CN113480625B - 香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建 - Google Patents

香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建 Download PDF

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Abstract

本发明提供香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建，该香蕉bZIP转录因子为香蕉MaHY5基因中的MaHY5like3基因；经对其表达特征和功能进行分析结果表明，MaHY5like3基因的表达随着香蕉果实的发育进程呈明显上调的趋势，MaHY5like3基因调控合成香蕉果实中淀粉和类胡萝卜素的MaAPS1和MaPsy2b基因的表达，从而调控果实品质的形成，为改良香蕉果实品质提供了候选基因，有利于为香蕉分子育种提供重要的理论基础。

Description

香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及 其表达载体构建
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建。
背景技术
香蕉具有丰富的营养和良好的口感，是全世界深受消费者喜爱的水果。香蕉果实的品质是影响香蕉质量和销量的重要因素，对香蕉果实品质的改良是香蕉生产育种工作的主要目标之一。香蕉果实的品质与其体内淀粉、糖和类胡萝卜素等代谢物的积累密切相关，因此，促进香蕉果实生长发育阶段淀粉和类胡萝卜素的积累，对于成熟后果实的风味和营养成份的形成非常重要。目前对于香蕉果实品质形成调控的机理不明，深入对香蕉果实中相关代谢物合成调控的分子机理研究，有利于为香蕉分子育种提供重要的理论基础，现有未见香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的相关报道。
发明内容
鉴以此，本发明提出香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用，该香蕉bZIP转录因子为香蕉MaHY5基因中的MaHY5like3基因。
进一步说明，所述MaHY5like3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步说明，香蕉bZIP转录因子MaHY5like3基因在调控香蕉果实中淀粉和类胡萝卜素含量方面的应用。
进一步说明，香蕉bZIP转录因子MaHY5like3基因用于促进合成香蕉果实中淀粉和类胡萝卜素的MaAPS1和MaPsy2b基因的表达。
进一步说明，香蕉bZIP转录因子MaHY5like3基因可结合至MaAPS1和MaPsy2b基因的G-box元件上，用于调控MaAPS1和MaPsy2b基因的表达。
一种香蕉bZIP转录因子表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)将MaHY5like3基因的CDS序列采用引物进行扩增；
(2)采用XbaI和BamHI两种限制性内切酶对pCambia1300-35S-cGFP-Tnos载体质粒进行双酶切，将酶切后的载体与扩增后的目的片段进行回收，利用NEBuilder HiFiDNAAssembly Master Mix试剂盒进行连接，转化及测序验证，得到香蕉转录因子MaHY5like3的pCambia1300-35S-MaHY5like3-GFP表达载体。
进一步说明，所述引物序列为：5’-AGAACACCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCTCCAGGAACAAGCCACGAGCTC-3’和5’-TGCTCACCATGGTACCCGGGGATCCCGCCGCCGCTTGGCTGTCTGCGGTGGCACTGCCAC-3’。
一种香蕉bZIP转录因子的酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)将MaHY5like3基因的CDS序列采用引物进行扩增；
(2)采用EcoRI和XhoI两种限制性内切酶对PB42AD载体质粒进行双酶切，将酶切后的载体与扩增后的目的片段进行回收，利用NEBuilder HiFi DNAAssembly Master Mix试剂盒进行连接，转化及测序验证，最终得到香蕉转录因子MaHY5like3的PB42AD-MaHY5like3酵母表达载体。
