CN108118068B - 一种高效快速的菊花转基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效快速的菊花转基因方法，属于菊花遗传育种及分子生物学领域。该方法包括：(1)取菊花茎段作为外植体置于预培养基上进行预培养；(2)将转化有重组表达载体的农杆菌菌液进行活化和培养，然后富集菌体，并用MS液体培养基重悬作为侵染液；(3)将步骤(1)中预培养后的外植体浸入侵染液中采用真空负压法对其进行侵染；(4)将侵染后的外植体置于预培养基上在黑暗条件下进行共培养；之后在脱羧培养基上进行脱羧培养，最后依次使用选择培养基1和选择培养基2进行选择培养，确定无农杆菌爆发后，继代至生根培养基进行进一步的生根筛选得到菊花转基因植株。与传统叶盘法菊花转基因相比，本发明显著缩短了转基因的时间，提高了菊花转基因的转化效率，减少了科研工作者的工作量，为菊花的高效转化和基因功能分析提供新途径，也为其他植物的转基因提供了新思路。

Description

一种高效快速的菊花转基因方法
技术领域
本发明涉及菊花转基因领域，不同于传统叶盘转基因法，本发明是通过真空负压法处理菊花茎段，解决了传统叶盘法中存在的转化效率低和耗时长的两大难题，实现高效、简便并能稳定遗传的菊花转基因体系的构建。
背景技术
菊花原产中国，是我国十大名花和世界四大切花之一，产量居首，在花卉生产中占有十分重要的地位，而现有的菊花品种无法完全满足大众日益增长的需求，因此急需加快菊花育种和遗传研究工作的进度。
根癌农杆菌介导的转基因技术是获得遗传修饰有机体的常用方法之一，同时也是研究基因功能的重要手段。在长期的基因工程实践中，人们已经注意到不同的植物由于受基因型、发育状态、组培难易程度等因素影响，相应地应该采取不同的基因转化方法，常用的有原生质体与农杆菌共培养法、叶盘法等。原生质体与农杆菌共培养法转化效率高，无嵌合体；但操作复杂，必须有良好的原生质体培养及植株再生技术，因而在许多重要作物中的应用受到限制。叶盘法的出现推动了农杆菌介导转化方法的应用，成为现在广为应用的方法之一。在1991年，科研工作者们通过叶盘转化的方法获得菊花转基因阳性株系，自此叶盘法在菊花转基因工作中得到广泛应用。然而，转化效率低、转化时间历时较长等问题限制了菊花转基因工作的进行，同时不同菊花品种无通用的成熟遗传转化体系，大大影响了相关课题的开展和科研进度。
因此，设计一种新的高效快速的菊花转基因方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效快速的菊花转基因方法，解决传统叶盘法转基因过程中转化效率低和耗时长的问题，为菊花的高效转化和基因功能分析提供新途径。
本发明的目的通过以下技术方案实现的：
一种高效快速的菊花转基因方法，包括以下步骤：
(1)取菊花茎段作为外植体置于预培养基上进行预培养；采用茎段作为外植体是本发明技术方案的主要发明点之一，本发明的研究表明，在使用茎段、叶盘、叶柄为外植体进行转基因分化过程中，以茎段为外植体的出芽率和转化效果明显高于另外两种外植体。这是由于茎段相对于叶盘和叶柄来说，具有更强的分化能力。选择未有腋芽分化的茎段为外植体，相对来说可降低嵌合体的发生率。
(2)将转化有重组表达载体的农杆菌菌液进行活化和培养，然后富集菌体，并用MS液体培养基重悬作为侵染液；所述的重组表达载体为插入有目的基因的植物表达载体，所述的植物表达载体具有特定的抗生素抗性。
(3)将步骤(1)中预培养后的外植体浸入侵染液中采用真空负压法对其进行侵染；
(4)将侵染后的外植体置于预培养基上在黑暗条件下进行共培养；之后在脱羧培养基上进行脱羧培养，最后依次使用选择培养基1和选择培养基2进行选择培养，确定无农杆菌爆发后，继代至生根培养基进行进一步的生根筛选得到菊花转基因植株。
步骤(1)中所述的茎段包含未分化的腋芽。步骤(2)中将所述的农杆菌菌液摇菌培养至OD600为0.5～0.7，优选为摇菌培养至OD600为0.6左右再进行菌体富集。OD过低，菌量少；OD过高，菌量过多或者活性变差，会影响侵染效果或者导致后续培养过程中农杆菌爆发。
步骤(3)中所述真空负压法对外植体进行侵染的方法为：将预培养后的外植体和侵染液置于密闭容器内并使外植体完全浸入侵染液中，震荡容器且使容器保持负压状态直至非负压状态下所有外植体沉入侵染液底部。浸染时间约为2-15min但不限于此，侵染时间视不同外植体材料可进行调整。所述的密闭容器可以是常规的能够产生真空容器，例如注射器。
