KR101677483B1 - 벼 유래의 종자무기성분함량을 증진시키는 OsNAS3 유전자가 과발현된 항생제 마커프리 형질전환 벼 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체 형질전환에 관한 기술로서, 구체적으로 벼 유래의 종자무기성분함량을 증진시키는 유전자인 OsNAS3가 도입되고 항생제 선발 마커가 제거된 형질전환 벼 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 형질전환 벼는 항생제 선발마커가 들어있지 않아 GM작물에 대한 소비자들의 안전성에 대한 우려를 경감하여 상업적인 활용이 타 형질전환 벼에 비해 우수하다. 또한, 본 발명에 사용된 OsNAS3은 벼에서 종자무기성분함량을 증가시키는 유전자로서, 상기 유전자의 과발현을 통해 인체에 필요로 하는 미량 원소인 철, 아연, 알루미늄 및 구리의 함량을 벼 종자내에서 증진시킬 수 있다.

Description

벼 유래의 종자무기성분함량을 증진시키는 OsNAS3 유전자가 과발현된 항생제 마커프리 형질전환 벼{Antibiotic marker-free transgenic rice with over-expressed of OsNAS3 gene from Oryza sativa enhancing content of seed inorganic compounds}

본 발명은 벼 유래의 종자무기성분함량을 증진시키는 유전자인 OsNAS3가 도입되고 항생제 선발 마커가 제거된 형질전환 벼 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

벼는 세계 4대 식량작물의 하나로 우리나라를 포함한 아시아 지역 사람들의 주식이 되는 작물로, 많은 연구자들이 관행 교배육종, 분자육종 및 형질전환방법 등 다양한 육종방법을 통해 경제성 및 수량성을 향상을 위해 노력하고 있다. 이 중 형질전환 방법은 관행의 육종방법에 비해 농업적으로 유용한 유전자를 직접 작물에 도입함으로써 유전적으로 개량된 신품종을 개발할 수 있는 장점이 있다. 즉 농업분야에서의 형질전환기술은 병충해, 가뭄, 습해, 자외선 등 다양한 생물학적, 비생물학적 스트레스에 대한 내성 등 작물의 수량성 관련 형질은 물론, 아이소플라본, 비타민 A, 철분 등 작물의 유용성분을 증가시킬 수 있도록 하는 품질관련 형질의 개선을 위해 보다 직접적이고 적극적으로 활용할 수 있는 육종법이다.

그러나 대부분의 기존의 형질전환기술은 유전자가 도입된 세포, 캘러스, 식물조직의 선발, 배양, 및 식물체 재분화를 위해 bar(Basta herbicide resistant gene), hpt(hygromycin phosphotransferase), NPTⅡ(neomycin phosphotransferase) 등의 제초제 및 항생제 저항성 유전자가 선발마커(selectable marker)로 이용된다. 선발마커 유전자는 목적유전자와 함께 동일 벡터에 탑재하여 식물조직에 형질전환 한 후 포스피노트리신 또는 하이그로마이신 B 등 항생제가 포함된 배지에서 선발 및 배양함으로써 효과적으로 형질전환 식물체를 생산하는 방법이다. 그러나 일반소비자들은 선발마커 유전자의 유해성 우려로, 형질전환작물 및 이를 원료로 한 가공식품에 대해 매우 부정적인 시각을 가지고 있어 형질전환작물의 실용화는 매우 어려운 실정이다.

