DE3889749T2

DE3889749T2 - Verfahren zum Vervielfältigen von Pflanzensämlingen.

Info

Publication number: DE3889749T2
Application number: DE3889749T
Authority: DE
Inventors: Shizufumi Tanimoto
Original assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1987-03-06
Filing date: 1988-03-02
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2008-03-03
Also published as: DK116588A; EP0281374A2; CN1018048B; KR960013130B1; EP0281374B1; CA1297295C; JP2662234B2; EP0281374A3; JPH0198418A; DE3889749D1; KR880011327A; DK116588D0; AU1272888A; CN88101686A; AU604533B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vermehrung von Setzpflänzchen durch Anwendung von Gewebezüchtung auf Pflanzen.
Gemüsepflanzen, wie Kohl, Tomaten und Gurken, sowie Reisarten werden als Nahrungsmittel verwendet. Dagegen sind andererseits Gartenpflanzen, wie Tulpern, Nelken und Rudbeckia, als Zierpflanzen gefragt. Diese Pflanzen sind bisher beispielsweise mit Hilfe von Setzlingen oder durch Teilung von Zwiebeln oder Knollen vermehrt worden. Dieses Vermehrungverfahren erfordert jedoch nicht nur große Flächen und viel Arbeit, sondern es birgt wegen der Verbreitung von Viruskrankheiten in den letzten Jahren auch Probleme hinsichtlich, der Herstellung der Wachstumsgeschwindigkeit oder der Minderung der Qualität der Blüten Mit dem Ziel, diese Probleme zu überwinden und den Wirkungsgrad der Vermehrung zu steigern, wurde in den letzten Jahren über Verfahren berichtet welche die Technik der Gewebezüchtung verwenden (vgl. beispielsweise Japanische Offenlegungsschrift Nr. Sho 55-14734). Die Vermehrung durch Züchtung von Gewebe wurde über die Differenzierung von zufällig hinzugekommenen Knospen zufällig hinzugekommenen Keimen oder Zwiebeln ausgehend von gezüchteten Gewebestücken und gezüchteten Zellen erreicht und es wurde in Erwägung gezogen, daß die Differenzierung durch das Verhältnis der Konzentrationen von Cytokinin zu Auxin als Pflanzenhormone gesteuert wird (vgl. beispielsweise Annals of Botany, Band 45, 321 - 327, 1980). Es gibt jedoch viele Pflanzengruppen die bei alleiniger Verwendung von Pflanzenhormonen keine Differenzierung erleiden oder bei denen die Häufigkeit der Differenzierung, wenn sie eintritt, äußerst gering ist. Es bestand ein Bedürfnis nach der Bereitstellung eines direkteren und wirksameren Verfahrens zum Einleiten der Differenzierung.
Wir haben ein im Vergleich zum üblichen Fall wirksameres Verfahren zur Vermehrung von Pflanzensetzlingen studiert, welches auf der Erkenntnis basiert, daß bei dem Verfahren der Gewebezüchtung für Pflanzen, wie oben beschrieben, verschiedene Probleme bestehen.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zum Vermehren von Pflanzensetzlingen durch Gewebezüchtung vorgesehen, das dädurch gekennzeichnet ist, daß man die Gewebezuchtung durchführt, nachdem man eine wässerige, Calmodulin und/oder Kalzium enthaltende Lösung direkt in die Zellen von Gewebestücken oder in die gezüchteten Zellen der Pflanzen eingebracht hat, wobei die erwähnte Lösung 3ug/ml bis 1 mg/ml Calmodulin und/oder 100 uMol bis 30 mMol Kalzium enthält.
Die Pflanzen welche im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nicht in spezieller Weise beschränkt, und das Verfahren kann auf alle Arten von Pflanzen angewendet werden.
