KR101198648B1 - 직접 신초 유도를 통한 오이 계통의 형질전환 방법 및 상기방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체 - Google Patents

직접 신초 유도를 통한 오이 계통의 형질전환 방법 및 상기방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 옥신계 성장 조절제 및 사이토키닌이 함유된 신초 유도 배지에서 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계를 포함하는, 오이 계통 형질전환체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체, 사과 (Malus domestica) 유래의 hpt (homogentistic acid phytyltransferase) 유전자를 오이 계통에 아그로박테리움 매개 형질전환하여 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 형질전환체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 형질전환체에 관한 것이다.
제아틴, IAA, 신초 유도, 아그로박테리움, 오이 계통, 형질전환체, 토코페롤

Description

직접 신초 유도를 통한 오이 계통의 형질전환 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체{Method for transforming Cucumis sativus line through direct shoot induction and Cucumis sativus line transformant produced by the same}
본 발명은 오이 계통 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 직접 신초 유도를 통한 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 오이 계통 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 오이 계통 형질전환체에 관한 것이다.
박과에 속하는 과채류인 오이 (Cucumis sativus L)는 노지 재배형과 온실재배형으로 구분되는데, 주로 유럽 대륙에서는 노지 재배형이 소비되고 있으며, 온실형은 영국을 중심으로 발달하였다. 아시아 지역의 오이는 중국 화남 및 동북아시아의 남지형과 북지형이 있다. 국내에는 약 1,500년 전에 도입된 것으로 추정되며 신선 또는 가공 채소로 이용되는 한편, 화장수 및 팩 등의 화장품 원료로도 많이 이용되고 있는 등 농가소득에 크게 기여하는 작물이다.
국내에서의 오이 노지 재배면적은 점차 감소하고 있지만, 시설 재배면적이 급증하여 전체 재배면적은 증가하는 추세에 있다. 시설재배의 확대, 시설의 현대화, 품종개량 및 재배기술의 발달로 1995년의 총 생산량은 1980년의 2배에 달하였다.
이와 같이 중요한 과채류인 오이 재배시 가장 문제시 되는 것은 병충해이다. 오이의 병충해는 진균병, 세균병 그리고 바이러스병 등이 보고되어 있다. 상기 병충해 중에서, 진균 및 세균에 의한 병은 약제 방제 및 계속적인 관리를 통해 피해를 줄일 수 있으나, 바이러스에 의한 피해는 현재로는 방제가 불가능한 실정이다. 또한 해충에 의한 피해도 적지 않으므로 이에 대한 방제 방법은 현재 약제에 의한 방법이 유일한 수단이다. 특히 시설 재배면적이 증가하면서 각종 병해충에 의한 피해도 점차 증가하고 있는 실정이지만 아직까지 뚜렷한 해결 수단이 제시되지 않고 있다. 그 이유는 한 형질의 육종에 5-10년이 소요되는 등의 문제점이 있기 때문이다. 따라서, 유전공학적인 방법을 이용하여 다양한 형질을 도입함으로써 육종 기간을 단축하는 것이 상기한 문제를 해결할 수 있는 하나의 방법으로서 거론되고 있다.
현재까지 오이의 재분화 및 형질전환에 관련하여 계속적인 연구가 있었으나, 현재까지 개발된 방법에 따르면, 재분화율이 여전히 낮고, 재분화된 식물체가 비정상적인 형태로 발달하는 문제점이 있으며, 기내 배양시 조기 개화 및 노화 등의 문제점이 있다 (Ziv and Gadasi, Plant-Sci. 47(2):115-122(1986)).