进一步说明，所述引物序列为5’-CATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGCTGCAGGAGCAGGCAACCAGCTC-3’和5’-AGTATCTACGATTCATCTGCAGCTCGAGCTACTTGCCTTCTCCATTGGCATTAA-3’。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明筛选得到了香蕉MaHY5基因中参与调控香蕉果实生长发育过程中品质形成的一个bZIP转录因子MaHY5like3，并通过对其表达特征和功能进行分析结果表明，MaHY5like3基因的表达随着香蕉果实的发育进程呈明显上调的趋势，并经过瞬时过表达该转录因子的果实中淀粉和类胡萝卜素合成相关基因的表达上调，表明MaHY5like3基因通过调控合成香蕉果实中淀粉和类胡萝卜素的MaAPS1和MaPsy2b基因的表达，从而调控果实品质的形成，本发明为改良香蕉果实品质提供了候选基因，也为利用分子育种方法培育具有优良品质的香蕉新品种提供了新思路和新方法。
附图说明
图1为本发明的香蕉A和B基因组中HY5家族转录因子和拟南芥、水稻、玉米中HY5的蛋白序列比对和系统进化树分析图；
图2为本发明的香蕉MaHY5家族基因表达特征分析图；
A为MaHY5家族基因在香蕉不同组织中的表达模式，统计数据表示为：平均值±标准偏差，MaUBQ2为qPCR的内参基因；
B为MaHY5家族基因在香蕉果实生长发育不同阶段的表达模式，统计数据表示为：平均值±标准偏差，MaUBQ2为qPCR的内参基因；
图3为本发明MaHY5like3基因瞬时过表达果实中MaHY5like3、MaAPS1和MaPSY2b基因的表达水平与对照组的表达水平比较图；统计数据表示为：平均值±标准偏差，MaUBQ2为qPCR的内参基因；
图4为本发明的酵母单杂实验中MaHY5like3蛋白与MaAPS1和MaPSY2b基因启动子的G-box元件结合实验结果图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-香蕉MaHY5家族基因的鉴定、进化分析
本发明通过由香蕉香蕉A和B基因组中分别鉴定出5个MaHY5like和4个MbHY5like基因，均具有HY5家族转录因子典型的bZIP结构域，如图1A所示。为了进一步探讨香蕉中HY5家族成员的系统进化关系，通过MEGA5软件对香蕉、拟南芥、水稻和玉米的HY5蛋白之间的进化关系进行了分析，香蕉中所有的HY5属于同一个亚家族，A基因组中的Ma05_p05820和B基因组中的Mba05_g11630与拟南芥中的HY5亲缘关系最近，如图1B所示。本发明以A基因组上的5个MaHY5基因为对象进行了进一步的研究，并对该5个基因Ma09_p29200、Ma10_p26990、Ma05_p05820、Ma07_p09800和Ma06_p06920分别命名为MaHY5like1、MaHY5like2、MaHY5like3、MaHY5like4和MaHY5like5。
实施例2-香蕉MaHY5家族基因的表达特征分析
本发明通过采用RT-qPCR技术检测上述MaHY5家族的5个基因在香蕉植株不同组织中和果实发育不同阶段的表达模式，结果发现MaHY5家族基因在各个组织中均有不同程度的表达，其中，在根中表达最高，在苞片和果实中表达次之，如图2A所示；随着香蕉果实的发育进程，MaHY5like3基因表达呈明显上调的趋势，在果实发育后期该基因表达下调，而其它四个MaHY5家族基因的表达在果实发育进程中没有表现出显著的规律性，如图2B所示，P1，P2，P3，P4和P5分别代表香蕉现蕾后第0天、10天、20天、40天和80天的果实；暗示着MaHY5like3蛋白可能在果实发育过程中具有重要的生物学功能。
MaHY5like3基因的核苷酸序列为：
ATGCTCCAGGAACAAGCCACGAGCTCCCTTCCTTCCAGCAGCGAGAGATCCTCCAGCTCTGCCCCTCAGATGGAAATCAAAGAAGGAATGGAGAGCGACGAGGATGTAAGACGAGTGCCGGAGTTCGGGCTAGAGTTAGCAGGTCCGTCCTCCTCCGAGCGAGGACACGGTTCGGCGGTCGGCCAGGACCAGGCTCGGGTCGGGCAGCGGAGGAGGGGGAGGAGCCCCGCCGACAAAGAGCACAAGCGTCTCAAAAGGTTGCTGAGGAATAGAGTATCGGCTCAGCAGGCAAGGGAGCGGAAGAAAGCTTATCTGAATGATCTGGAGGCCAAGGTGAAGGATTTGGAGGCCAAGAACTCGGAGCTGGAGGAGAGGATGTCCACATTGCAGAACGAGAACAACATGCTGAGACAAATCCTGAAGAATACAACTGTGAGCAGAAGAGGATCCAGTGGCAGTGCCACCGCAGACAGCCAATAG。
实施例3-MaHY5like3的功能分析
为了进一步研究MaHY5like3在香蕉使果实发育中的功能，本发明通过构建了35S:MaHY5like3-GFP的表达载体，并通过农杆菌介导的瞬时转化方法，在抽蕾20天的香蕉果实中瞬时过表达MaHY5like3，以瞬时转化35S-GFP的果实作为对照，分析MaHY5like3过表达果实中MaHY5like3基因的表达水平。
MaAPS1和MaPsy2b是分别编码香蕉中淀粉和类胡萝卜素生物合成通路中关键酶的两个基因，亦是决定香蕉果实中淀粉和类胡萝卜素含量的两个重要基因。本发明通过在果实中瞬时过表达MaHY5like3，进一步分析MaAPS1和MaPsy2b两个基因的表达水平。