한편, 철은 체내에 산소를 공급해 주는 헤모글로빈의 구성 성분으로서 산소를 각 조직으로 운반하는 역할을 한다. 철은 간, 살코기, 달걀노른자, 검정콩, 진한 녹색 채소에 많이 들어있는 영양소로 한번 체내로 흡수된 철은 극히 일부만 배설되고 재사용되므로 일일 필요량은 적다. 하지만 성장기 어린이와 청소년, 성인 여성, 특히 임신부는 필요량이 증가하여 장기적으로 철 섭취가 부족하면 빈혈을 일으키기 쉬우며 빈혈이 생기면 안색이 창백하고 어지러우며 피로감으로 쇠약해져 집중력이 떨어지고 작업 및 학습 능력이 감소한다. 벼에는 철이 미량 들어 있어 쌀을 주곡으로 먹는 나라에서는 철 결핍에 따른 병이 많이 발생하고 있다. 이에 따라, 철을 비롯한 무기성분함량을 증진시킬 수 있는 작물을 개발하기 위해 지금까지 많은 연구가 수행되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 철을 비롯한 무기성분함량을 증진시킬 수 있는 유전자를 벼에서 발견하였으며, 벼에서 유래한, 종자무기성분함량을 증진시키는 OsNAS3 유전자가 도입되고, 항생제 선발마커가 제거된 형질전환용 벡터를 제작하였고, 이를 형질전환시켜 종자내 철을 비롯한 무기성분 함량이 증가된 항생제 선발마커프리 형질전환 벼를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 인산을 포함하는 MS(Murashige-Skoog) 배지에 현미를 치상하여 30 내지 35℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; (b) OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터가 도입된 아그로박테리움 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 아그로박테리움을 2.5 : 1 내지 3.5 : 1의 비율로 캘러스에 접종시켜 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 배양된 캘러스로부터 재분화 벼 식물체를 유도하는 단계; 및 (d) 상기 유도된 재분화 식물체로부터 OsNAS3 유전자가 도입되고, 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는, 형질전환 벼를 선별하는 단계를 포함하는, OsNAS3 유전자가 도입되고 항생제 선발 마커가 제거된, 형질전환 벼의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 OsNAS3 유전자가 도입되고 항생제 선발 마커가 제거된, 형질전환 벼를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 인산을 포함하는 MS(Murashige-Skoog) 배지에 현미를 치상하여 30 내지 35℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; (b) OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터가 도입된 아그로박테리움 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 아그로박테리움을 2.5 : 1 내지 3.5 : 1의 비율로 캘러스에 접종시켜 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 배양된 캘러스로부터 재분화 벼 식물체를 유도하는 단계; 및 (d) 상기 유도된 재분화 식물체로부터 OsNAS3 유전자가 도입되고, 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는, 형질전환 벼를 선별하는 단계를 포함하는, OsNAS3 유전자가 도입되고 항생제 선발 마커가 제거된, 형질전환 벼의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 (a) 단계는 형질전환 벼를 제조하기 위하여, 먼저 인산을 포함하는 MS(Murashige-Skoog) 배지에 현미를 치상하여 30 내지 35℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계이다.

본 발명에서 용어, “벼(Oryza sativa)”는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀 식용작물로서, 열매를 찧은 것을 쌀이라고 하며, 전세계 인구의 40% 정도가 쌀을 주식량으로 한다. 벼속에 속하는 식물로는 20여 종(種) 이상이 알려져 있으나 실제로 재배되고 있는 것은 벼(O. sativa)가 대부분이다. 본 발명의 형질전환 대상으로서, 구체적으로 풍옥, 수성, 팔굉, 팔달, 진흥, 재건, 팔금, 농백, 낙동, 관악, 진주, 설악, 동진 등이 있으나, 벼목에 속하는 식물체라면 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 동진벼일 수 있다.

본 발명에서 용어, “배지”란 미생물이나 동식물의 세포 또는 조직 등을 배양하기 위해 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 함유한 것을 의미한다. 현재까지 수많은 종류의 배지가 개발되어 있으나, 실험 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명에서 사용한 MS 배지는 Murashige-Skoog 배지라고도 하며, 상기 배지는 일반적으로 캘러스 등의 식물세포를 배양하기에 적절한 증식배지로 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 MS 배지는 다른 배지에 비하여 질산, 암모늄 등의 질소원과 포타슘 이온의 함량이 높은 편이다.

본 발명에서 용어, “현미”란 수확한 벼를 건조, 탈곡한 후 왕겨를 벗긴 쌀로서, 과피, 종피 등의 겨층은 벗겨지지 않은 상태의 쌀을 의미한다. 바람직하게 상기 현미는 동진벼 품종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “캘러스”란 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리를 의미하며, 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 이러한 캘러스의 배양은 식물의 기관에서 분리해 낸 상처받은 절편체 조직으로부터 세포 분열 증식시키는 것을 의미하며, 이는 형태형성, 세포 구조 및 물질대사를 연구하는데 널리 이용될 수 있다.

본 발명의 (a) 단계는 캘러스를 유도하는 단계로서, ⅰ) MS 배지에 인산을 추가로 포함하고, 또한 ⅱ) 종래의 캘러스 배양온도인 25℃보다 높은 30 내지 35℃에서 배양함으로써 캘러스의 배양기간을 훨씬 단축시킬 수 있는 효과가 있다.

일반적으로 캘러스의 치상배지에서 현미를 배양함에 있어, 25℃ 내외의 온도에서 배양을 한다. 다만, 본 발명에서는 캘러스 배양온도를 종래의 25℃에서 30 내지 35℃, 바람직하게는 32℃로 높임으로써 캘러스 배양기간이 단축되는 효과를 확인하였다.

또한, 본 발명에서는 캘러스의 생장촉진을 위하여 종래의 MS 배지에 인산, 구체적으로 KH2PO4를 추가함으로써, 마찬가지로 캘러스 배양기간을 단축시킬 수 있음을 확인하였다. 이때, 상기 배지 내에 포함되는 인산의 농도는 바람직하게는 3.0 내지 4.0 %(w/v), 가장 바람직하게는 3.6 %(w/v) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에 따라, 캘러스 발생기간이 2주에서 1주로 단축되었고, 현미에서 유도된 캘러스를 새로운 캘러스 유도 배지에 치상하고 나서 1주일 후에 생장된 캘러스를 형질전환에 이용할 수 있었다. 따라서 기존의 캘러스 배양에 4주의 기간이 소요되던 것을 2주로 단축할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 (b) 단계는 OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터가 도입된 아그로박테리움 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 아그로박테리움을 2.5 : 1 내지 3.5 : 1의 비율로 캘러스에 접종시켜 배양하는 단계이다.

