CN108976293B

CN108976293B - 荔枝花色素苷生物合成负调控基因及其应用

Info

Publication number: CN108976293B
Application number: CN201810863444.6A
Authority: CN
Inventors: 赵杰堂; 陈霖欢; 胡冰; 秦永华; 胡桂兵
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN108976293A

Abstract

本发明涉及一种荔枝花色素苷生物合成负调控基因及其应用。本发明首次克隆出荔枝花色素苷生物合成负调控基因(命名为LcMYBC2)，其是MYB类基因，长度为708bp，编码的氨基酸数目为235个。通过烟草等模式植物转化技术证明，大量表达该负调控基因能够抑制烟草的花色素苷的生物合成，改变花色，因而，在生产上对改善荔枝着色及园艺作物颜色基因基因工程有着广泛的应用前景。

Description

荔枝花色素苷生物合成负调控基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种荔枝花色素苷生物合成负调控基因及其应用。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是我国重要的南亚热带经济果树，种质资源十分丰富，具有很高的食用价值。果实着色是影响荔枝果实品质的突出问题之一，着色不良是荔枝果实发育过程中常见的一种遗传现象。荔枝着色好，果实品质商业价值高，因此果实着色是评估荔枝品质的一个非常重要的指标。目前栽培的优质荔枝品种如广东省的‘妃子笑’就存在着色不良的问题。果实色泽形成及其调控一直是果树学领域“长盛不衰”的热点问题。

在此之前，发明人团队已利用HPLC-DAD-MS技术鉴定荔枝果皮花色素苷的主要成分，发现早熟荔枝品种果皮中的花色素苷以矢车菊色素-3-葡萄糖为主，而中晚熟荔枝品种果皮花色素苷以矢车菊色素-3-芸香糖苷为主。扩增获得荔枝花色素苷生物合成过程中PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等7个结构基因和LcMYB1、LcMYB2、LcMYB5、LcbHLH1、LcbHLH3等5个调节基因的序列，并对其功能进行解析，证明LcMYB1是调控荔枝果色花色素苷生物合成的关键调控因子，此外，还进一步发现miR156a通过靶基因SPL1/2与LcMYB1/5互作负调控荔枝果皮花色素苷的生物合成。

荔枝果实成熟期果皮的红色主要是由花色素苷的积累引起。目前，花色素苷代谢途径的主链已经阐明，关键转录调控基因得以鉴别，并在模式植物上实现了转基因调控。但是对其分子调控机理方面仍有诸多关键问题需要揭秘，比如对其负调控因子的研究尚未有报道。

发明内容

基于此，有必要提供一种荔枝花色素苷生物合成负调控基因及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

一种荔枝花色素苷生物合成负调控基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在其中一个实施例中，所述荔枝花色素苷生物合成负调控基因的编码区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种用于克隆荔枝花色素苷生物合成负调控基因的试剂盒，含有用于扩增上述任一实施例所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因的扩增引物对。

在其中一个实施例中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR扩增试剂及加A试剂中的至少一种。

一种含有上述任一实施例所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因的表达载体。

通过农杆菌介导的烟草遗传转化的方法，对上述荔枝花色素苷生物合成负调控基因的功能进行了验证，发现异源表达该负调控基因能够引起烟草K326的花从红花变成白花，说明其花青素苷生物合成受到抑制。

因此，上述任一实施例所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因，或上述任一实施例所述的试剂盒，或上述表达载体可以应用在制备用于改善荔枝着色的制剂中。

上述任一实施例所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因，或上述任一实施例所述的试剂盒，或上述表达载体还可以应用在改善荔枝着色或园艺作物颜色培育过程中。

在其中一个实施例中，在改善荔枝着色或园艺作物颜色培育过程中的应用包括如下步骤：

将制备的或提供的含有上述任一实施例所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，以所述农杆菌工程菌作为浸染液浸染荔枝植株或园艺作物。

在其中一个实施例中，所述农杆菌工程菌的A₆₀₀在0.6～0.8之间。

本发明首次克隆出荔枝花色素苷生物合成负调控基因(命名为LcMYBC2)，其是MYB类基因，长度为708bp，编码的氨基酸数目为235个。通过烟草等模式植物转化技术证明，大量表达该负调控基因能够抑制烟草的花色素苷的生物合成，改变花色，因而，在生产上对改善荔枝着色及园艺作物颜色基因工程有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为部分荔枝组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为荔枝和其他物种花色素苷生物合成负调控MYB基因的进化树分析。