따라서, 오이 식물체의 재분화 및 형질전환에 관하여는, 아직까지 많은 개선점이 잔존해 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 기존에 일반 오이 품종은 아그로박테리움을 이용하여 형질전환한 예는 있지만 오이 계통으로 형질전환한 예는 없다. 이는 오이 계통은 형질전환하기가 매우 어렵기 때문이다. GM(genetically modified) 오이 종자 생산을 위해서는 반드시 오이 계통을 이용해야 하므로, 본 발명에서는 신초 유도 단계에서 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도함으로써 아그로박테리움을 이용하여 오이 계통을 형질전환할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 특정 옥신계 성장 조절제 및 사이토키닌이 함유된 신초 유도 배지에서 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계를 포함하는, 오이 계통 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 또한, 사과 (Malus domestica) 유래의 hpt (homogentistic acid phytyltransferase) 유전자를 오이 계통에 아그로박테리움 매개 형질전환하여 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 따르면, 아그로박테리움을 이용하여 형질전환이 어려운 오이 계통에 대해 형질전환을 성공함으로써 GM 오이 종자 생산에 크게 기여할 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 옥신계 성장 조절제 및 사이토키닌이 함유된 신초 유도 배지에서 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계를 포함하는, 오이 계통 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.
더욱 구체적으로,
(i) 외래 유전자를 포함하는 식물 재조합 벡터가 내재된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 오이 계통의 자엽을 감염시키는 단계;
(ii) 상기 감염된 오이 계통의 자엽을 제아틴(zeatin) 및 IAA (indole acetic acid)가 함유된 배지에 치상하여 재분화시켜 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계; 및
(iii) 상기 재분화된 신초를 IAA가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 오이 계통을 형성시키는 단계를 포함하는, 오이 계통 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.
GM(genetically modified) 오이 종자 생산을 위해서는 반드시 오이 계통을 이용해야 한다. 기존에 일반 오이 품종은 아그로박테리움을 이용하여 형질전환한 예는 있지만 오이 계통으로 형질전환한 예는 없다. 이는 오이 계통은 형질전환하기가 매우 어렵기 때문이다. 따라서, 본 발명에서는 신초 유도 단계에서 특정 옥신계 성장 조절제 및 사이토키닌이 함유된 신초 유도 배지에서 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도함으로써 아그로박테리움을 이용하여 오이 계통을 형질전환할 수 있었다.
본 발명의 오이 계통 형질전환체의 제조 방법은 먼저 외래 유전자를 포함하는 식물 재조합 벡터가 내재된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 오이 계통의 자엽을 감염시키는 단계를 포함한다.
오이 계통은 오이 계통 4783 또는 1025를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 오이 계통의 형질전환 재료로서 이용될 수 있는 것은 식물의 다양한 부분에서 얻을 수 있으나, 가장 바람직하게는 종자로부터 얻는다. 종자는 사용하기 전에 미리 소듐 하이포클로라이드 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다.
종자의 발아시 이용되는 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 본 발명의 발아 배지는 고체 지지체로서 phyto-agar를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 조직은 종자의 발아로부터 생성된 모든 조직이 이용될 수 있으나, 바람직하게는 자엽 및 배축을 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 자엽을 이용하는 것이다. 자엽을 발아된 종자로부터 얻은 경우에는 생장점이 완전히 배제되도록 채취하는 것이 바람직하다. 또한, 자엽은 절단되지 않은 자엽 일부를 이용하는 것이 바람직하다.
오이 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스로 실시한다. 보다 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용하는 것이다. 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400, pRD320 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 이용되는 바이너리 벡터는 기본적으로 (a) 오이 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 오이 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 오이 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다. 또한, 바람직하게는 상기 벡터에는 선택 표지로서 항생제 (예를 들면, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자를 포함한다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질(예를 들면, 루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 바이너리 벡터내에 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 1' 프로모터, 2' 프로모터 또는 노팔린 합성효소 (nos) 프로모터를 포함한다. 한편, 상기 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열은 얻고자 하는 바람직한 형질에 따라 결정된다. 예컨대, 제초제 (글라이포세이트, 설포닐우레아 등) 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자 (예: Bt 유전자), 악조건 (가뭄, 기온, 염도) 저항성 유전자, 품질향상을 위한 유전자 (예; 당도 증가, 과숙 지연 등), 의료용 단백질 생산 관련 유전자(EGF, 각종 질병의 항원 또는 항체, 인슐린 등), 기능성 화장품 생산 관련 유전자 (알부민, 항균성 펩타 이드 등) 등이 있다.
상기한 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 생장점이 배제되도록 채취한 자엽을 아그로박테리움의 배양액에 침지시켜 공동 배양함으로써 아그로박테리움이 자엽에 감염되도록 하는 것이다. 공동배양액에는 바람직하게는 아세토시리곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.
