CN113025645A - 一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法，以满天星茎段诱导得到的愈伤组织为遗传转化受体，通过农杆菌介导的方法，经愈伤组织诱导、转化受体的继代增殖培养、遗传转化，共培养，选择增殖培养、选择萌发培养、选择成苗培养并最终得到满天星的转基因植株。本发明方法简单，培养周期较短，成功实现满天星转基因植株的培育。
Description
技术领域
本发明涉及植物转基因技术领域，具体涉及一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法。
背景技术
满天星，学名锥花丝石竹(Gypsophila paniculata)，属于石竹科丝石竹属多年生草本植物。花单瓣和重瓣，是世界十大鲜切花之一，是月季、康乃馨、菊花等各种鲜切花所制花束、花篮、插花的衬衣，具有独特魅力，栽培相对容易，具有较高的经济价值，深受人的喜爱。但满天星的花色较为单一，目前主要应用于鲜切花的为白色花品种，若进行一些性状改良，得到更丰富的花色，将在现有经济价值上更上一层楼。传统育种方法存在着很大的局限性，而植物基因工程技术却能在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，从而为培育满天星新品种提供了新的途径。
虽然关于满天星的组织培养已有不少报道，但对满天星的遗传转化研究较少，目前仅见3篇中文文献与1篇英文文献报道了满天星农杆菌介导的遗传转化。王敬文等用发根农杆菌对满天星的叶片、茎切段和愈伤组织，外植体长出毛状根后，将毛状根剪成1-1.5cm小段后转移到分化培养基上使其脱分化，形成愈伤组织；再转移愈伤分化培养基，得到有矮化趋势的转化再生植株(王敬文等1992)。余沛涛等利用带有生长素基因的根癌农杆菌，以无菌苗的茎段为材料，
用注射器将农杆菌悬浮液注射在伤口上，待伤口处形成瘤组织后将其转移到分化培养基中使其再生，得到从瘤组织中分化的转化再生植株(余沛涛等1996，余沛涛等1997)。Zvi等(2008)以满天星无菌苗茎段为受体，进行根癌农杆菌介导遗传转化，获得转化再生植株。童雨嘉(2019)以满天星重瓣花瑞亚品种试管苗的上中部茎段为外植体，构建了农杆菌介导的满天星遗传转化体系。研究报道，在所有的遗传转化受体系统中，由于愈伤组织转化受体具有易于接受外源基因的能力，扩繁量大，转化效率较高等优点一直成为遗传转化体系研究的首选。目前，国内外还没有关于以满天星愈伤为受体，进行根癌农杆菌介导获得转基因植株的成功报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法，用以解决上述现有技术中的问题。
本发明的技术方案如下：
一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法，以满天星的茎段为外植体诱导获得愈伤愈伤组织为遗传转化受体材料，通过农杆菌介导的方法获得满天星的转基因植株。
进一步地，所述以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法按下述步骤进行处理：
S1.愈伤组织诱导：以满天星茎段为外植体，将所述的外植体在满天星愈伤组织诱导培养基中直接诱导出满天星愈伤组织；
S2.转化受体的继代增殖培养：将诱导得到的满天星愈伤组织接种到愈伤组织继代增殖培养基中，为遗传转化提供受体材料；
S3.遗传转化：将继代增殖培养的满天星愈伤组织作为转化受体材料转入农杆菌制备的菌液中进行侵染；
S4.然后将侵染后的满天星愈伤组织进行共培养、选择增殖培养、选择萌发培养、选择成苗培养并最终得到满天星的转基因植株。
根据本发明的实施例，所述愈伤组织诱导培养基成分包括：MS基本培养基、NAA0.3-1.0mg/L、6-BA 0.5-1.0mg/L蔗糖30.0g/L、Agar 7.5g/L，加蒸馏水至1L、pH为6.0。
根据本发明的实施例，所述愈伤组织继代增殖培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D2.0mg/L、NAA0.2 mg/L、蔗糖30.0g/L、Agar7.5g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0；所述继代增殖培养过程每4周更新一次培养基，并以在更新的愈伤继代增殖培养基中培养了2周的愈伤组织作为遗传转化的受体材料。
根据本发明的实施例，所述遗传转化步骤侵染时间为10-15min。
根据本发明的实施例，所述步骤S4中，先将侵染后的满天星愈伤组织转入共培养培养基中，在24±2℃黑暗条件下进行共培养3d，然后转入选择增殖培养基中进行选择增殖培养4周，每2周更新一次培养基，筛选得到抗性愈伤组织。
进一步地，所述步骤S4中，将筛选得到的抗性愈伤组织接种到选择萌发培养基中培养4周，每2周更新一次培养基，筛选得到抗性芽；然后将筛选得到的抗性芽接种到选择成苗培养基中培养4周，最终获得满天星的转基因植株。
根据本发明的实施例，所述步骤S4共培养培养基成分包括：MS基本培养基，2,4-D2.0mg/L，NAA 0.2mg/L，AS100μmol/L，蔗糖30.0g/L，Agar 7.5g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0。