图3为LcMYBC2扩增和信号肽预测结果。

图4a、4b和4c为LcMYBC2氨基酸序列与其他物种的同源性比较。

图5为LcMYBC2蛋白质功能结构域分析。

图6为LcMYBC2亚细胞定位。

图7为转化有LcMYBC2的烟草PCR鉴定。

图8为转化有LcMYBC2的烟草的表型。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一、荔枝花色素苷生物合成负调控基因的筛选和克隆

1、荔枝样品总RNA的提取以及质量检测

采用华越洋超快型RNA提取试剂盒(具体方法参照说明书)对‘桂味’、‘妃子笑’荔枝的叶片、果皮等组织的总RNA进行提取，总RNA的浓度用紫外核酸蛋白检测仪，取1μL测定260nm与280nm的比值，若介于1.80～2.00之间则可以进行下一步实验。如果总RNA浓度较高，可以稀释一定倍数后检测。

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，由图1可以看出总RNA呈现出清晰的28S和18S两条带，并且28S的亮度是18S的亮度的两倍左右，没有拖尾现象，说明无基因组DNA污染，表明提取的总RNA质量比较高，无明显降解，满足后续实验的需要。

2、花色素苷负调控基因的筛选和聚类分析

根据荔枝基因组测序结果，筛选到负调控花色素苷的MYB类基因(一共6个)，经NCBI比对(与其他物种中花色素苷相关MYB负调控基因比对)和生物信息学分析软件分析，利用MEGA 7进行聚类分析，用生物信息学在线分析网站Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)删除掉一些不具备完整功能或者基因组注释错误的成员，最后筛选出1个结构完整的与花色素苷生物合成相关的负调控基因LcMYBC2(表1，Genbank分类号见表2)，对荔枝和其他品种已报道的MYB花色素苷生物合成负调控基因用MEGA7进行聚类分析，结果参见图2，可以看到LcMYBC2与葡萄(Vitis vinifera)的VvMYBC2-L1和桃李(Prunuspersica)的PpMYB18基因聚类在一起。

表1荔枝花色素苷生物合成负调控基因LcMYBC2的基本信息

表2用于进化树构建的MYB类基因GenBank登录号

3、LcMYBC2的克隆和信号肽分析

(1)LcMYBC2的克隆

分别提取‘黑叶’、‘妃子笑’和‘糯米糍’叶片的总RNA，以总RNA为模板利用M-MLVFirst cDNA Synthesis Kit(invitrogen公司)逆转录合成cDNA。根据荔枝基因组测序结果中LcMYBC2的全长序列(编码序列如SEQ ID NO.2所示)，用Primer Premier 5.0软件分别于其起始子和终止子处设计引物(引物序列如SEQ ID NO.3和4)，引物合成在艾基生物工程(广州)有限公司完成。以cDNA为模版扩增目的基因的全长，使用东洋纺生物科技有限公司的KOD-Plus-Neo Taq聚合酶，具体反应体系参照说明书。扩增条件为：94℃、2min；98℃、10s，55℃、30s，72℃、2min，共35个循环；72℃、10min。反应结束后取2μL进行电泳检测PCR扩增产物是否正确。扩增结果如图3所示，说明PCR扩增产物正确。

(2)PCR产物加A和目的基因的回收

由于KOD-Plus-Neo Taq聚合酶为平末端聚合酶，为进行TA克隆需在PCR产物的3’端加一个A，因此对PCR扩增产物进行加A孵育，反应体系为：0.1μL Ex Taq和3μL 10×ExTaq Buffer(TaKaRa)，在72℃孵育半小时。

根据目的片段的特异性来决定是进行产物纯化还是切胶回收，若目的片段特异，采用PCR扩增产物纯化试剂盒(Genstar)，具体方法参见试剂盒说明书。若目的片段不特异，将产物全部进行普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下进行切胶，然后用DNA凝胶回收试剂盒(Genstar)进行回收，具体方法参加试剂盒说明书。回收完成后，取2μL进行电泳检测，并用紫外核酸蛋白测定仪检测浓度。

