，将库涂布在含有X-gal的LB平板上，提取蓝色最深的克隆扩大培养，分别进行β-半乳糖苷酶的酶活测定和改组启动子的克隆测序分析。
6.根据权利要求1所述的方法，该方法是对大肠杆菌的tac启动子进行定向进化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，易错PCR的反应体系含有0.5mM的MnCl2、50mM的KCl、2.5mM的MgCl2、5U的Taq酶、10mM的Tri-Cl(pH8.3)和1.0μM的引物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括按照以下操作建立突变启动子文库：
以Psv-β-galactosidase为模板，扩增报告基因β-半乳糖苷酶基因；扩增产物回收纯化后经Sal1和Sap1双酶切，插入经同样酶切的质粒pUC19中，获得质粒pUC19-lacZ；
改组后的启动子片段经BamHI和SalI双酶切，插入经相同酶切的pUC19-lacZ中，获得重组质粒pUC19-MPtac-lacZ；
制备感受态细胞，向感受态细胞中加入重组质粒pUC19-MPtac-lacZ，于含有X-Gal的LB平板中培养，获得克隆文库。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括按照以下操作筛选突变启动子：
挑取蓝色显示快、深的多个克隆进行液体培养，测定β-半乳糖苷酶酶活。
10.按照权利要求1～9任意一项所述的方法得到的改组后的启动子。
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