CN112931200B - 一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用 - Google Patents

一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用，本发明提供的方法具有繁殖系数高，繁殖速度快，生根效果好，简单方便等特点，与用叶片进行组培快繁获取再生植株相比，其繁殖系数高，可达32~35，繁殖速度快，缩短了培养周期。不仅为石竹提供了一种快速繁殖生产技术，进行工厂化生产；同时利用这个再生方法进行遗传转化，也可以快速完成遗传转化，获得转基因植株，为进一步开展农杆菌介导的中国石竹转基因研究构建一个强有力的技术平台。

Description

一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的 应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用。
背景技术
中国石竹(Dianthus chinensis)属一二年生草本植物，起源于中国，被广泛用于鲜切花，花坛花境，园林绿化，丰富的花型有利于提高经济价值。近几年石竹的组培和快繁技术取得不少成果，然而，其再生率较低，且再生苗比较纤细，工业化组培快繁培养生产用苗困难。现有技术中，陈旭(2006)的毕业论文中介绍了利用叶片为外植体建立中国石竹的遗传转化体系其最佳再生条件为：离体的植物叶片在预培养基(MS基础培养基+2,4-D1.0mg/L+6-BA 0.1mg/L)中培养3-4d，然后转入分化培养基(MS基础培养基+NAA 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L)，其再生率为68％，但受叶片状态的影响较大；2009年公布的专利《一种制备石竹高频再生植株的方法》(200910046388.8)中获取石竹再生植株的方法是借助原生质体的细胞全能性，然而获取原生质体的方法复杂，操作中需要用纤维素酶和果胶酶，耗费成本较高；张静静(2011)的毕业论文中详细的报道的先利用叶片诱导愈伤组织，进而分化出芽的遗传转化体系，转化效率较低，同时还介绍了叶片直接再生，再生率为56％，最佳分化培养基与陈旭报道的一致。施和平等(2013)发表的文章中报道了，五寸石竹(Dianthuschinensis)利用毛状根诱导及其植株再生的方法，其诱导植株再生培养基为：MS基础培养基+NAA 0.02mg/L+6-BA 1.0mg/L，30天可形成不定芽，但本方法需要先诱导足量毛状根的产生，然后对其进行脱分化获得愈伤组织，最后再分化成新的植株，过程复杂。
获取再生植株的方式有很多种，然而不难发现，目前农杆菌介导的中国石竹的遗传转化，受组培苗叶片的状态影响很大，同时已报道的另一种方法，通过制备原生质体的诱导再生的方法花费高，效率低。然而，在其他物种中，如苏晓瑜(2007)在康乃馨中发现，接种不同部位的外植体，再生植株的再生率不同，同时将农杆菌转入不同的外植体，遗传转化效率也有很大差异。因此，筛选合适的外植体进行植株再生和遗传转化，提高再生率和诱导率，是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用石竹(Dianthus spp.)子叶的组织培养方法，方法简单，易行，特别适用于石竹的遗传转化。
本发明的另一个目的在于提供了石竹(Dianthus spp.)的组织培养方法在石竹遗传转化中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
石竹(Dianthus spp.)的组织培养方法：
(1)外植体选取及处理：
取真叶还未长出，子叶刚刚展开的石竹(Dianthus spp.)无菌苗，培养3-7天，光周期为光照14-16h，黑暗8-10h，光照强度1600-2000lux，取子叶刚刚由黄转绿无菌苗，用切去根和下胚轴，沿子叶中线切开，分离两片子叶，即得分离的子叶外植体；
(2)增殖再生培养：将分离的子叶接种到增殖再生培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.04-0.08mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L上进行增殖再生培养，pH值为5.8-6.8，接种时伤口紧贴于培养基上；温度24-28℃，光照15-16h/d，光照强度1800-2000lux，获得芽丛，芽丛上的芽单独切下在相同培养基和培养条件下继续进行增殖再生培养，扩繁植株；
(3)壮芽培养：将获得的芽丛接种到壮芽培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.3-0.4mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L,中进行壮芽培养，培养基pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与(2)相同；
(4)生根培养：芽丛上的不定苗长至3～5cm，具有2～4片完整的叶片时，切割成单株不定苗接种到生根培养基：MS+琼脂7.0-7.5g/L+蔗糖28-32g/L,中进行生根培养，培养基pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与(2)相同；