步骤(3)中所述真空负压法对外植体进行侵染的简易方法具体包括如下步骤：
a.将预培养后的外植体放入注射器中；
b.吸取侵染液于所述的注射器中，使外植体完全浸入侵染液中，排出注射器中的气体并将注射器前端口密封；
c.拉动注射器活塞，并摇动注射器，使侵染液侵入茎段内，使注射器保持负压状态，并不时摇动注射器，直至非负压状态下所有茎段沉入侵染液底部，该过程一般为5-10min。
步骤(1)和(4)中各培养基的配方为：
预培养基：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
脱羧培养基：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 350mg/L；
选择培养基1：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 160mg/L+抗生素10mg/L；
选择培养基2：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 80mg/L+抗生素8mg/L；
生根培养基：MS+抗生素9mg/L。
上述选择培养基1、选择培养基2和生根培养基配方中的抗生素为与所述植物表达载体所具有的抗性相关的抗生素。例如，pMDC43载体是常用的植物表达载体之一，由于其载体上具有编码潮霉素抗性的一段序列，因此，可以用潮霉素作为转基因阳性植株筛选的抗生素(成功转入外源基因的植株可以在筛选培养基上正常生长并生根，而未转入的植株则会黄化并死亡)。若使用其它种类的植物表达载体，可以根据载体构造，决定筛选所用抗生素。目前比较常用的是卡纳和潮霉素。
步骤(1)中所述预培养的时间为2～4天，优选为3天。步骤(4)中在黑暗条件下进行共培养的时间为2～3天；所述脱羧培养的时间为6～8天，优选为7天；选择培养时每12～18天继代一次，优选为15天。
在培养过程中，除生根培养基外，其它每一步的培养基都加入了高比例的6-BA和NAA，使得外植体不断产生新的侧芽。每次继代培养时，将分生出的小侧芽从母体分离，单独培养，以此类推。通过此种方法，可有效筛除分化过程中产生的嵌合体。
在选择培养过程中，羧苄青霉素浓度按照梯度依次降低，直至茎段在Carb 80mg/L状态下持续一个月时间无农杆菌爆发，可转到去羧苄的生根培养基培养。
生根培养基无需再添加植物生长调节剂促进侧芽生成，而是提高抗生素(例如Hyg)浓度进行进一步筛选。
上述的方法在快速进行转基因菊花培育中的应用。
本发明的所述的方法在具体的操作过程中可以根据需要选择不同的目的基因和植物表达载体进行菊花转基因实验，实验过程中可根据所选择的植物表达载体所具有的抗性在选择培养基1、选择培养基2和生根培养基配方中添加相应的抗生素。例如，以栽培型地被菊‘雨花落英’茎段为材料，以pMDC43作为植物表达载体(具有潮霉素抗性)，构建CmLEC1的超表达载体，通过真空负压法侵染进行转基因试验，且在选择培养基1、选择培养基2和生根培养基配方中的添加的抗生素为潮霉素(Hyg)；具体包括以下步骤：
1)以栽培型地被菊‘雨花落英’为材料，取其茎段作为外植体。
选取苗龄在30d左右的组培苗，去除茎尖及茎上叶片，切成0.5cm左右茎段，上口为横切，下口为斜切。茎段需包含未分化的腋芽如图4A所示。将选取的外植体置于预培养基上预培养3天；所述预培养的基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L。
2)农杆菌的活化、培养及侵染液置备。
将-80℃保存的转化有重组表达载体的农杆菌菌液在YEB固体培养基上活化，并用YEB液体培养基进行摇菌培养至OD600为0.6左右，离心富集菌体，用MS液体等体积重悬。
所述的重组表达载体为以pMDC43作为植物表达载体(具有潮霉素抗性)，构建的CmLEC1的超表达载体。
3)真空负压法侵染‘雨花落英’茎段。
将步骤1)中预培养3d后的茎段浸入侵染液中，进行手动抽真空操作，时间5-10min，以全部茎段外植体沉底为标准。
a.将预培养后的待侵染茎段从固体培养基中拣出，放入注射器(容积为30mL)中。
b.吸取侵染液约8-10mL于注射器中，使茎段完全浸入侵染液中，取下针头，排出注射器中的气体，用左手大拇指堵住注射器前口，或用酒精灯将前口烧融，轻捏封死。