根据本发明的实施例，所述步骤S4选择增殖培养基成分包括：MS基本培养基，2,4-D 2.0mg/L，NAA 0.2mg/L，Km30-50mg/L，Cef 300mg/L，蔗糖30.0g/L，Agar 7.5g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0。
根据本发明的实施例，所述步骤S4选择萌发培养基成分包括：MS基本培养基，NAA0.2mg/L，Km20-30mg/L，Cef300mg/L，蔗糖20.0g/L，Agar7.5 g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0；所述步骤S4选择成苗培养基成分包括：1/2MS基本培养基，NAA 0.5mg/L，Km 0-20mg/L，Cef300mg/L，蔗糖20.0g/L，Agar 7.5g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.通过本发明方法成功实现以满天星愈伤组织为转化受体材料，通过农杆菌介导及后期进一步培养获得了含有gus报告基因的转基因植株，为目的基因的转化打下了良好的基础。
2.本可发明所采用的外植体来源不受季节限制，以周年进行满天星的组织和愈伤培养，并且工艺简单、转化受体材料充分。
3.本发明离体培养下的满天星愈伤组织还可通过次生组织不断增殖，具有良好的增殖效果。
附图说明
图1本发明以满天星愈伤组织为受体的遗传转化技术路线图。
图2为本发明增殖培养基中培养的满天星愈伤组织。
图3为本发明满天星愈伤组织萌发成苗的情况。
图4为本发明中满天星转基因植株的GUS活性检测情况。
图5为本发明中满天星转基因植株的PCR分子检测情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明提出了一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法，以满天星的茎段为外植体诱导获得愈伤愈伤组织为遗传转化受体材料，通过农杆菌介导的方法获得满天星的转基因植株。图1为本发明以满天星愈伤组织为受体的遗传转化技术路线图，成功获得了含有gus报告基因的转基因植株，为目的基因的转化打下了良好的基础。
实施例
1、试验材料来源及其处理
满天星茎段诱导得到的愈伤组织，愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中进行增殖继代培养，以转入新鲜的增殖培养基中培养2周的愈伤组织为受体材料；
菌株和质粒：所用根癌农杆菌为GV3101菌株，含有pBI121质粒，该质粒于35S组成型启动子后携带GUS报告基因和Km抗性筛选标记。
2、培养基设计
表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。
表1：满天星的离体培养基设计
注：MS基本培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497。
表1中的卡那霉素(Kanamycin,Km)、头孢霉素(Cefotaxime,Cef)、乙酰丁香酮(AS)均采用0.45μm滤膜过滤灭菌，培养基高温灭菌后加入。
培养基中各种成分的代号如下：6-苄基腺嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、卡那霉素(Kanamycin,Km)、头孢霉素(Cefotaxime,Cef)、乙酰丁香酮(AS)、琼脂(Agar)均可以从商业上购买。
3、培养条件
培养室培养温度24±2℃，光照强度1000-15001x，光照周期为14h；黑暗培养温度24±2℃。
4、GUS组织化学染色分析
满天星GUS组织化学染色分析参照中科瑞泰(北京)生物科技有限公司生产的RTU4032 GUS染色试剂盒中的操作方法。
5、遗传转化过程：
①受体材料的准备：以满天星茎段为外植体，将所述的外植体在愈伤组织诱导培养基中直接诱导出愈伤组织，如图2所示；愈伤组织接种到愈伤组织继代增殖培养基中，每4周更新一次培养基，并在更新的继代增殖培养基中培养了2周的愈伤组织作为遗传转化的受体材料；
②菌株的制备：从-70℃冰箱中取出所保存的菌种，用接种环在含100mg/L Km的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28℃恒温箱中黑暗培养直至单菌落产生。挑取单菌落接种于含有100mg/L Km LB液体培养基中，在28℃恒温摇床上180r/min振荡培养过夜。然后将对数生长期的OD值为0.6-0.8菌液从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，3000r/min离心8min，去上清液，将收集到的农杆菌菌体置于含有100μmol/L AS的MS液体培养基中，在28℃恒温摇床上180r/min重悬培养2h后用于转化受体的侵染；
③侵染：将步骤①中在愈伤组织继代增殖培养基中培养两周的生长健壮的愈伤组织转入制备好的菌液中侵染10-15min；