所述的石竹为杂交石竹(Dianthus hybrid)或中国石竹(Dianthus chinensis)。
上述石竹(Dianthus chinensis)的组织培养方法在石竹的遗传转化中的应用，其应用过程是利用本领域的常规方法，将携带有目的基因的农杆菌侵染子叶，再将其接种到共培养培养基中培养，然后接种至选择培养基培养，获得的抗性芽依次接种至壮芽培养基和生根培养基中；所述的共培养培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.04-0.08mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+AS 80-120μmol/L，pH值为5.8-6.8；
所述的选择培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.04-0.08mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+抗生素；所述的壮芽培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.3-0.4mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+抗生素；
所述的生根培养基：MS+琼脂7.0-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+抗生素；
所述的抗生素为农杆菌转入的目的质粒携带的抗性基因对应的抗生素。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供一种利用石竹的子叶进行植物再生及遗传转化的方法，该方法繁殖系数高，繁殖速度快，生根效果好，简单方便等特点，与用叶片进行组培快繁获取再生植株相比，其繁殖系数高，可达32～35，繁殖速度快，缩短了培养周期。不仅为石竹提供了一种快速繁殖生产技术，进行工厂化生产；同时利用这个再生方法进行遗传转化，也可以快速完成遗传转化，获得转基因植株，为进一步开展农杆菌介导的中国石竹转基因研究构建一个强有力的技术平台。
附图说明
图1用于遗传转化的子叶。
图2从子叶再生出的丛芽。
图3再生芽在壮芽培养基的生长情况。
图4转基因植株GFP检测。
图5植株在生根培养基的生根情况。
图6为阳性转化植株种植后示意图。
图7部分T0代转化植株RT-PCR结果。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
石竹(Dianthus spp.)的组织培养方法：
(1)外植体选取及处理：
外植体的子叶的获得：取发育饱满无病害的石竹(Dianthus spp.)种子，诱导发芽。
所述诱导发芽是指将种子利用70％乙醇浸泡10min表面消毒，再用100％乙醇消毒10min，无菌水冲洗3-4次，每次4-5min。随后将种子接种于MS固体培养基，并转入暗培养箱。培养条件为25℃，培养3-5天，获得无菌苗。
子叶的获得：取真叶还未长出，子叶刚刚展开的无菌苗，置于光下培养1天(光周期为光照16h，黑暗8h，光照强度1800lux)。取子叶刚刚由黄转绿无菌苗，用解剖刀切去根和下胚轴，沿子叶中线切开，分离两片子叶，即得分离的子叶外植体。
(2)增殖再生培养：将分离的子叶接种到增殖再生培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.06mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖30g/L上进行增殖再生培养，pH值为6.5，接种时伤口紧贴于培养基上。培养基分装在90mm×20mm的培养皿中，每个分装30ml，每个皿接种15个外植体。温度25℃，光照16h/d，光照强度1800lux，可以在短时间内获得大量的植株，30天统计再生芽，单个接种的子叶，再生芽为32-35个，再生率为86％。待芽高0.8cm可再切下，相同培养基和培养条件下继续进行增殖再生培养，扩繁植株。
(3)壮芽培养：将获得的芽丛接种到壮芽培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖30g/L进行壮芽培养，培养基分装在350ml的培养瓶中，每个分装40ml，每瓶接种4个丛芽。pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与(2)相同，壮芽时芽丛的存活率为100％。
(4)生根培养：将芽丛上的不定苗长至3～5cm，具有2～4片完整的叶片时，切割成单株不定苗接种到MS+琼脂7.5g/L+蔗糖30g/L蔗糖进行生根培养。培养基pH值、培养瓶、分装容积、每瓶接种数、培养温度、光照时间、光照强度、培养时间均与(2)相同，生根率100％。
待不定苗在生根培养基中，根长为2～5cm时即可出瓶，出瓶后按2011年张静静硕士论文《石竹杂种优势育种及农杆菌介导的遗传转化研究》操作，下地养护，下地后的存活率是95％。
上述组培方法适用于目前已报道的杂交石竹(Dianthus hybrid)或中国石竹(Dianthus chinensis)自交系，包括但不限于：中国石竹‘X4’自交系，杂交石竹Diamond各颜色自交系、中国石竹‘MH’自交系，利用上述组培方法得到的效果无显著差异。
实施例2：