본 발명의 오이 계통 형질전환체의 제조 방법은 상기 감염된 오이 계통의 자엽을 제아틴(zeatin) 및 IAA (indole acetic acid)가 함유된 배지에 치상하여 재분화시켜 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계를 포함한다.
상기 아그로박테리움에 의해 형질전환된 식물 조직의 재분화는 엄격하게 조절된 성분과 성분 양를 포함하는 재분화 배지에서 실시되어야 한다.
본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 phyto-agar를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 재분화 배지에는 식물 성장 조절제가 포함된다. 식물 성장 조절제 중 함유되는 시토키닌은 제아틴, 키네틴, 이소펜틸아데노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 제아틴이 이용된다. 또한, 본 발명의 재분화 배지에는 옥신계 성장 조절제 (예를 들면, 인돌아세트산(IAA), (2,4-디클로로 페녹시)아세트산)가 필수적으로 포함되어야 하며, 가장 바람직한 옥신계 성장 조절제는 인돌아세트산(IAA)이다.
재분화 배지에 포함되는 시토키닌의 양, 특히 제아틴의 양은 2-4 ㎎/ℓ가 바람직하고, 그 함량이 2 ㎎/ℓ 미만 및 4 ㎎/ℓ을 초과하는 경우에는 재분화율이 크게 감소된다. 보다 바람직하게는 제아틴의 양은 3 ㎎/ℓ이다.
상기 옥신계 성장 조절제, 특히 IAA의 양은 0.2-0.4 ㎎/ℓ이 바람직하고, 그 함량이 0.2 ㎎/ℓ 미만 및 0.4 ㎎/ℓ을 초과하는 경우에는 재분화율이 크게 감소된다. 보다 바람직하게는 IAA의 양은 0.3 ㎎/ℓ이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 형질전환된 조직을 선별할 수 있도록 항생제 (예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등)를 추가적으로 포함한다. 예컨대, 항생제로서 카나마이신을 이용하는 경우에는 그 양을 50 ㎎/ℓ으로 조절하는 것이 바람직하다.
재분화 배지에 자엽을 치상하는 방법은 아그로박테리움 튜머파시엔스와 공동 배양된 절편체 유근 부위를 신초유도 배지와 45도 각도로 치상하는 것이 바람직하다. 상기와 같이 치상한 자엽을 10일간 암배양 후 광조건에서 신초를 유도한다.
본 발명의 오이 계통 형질전환체의 제조 방법은 상기 재분화된 신초를 IAA가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 오이 계통을 형성시키는 단계를 포함한다.
재분화된 조직은 본 발명의 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 오이 계통을 얻는다. 본 발명의 발근 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 본 발명의 재분화 배지는 고체 지지체로서 phyto-agar를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 발근 배지에는 식물 성장 조절제로서 시토키닌은 거의 이용되지 않고, 옥신이 주로 이용된다. 상기 옥신계 성장 조절제로서는 인돌아세트산(IAA), (2,4-디클로로페녹시)아세트산 등이 이용될 수 있고, 가장 바람직하게는 IAA이다. 본 발명의 발근 배지에서 IAA의 바람직한 함량은 0.1 ㎎/ℓ이다.
또한, 본 발명의 발근 배지가 고체 지지체로서 아가를 포함하는 경우에는 0.8% (w/v)의 함량이 바람직하다.