c.右手用力拉动注射器活塞，摇动注射器，使侵染液侵入茎段内。反复多次，用10mL离心管抵住注射器，使其保持负压状态，不时摇动注射器，直至观察到非负压状态下所有茎段沉入侵染液底部。这个过程在5-10min左右。
为保证侵染效果，步骤a和步骤c中所述注射器的容积至少为30mL，可根据试验材料和基因不同进行调整。侵染时间视不同外植体材料同样可调整。
4)将侵染后的茎段捞出平摊于滤纸上吹干，换至新的预培养基上，共培养2-3天。
需将茎段连同培养基放在干燥黑暗条件下，使得农杆菌能够侵入外植体内发挥作用。
使用羧苄青霉素抑制农杆菌的爆发，脱羧培养7d左右，茎段状态如图4B所示，脱羧培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 350mg/L。
对茎段外植体进行选择培养，主要利用潮霉素进行转基因筛选。
选择培养基1：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 160mg/L+Hyg10mg/L
选择培养基2：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 80mg/L+Hyg 8mg/L
使用选择培养基对侵染后的茎段进行培养，每15d继代一次。羧苄青霉素浓度按照梯度依次降低，直至茎段在Carb 80mg/L状态下持续一个月左右无农杆菌爆发，可转到去羧苄的生根培养基培养(生根培养基：MS+Hyg 9mg/L)。每次继代培养时，应将分生出的小侧芽从母体分离，单独培养，以不断进行筛选，减少转基因嵌合体的产生。
结果表明该方法显著提高了菊花转基因的转化效率，而且缩短了得到转基因阳性苗的时间。本发明为菊花的高效转化和基因功能分析提供新途径，也为其他植物的转基因提供了新思路。
本发明的有益效果：
本发明针对地被菊品种‘雨花落英’无成熟的叶盘遗传转化体系、叶盘转化方法耗时长、转化效率低等问题，提供了一种高效快速的转化方法，为菊花的高效转化和基因功能分析提供新途径，同时也为其他植物的转基因提供了新思路。
附图说明
图1为具体培养过程。
图2为转基因植株PCR检测。
其中，M：5000marker；CK1：阳性对照；CK2：阴性对照；WT:‘雨花落英’野生型植株1-45：被检测抗性植株。
图3为CmLEC1在16个转基因阳性植株中的相对表达情况。
图4为高效快速的菊花转基因过程中外植体分化过程图。
选取苗龄在30d左右的组培苗，去除茎尖及茎上叶片，切成茎段，茎段需包含未分化的腋芽如图4A所示；预培养3d，将预培养3d后的茎段浸入侵染液中，进行抽真空操作，将侵染后的茎段平摊于滤纸上吹干，换至新的培养基上，共培养2-3天，使用羧苄青霉素抑制农杆菌的爆发，脱羧培养7d，茎段腋芽开始分化状态如图4B所示；使用选择培养基对侵染后的茎段进行培养，每15d继代一次，继代过程中茎段腋芽不断分化呈簇状如图4C所示；每次继代培养时，将分生出的小侧芽从母体分离，单独培养，以不断进行筛选，减少转基因嵌合体的产生，筛选过程中羧苄青霉素浓度按照梯度依次降低，直至茎段在Carb 80mg/L状态下持续一个月左右无农杆菌爆发，可转到去羧苄的生根培养基进行进一步的生根筛选，发现转基因腋芽正常生长，如图4D所示；根系生长健壮，如图4E所示；最后可得到转基因植株1F。
具体实施方式
下面结合具体实施对本发明作进一步详细说明。
本发明所提供的利用真空负压法对菊花茎段进行转基因工作，其具体实施示例如下：
1、取样并进行预培养
以栽培型地被菊品种‘雨花落英’为实验材料，取苗龄在30d左右的组培苗，去除茎尖及茎上叶片，切成0.5cm左右茎段作为外植体备用，上口为横切，下口为斜切，茎段需包含未分化的腋芽如图4A所示。下口斜切，增加伤口面积，保证农杆菌侵染效率。将选取的外植体置于预培养基上预培养3天。
2、农杆菌的活化、培养及侵染液置备。
将在-80℃保存的转化有重组表达载体的农杆菌菌液化冻后，于YEB+Kan50mg/L+Rif50mg/L固体培养基上划线，并于28℃培养48h，挑取单克隆接种于YEB+Kan50mg/L+Rif50mg/L液体培养基中，28℃震荡培养，至农杆菌长到OD600为0.6左右，将菌液倒入无菌离心管中，5000r/min离心15-20min，富集菌体，用等量已灭菌的MS液体培养基重悬，备用。所述的重组表达载体为以pMDC43作为植物表达载体(具有潮霉素抗性)，构建的CmLEC1(如SEQID NO.1所示)的超表达载体。
3、培养过程中所用到的几种培养基