④共培养：将侵染过的愈伤组织在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2℃，黑暗条件下培养3d；
⑤选择培养：将共培养后的愈伤组织接种到选择增殖培养基中，培养4周；筛选得到的抗性愈伤组织接种到选择萌发培养基中，培养4周；筛选得到的抗性芽接种选择成苗培养基中，抗性芽再生成植株，每2周更新一次培养基；满天星愈伤组织萌发成苗的情况如图3所示，可见成苗状况良好。
⑥以转基因植株和未转化植株为材料，进行GUS活性检测，未转化植株为阴性对照，如图4所示(a为未转基因植株；b为转基因植株)可见GUS稳定表达；以未转基因植株和转化植株叶片为材料，提取总DNA，并进行PCR分子检测，结果如图5所示(M：Marker；P：质粒(阳性对照)；U：未转化植株(阴性对照)；1-4：转化植株)，检测转化植株呈阳性。
6、试验结果
本发明以满天星的愈伤组织作为遗传转化受体材料，通过农杆菌介导以及后期进一步培养，培养12周后获得GUS稳定表达的满天星转基因植株，为目的基因的转化打下了良好的基础。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和描述的实施例。
Claims (10)
1.一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法，其特征在于：以满天星的茎段为外植体诱导获得愈伤组织为遗传转化受体材料，通过农杆菌介导的方法获得满天星的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按下述步骤进行处理：
S1.愈伤组织诱导：以满天星茎段为外植体，将所述的外植体在满天星愈伤组织诱导培养基中直接诱导出满天星愈伤组织；
S2.转化受体的继代增殖培养：将诱导得到的满天星愈伤组织接种到愈伤组织继代增殖培养基中，为遗传转化提供受体材料；
S3.遗传转化：将继代增殖培养的满天星愈伤组织作为转化受体材料转入农杆菌制备的菌液中进行侵染；
S4.然后将侵染后的满天星愈伤组织进行共培养、选择增殖培养、选择萌发培养、选择成苗培养并最终得到满天星的转基因植株。
3.根据权利要求2所述的获得满天星转基因植株的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基成分包括：MS基本培养基、NAA 0.3-1.0mg/L、6-BA 0.5-1.0mg/L蔗糖30.0g/L、Agar 7.5g/L，加蒸馏水至1L、pH为6.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织继代增殖培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D2.0mg/L、NAA0.2 mg/L、蔗糖30.0g/L、Agar7.5g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0；所述继代增殖培养过程每4周更新一次培养基，并以在更新的愈伤继代增殖培养基中培养了2周的愈伤组织作为遗传转化的受体材料。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述遗传转化步骤侵染时间为10-15min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，先将侵染后的满天星愈伤组织转入共培养培养基中，在24±2℃黑暗条件下进行共培养3d，然后转入选择增殖培养基中进行选择增殖培养4周，每2周更新一次培养基，筛选得到抗性愈伤组织。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，将筛选得到的抗性愈伤组织接种到选择萌发培养基中培养4周，每2周更新一次培养基，筛选得到抗性芽；然后将筛选得到的抗性芽接种到选择成苗培养基中培养4周，最终获得满天星的转基因植株。
8.如权利要求2所述的的方法，其特征在于，所述步骤S4共培养培养基成分包括：MS基本培养基，2,4-D 2.0mg/L，NAA 0.2mg/L，AS100μmol/L，蔗糖30.0g/L，Agar 7.5g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S4选择增殖培养基成分包括：MS基本培养基，2,4-D 2.0mg/L，NAA 0.2mg/L，Km30-50mg/L，Cef300 mg/L，蔗糖30.0g/L，Agar7.5g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S4选择萌发培养基成分包括：MS基本培养基，NAA 0.2mg/L，Km20-30mg/L，Cef300mg/L，蔗糖20.0g/L，Agar7.5 g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0；所述步骤S4选择成苗培养基成分包括：1/2MS基本培养基，NAA 0.5mg/L，Km0-20mg/L，Cef300mg/L，蔗糖20.0g/L，Agar7.5 g/L，加蒸馏水至1L，pH为6.0。
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