본 발명에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체는 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환체를 확인할 수 있다. 예컨대, 형질전환 오이의 조직으로부터 분리한 DNA 시료를 이용하여 PCR을 실시함으로써 형질전환에 의해 오이의 지놈에 삽입된 외래 유전자를 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅에 의해서도 형질전환체를 확인할 수 있다. 한편, 형질전환시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 (glucuronidase) 유전자가 있는 경우에는 재분화된 자엽 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 형질전환 여부를 용이하게 확인할 수 있다. 그러나, 형질전환체의 확인은 서던 블롯팅이나 노던 블롯팅으로 확인하는 것이 바람직하다. PCR의 경우에는 위양성 (false positive) 밴드가 생성될 수 있기 때문이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 또한,
(i) 사과 (Malus domestica) 유래의 hpt (homogentistic acid phytyltransferase) 유전자를 포함하는 식물 재조합 벡터가 내재된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 오이 계통의 자엽을 감염시키는 단계;
(ii) 상기 감염된 오이 계통의 자엽을 제아틴(zeatin) 및 IAA (indole acetic acid)가 함유된 배지에 치상하여 재분화시켜 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계; 및
(iii) 상기 재분화된 신초를 IAA가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 오이 계통을 형성시키는 단계를 포함하는, 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 형질전환체의 제조 방법에서, (i), (ii), 및 (iii) 단계의 구체적인 방법은 전술한 바와 같다. 사과 (Malus domestica) 유래의 hpt (homogentistic acid phytyltransferase) 유전자는 토코페롤 생합성 관련 유전자로서, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가진다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 형질전환체를 제공한다. 선발된 오이 계통 형질전환체는 비형질환체에 비해서 α-, β-토코페롤 함량이 1.5배 또는 2배 이상 증가하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 오이 계통 형질전환 방법의 확립
1. 종자 발아
오이 계통은 4783 또는 1025를 이용하였다.
배지는 1/2MS, 수크로스 1%, phyto-agar 0.8%, pH 5.8을 사용하였다.
종자 소독은 하기와 같이 수행하였다.
① WIRE STRIPPER를 이용하여 종피를 양옆에서 살짝 눌러준다. 배와 유근의 발생 부위가 상처입지 않도록 주의한다.
② 10번이나 11번 메스를 이용하여 종피를 벗겨낸다.
③ 종피가 제거된 종자를 70% EtOH에 40sec ~ 1min간 표면 살균한다.
③ 멸균수로 1회 1min간 inverting하여 세척한다.
④ 25% ROX로 20min간 shaking(110 rpm)하여 멸균한다.
⑤ 멸균수로 1분 2회, 2분 2회, 3분 1회 (총 5회) 세척한다.
이 때, 종자를 감싸고 있는 외배유가 벗겨지도록 흔들어 제거해 준다.
⑥ petri-dish에 멸균하여 건조한 여과지 두 장 정도를 깔고 그 위에 표면 살균한 종자를 얹고, 그 위에 멸균된 여과지를 올려 물기를 제거해 준다.
⑦ 배지에 유근 발생부위를 배지에 살짝 꽂아주는 느낌으로 치상한다. (종자가 구부러진 쪽을 배지에 닿도록 치상한다)
Figure 112008077847005-pat00001
배양조건은 4일, 16L/8D (25±1℃)이며, 파종량은 페트리디쉬당 10립이었다.
2. 아그로박테리움 ( Agrobacterium ) 준비
① YEP 고체배지에 streaking 하여 28℃에서 24~48시간 암배양한다.
② single colony를 항생제가 첨가된 5㎖ YEP 액체배지에 접종하여 28℃(180rpm)에서 24~48시간 동안 배양한다.
③ 배양된 균 1㎖을 항생제가 첨가된 YEP 20㎖ 액체배지에 재접종하여 28℃(180rpm)에서 12~18시간 배양한다. 이 때, 아그로박테리움의 농도는 OD600nm 0.6~1.0으로 한다.
3. 절편체 준비
배지는 MS 액체배지 (MS, 수크로스 2%, pH 5.2)를 이용하였다.
절편체 준비(자엽)는 하기와 같이 수행하였다.
① 발아된 건실한 종자를 선별하여 사용한다.
② 자엽의 상단부 2/5 정도와 유근 부위를 자른 후, 자엽 절편을 둘로 쪼개고 가능한한 표피를 벗긴다.
Figure 112008077847005-pat00002
③ 균 접종 전까지 절편을 모아 절편체가 마르지 않도록 멸균된 filter paper에 액체 배지가 부어진 petri-dish에 보관하여 과도한 건조를 방지한다.
4. 균접종 및 공동배양
공동배양 배지는 MS, 수크로스 3%, phyto-agar 0.8%, pH 5.2 + MES 500mg/L, 제아틴 3mg/L, IAA 0.3mg/L, 아세토시린곤 100μM 을 이용하였다.