구체적으로, 본 발명의 (b) 단계는 아그로박테리움 공동형질전환법(Agrobacterium-mediated co-transformation)으로 형질전환 벼를 제조하는 단계이다.

먼저, OsNAS3 유전자를 포함하면서 항생제 저항성 유전자가 제거된 마커프리 재조합 발현벡터는 하기와 같이 제조될 수 있다.

본 발명에서 용어, “OsNAS3"은 니코티아나민 합성효소 유전자(nicotianamine synthase genes) 군(family)의 하나로서, 식물체 내에 존재하는 금속 원소들과 결합하는 킬레이터 (chelator)로서, 금속 원소들의 흡수와 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 유전자로 알려져 있다. 바람직하게는 상기 OsNAS3 유전자는 서열번호 5의 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. (OsNAS3의 Genebank Accession number : AB023819.1)

본 발명의 일실시예에서는 벼에 존재하는 OsNAS3유전자를 활성화시켰을 때 철을 포함한 미량 원소의 함량이 증가되었음을 확인하였으며(도 4), OsNAS3을 과발현시켜 종자내 철함량이 증진된 벼의 개발을 통해 철을 비롯한 미량원소의 결핍을 예방할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 “유전자”에는 DNA, RNA 등이 포함될 수 있다. DNA에는 유전체 DNA(gemonic DNA), cDNA 등을 포함할 수 있으며, RNA에는 mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자는 오픈리딩프레임(open reading frame)은 물론, TATA 박스나 폴리-A-tail 서열 등의 비번역 부위(UTR) 등을 모두 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “벡터”란 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 구체적으로, 종자무기성분함량을 증진시키는 유전자 OsNAS3의 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 종자무기성분함량 증진 단백질을 암호화하는 OsNAS3 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선발마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어, "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는, 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 OsNAS3을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 식물 바이러스 벡터 등이 있으며, 구체적 예로서 pCHF3, pPZP, pGA, pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용할 수 있다. 그러나 당업자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

한편, 발현벡터에 존재하는 항생제 저항성 유전자 및/또는 이의 프로모터를 제거하고 난 후, 남은 부분을 재결합(ligation)시킴으로써 상기 항생제 저항성 유전자 및/또는 이의 프로모터가 없는 마커프리 벡터를 제조할 수 있다. 본 발명에서 용어, “마커프리”는 항생제 내성 유전자가 없는 또는 항생제 내성 유전자를 제거한 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어, 항생제는 미생물 등이 생산하는 대사산물로서, 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질을 의미한다. 항생제의 종류에는 페니실린류, 세팔로스포린류, 아미노글리코사이드류, 테트라사이클린류, 클로람페니콜, 폴리펩티드류, 퀴놀론류 등이 존재하며, 바람직하게는 아미노글리코사이드류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하이그로마이신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터”는 목적 유전자가 도입되지 않으며, 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터를 의미한다. 상기 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터는 공벡터로도 명명되며, 상기에 설명한 OsNAS3 유전자가 도입된 마커프리 벡터의 제조단계를 거치지 않은 일반적인 플라스미드일 수 있으며, 구체적으로 pCAMBIA1300 벡터일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 (b) 단계는 상기 벡터를 캘러스에 접종하는 단계로서, 구체적으로 상기 과정을 통해 제조된, OsNAS3 유전자를 포함하는 항생제 마커프리 발현벡터 또는 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터를 아그로박테리움 균주에 도입시키는 단계에 해당한다. 본 발명에서는 형질전환 벼 생산을 위해 LBA4404, AGL1 및 EHA105 등 다양한 아그로박테리움이 제한없이 이용될 수 있으며, 도입방법 역시 통상적인 아그로박테리움의 도입방법이 적용될 수 있다.

바람직하게는 상기 캘러스는 배양한지 2주 내지 3주 이내의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는 상기 OsNAS3 유전자를 포함하는 항생제 마커프리 발현벡터와 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터의 비율은 2.5 : 1 내지 3.5 : 1의 비율로 혼합하여 도입될 수 있으며, 보다 바람직하게는 3 : 1의 비율로 혼합하여 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. OsNAS3 유전자를 포함하는 항생제 마커프리 발현벡터가 도입된 개체를 수득하고자 하는 것이므로, 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터보다 더 많이 혼합되어야 하나, 지나치게 많은 경우에는 항생제가 포함된 재분화배지에서 재분화된 개체를 수득하기 어려우므로, 2.5 : 1 내지 3.5 : 1의 비율로 혼합하여 도입될 수 있으며, 보다 바람직하게는 3 : 1의 비율로 혼합하여 도입하는 것이 바람직하다.