Pflanzen, auf die das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden kann, schließen beispielsweise ein: Mohngewächse (Papaveraceae), Nachtschallengewächse (Solanaceae), Doldengewächse (Umbelliferae), Rosengewächse (Rosaceae), Liliengewächse (Liliaceae), Korbblütler (Compositae), Geraniengewächse (Geraniaceae), Kürbisgewächse (Cucurbitaceae) und Gräser (Gramineae). Spezifische Beispiele für solche Pflanzen können ferner diejenigen einschließen, welche in "Ground for the Plants System Classification", heraugegeben von Yamagishi, veröffentlicht von Kokuryukan 1974. Spezifisch können diejenigen Pflanzen erwähnt werden, welche zu den Nachschattengewächsen gehören, wie Aubergine, Tomate, Kartoffel, Süßkartoffel und Basilikum, Pflanzen, die zu den Mohngewächsen gehören, wie Mohn, Raps, Kohl, Rettich und Chinakohl, Pflanzen, die zu den Doldengewächsen gehören, wie Karotte, japanische Petersilie und Petersilie, Pflanzen, die zu den Rosengewächsen gehören, wie Rose, Erdbeere, Sojabohne und Kirsche, Pflanzen, die zu den Liliengewächsen gehören, außer Lilium, wie Zwiebeln und Tulpen, Pflanzen, die zu den Korbblütlern gehören, wie Chrysantheme, Kornblume und Sonnenblume, Pflanzen, die zu den Geraniengewächsen gehören, wie Pelargonie, Geranie und Flachs, Pflanzen, die zu den Kürbisgewächsen gehören, wie Gurke und Kürbis, Pflanzen, die zu den Gräsern gehören, wie Reis und Mais. Unter diesen Pflanzen, die für vorliegende Erfindung von Bedeutung sind, stellen Tomate, Tabak, Aubergine, Trenia, Karotte, Kohl, Zwiebel, Sojabohne, Basilikum, Kornblume, Rudbeckia, Nelke, Trompetenlille, Tulpe, Spargel, Flachs, Gurke und Reis speziell bevorzugte Pflanzen dar.
Gemäß vorliegender Erfindung wird die Züchtung von Pflanzengewebe unter Verwendung von Gewebestücken oder gezüchteten Pflanzenzellen durchgeführt. Die zur Züchtung verwendeten Gewebestücke können speziell Gewebestücke von Pflanzen einschließen, die hergestellt werden, indem man Gewebe von Keimblättem, Hypocotyl, Triebspitzen, Stengeln, Blättern, Wurzeln oder anderes Gewebe in dünne Scheiben schneidet. Diese Gewebestücke werden gewöhnlich nach Sterilisation mit Natriumhypochlorit oder Ethanol verwendet. Falls jedoch unter keimfreien Bedingungen gezüchtete Pflanzen verwendet werden, ist die oben erwähnte Sterilisation nicht erforderlich. Außerdem können zur Vermehrung von Pflanzensetzlingen von Pflanzen, die in der Nähe der Triebspitze nicht durch Krankheiten oder Viren befallen sind. Stücke von Pflanzengewebe, die aus Gewebe in der Nähe der Triebspitze gewonnen wurden, als Ausgangsmaterial für die Züchtung verwendet werden. Die gezüchteten Zellen, welche im Verfahren zur Züchtung von Pflanzengewebe gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden können, sind undifferenzierte amorphe Zellen, welche Kallusgewebe einschließen, das in bekannter Weise durch Anwendung des Verfahrens der Gewebezüchtung auf die Gewebestücke erhalten wurde.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung von Gewebezüchtung wird die Züchtung des Gewebes nach Einbringen von Calmodulin und/oder Calcium in die Zellen der Gewebestücke oder in die gezüchteten Zellen durchgeführt.
In bezug auf vorliegende Erfindung ist Calmodulin eine Art von Protein, wie Ca²&spplus;-ATPase aus Erythrozytenmembranen oder Phosphodiesterase aus Hirn die eine aktivierende Funktion haben und deren Mobilität in Gegenwart von Kalzium nach Durchfühung von Elektrophorese herabgesetzt ist. Calmodulin kann beispielsweise aus Zwiebeln der Trompetenlilie, aus Hirn von Rindern oder aus Samenbläschen der Ratte isoliert und gereinigt werden.
Nunmehr werden spezielle Ausfühungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