아그로박테리움 감염은 하기와 같이 수행하였다.
① 배양된 균은 원심분리 (3000rpm, 15min, swing rotor)하여 cell down 시킨다.
② 상층액 (YEP 배지)을 버리고 펠렛 상태의 균을 100μM 아세토시린곤이 포함된 20㎖ MS 액체배지에 조심스럽게 현탁한다.
③ 준비된 현탁 아그로박테리움과 절편체를 함께 교반한다 (100rpm, 20min).
④ 접종된 절편체를 멸균 filter paper에 올려 아그로박테리움 현탁액을 제거하고, 절편체 유근 부위가 공동배양 배지와 45도 각도로 치상하여 공동배양한다.
배양 조건은 2~3일, 암배양 (25±1℃)이었다.
Figure 112008077847005-pat00003
5. 공동배양균의 세척
공동배양균의 세척액은 MS, 수크로스 2%, pH 5.2, lillaciline 400mg/L 이다.
① 자엽 절편 중 균이 증식하여 자랐거나, 절편이 생장하지 않은 절편을 제외한 충실한 절편만을 고른다.
② 공동배양균 세척액이 담긴 입구가 큰 용기에 자엽 절편을 넣고 5min간 shaking(110 rpm)을 2회 수행하여 agar와 균을 세척하여 떨어낸다.
6. 신초유도
배지는 MS, 수크로스 3%, phyto-agar 0.8%, pH 5.8 + MES 500mg/L, 제아틴 3mg/L, IAA 0.3mg/L, 카나마이신 50mg/L, lillaciline 400mg/L 이다.
배양 조건은 공동 배양된 절편체 유근 부위가 신초유도 배지와 45도 각도로 치상하여 10일간 암배양 (25±1℃) 후 광조건 (25±1℃)에서 신초를 유도한다.
7. 신장유도
배지는 MS, 수크로스3%, phyto-agar 0.8%, pH 5.8 + 카나마이신 20mg/L, lillaciline 400mg/L 이다. 계대배양은 유도된 shoot을 떼어 신장유도배지에 올려준다.
8. 발근유도
배지는 MS, 수크로스 3%, phyto-agar 0.8%, pH 5.8 + IAA 0.1mg/L, 카나마이신 20mg/L, lillaciline 400mg/L 이다. 계대배양은 신장된 식물체를 발근 유도 배지에 올려 발근을 유도한다.
9. 식물체 순화
① 식물체 뿌리 부분의 배지를 물로 완전히 제거한다.
② 미리 물로 불려 놓은 jiffy pot에 뿌리에 상처가 나지 않도록 옮겨 심고, 배양실에서 순화한다.
③ 뿌리가 jiffy pot에 활착되면 좀 더 큰 pot으로 옮겨 뿌리가 보일 때까지 배양실에서 순화한 후, 온실(육묘장)으로 옮겨준다.
상기 과정을 통해 제조한 오이 계통 형질전환체의 형질전환 효율은 계통 4783의 경우에는 0.16%이며, 계통 1025의 경우에는 0.38% 이었다.
실시예 2: 본 발명의 오이 계통 형질전환 방법을 이용한 토코페롤 과발현 오 이 계통 형질전환체 제조
상기 실시예 1의 방법에 따라, 사과에서 추출한 토코페롤 생합성에 관여하는 mdhpt (Malus domestica homogentistic acid phytyltransferase) 유전자를 이용하여 오이 계통 형질전환을 수행하였다.
도 1은 mdhpt 유전자를 형질전환한 오이의 발달 과정을 나타낸 그림이다.
하기 표 1은 오이 계통별 형질전환 효율을 나타낸 것이다. 형질전환 효율은 평균 0.27% 이었다.