石竹的组织培养方法在中国石竹遗传转化中的应用：
1.用于遗传转化的石竹子叶的制备
选用中国石竹‘X4’自交系(Mapping a double flower phenotype-associatedgene DcAP2 L in Dianthus chinensis)作为试验材料。取发育饱满无病害的种子，70％乙醇浸泡10min表面消毒，再用100％乙醇消毒10min，无菌水冲洗3-4次，每次4-5min。随后将种子接种于MS固体培养基，并转入暗培养箱。培养条件为25℃，培养3-5天，获得无菌苗。
取真叶还未长出，子叶刚刚展开的无菌苗，置于光下培养1天(光周期为光照16h，黑暗8h，光照强度1800lux)。
取子叶刚刚由黄转绿无菌苗，用解剖刀切去根和下胚轴，沿子叶中线切开，分离两片子叶，即得分离的子叶外植体(图1)。
2.农杆菌的制备与活化
2.1质粒转化农杆菌：
(1)-80℃冰箱中取出一支冻存的感受态农杆菌EHA105(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)置于冰上融化；
(2)取10μl pRI101质粒DNA加入到200μl已解冻的感受态农杆菌EHA105中，轻轻混合，在冰上孵育30min，并在液氮中速冻5min后迅速转至37℃水浴中孵育5min；
(3)加入400μl新鲜LB液体培养基，28℃摇床，200rpm，1h；
(4)取200μl LB液体培养基，涂布于LB固体培养基(含50mg/L Km，50mg/L Rif)，28℃培养2-3天，直到出现菌斑，然后置于4℃条件保存。
(5)在平板上挑选单克隆，接种到10ml LB液体培养基(含50mg/L Km，50mg/LRif)，28℃，200rpm培养1-2d到OD600值约0.5左右结束培养；加入70％灭菌甘油，制备成甘油菌-70℃冰箱备用。
2.2菌种活化
制备的含pRI101质粒的农杆菌EHA105接种于LB固体培养基平板:含有50mg/LRif、50mg/L卡那霉素:上活化(28℃，约36h)，然后接种于LB固体培养基平板待用。
3.遗传转化与共培养
挑取农杆菌单菌落接种于50ml LB液体培养基+50mg/L利福平(Rif)+50mg/L卡那霉素中，摇床培养过夜，28℃摇床，200rpm，至对数生长期，OD600为0.5。菌液在10℃下5000rpm离心20min，弃上清，收集管底菌体，用液体养培养基：MS基础培养基+乙酰丁香酮100μmol/L，重悬菌体，室温下，静置30min备用。
将分离的子叶浸入到重悬后的菌液中振荡浸泡12-15min左右，将子叶外植体取出，无菌滤纸吸干菌液，放在铺有灭菌滤纸的共培养培养基上，在25℃黑暗条件下共培养4天。
所述的共培养培养基的配方是：MS培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.06mg/L+AS 100μmol/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH 6.5。
4.外植体的诱导和筛选分化
将侵染后的子叶，从共培养培养基转到选择培养基(MS培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA0.06mg/L+卡那霉素80mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+头孢噻肟100mg/L，pH 6.5)上培养(图2)，全部子叶转入选择培养基后，出芽率为21％(出芽率＝选择培养基上出芽的子叶数量/全部子叶)。
待抗性芽长至1-2cm时转到壮芽培养基(MS培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+卡那霉素60mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+头孢噻肟100mg/L，pH 6.5)上生长，直至芽高4cm(图3)，温度25℃，光照16h/d，光照强度1800lux。
由于本发明转染的农杆菌是含有绿色荧光蛋白的，因此可用手持荧光器对转化后的子叶进行初步检测(图4)；
5.待步骤4中的抗性芽长至4cm，转至生根培养基中进行生根，根长为2～5cm时即可出瓶(图5)，其生根率100％，RT-PCR(引物ATGGTGAGCAAGGGCGAG和TTACTTGTACAGCTCGTCCATG)结果显示(图7)，共培养培养基上共选取了200株转染的子叶，经手持荧光器和PCR鉴定，共获得阳性株37株。出瓶后按2011年张静静硕士论文《石竹杂种优势育种及农杆菌介导的遗传转化研究》操作，移栽大田；移栽大田后的存活率是92％(图6)。
所述的生根培养基的配方是：MS+卡那霉素10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+头孢噻肟50mg/L。
将上述方法的应用对象替换为Diamond‘Scarlet’(https://sakataornamentals.com/plantname/diamond/)时，其余参数条件不变，其在选择培养基上的出芽率为15％；该品种的其他自交系，包括‘Blush Pink’，‘Carmine Rose’，‘Coral’，‘Crimson’，‘Pink’和‘Purple’，均适用于上述的遗传转化。