본 발명의 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 배양된 캘러스로부터 재분화 벼 식물체를 유도하는 단계이다.

구체적으로, 상기 벡터가 도입된 아그로박테리움이 접종된 캘러스를 재분화 배지에 배양함으로써, 벼 식물체를 성장시키는 단계이다.

본 발명에서 용어, “재분화”는 배양 조건을 변화시킴으로써 부정 싹이나 부정 뿌리가 형성되어 식물체가 재생하는 출발점이 되는 현상을 의미한다. 즉, 기존의 캘러스 상태의 세포는 특별한 기능을 갖도록 성장하는 능력이 없었으나, 배양 조건을 변화시켜 줌으로써 식물체가 자랄 수 있도록 하는 것을 의미한다.

본 발명에서의 재분화 배지에는 항생제가 포함되어 있는 것을 특징으로 한다. 따라서 상기 배지에서 재분화하는 벼 식물체는 OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터와 항생제 저항성 유전자를 포함하는 공벡터가 함께 도입된 형질전환 벼이거나, 또는 항생제 저항성 유전자를 포함하는 공벡터만이 도입된 형질전환 벼에 해당할 수 있다.

본 발명의 (d) 단계는 상기 유도된 재분화 식물체로부터 OsNAS3 유전자가 도입되고, 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는, 형질전환 벼를 선별하는 단계이다.

구체적으로, 상기 (d) 단계는, (c) 단계의 재분화 단계를 통해 선발된 형질전환 식물체 중에서 OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터가 도입된 형질전환체를 선택적으로 선발하기 위하여, OsNAS3 유전자를 검출하고, 항생제 저항성 유전자의 도입 여부를 확인하는 단계이다.

이러한 (d) 단계는 OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터에 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR) 등으로 OsNAS3 유전자의 도입 여부를 확인함으로써, OsNAS3 마커프리 벡터가 삽입된 개체를 선발할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이때, PCR 반응의 증폭산물을 검출하는 방법 또한 전기영동법에 의할 수 있으나, 당업계에 알려진 다른 기술에 의하여도 증폭될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

이후, 상기 형질전환 벼 개체를 이앙하여 수득한 종자의 이앙개체로부터 DNA 추출을 통하여 항생제 저항성 유전자의 삽입 여부를 확인할 수 있고, 이들 개체의 세대 진전을 통하여 수득한 개체에 대하여도 이를 확인함으로써 OsNAS3 유전자가 도입되고, 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는, 형질전환 벼를 최종적으로 선발할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, pCAMBIA1300벡터에 제한효소 XhoI과 EcoRI을 처리하여 하이그로마이신 저항성 유전자(HPT)가 제거하고, 이후 상기 벡터에 OsNAS3 유전자를 삽입하여 제조한 마커프리 벡터를 만들고, 상기 마커프리 벡터와 공벡터를 3 : 1의 비율로 캘러스에 접종시켜 배양 및 재분화한 후, OsNAS3 마커프리 벡터 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 및 전기영동을 통해 OsNAS3 마커프리 벡터가 삽입된 22개체를 선발하였다. 이후 세대 진전을 통한 개체에 대한 선발을 계속한 결과 생육양상이 가장 우수한 계통의 OsNAS3 마커프리 형질전환 벼를 선발하여 이를 기탁하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 OsNAS3 유전자가 도입되고 항생제 선발 마커가 제거된, 형질전환 벼를 제공한다.

상기 OsNAS3 유전자, 항생제 선발 마커에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, “형질전환”은 일반적으로 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미할 수 있다. 상기 형질전환은 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 식물 병원균 아그로박테리움을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 아그로박테리움은 그들의 Ti(종양 유도성, tumor-inducing) 또는 Ri(뿌리 유도성, root-inducing) 플라스미드 DNA 중 일부(T-DNA)를 감염된 식물 세포 내로 전이 이식시키는 능력을 지니고 있다. 따라서 목적 유전자를 T-DNA 내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다.