표 1. 오이 계통별 형질전환 효율
Figure 112008077847005-pat00004
도 2는 mdhpt 유전자 형질전환 오이(T0 세대)의 PCR과 서던 블롯 사진이다. 선발된 식물체에서 mdhpt 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다. Genomic DNA 분리는 Dellaporta 등(Dellaporta, Newsletter, 57, 26-29(1983))의 방법에서 약간 변형된 방법으로 수행하였으며, 프라이머는 35'S-C 프라이머 (5'-ATG ACG CAC AAT CCC ACT AT-3'; 서열번호 2)와 역방향 프라이머 (5'- CGT TCG ATT GTT ACC CCC TA-3'; 서열번호 3)를 이용하였다. PCR 조건은 premix(Accupower
Figure 112008077847005-pat00005
, Bioneer)를 이용하였으며, 예비변성은 94℃에서 5분간 하였고, 그 후 변성은 94℃에서 1분, 어닐링은 58℃에서 1분, 신장(extension)은 72℃에서 1분간으로 35 사이클을 수행하였으며, 최종 신장은 72℃에서 5분간 하였다.
PCR 분석을 통해 유전자 도입이 확인된 식물체를 대상으로 서던 블롯 분석을 실시하였다. 하우스에서 생육 중인 오이 잎을 이용하여 genomic DNA 분리는 Sambrook 등(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)의 방법을 약간 변형하여 이용하였으며, 분리한 genomic DNA(20㎍)를 SacⅠ 과 KpnⅠ 제한효소로 각각 절단하여 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하였다. 아가로스 겔 상의 DNA 밴드를 Hybond N 멤브레인 (Amersham Biosciences 사)에 전이시켜 32P-dCTP로 표지된 mdhpt 프로브(약 1290bp)를 이용하여 서던 분석하였다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, PCR에 의해 mdhpt 유전자가 증폭되었으며, 서던 블롯에 의해 상기 유전자가 검출됨을 알 수 있었다. 따라서, mdhpt 유전자가 안정적으로 오이 계통에 형질전환되었음을 알 수 있었다.
도 3은 T1 세대의 PCR 증폭을 통한 mdhpt 유전자 밴드를 확인한 것이다. PCR 증폭은 상기와 같은 조건으로 수행하였다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, T1 세대에서도 mdhpt 유전자가 안정적으로 유전되어 검출됨을 알 수 있다.
도 4는 T1 세대의 하우스 재배를 보여주는 것이다.
도 5는 T1 세대의 토코페롤 함량을 보여주는 그래프이다. 토코페롤 함량의 측정은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 측정하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 오이 계통 4783 또는 1025의 형질전환체(빨간 막대)는 비형질전환체에 비해 α-토코페롤 및 β-토코페롤 함량이 1.5배 또는 2배 이상 증가하였다.
도 1은 mdhpt 유전자를 형질전환한 오이의 발달과정을 나타낸 그림이다.
A. 자엽의 형질전환 후 선발배지에서 배양(4주); B. 뿌리 형성 (8주); C & D. 순화; E. 공동배양 후 5개월; F. 하우스 재배 후 종자 완숙
도 2는 mdhpt 유전자 형질전환 오이(T0 세대)의 PCR과 서던 블롯 사진이다.
도 3은 T1 세대의 PCR 증폭을 통한 mdhpt 유전자 밴드를 확인한 것이다.
도 4는 T1 세대의 하우스 재배를 보여주는 것이다.
도 5는 T1 세대의 토코페롤 함량을 보여주는 그래프이다.