将上述方法用于中国石竹‘MH’自交系(Mapping a double flower phenotype-associated gene DcAP2L in Dianthus chinensis)时，其在选择培养基上的出芽率为1％。
将上述方法用于申请人实验室的其余石竹自交系，完全无法转入外源基因，出芽率小于1％。
实施例3：
利用现有的中国石竹的组培方法进行遗传转化：
张静静(2011)的毕业论文中报道的，最适转化体系为：将组培植物的叶片(Diamond‘Scarlet’或中国石竹‘X4’自交系)在分化培养基MS+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L上预培养2天；将携带GUS报告基因的农杆菌EHA105菌株侵染10min；转移至共培养基MS+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+AS100 mg/L中，共培养4天；再转移到选择培养基MS+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+Hyg4-5 mg/L+Cef 400mg/L中进行生根筛选培养，选择培养基上的出芽率仅为1-2％。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgagca agggcgag 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttacttgtac agctcgtcca tg 22

Claims (2)

1.石竹（Dianthus spp.）的组织培养方法：
（1）外植体选取及处理：
取真叶还未长出，子叶刚刚展开的石竹无菌苗，培养3-7天，光周期为光照14-16h，黑暗8-10h，光照强度1600-2000lux，取子叶刚刚由黄转绿无菌苗，切去根和下胚轴，沿子叶中线切开，分离两片子叶，即得分离的子叶外植体；
（2）增殖再生培养：将分离的子叶接种到增殖再生培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA0.04-0.08mg/L +琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L上进行增殖再生培养，pH值为5.8-6.8，接种时伤口紧贴于培养基上；温度24-28℃，光照15-16h/d，光照强度1800-2000lux，获得芽丛，芽丛上的芽单独切下在相同培养基和培养条件下继续进行增殖再生培养，扩繁植株；
（3）壮芽培养：将获得的芽丛接种到壮芽培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+ NAA 0.3-0.4mg/ L +琼脂6.5-7.5g/L +蔗糖28-32 g/L，中进行壮芽培养，培养基pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与（2）相同；
（4）生根培养：芽丛上的不定苗长至3～5cm，具有2～4片完整的叶片时，切割成单株不定苗接种到生根培养基：MS+琼脂7.0-7.5g/L +蔗糖28-32g/L,中进行生根培养，培养基pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与（2）相同；
所述的石竹为杂交石竹（Dianthus hybrid）或中国石竹（Dianthus chinensis）。
2. 权利要求1所述的石竹的组织培养方法在石竹的遗传转化中的应用，所述的石竹为：中国石竹‘X4’自交系，Diamond‘Scarlet’，‘Blush Pink’，‘Carmine Rose’，‘Coral’，‘Crimson’，‘Pink’和‘Purple’品系；
其应用过程是：利用本领域的常规方法，将携带有目的基因的pRI101质粒的农杆菌侵染子叶，再将其接种到共培养培养基中培养，然后接种至选择培养基培养，获得的抗性芽依次接种至壮芽培养基和生根培养基中；
所述的共培养培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.04-0.08mg/L +琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+ AS 80-120μmol/L，pH值为5.8-6.8；
所述的选择培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.04-0.08mg/L +琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+抗生素；所述的壮芽培养基：MS+6-BA 0.8-1.2mg/L+ NAA 0.3-0.4mg/ L +琼脂6.5-7.5g/L +蔗糖28-32 g/L+抗生素；
所述的生根培养基：MS+琼脂7.0-7.5g/L +蔗糖28-32g/L+抗生素；
所述的抗生素为头孢噻肟。
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利用二次回归正交设计优化香石竹叶片再生体系中6-BA和NAA的浓度组合;刘彩霞;《核农学报》;20081231;第22卷(第1期);第45-48页 *
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