본 발명의 형질전환 벼는 벼 유래 종자무기성분 함량을 증진시키는 OsNAS3 유전자가 발현된 또는 발현될 수 있는 상태로 세포 내에 존재하는 벼의 형질전환 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 형질전환 벼는 상기 유전자가 도입된 형질전환세포를 포함한 벼의 식물체 전체 또는 일부 기관 등을 모두 포함할 수 있으며, 상기 유전자가 도입된 식물체의 유성생식 또는 무성생식에 의해 얻어질 수 있는 종자, 식물체 및 이의 조직이나 기관의 일부도 포함될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 형질전환 벼는 기탁번호 KACC98041P 인 것인 형질전환 벼 또는 이의 종자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환 벼는 OsNAS3을 과발현시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 용어, “과발현”이란 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 유전자를 변형 세포 내에서 인공적으로 발현시켜 전구체 숙주 세포 내에서 동일한 폴리펩티드의 발현 수준을 넘어서는 암호화된 폴리펩티드의 발현의 수준을 생성하도록 하는 과정을 의미한다. 따라서, 본 발명의 형질전환 벼는 OsNAS3 유전자가 형질전환 됨으로써, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 카피의 수가 증가되어 이를 과발현할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 형질전환 벼는 상기의 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환 벼는 항생제 선발마커가 들어있지 않아 GM작물에 대한 소비자들의 안전성에 대한 우려를 경감하여 상업적인 활용이 타 형질전환 벼에 비해 우수하다. 또한, 본 발명에 사용된 OsNAS3은 벼에서 종자무기성분함량을 증진시키는 유전자로서, 상기 유전자의 과발현을 통해 인체에 필요로 하는 미량 원소인 철, 아연, 알루미늄 및 구리의 함량을 벼 종자내에서 증진시킬 수 있다.

도 1은 pCAMBIA1300 형질전환용 벡터를 이용하여 벼 유래 종자무기성분함량을 증진시키는 OsNAS3을 삽입하고, 항생제 선발마커(하이그로마이신저항성) 유전자를 제거하여 형질전환용 마커프리 벡터를 제작한 것을 나타낸 도이다. 도 1a는 pCAMBIA1300의 선발마커-프리 형질전환용 벡터를 나타낸 도이고, 도 1b는 pCAMBIA1300의 하이그로마이신 삽입 공벡터를 나타낸 도이다.
도 2는 캘러스가 치상된 재분화배지, 재분화 배지에서 캘러스를 재분화하는 모습, 재분화된 식물체가 성장하는 모습을 나타낸 사진이다.
도 3은 T0세대에서의 OsNAS3 형질전환용 벡터의 삽입여부의 확인을 위한 전기영동 결과를 나타낸 것으로, 재분화식물체의 DNA를 추출하여 마커프리 벡터 특이적인 프라이머를 제작하였으며, PCR을 통하여 마커프리 벡터가 삽입된 식물체를 22개체 선발하였다.
도 4는 OsNAS3 마커프리 벡터 삽입이 확인된 형질전환벼의 종자내 무기성분함량을 확인한 것이다.
도 5는 하이그로마이신 벡터 삽입 및 선발마커프리 벡터 삽입 확인용 PCR 결과 및 RT-PCR 결과를 나타낸 것으로, 선발된 식물체를 세대진전하여 개체 분리를 통하여 T4세대에서 항생제선발마커 유전자가 분리되고 마커프리 형질전환용 벡터만 삽입된 개체 4개체를 선발하였으며, 이들 개체에서 OsNAS3유전자 발현량을 확인하였다.

이하, 하기 예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 마커프리 벡터 제작

pCAMBIA1300벡터에 제한효소 XhoI과 EcoRI을 처리하여 하이그로마이신 저항성 유전자(HPT) 및 하이그로마이신 저항성 유전자의 발현을 위한 CaMV35S 프로모터까지 제거하였다. 이 후 DNA 엑소뉴클레아제(DNA exonuclease)를 처리하여 잘려진 벡터 양쪽 말단(N-terminal, C-terminal)부위에 각각 남아 있는 XhoI과 EcoRI 부위를 평활말단(blunt-end)으로 만든 후 양쪽 말단을 자가결합(self-ligation)시켜 마커프리 벡터를 제조하였다. 이후 상기 마커프리 벡터에 OsNAS3 유전자를 제한효소 XbaI 위치에 맞게 삽입함으로써, 형질전환용 벡터를 제조하였다(도 1).

실시예 2: 형질전환을 위한 캘러스 유도

형질전환에 사용되는 캘러스를 유도하기 위하여 캘러스 치상 배지(4.43 g/l MS salts with vitamins, 2 mg/ℓ 2,4-D, 2.872 g L-proline, 2 g/ℓ Casein hydrolysate, 30 g/ℓ sucrose 및 4 g/ℓ Gelite, 0.36 g KH2PO4, pH 5.8)를 제조하였다. 제조된 배지를 pH 5.8로 맞추어 고압 멸균 후 페트리 디쉬에 분주하여 건조 후 현미를 치상하였다. 현미를 치상 후 배양온도를 기존 25℃에서 32℃로 높여 1주일간 배양하였고 현미에서 유도된 캘러스를 새로운 캘러스 유도 배지에 치상하여 1주일간 배양하여 형질전환에 사용하였다.

실시예 3: OsNAS3 마커프리 벡터를 이용한 형질전환

상기 실시예 1에 따라 제조한 형질전환용 벡터를 이용하여, 상기 실시예 2에 따라 제조된 캘러스를 이용하여 아그로박테리움-매개 공동형질전환법(Agrobacterium-mediated co-transformation)으로 형질전환 벼를 제조하고자 하였다.