(1) Einbringen von Calmodulin allein in die Zellen von Gewebestücken oder in gezüchtete Pflanzenzellen.

Calmodulin kann beispielsweise durch die folgenden Verfahren eingebracht werden: Die Behandlung zur Einführung von Calmodulin wird durchgeführt, indem man die Gewebestücke für die Züchtung oder die gezüchteten Pflanzenzellen zwischen Elektroden bringt und, nachdem man eine Calmodulin enthaltende Lösung zugesetzt hat, werden bei einer Feldstärke eines elektrischen Feldes von 30 V/cm bis 2,5 kV/cm wahrend 30 uSek. bis 1 mSek. elektrische Stromstöße einwirken gelassen. In diesem Fall wird Calmodulin in einer Konzentration von 3 ug/ml bis 1 mg/ml verwendet. Außer dem auf elektrischer Einspritzung beruhenden Verfahren, wie es oben beschrieben wurde, können verschiedene Arbeitsweisen erwähnt werden, wie ein Verfahren zum Einspritzen einer Calmodulin enthaltenden Lösung in das Innere der Zellen durch Verwendung einer Mikropipette aus Glas unter mikroskopischer Beobachtung, ein Verfahren zur stoßweisen Bestrahlung der in eine Calmodulin enthaltende Lösung eingebrachten Zellen mit Laserstrahlen, um die Zellen mit feinen Poren mit einem Durchmesser von weniger als 1 Mikron zu durchsetzen und das Einbringen von Calmodulin durch die Öffnungen in das Innere der Zellen durch Anwendung eines Verfahrens zum Transport von Material in das Innere von lebenden Zellen, wie es in der japanischen Patentpublikation Nr. Sho 62-7838 vorgeschlagen wird, oder ein Verfahren zum Einbringen von Makromolekülen in das Innere von Pflanzenzellen durch Verwendung von Wolfam-Barren (tungsten billets), wie es kurzlich beschrieben wurde. Die Menge an durch die oben beschriebenen Verfahren in das Innere der Zellen eingebrachten Calmodulin kann durch Markieren des Calmodulins mit einem fluoreszierenden Farbstoff und Messen der Intensität der Fluoreszenz nach dem Einbringen in das Innere der Zellen bestimmt werde und liegt gewöhnlich im Bereich von 1 ug/ml bis 300 ug/ml und vorzugsweise von 10 ug/ml bis 100 ug/ml.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung von Gewebezüchtung nach dem Einbringen von Calmodulin in das Innere der Zellen von Gewebestücken oder in gezuchtete Zellen von Pflanzen ist, obwohl die Gewebezüchtung unter Verwendung des später nach dem Einbringen von Calmodulin beschriebenen Mediums durchgeführt werden kann, die Anwendung der Gewebezüchtung unter Verwendung eines Kalziumionen enthaltenden Mediums mit einer Konzentration von über 1 mMol bevorzugter, da die Differenzierung zu hinzugekommenen Knospen, hinzugekommenen Keimen und Zwiebeln der Pflanzen weiter gefördert wird. In diesem Fall ist es wünschenswert das Verfahren zum Züchten von Gewebe unter Verwendung von Ca-Ionophoren enthaltenden Kulturmedien, wie A23187, das in der nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung publizierten EP-A-276575 vorgeschlagen wird, gewöhnlich in einem Konzentrationsbereich von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup4; Mol, vorzugsweise 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup5; Mol, durchzuführen, da die Differenzierung bemerkenswert ist. Außerdem ist es gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt, nach der Gewebezüchtung durch Einbringen von Calmodulin unter Verwendung eines einen Ca-Ionophor enthaltenden Kulturmediums, wie A23187, im Konzentrationsbereich von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup4; Mol eine weitere Gewebezüchtung vorzunehmen, da die Differenzierung weiter gefördert wird.

(2) Einbringen von Kalzium allein in die Zellen von Gewebestücken oder in gezüchtete Zellen von Pflanzen.

Das Verfahren zum Einbringen von Kalzium kann erfindungsgemäß in der gleichen Weise durchgeführt werden, wie im Falle des Einbringens von Calmodulin. Beispielsweise werden im Falle des elektrischen Einspritzens die Gewebestücke oder die gezüchteten Zellen zwischen Elektroden gebracht, es wird eine Kalzium enthaltende Lösung zugegeben und danach werden Stromstöße einwirken gelassen, um das Kalzium in das Innere der Zellen einzubringen.
Die Konzentration an Kalzium in der Kalzium enthaltenden Lösung betragt in diesem Fall 100 uMol bis 300 mMol. Die Kalzium enthaltende Lösung kann speziell diejenigen wässerigen Lösungen einschließen, welche Kalziumverbindungen, wie Kalziumchlorid, Kalziumnitrat und Kalziumcarbonat, in gelöster Form enthalten. Gemäß vorliegender Erfindung liegt die Menge an Kalzium, die durch das oben erwähnte Verfahren in das Innere der Zellen eingebracht wird, wenn sie in gleicher Weise ausgedrückt wird wie für Calmodulin, gewöhnlich im Bereich von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; Mol, vorzugsweise von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup5; Mol.