关于MaHY5like3瞬时表达载体的构建以及转化香蕉果实薄片，具体实验方法如下：
a.将MaHY5like3基因的CDS序列利用5’-AGAACACCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCTCCAGGAACAAGCCACGAGCTC-3’和5’-TGCTCACCATGGTACCCGGGGATCCCGCCGCCGCTTGGCTGTCTGCGGTGGCACTGCCAC-3’引物进行扩增；
b.利用XbaI和BamHI两种限制性内切酶对pCambia1300-35S-cGFP-Tnos载体质粒进行双酶切，将酶切后的载体与扩增后的目的片段进行回收，利用NEBuilder HiFi DNAAssembly Master Mix试剂盒进行连接，转化及测序验证，最终得到香蕉转录因子MaHY5like3的pCambia1300-35S-MaHY5like3-GFP表达载体；
c.将构建好的载体，转入GV3101农杆菌，冰浴30min，液氮5min，37℃5min，加入1mlLB液体培养基，28℃，220rpm培养4-5h；吸取200μl菌液至20mg/L Kana和Rif的LB固体培养基上，均匀涂于平板上，28℃倒置培养2d；挑单克隆验证，将检测正确的单克隆农杆菌转入5ml LB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养24h，保菌以供用于后续实验；
d.取1ml摇好的菌液转入500ml液体LB培养基中，28℃，220rpm振荡培养16-24h。4000rpm离心20min收集菌体。用浸染液(1L浸染液含有10mM Mgcl2，10mM MES，100μM乙酰丁香酮，pH 5.6)悬浮菌体，用枪头吹打散菌块混匀，调整菌液OD600值至0.8～1，侵染液在24℃静置3h后,立即用于侵染香蕉果实薄片；
e.在超净工作台将巴西蕉果实薄片切至1mm厚度，用75％乙醇浸泡1min，再用无菌水冲洗1次；20％次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗3-5次。用pCambia1300-35S-MaHY5like3-GFP和pCambia1300-35S-GFP侵染液分别浸泡果实薄片，抽真空后浸泡15min；将薄片取出后用无菌滤纸吸干薄片表面的菌液后，转至MS培养基，28℃暗培养3d，光下培养1d后用于MaHY5like3，MaAPS1和MaPsy2b基因的表达分析。
经结果表明，与对照组(瞬时转化35S-GFP的果实)相比，MaHY5like3过表达果实中MaHY5like3基因的表达水平显著上调，如图3A所示。并且，通过在果实中瞬时过表达MaHY5like3，发现MaAPS1和MaPsy2b两个基因的表达水平均显著高于对照组，如图3B和3C所示，即，MaHY5like3基因瞬时过表达果实中MaHY5like3、MaAPS1和MaPSY2b基因的表达水平显著高于35S:GFP瞬转材料，进一步说明了MaHY5like3可能通过调控淀粉和类胡萝卜素合成通路中相关基因的表达，从而调控果实品质的形成。
实施例4-酵母单杂实验
G-box，ACE-box，GATA-box等元件是HY5转录因子的结合部位，在MaAPS1和MaPsy2b两个基因的启动子上都含有HY5的结合元件。本发明通过酵母单杂实验，验证MaHY5like3调控MaAPS1和MaPsy2b两个基因表达之间作用关系，具体步骤如下：
(1)将MaHY5like3基因的CDS序列利用5’-CATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGCTGCAGGAGCAGGCAACCAGCTC-3’和5’-AGTATCTACGATTCATCTGCAGCTCGAGCTACTTGCCTTCTCCATTGGCATTAA-3’引物进行扩增，利用EcoRI和XhoI两种限制性内切酶对PB42AD载体质粒进行双酶切，将酶切后的载体与扩增后的目的片段进行回收，利用NEBuilder HiFi DNA AssemblyMaster Mix试剂盒进行连接，转化及测序验证，最终得到香蕉转录因子MaHY5like3的PB42AD-MaHY5like3酵母表达载体；
(2)将MaAPS1和MaPsy2b基因启动子的核苷酸序列，利用KpnI和XhoI两种限制性内切酶分别对目的片段及pLacZ-2U载体进行双酶切，将酶切后的目的片段和pLacZ-2U载体片段回收后，利用T4连接酶进行连接，转化及测序验证，最终分别得到含有MaAPS1和MaPsy2b基因启动子的载体pLacZ-2U-MaAPS1-promoter和pLacZ-2U-MaPsy2b-promoter；