형질전환용 OsNAS3 마커프리 벡터가 들어있는 아그로박테리움과, 하이그로마이신 저항성 유전자 삽입 벡터가 들어있는 아그로박테리움을 각각 카나마이신　및 리팜피신　항생제가 포함된 YEP 액체배지에서 28℃에서 3일간 증식시켰다. 증식된 각 벡터를 원심분리하여 추출하여 OsNAS3 마커프리 벡터의 아그로박테리움과 하이그로마이신 저항성 유전자 삽입 벡터 아그로박테리움의 농도를 3:1로 조절하여 형질전환에 이용하였다.

제조된 형질전환용 벡터 삽입 균을 100 μM 아세토실링곤이 포함된 부유배지(suspension medium, 4.43 g/ℓ MS salts with vitamins, 2 mg/ℓ 2,4-D, 0.5 g/ℓ casamino acid, 65.8 g/ℓ sucrose 및 36 g/ℓ glucose, pH 5.7)에 희석하여 OsNAS3 마커프리 벡터의 아그로박테리움과 하이그로마이신 저항성 유전자 삽입 벡터 아그로박테리움의 농도가 3:1로 조절된 혼합 균의 농도를 0.01(OD600=0.01)로 만들어 캘러스를 혼합하였다.

아그로박테리움균이 혼합된 부유 배지(suspension medium)에 캘러스를 넣고 20분간 접종 뒤 공동배양배지(4.43 g/ℓ MS salts with vitamins, 2 mg/ℓ 2,4-D, 0.5 g/ℓ L-proline, 30 g/ℓ sucrose, 10 g/ℓ glucose, 0.5 g/ℓ MES 및 2.5 g/ℓ phytogel, pH 5.7 with 100 μM 아세토실링곤)에 치상 후 3일간 25℃에서 배양하였다.

공동배양배지에 치상하고 3일 후, 캘러스를 선발배지(4.43 g/ℓ MS salts with vitamins, 2 mg/ℓ 2,4-D, 0.5 g/ℓ L-proline, 30 g/ℓ sucrose, 10 g/ℓ glucose, 0.5 g/ℓ MES 및 2.5 g/ℓ phytogel, pH 5.7, 50mg HPT)에 치상하여 25℃에서 3주간 배양 뒤 정상적인 생장을 하는 캘러스를 재분화 배지Ⅰ(4.43 g/ℓ MS salts with vitamins, 2 mg/ℓ 2,4-D, 0.5 g/ℓ L-proline, 30 g/ℓ sucrose, 10 g/ℓ glucose, 0.5 g/ℓ MES, 30 g D-Sorbitol 및 2.5 g/ℓ phytogel, pH 5.7, 50 mg HPT, 0.1 ㎖/ℓ NAA, 1 ㎖/ℓ kinetin)에 1주간 배양 후, 타 영양성분은 재분화 배지Ⅰ과 같고 생장호르몬인 NAA과 kinetin의 함량을 조절한 재분화 배지 Ⅱ(10 ㎕/ℓ NAA, 3 ㎖/ℓ kinetin)에 2주 이상 배양하여 재분화된 식물체를 MS배지로 이식하여 형질전환 식물체 60 개체를 확보하였다(도 2).

실시예 4: 형질전환 벼( T0 )의 선발

상기 실시예 3을 통해 확보된 형질전환 식물체의 하이그로마이신 유전자 삽입 벡터 및 OsNAS3 마커프리 벡터의 삽입 여부를 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 OsNAS3 마커프리 벡터 특이적인 프라이머(OsNAS3 Vector F, OsNAS3 Vector R)를 제작하였다.

OsNAS3 Vector F	ACATGTCCGCCATGGAGAAGC (서열번호 1)	OsNAS3 마커프리 벡터 삽입 확인용
OsNAS3 Vector R	GAAACCGGCGGTAAGGATC (서열번호 2)

확보한 식물체를 변형된 CTAB DNA 추출방법(Modified CTAB DNA Method)[Lee et al. 2008 JSCS. 40(3):286-290]에 따라 형질전환 벼에서 DNA를 추출하였다.

잎 0.2 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 퀵프랩 버퍼(200 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 1.5 ㎖과 함께 튜브에 넣은 후, 60 ℃에 1시간 반응시켰다. 10,000 X g에서 10분 원심분리하여 상층액 400 ㎕를 새 튜브에 넣고, 이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕를 첨가 후 잘 섞은 후 -80 ℃에서 30분 반응시켰다. 20,000 X g에서 10분 원심분리하여 상층액을 제거하고, 70% 에탄올을 넣고 가볍게 씻어준 후 30분 건조시켰다. DNA 추출버퍼(10 mM NH4OAC, 0.25 mM EDTA) 150 ㎕를 첨가 후 잘 섞어주었다. 60 ℃에서 1 시간 반응 후 10,000 X g에서 10분 원심분리하여 상층액 100 ㎕를 새 튜브에 넣었다. 이렇게 추출한 DNA를 이용하여 제작한 프라이머를 이용하여 다음의 PCR조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR 프라이머로 상기 표 1의 프라이머 세트를 사용하고, 3'-5' 엑소 뉴클레아제 활성이 없는 Taq 중합효소를 사용하여 94 ℃ 30초, 56.5 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다.