(3) Einbringen sowohl von Calmodulin als auch von Kalzium in Zellen von Gewebestücken oder gezüchtete Zellen von Pflanzen.

Dieses Verfahren ist besonders bevorzugt, da die Differenzierung zu hinzugekommenen Knospen und hinzugekommenen Keimen von Pflanzen im Vergleich zu Verfahren (1) oder (2) in bemerkenswerter Weise gefördert wird. Das Calmodulin und das Kalzium können durch die gleichen Verfahren in die Zellen eingebracht werden, wie sie oben in (1) und (2) erwähnt wurden, und das Einbringen kann beispielsweise erreicht werden, indem man die Gewebestücke oder die gezüchteten Zellen von Pflanzen zwischen Elektroden bringt und nach Zugabe einer Kalzium enthaltenden Lösung, die Calmodulin enthalt, bei der gleichen Feldstärke wie oben in der gleichen Weise Stromstöße einwirken läßt. In diesem Fall liegen die Konzentrationen von Calmodulin und Kalziumionen in der Lösung in den gleichen Bereichen wie denjenigen, die oben in (1) und (2) genannt wurden. Ferner liegen die Mengen an Calmodulin und Kalziumionen, die in das Innere der Zellen eingebracht werden, ebenfalls in den oben in (1) und (2) beschriebenen Bereichen.
Beim erfindungsgemäßen Einbringen von Calmodulin und Kalzium in das Innere von Zellen ist es gewöhnlich wünschenswert, ein Verfahren zum gleichzeitigen Einbringen von Kalziumionen und damit vereintem Calmodulin zu verwenden, wobei, wie oben beschrieben, eine Kalzium enthaltende Lösung verwendet wird, die Calmodulin enthält. Es ist jedoch auch möglich, Calmodulin und Kalzium durch die oben beschriebenen Verfahren nach Bedarf getrennt in das Innere der Zellen einzubringen und anschließend eine Gewebezüchtung durchzuführen.
Das Kulturmedium, das nach dem Einbringen von Calmodulin und/oder Kalzium für das Züchten von Gewebe verwendet wird, kann beispielsweise diejenigen Kulturmedien einschließen, die nachstehend beschrieben werden.
Das erfindungsgemäß verwendete Kulturmedium ist ein anorganische Bestandteile und eine Kohlenstoffquelle als wesentliche Bestandteile enthaltendes Kulturmedium, welchem Pflanzenhormone und Vitamine und, soweit erforderlich, Alminosäuren zugesetzt wurden. Die anorganischen Bestandteile können diejenigen anorganischen Salze einschließen, welche Elemente, wie Stickstoff, Phosphor, Kalium, Natrium, Kalzium, Magnesium, Schwefel, Eisen Mangan, Zink, Bor, Molybdän, Chlor, Jod und Kobalt enthalten. Spezifisch können diejenigen Verbindungen, wie Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Kaliummonohydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Natriumsalfat, Eisen(II)sulfat, Eisen(III)sulfat, Mangansulfat, Kupfersülfat, Natriummolybdat, Molybdäntrioxid, Kaliumjodid, Zinksulfat, Borsäure und Kobaltchlorid, erwähnt werden.
Die Kohlenstoffquelle für das Kulturmedium kann beispielsweise Kohlehydrate und Derivate davon einschließen, wie Rohrzucker, organische Säuren, wie Fettsäuren, und primäre Alkohole, wie Ethanol.
Pflanzenhormone für das Kulturmedium können beispielsweise Auxine, wie Naphthalinessigsäure (NAA), Indolylessigsaure (IAA), p-Chlorphenoxyessigsäure (2,4-D), Indolbuttersäure (IBA) und Derivate davon, sowie Zytokinine, wie Benzyladenin (BA), Kinetin und Zeatin, einschließen.
Vitamine für das Kulturmedium konnen beispielsweise biotin, Thiamin (Vitamin B1), Pyridoxin (Vitamin B6), Pyridoxal, Pyridoxamin, Kalziumpantothenat, Ascorbinsäure (Vitamin C), Inosit, Nikotinsäure, Nikotinamid und Riboflavin (Vitamin B2) einschließen.
Die Aminosäuren fur das Kulturmedium können beispielsweise Glycin, Alanin, Glutaminsäure, Cystein, Phenylalanin und Lysin einschließen.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Kulturmedium enthält in wünschenswerter Weise 0,1 uMol bis 100 mMol des anorganischen Bestandteils, 1 g/l bis 100 g/l der Kohlenstoffquelle 0,01 mg/l bis 10 mg/l Pflanzenhormone, 0,1 mg/l bis 150 mg/l Vitamine und 0 bis 1000 mg/l Aminosäuren.