(3)将-80℃冻存的EGY48划线到SD-Ura平板上，放入30℃温箱培养48h左右；跳取单克隆至5mlYPDA液体培养基中，置于220rpm摇床，30℃培养16小时左右；将过夜培养的酵母按1:200的比例转接到50-250ml YPDA培养基中，扩大培养3小时左右，至OD600＝0.5±0.1；将酵母培养液分装到50mlBD管中，1000g室温离心5分钟；弃上清，用无菌ddH2O重悬酵母细胞；1000g室温离心5分钟，弃上清；用1×TE/LiAc重悬酵母细胞；
(4)将构建有MaAPS1和MaPsy2b基因启动子的载体pLacZ-2U-MaAPS1-promoter和pLacZ-2U-MaPsy2b-promoter和构建有MaHY5like3基因酵母表达载体PB42AD-MaHY5like3等量混合(通常每种载体100ng)，加入100ng鲑鱼精DNA；加入100μL1×TE/LiAc重悬的酵母细胞，混匀；加入600μL PEG/LiAc溶液，震荡混匀；30℃，200rpm孵育30分钟；加入70μL二甲基亚砜(DMSO),上下颠倒混匀；40℃热激15min；冰上2min；14000g离心5s，弃上清；0.5mL 1×TE buffer重悬转化后的酵母细胞；
(5)将重悬后的酵母细胞涂至SD-Trp-Ura二缺板，30℃培养48-72h；长出的单克隆划线至SD-Trp-Ura/Gal/Raf/X-gal显色板上，置于30℃培养12-24h，拍照，SD-Leu-Trp-His+50mM 3-AT(3-Amino-1，2，4-triazole)用于检测相互作用。经酵母单杂实验发现MaHY5like3可以直接结合到MaAPS1和MaPsy2b两个基因的G-box元件上，从而参与直接调控这两个基因的表达，如图4所示，1:1为酵母菌原液；1:100为酵母菌原液稀释100倍；1:1000为酵母菌原液稀释1000倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院海口实验站
<120> 香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctccagg aacaagccac gagctccctt ccttccagca gcgagagatc ctccagctct 60
gcccctcaga tggaaatcaa agaaggaatg gagagcgacg aggatgtaag acgagtgccg 120
gagttcgggc tagagttagc aggtccgtcc tcctccgagc gaggacacgg ttcggcggtc 180
ggccaggacc aggctcgggt cgggcagcgg aggaggggga ggagccccgc cgacaaagag 240
cacaagcgtc tcaaaaggtt gctgaggaat agagtatcgg ctcagcaggc aagggagcgg 300
aagaaagctt atctgaatga tctggaggcc aaggtgaagg atttggaggc caagaactcg 360
gagctggagg agaggatgtc cacattgcag aacgagaaca acatgctgag acaaatcctg 420
aagaatacaa ctgtgagcag aagaggatcc agtggcagtg ccaccgcaga cagccaatag 480
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaacacctg caggtcgact ctagaatgct ccaggaacaa gccacgagct c 51
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctcaccat ggtacccggg gatcccgccg ccgcttggct gtctgcggtg gcactgccac 60
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catatggcca tggaggccag tgaattcatg ctgcaggagc aggcaaccag ctc 53
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtatctacg attcatctgc agctcgagct acttgccttc tccattggca ttaa 54

Claims (2)

1. 香蕉bZIP转录因子在促进香蕉果实中的MaAPS1和MaPsy2b基因表达的应用，其特征在于：香蕉bZIP转录因子为香蕉MaHY5基因中的MaHY5like3基因，所述MaHY5like3基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的香蕉bZIP转录因子在促进香蕉果实中的MaAPS1和MaPsy2b基因表达的应用，其特征在于：所述MaHY5like3基因结合至MaAPS1和MaPsy2b基因的G-box元件上，用于调控MaAPS1和MaPsy2b基因的表达。
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