(3)载体连接与转化

取适量检测正确的PCR扩增产物与克隆载体pMD19-T(TaKaRa)进行连接，目的片段与克隆载体的摩尔比控制在3～5:1之间。连接体系包括：1μL 19-T vector、适量纯化后的PCR扩增产物、5μL Ligation solution I(TaKaRa)，加双蒸水补至10μL，混匀后在16℃条件下恒温连接过夜。

将感受态细胞DH5α(唯地生物)从-80℃取出并置于冰上融化，将2μL连接产物加入到50μL感受态细胞中，轻轻敲打，冰浴30min，然后于42℃水浴热击90s，取出置冰上稳定3min左右后加入不加抗生素的LB培养基500μL，37℃震荡培养1h。4000rpm离心3min，留下约100μL上清，用枪头将菌体重悬浮后涂于含有100μg ml^-1Amp⁺的LB平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。

用灭菌的牙签从平板上挑取单菌落接种于含有100μg ml^-1Amp⁺的LB液体培养基中，在37℃恒温震荡摇床震荡培养3～4h后，跑菌液PCR检测阳性克隆。菌液PCR方法为：扩增结束取2μL产物电泳检测，挑取扩增产物条带大小正确的菌液进行测序(测序在艾基生物技术有限公司完成)，最终克隆获得LcMYBC2。

(4)信号肽预测

扩增到LcMYBC2的全长序列，对它们在ExPASy translate tool(http://web.expasy.org/translate/)进行翻译分析和在SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析，结果见图3，发现LcMYBC2可正确翻译成蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，不具有信号肽。

4、LcMYBC2序列分析及氨基酸序列理化性质的预测

LcMYBC2 cDNA全长(如SEQ ID NO.2所示)为708bp，对其编码的氨基酸序列进行预测分析，得到其编码235个氨基酸(序列如SEQ ID NO.1所示)，蛋白质分子质量27.99kD，等电点为8.80。将LcMYBC2推导氨基酸序列与已知物种花色素苷生物合成MYB负调控基因进行序列比对，结果见图4a、4b和4c，发现其具有较高的同源性，LcMYBC2与土瓶草(Cephalotusfollicularis GAV84590.1)、巨桉(Eucalyptus grandis XP_010044170.1)、木薯(Manihotesculenta OAY25210.1)和蓖麻(Ricinus communis XP_015578968.1)等物种的蛋白同源性分别为76％、75％、73％和72％。对其蛋白质功能结构域分析发现LcMYBC2属于SANT家族，有MYB转录因子和mRNA剪切因子以及SANTSWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB连接区域，参见图5。

二、荔枝LcMYBC2基因的亚细胞定位分析

参考in-FusionHD Cloning System说明书进行实验。将质粒载体用XbaⅠ(NEB)单酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。将完全酶切的线性化质粒进行产物纯化回收。将LcMYBC2不含终止密码子的编码区序列重组进入eGFP序列不含终止子的pCambia1300-eGFP载体中。使用东洋纺生物科技有限公司的KOD-Plus-Neo Taq聚合酶。PCR重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同上。抗生素为Kan。菌液PCR引物用克隆基因引物，将PCR检测的阳性菌株进行测序，测序引物的序列分别如SEQ ID NO.5和6所示。

将测序正确的阳性质粒转入农杆菌3101，转化方法为：①取出GV3101农杆菌感受态细胞100μL，冰上解冻，立即加入3μL(～200ng)重组质粒DNA；②轻弹，冰上放置30min；③液氮中冷冻5min；④37℃水浴中温浴5min，冰上2min；⑤加入无抗生素的500μL的YEP液体培养基，28℃摇3～4h；⑥3000rpm，离心3min，去培养基500μL，剩下的100μL适量均匀涂布于YEP固体培养基上(含抗生素100μg mL^-1Kan、50μg mL^-1Rif)；⑦28℃倒置培养2～3d；⑧摇菌于含抗生素的(100μg mL^-1Kan、50μg mL^-1Rif)YEP培养基中，28℃，250rpm振荡过夜。