PCR 반응 방법으로 DNA는 각 50 ng을 사용하였으며, SSR(Simple Sequence Repeat) 마커 프라이머쌍은 각각 10 pmol를 사용하였으며, PCR 증폭에 관련하여 폴리머라제 및 PCR 완충액이 혼합되어 있는 Premix(Cat. No. G2002, (주) 제넷바이오)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 증폭 조건으로는 추출된 각 계통의 50 ng의 게놈 DNA를 이용하여 30 ㎕ 의 부피 (100 pM의 각 프라이머, 200 μM 각각의 dNTPs, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 0.5 U Taq 중합효소) 조건에서 94.5 ℃, 5 분, 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분, 40 번 반복 반응한 후 마지막으로 72 ℃에서 10 분간 반응한 후 증폭하였다.

PCR 증폭 후, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 사용하여 증폭한 증폭산물은 1 %의 아가로즈 겔(EtBr 0.5 ㎍/㎖ 함유) 상에서 UV로 확인하여 OsNAS3 마커프리 벡터가 삽입된 개체 총 22개체를 선발하였다(도 3).

이렇게 선별된 형질전환 벼의 무기원소함량을 측정하기 위해 수확된 종자의 종피를 인습기를 이용하여 제거하여 현미를 제조 후 가루화 하였다. 현미가루 0.5g을 유리튜브에 넣고 perchloric acid 분해액 10ml과 농황산 1ml을 추가하여 전열판에 두고 온도를 차츰 올려 시료가 완전히 분해될 때까지 가열하였다. 분해가 끝나 색이 투명해진 분해액에 뜨거운 증류수를 첨가하여 잘 흔들어준 뒤 여과지를 이용해 거르고 100ml이 되도록 정량하였다. 정량된 분해액 100ml중 10ml을 취하여 튜브에 덜고 ICP(유도결합플라즈마 원자방출분광기)를 이용해 종자내 무기성분함량을 측정하였다. 종자내의 무기성분 Fe, Zn, Al, Cu 함량이 동진벼에 비하여, OsNAS3 마커프리 벡터가 삽입된 형질전환벼에서, 현저히 증가하였음을 확인하였다. 반면, 동진벼에 비하여, Na 함량은 현저히 감소함을 확인하였다(도 4).

실시예 5: 항생제 선발마커 프리 형질전환 벼( T4 )의 선발

선발된 OsNAS3 마커프리 벡터 삽입 벼를 온실에 이앙하여 종자를 수확하였다. 수확된 종자(T4)를 포장에 이앙하였고, 이앙개체에서 상기 실시예 4와 같은 방법으로 DNA를 추출하여 하이그로마이신 유전자 특이적인 프라이머를 제작하여(표 2), 이 유전자의 삽입 여부를 PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 하이그로마이신이 제거된 4개체를 선발하였다(도 5).

HPT F	CCCATTCGGACCGCAAGGA (서열번호 3)	하이그로마이신 삽입 벡터 확인용
HPT R	CGCTTCTGCGGGCGATTT (서열번호 4)

실시예 6: 항생제 선발마커 프리 형질전환 벼( T4 )의 유전자 고정세대 선발

실시예 5와 같이 선발된 개체의 종자를 수확하여 동계온실에 이앙하여 T4 개체를 확보하였다. 이들 개체들의 유전자 고정상태를 확인하기 위하여 DNA를 추출한 후, OsNAS3 마커프리 벡터 특이적인 프라이머(OsNAS3 Vector F, OsNAS3 Vector R)를 이용하여 PCR을 수행한 결과 유전자 고정계통 3계통을 선발하였다. 이 중 식물체 생육양상이 가장 우수한 1계통을 선발하였고, 이를 농업유전자원센터에 2014년 11월 7일자로 기탁하였다(기탁번호: KACC98041P).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC98041P 20141107