预培养基MS1：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L
脱羧培养基MS2：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 350mg/L
选择培养基MS3：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 160mg/L+Hyg10mg/L
选择培养基MS4：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Carb 80mg/L+Hyg 8mg/L
生根培养基MS5：MS+Hyg 9mg/L
4、具体培养过程
1)将经过预培养的茎段浸入侵染液中，手动法抽真空(具体方法见第5步)，时间设置为5-10min，具体以全部茎段外植体沉底为标准。
2)将侵染后的茎段平摊于滤纸上吹干，换至新的MS1培养基上，在黑暗条件下培养2-3天，当外植体边缘可见斑点状农杆菌菌落时，为进行脱羧培养的最佳时机。
3)将共培养后的茎段在滤纸上吹干，放置于MS2培养基上进行脱羧培养7d，以起到抑制农杆菌的作用。
5)使用MS3、MS4培养基对侵染后的茎段进行选择培养，每15d继代一次。每次继代培养时，应将分生出的小侧芽从母体分离，单独培养。茎段外植体可在MS4培养基上培养直至生根。观察是否有农杆菌残留并及时补救。持续一个月左右无农杆菌爆发，可转到生根培养基MS5上培养。
5、手动抽真空操作方法
1)将预培养后的待侵染茎段从固体培养基中拣出，放入注射器(容积为30mL)中。
2)吸取侵染液约8-10mL于注射器中，使茎段完全浸入侵染液中，取下针头，排出注射器中的气体，用左手大拇指堵住注射器前口，或用酒精灯将前口烧融，轻捏封死。
3)右手用力拉动注射器活塞，摇动注射器，使侵染液侵入茎段内。反复多次，用10mL离心管抵住注射器，使其保持负压状态，不时摇动注射器，直至观察到非负压状态下所有茎段沉入侵染液底部。这个过程在5-10min左右。
结果分析
1、转基因苗DNA水平鉴定
对生根筛选获得的45株抗性单株进行PCR鉴定，PCR鉴定结果见图2，用质粒DNA为模板做阳性对照(CK1)，以清水为模板做阴性对照(CK2)，WT为未转基因的‘雨花落英’野生型植株。结果显示，有19株抗性植株在近500bp处扩增出一条清晰的条带，与阳性对照扩增长度相等。扩增产物经测序分析，与CmLEC1序列一致。初步证实外源基因已成功转入菊花中，获得了PCR阳性单株19株，对单株进行扩繁获得19个转基因株系。
2、转基因阳性苗RNA水平验证
验证结果见图3，根据荧光定量PCR结果显示，在待鉴定的16棵阳性植株中，有12棵植株实现了CmLEC1两倍以上的超表达。其中，9号植株相对表达量最高，是WT的21.86倍，其次为14号植株，为WT的18.95倍；7号和12号植株的相对表达量均为WT的10倍以上。结果表明，通过此方法，能快速得到目的基因的超表达植株，用于后续的研究。
3、转化效率分析
根据试验结果统计发现，本发明所提供的茎段基因转化方法获得阳性转基因植株的时间约为90天，获得转基因植株的阳性苗率为42％，具体时间视不同的实验材料而有所差异。而目前，菊花转基因传统方法为叶盘法，由于叶盘法所用外植体为菊花叶盘，形成新的植株须经历脱分化、再分化过程，因此转化效率低，所需时间长；且工作量较大。目前已知转基因体系较为成熟的菊花品种——切花大菊‘神马’获得转基因阳性植株的时间为半年以上。通过与传统叶盘法菊花转基因的转化效率相比，本发明提供的方法有效地提高了转基因效率，降低了转基因成本。
总结
本发明以栽培型地被菊‘雨花落英’茎段为材料，通过真空负压法侵染获得转基因阳性株系。该方法相对于叶盘转化法来说，能够显著提高菊花外源基因的转化效率，明显缩短得到转基因阳性苗的时间。本发明为菊花的高效转化和基因功能分析提供新途径，同时也能够为其他不具有遗传转化体系的植物转基因提供了新思路。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种高效快速的菊花转基因方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaacgtg gaggaggttt tcatggatac cacaggctcc ccactcaccc tacatccgga 60