菌液PCR验证同上。验证结果正确的阳性农杆菌菌株保存备用。

将阳性农杆菌菌株摇菌于含抗生素的(100μg mL^-1Kan、50μg mL^-1Rif)YEP培养基中培养过夜，使OD₆₀₀≈0.8离心收集菌体，用加有100μg mL^-1的AS(乙酰丁香酮)注射缓冲液MMA(10mM MES 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid，10mM MgCl₂，pH 5.6)，稀释菌体至OD₆₀₀≈0.2左右。将菌液用不含针头的1mL注射器注射本氏烟草叶背面，同时注射含有空载体pCambia1300-eGFP的农杆菌作为对照。培养2～3d后取注射部位的叶片分离原生质体，然后用蔡司倒置荧光显微镜(ZEISS Observer.D)观察，拍照记录。通过荧光显微镜观测可以发现LcMYBC2基因是定位在本氏烟草的细胞核上，参见图6。

三、荔枝LcMYBC2基因的功能验证

参考in-Fusion HD Cloning System说明书，使用pBI121载体，选择酶切位点为XbaⅠ和SmalⅠ两个酶切位点，对目的基因进行带酶切位点接头的扩增，使用KOD-Plus-NeoTaq聚合酶，扩增引物见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，将扩增产物用1％的琼脂糖进行凝胶电泳，并对符合目的条带使用胶回收试剂盒(Genstar)进行切胶回收，并进行连接转化DH5α，在涂有Kan的LB板培养基倒置过夜培养，挑单克隆菌落进行扩摇。

取出菌液，在超净工作台，取1mL菌液放入50mL离心管中，加入不含抗生素的液体YEP培养基20mL，28℃，200rpm培养3～5h(OD₆₀₀约为0.6～0.8)。然后将菌液5000rpm离心5min。用约3倍原离心时菌液体积的MS液体培养基重悬菌体，备用。

选择生长健壮的烟草K326叶片，将叶片用镊子分离下来，放于灭过菌的培养皿中，倒入无菌水。在无菌水中将叶片切成约0.5cm²大小的外植体(去掉叶片的边缘部分以及主脉)。

浸入上述步骤重悬好的农杆菌菌液的50mL管中，轻轻振荡让其浸染5min，然后倾倒去菌液，再用灭过菌的纸巾吸干外植体上残留的菌液。在预先制备好的预培养培养基上铺上两张灭过菌的滤纸，然后将侵染后的叶片放入含有滤纸的培养基上面，注意将外植体光面(即叶片上表面)朝上放置。做好标记和记录，将完成实验的培养基放在避光的纸箱中28℃下暗培养2d，取出时可见外植体边缘微卷，且有些许泛白。

共培养2d后将外植体转入第一次筛选培养基上进行选择培养，然后将完成实验的培养瓶放在光照培养箱中进行培养，3w后继代，将叶片转入第二次筛选培养基上培养，以后每3～4w继代一次。注：若培养过程中发现切口往上翘，需重新放置叶片，尽量让切口接触培养基表面，以便充分吸收培养基中养分。

约四周后，第二次筛选培养基上会诱导产生抗性芽，在抗性芽生长至1～2cm时，将抗性芽切下，转入生根培养基中，诱导根的形成。注：要将绿芽底部稳固地插入培养基，不能过深也不能过浅。

待抗性芽生根，且幼苗高度长至瓶高2/3以上时，将苗取出，清洗干净根部的培养基，放于清水中，置于窗台上炼苗。让其接触自然环境，适应自然环境中的光照、温度和湿度。每2～3d换一次水。炼苗约1w后移栽22℃温室的盆土里培养，注意生长期间营养管理。

MS液体培养基：基础培养基MS、30g/L蔗糖、100μM As，pH 5.8。

共培养及生根培养基：基础培养基MS、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂、100μM As，pH 5.8。

筛选培养基：基础培养基MS、30g/L蔗糖、2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、6.5g/L琼脂、抗生素(100μg/ml Kan、300mg/L特美汀Timentin)，pH 5.8。

转基因烟草鉴定，提取烟草基因组DNA，用LcMYBC2引物进行PCR鉴定，结果如图7所示。

转基因烟草表型鉴定结果如图8所示，转基因烟草的花瓣颜色变为白色，花色素苷生物合成受到明显抑制，验证了LcMYBC2具有负调控花色素苷生物合成的功能。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 荔枝花色素苷生物合成负调控基因及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 荔枝(Litchi chinensis Sonn.)