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Antibiotic marker-free transgenic rice with over-expressed of OsNAS3 gene from Oryza sativa enhancing content of seed inorganic compounds <130> KPA141084/KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNAS3 Vector forward primer <400> 1 acatgtccgc catggagaag c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNAS3 Vector reverse primer <400> 2 gaaaccggcg gtaaggatc 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPT forward primer <400> 3 cccattcgga ccgcaagga 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPT reverse primer <400> 4 cgcttctgcg ggcgattt 18 <210> 5 <211> 1482 <212> DNA <213> Oryza sativa Indica Group osnas3 mRNA for nicotianamine synthase 3, complete cds <400> 5 atcaagcaaa gcagctcgat cgagtgttcg actgatcacc agttggagct aatcgatcga 60 gagagagagt atgacggtgg aagtggaggc ggtgaccatg gcgaaggagg agcagccgga 120 ggaggaggag gtgatcgaga agttggttga gaagatcacc gggctggcgg cggccatcgg 180 caagctgccg tcgctgagcc cgtcgccgga ggtgaacgcg ctgttcacgg agctggtgat 240 gacctgcatc ccgcccagca gcgtggacgt ggagcagctg ggggcggagg cgcaggacat 300 gcgcggccgc ctcatccgcc tctgcgccga cgccgagggc cacctcgagg cgcactactc 360 cgacgtcctc gccgcccacg acaacccgct cgaccacctc gccctcttcc cctacttcaa 420 caactacatc cagctcgccc agctcgagta cgccctcctc gcccgccacc tccccgccgc 480 cccgccgccc tcccgcctcg ccttcctcgg ctccggcccg ctcccgctca gctccctcgt 540 cctcgccgcc cgccacctcc ccgccgcctc cttccacaac tacgacatct gcgccgacgc 600 caaccgccgc gccagccgcc tcgtccgcgc cgaccgcgac ctgtccgcgc gcatggcctt 660 ccacacctcc gacgtcgccc acgtcaccac cgacctcgcc gcctacgacg tcgtgttcct 720 ggcggcgctg gtgggtatgg ccgccgagga gaaggcgcgc atggtggagc acctcgggaa 780 gcacatggcg cccggcgccg ccctggtggt gcggacggcg cacggcgccc ggggattcct 840 gtaccccgtg gtggacccgg aggagatccg ccgcggcggc ttcgacgtgc tcgccgtgca 900 ccacccggag ggcgaggtga tcaactccgt catcatcgcg cgcaaccgcc cgtggccggg 960 gccggcgttg gagggaggag acgcgcacgc gcacggccat ggcgccgtgg tgagccgtcc 1020 atgccagcgc tgcgagatgg aggcgagggc gcaccagaag atggaggaca tgtccgccat 1080 ggagaagctg ccctcctcgt aggcaggcat cgatgactgc ttccatcgct tgctacctca 1140 ccagctcacc tgataaatca cctcagttac tatcgattaa tcatttacca tgcattaatt 1200 aagaagaaaa catatatacc ataattatct accagtaaaa caaatctaat agtagtattt 1260 aataatctcg ttggtaatta actgcagtca tgcatgaatg catgccatat tgcgtcgcta 1320 tctttttttc ccatgatgag actgatgaga gagagagaga atatatgtcg ctattgagtg 1380 ttactgcttg attactgtac tagtagctta ttacaatcaa ccattgtctc tgttgcgtat 1440 ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1482

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 5의 염기서열로 구성된 OsNAS3 유전자가 도입되고 항생제 선발 마커가 제거된, 기탁번호 KACC98041P로 기탁된 형질전환 벼.
   
6. 삭제
7. 제5항에 있어서,
   상기 형질전환 벼는 (a) 인산을 포함하는 MS(Murashige-Skoog) 배지에 현미를 치상하여 30 내지 35℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; (b) 서열번호 5의 염기서열로 구성된 OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터가 도입된 아그로박테리움 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 아그로박테리움을 2.5:1 내지 3.5:1의 비율로 캘러스에 접종시켜 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 배양된 캘러스로부터 재분화 벼 식물체를 유도하는 단계; 및 (d) 상기 유도된 재분화 식물체로부터 OsNAS3 유전자가 도입되고, 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는 형질전환 벼를 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인 형질전환 벼.
   
8. (a) 인산을 포함하는 MS(Murashige-Skoog) 배지에 현미를 치상하여 30 내지 35℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
   (b) 서열번호 5의 염기서열로 구성된 OsNAS3 유전자를 포함하는 마커프리 벡터가 도입된 아그로박테리움 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 아그로박테리움을 2.5:1 내지 3.5:1의 비율로 캘러스에 접종시켜 배양하는 단계;
   (c) 상기 (b) 단계의 배양된 캘러스로부터 재분화 벼 식물체를 유도하는 단계; 및
   (d) 상기 유도된 재분화 식물체로부터 서열번호 5의 염기서열로 구성된 OsNAS3 유전자가 도입되고, 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는 형질전환 벼를 선별하는 단계를 포함하는,
   제5항의 형질전환 벼의 제조 방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 현미는 동진벼 품종인 것인 방법.
   
10. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 MS 배지에 포함된 인산은 3.0 내지 4.0 %(w/v) 농도인 것인 방법.
    
11. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계에 사용된 캘러스는 배양한 지 2 내지 3주의 것인 방법.
    
    
    

Images