gggacacaac aaccggacat gaagatgaag ttaccagaaa tgaccagcac cacagtacct 120
acacctacag atgacaatga gtgcacagtt cgggaacaag atcgcttcat gccaatagca 180
aacgtcatcc gaatcatgag aaagatcctt cctcctcatg ctaagatatc tgatgatgca 240
aaagaaacca tccaagaatg tgtttctgag tacattagct ttgtgacagg tgaagccaat 300
gaccgctgcc agcgtgaaca aaggaagacc atcactgctg aagatgtgct gtgggccatg 360
agcaaactag ggtttgatga ttatatcgag cctctgactg tgtatctgca ccgctatagg 420
gagtttgatg gcggagaacg tgggtccata aggggtgagc cacttgtgaa gagaactgct 480
gatcatggtc actttggtat gagtcatcct tttgtgcctg cttttcacat ggggcatcat 540
cataacggct tctttggtcc tgcaagcatt ggtggtttta tgaaggaccc atcaagtgct 600
ggaccttctg gacctgctgc cgtggctggt tttgagccat atgctcagtg taaagaa 657

Claims (3)

1.一种高效快速的菊花转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取菊花茎段作为外植体置于预培养基上进行预培养；
（2）将转化有重组表达载体的农杆菌菌液进行活化和培养，然后富集菌体，并用MS液体培养基重悬作为侵染液；
（3）将步骤（1）中预培养后的外植体浸入侵染液中采用真空负压法对其进行侵染；
（4）将侵染后的外植体置于预培养基上在黑暗条件下进行共培养；之后在脱羧培养基上进行脱羧培养，最后依次使用选择培养基1和选择培养基2进行选择培养，确定无农杆菌爆发后，继代至生根培养基进行进一步的生根筛选得到菊花转基因植株；
步骤（1）中所述的茎段包含未分化的腋芽；
步骤（2）中将所述的农杆菌菌液摇菌培养至OD600为0.6；
步骤（3）中所述真空负压法对外植体进行侵染的方法具体包括如下步骤：
a. 将预培养后的外植体放入注射器中；
b. 吸取侵染液于所述的注射器中，使外植体完全浸入侵染液中，排出注射器中的气体并将注射器前端口密封；
c. 拉动注射器活塞，并摇动注射器，使侵染液侵入茎段内，使注射器保持负压状态，并不时摇动注射器，直至非负压状态下所有茎段沉入侵染液底部；
步骤（1）和（4）中各培养基的配方为：
预培养基： MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.1mg/L；
脱羧培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+Carb 350mg/L；
选择培养基1：MS+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.1mg/L+Carb 160mg/L+抗生素10mg/L；
选择培养基2：MS+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.1mg/L+Carb 80mg/L+抗生素 8mg/L；
生根培养基：MS+抗生素 9 mg/L；
所述的抗生素为与所述重组表达载体所具有的抗性相关的抗生素；
步骤（1）中所述预培养的时间为3天；
步骤（4）中在黑暗条件下进行共培养的时间为2~3天；所述脱羧培养的时间为7天；选择培养时每15天继代一次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述真空负压法对外植体进行侵染的方法为：将预培养后的外植体和侵染液置于密闭容器内并使外植体完全浸入侵染液中，震荡容器且使容器保持负压状态直至非负压状态下所有外植体沉入侵染液底部。
3.权利要求1或2所述的方法在快速进行转基因菊花培育中的应用。
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