<400> 1

Met Arg Lys Pro Cys Cys Asp Lys Gln Asp Thr Asn Lys Gly Ala Trp

1 5 10 15

Ser Lys Gln Glu Asp Gln Lys Leu Ile Asp Tyr Ile Arg Lys His Gly

20 25 30

Glu Gly Cys Trp Arg Thr Leu Pro Gln Ala Ala Gly Leu Leu Arg Cys

35 40 45

Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Leu

50 55 60

Lys Arg Gly Asn Phe Ala Glu Asp Glu Glu Asp Leu Ile Ile Lys Leu

65 70 75 80

His Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro

85 90 95

Gly Arg Thr Asp Asn Glu Val Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu Arg

100 105 110

Arg Lys Leu Ile Asn Met Gly Ile Asp Pro Asn Asn His Arg Leu Ser

115 120 125

Gln Ser Leu Pro Arg Leu Gln Gln Asn Leu Gln His Ile Ser Ser Ser

130 135 140

Ala Thr Ser Ser Gly Arg Lys Thr Asp Ala Asn Pro Pro Met Lys Pro

145 150 155 160

Arg Arg Asp Asn Asp Gln Ile Ser Asp Ala Gly Ser Cys Leu Glu Asp

165 170 175

Ser Glu Pro Ser Gly Leu Pro Asp Leu Asn Leu Asp Leu Thr Ile Ser

180 185 190

Ile Pro Ser Asp Ser Ser Leu Ala Lys Thr Gln Glu Glu Lys Lys Lys

195 200 205

Leu Ile Lys Asn Asn Ser Asp Arg Gln Pro Lys Leu Ser Glu Gln Glu

210 215 220

Phe Val Pro Ser Pro Thr Leu Cys Leu Phe Gln

225 230 235

<210> 2

<211> 708

<212> DNA

<213> 荔枝(Litchi chinensis Sonn.)

<400> 2

atgaggaagc cttgttgtga taagcaagac acgaacaaag gagcttggtc gaagcaggaa 60

gaccagaagc tcattgatta tatccgtaaa cacggcgaag gttgctggcg taccctcccc 120

caagctgcag gtttacttcg ctgcggtaaa agttgtaggc tgagatggat aaattatctg 180

aggcctgacc ttaaaagagg caactttgct gaagatgaag aagatcttat catcaagcta 240

cacgctcttc taggcaatag gtggtcattg atcgctggga gattacctgg acgtacagac 300

aatgaagtga agaactattg gaattctcat ttaagaagaa agcttataaa catgggaatt 360

gatccaaaca atcatagatt aagccaaagc cttcctcgtc ttcagcaaaa cctacaacac 420

atctccagca gtgcgacatc ttcgggtcgc aaaaccgatg cgaatccgcc aatgaagccc 480

cggagagaca atgatcaaat ttccgatgct ggaagttgct tggaggatag tgagccatct 540

ggtttgcctg atttgaacct tgatctaacg atcagcattc cttctgattc ttcccttgcc 600

aaaactcaag aggagaaaaa gaagctaatt aaaaacaata gtgatcgtca gccaaaatta 660

agtgaacaag aatttgttcc ttctcctaca ctttgtctct tccaataa 708

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaggaagc cttgttgtga taag 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttattggaag agacaaagtg tagga 25

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacgggggac tctagaatga ggaagccttg ttgtgataag 40

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccatggatcc tctagattat tggaagagac aaagtgtagg a 41

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactctaga ggatccatga ggaagccttg ttgtgataag 40

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcggggaa attcgagctc ttattggaag agacaaagtg tagga 45

Claims

1.一种荔枝花色素苷生物合成负调控基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因，其特征在于，其编码区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种用于克隆荔枝花色素苷生物合成负调控基因的试剂盒，其特征在于，含有用于扩增如权利要求1或2所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因的扩增引物对；所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR扩增试剂及加A试剂中的至少一种。

5.一种含有如权利要求1或2所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因的表达载体。

6.如权利要求1或2所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因，或如权利要求3~4中任一项所述的试剂盒，或如权利要求5所述的表达载体在制备用于改善荔枝着色或园艺作物颜色的制剂中的应用。

7.如权利要求1或2所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因，或如权利要求3~4中任一项所述的试剂盒，或如权利要求5所述的表达载体在改善荔枝着色或园艺作物颜色培育过程中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

将制备的或提供的含有如权利要求1或2所述的荔枝花色素苷生物合成负调控基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，以所述农杆菌工程菌作为浸染液浸染荔枝植株或园艺作物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农杆菌工程菌的A₆₀₀在0.6~0.8之间。