<110> NONG WOO BIO CO., LTD <120> Method for transforming Cucumis sativus line through direct shoot induction and Cucumis sativus line transformant produced by the same <130> PN08230 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1582 <212> DNA <213> Malus domestica <400> 1 ggatcccccg ggctgcagga attcggcacg aggatttctt tgttggctga agcacatgga 60 ctctgcgctt gttgggtcct tctccaaagc atctttgggt gggaacattt ggagaaggga 120 taatctccac aagaactgct tttcaggttc atatgtagca gtcagagttt caaggtgcag 180 agcatgggat atcctagaaa gttactgtgg tgttggatct cagcaacatc tttttcagcg 240 aaataccgga ggcactaaag aaaagtctaa attctacagg gggcatgata aaaagttctt 300 ggtgaatgct actgcaggca accctcttga atctgaacct gaagcctata atccgaaaag 360 catatggaac tctatcaaaa atgccataga tgctttttac aggttttcaa ggccgcacac 420 agttataggc acagcattga gcataatttc agtttctctc cttgcagtca agaatctgtc 480 agatttgtct ccattatttt tcacaggggt gctggaggct gtagttgctg ctttctttat 540 gaatatttac attgttgggt tgaatcagtt gtctgacatc gatatagaca aggttaacaa 600 gccttatctt ccgttggcat ctggggaata ttcagttgga accggcatca tgattgtgac 660 atcttttcta attatgagct tttggcttgg atgggttgtt ggttcatggc cattgttttg 720 ggcccttttc gtcagttttg tacttggaac tgcttattca atcaatttgc cactattgag 780 atggaagagg tctgctgtgg ttgctgcaat gtgtatccta gctgttcggg cagtgatagt 840 ccaacttgct tttttcctgc acatgcagat gcatgtgtac aaaagaccag ctgccttctc 900 gaggccacta atctttgcaa ctgcatttat gagcttcttc tcagttgtta tagcattatt 960 taaggacata cctgatattg atggagataa aatattcggc atccggtctt ttacagtacg 1020 catgggacaa aagcgggtct tttggatttg tatttcgcta cttgaaatgg cttatggtgt 1080 tgccgtttta ttgggagcat catcgggctt catgttgagc aaatgcgtca cggttttggg 1140 acatacaatt ttggctttgg tactgtggaa cagagccaaa tctgtcgatc tcaacagcaa 1200 agctgcaatc acatcctttt acatgtttat atggaagctt ttctacgctg agtatctact 1260 tataccgctt gttagatgac gatgcaactt atgtcaaagt aaaggttgct ttcggaatct 1320 tagggggtaa caatcgaacg ctgttgctgg gttattcaac gtacattgta ctctccgata 1380 tttccttggt acattatttc accgtcccgg cctggtttcc ggggaaaagc tggaaagttt 1440 gaggcgtaag acctttgcat atcggttgaa attgaagttt aagcaaatat tatgaatatt 1500 tggttgaaat tgaagtttac gaaagatctg caatcactag tgaattcgcg gccgcctgca 1560 ggtcgaccat atgggagagc tc 1582 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35'S-C primer <400> 2 atgacgcaca atcccactat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 cgttcgattg ttacccccta 20

Claims (7)

  1. (i) 사과 (Malus domestica) 유래의 hpt (homogentistic acid phytyltransferase) 유전자를 포함하는 식물 재조합 벡터가 내재된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 오이 계통 4783 또는 1025의 자엽을 감염시키는 단계;
    (ii) 상기 감염된 오이 계통 4783 또는 1025의 자엽을 2~4 mg/L 제아틴(zeatin) 및 0.2~0.4 mg/L IAA (indole acetic acid)가 함유된 배지에 치상하여 재분화시켜 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계; 및
    (iii) 상기 재분화된 신초를 IAA가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 오이 계통 4783 또는 1025을 형성시키는 단계를 포함하는, 오이 계통 4783 또는 1025 형질전환체의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 신초 유도는 아그로박테리움 튜머파시엔스와 공동 배양된 절편체 유근 부위를 신초유도 배지와 45도 각도로 치상하여 10일간 암배양 후 광조건에서 신초를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. (i) 사과 (Malus domestica) 유래의 hpt (homogentistic acid phytyltransferase) 유전자를 포함하는 식물 재조합 벡터가 내재된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 오이 계통 4783 또는 1025의 자엽을 감염시키는 단계;
    (ii) 상기 감염된 오이 계통 4783 또는 1025의 자엽을 2~4 mg/L 제아틴(zeatin) 및 0.2~0.4 mg/L IAA (indole acetic acid)가 함유된 배지에 치상하여 재분화시켜 캘러스 상태를 거치지 않고 직접 신초를 유도하는 단계; 및
    (iii) 상기 재분화된 신초를 IAA가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 오이 계통 4783 또는 1025을 형성시키는 단계를 포함하는, 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 4783 또는 1025 형질전환체의 제조 방법.
  7. 제6항의 방법에 의해 제조된 토코페롤 함량이 증가된 오이 계통 4783 또는 1025 형질전환체.
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