Das gemäß vorliegender Erfindung zur Züchtung von Gewebe verwendete Kulturmedium kann speziell diejenigen bekannten Kulturmedien einschließen, die zur Züchtung von Gewebe verwendet werden, zum Beispiel Murashige & Skoog Kulturmedium ('62), Linsmaier & Skoog Kulturmedium (RM-1965), White Kulturmedium ('63), Gamborg B-S Kulturmedium, Mitsui M-9 Kulturmedium, Nitch & Nitch Kulturmedium usw., wobei diese nach Bedarf mit einer Kohlenstoffquelle und einem Pflanzenhormon, wie oben beschrieben, und weiter mit Vitaminen und Aminosäuren, wie oben beschrieben, vereinigt werden. Unter diesen sind diejenigen Kulturmedien bevorzugt, welche unter Verwendung von Nitch & Nitch, Linsmaler & Skoog oder Murashige & Skoog Kulturmedium hergestellt wurden. Gemäß vorliegender Erfindung ist es auch möglich, solche Kulturmedien zu verwenden, die durch Zugabe einer Ca²&spplus;-Ionen enthaltenden Verbindung, cyclischer AMP und einem Polyamin hergestellt wurden, wie es in der oben erwähnten EP-A-276575 vorgeschlagen wird. Die Zusammensetzungen der oben erwähnten bekannten Kulturmedien sind beispielsweise in "New Plant Tissue Culture", Seiten 386 - 391, verfäßt von Takeuchi, Nakajima, Furuya, und 1979 von Askra Shoten publiziert.
Ein gemäß vorliegender Erfindung verwendetes Kulturmedium ist ein flüssiges oder ein festes Kulturmedium, das gewöhnlich 0,1 bis 2% eines Geliermittels, wie Agar oder Gellite enthält.
Gemäß vorliegender Erfindung können die Gewebestücke oder die gezüchteten Zellen von Pflanzen, wie sie oben beschrieben wurden, unter Verwendung eines flüssigen, mit einem Sauerstoff enthaltenden Gas begasten Kulturmediums in gleicher Weise bei der Züchtung von Gewebe verwendet werden, wie es in der japanischen Patentanmeldung Nr. Sho 60-128348 beschrieben ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich eine große Menge hinzugekommener Knospen, hinzugekommener Keime oder Zwiebelchen (Meine Zwiebeln) mit einem hohen Wirkungsgrad aus Gewebestücken oder gezüchteten Zellen von Pflanzen zu erhalten. In dieser Hinsicht ist weiter darauf hinzuweisen, daß hinzugekommene Knospen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, in Pflanzenkörper eingepflanzt werden können, welche darin zu Gewebestucken zerstückelt (Zwiebelchen werden ebenfalls zerstückelt) und gemäß vorliegender Erfindung einer weiteren Gegebezüchtung durch das oben beschriebene Züchtungsverfahren unterworfen werden. Dadurch wird es möglich Setzlinge in großer Menge zu vermehren. Außerdem können sich die gemäß vorliegender Erfindung erhaltenen Pflanzen durch üblichen Anbau zu vollstandigen Pflanzen von stabiler Natur entwickeln.
Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, in welchem nach Einbringen von Calmodulin und/oder Kalzium in Zellen von Gewebestücken oder in gezüchtete Zellen von Pflanzen eine Züchtung von Gewebe durchgeführt wird, kann eine große Menge von Setzlingen erhalten werden, da die Differenzierung von hinzugekommenen Knospen, hinzugekommenen Keimen und Zwiebeln der Pflanzen in bemerkenswerter Weise gefordert wird. Dementsprechend können durch das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu üblichen Verfahren Pflanzenkörper von hoher Qualität und in großer Menge mit einem besseren Wirkungsgrad gezüchtet werden. Außerdem kann durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens der Durchmesser der Stengel von differenzierten hinzugekommenen Knospen vergrößert werden, um zufriedenstellende Setzlinge zu erhalten. Das Verfahren ist ein neues Verfahren zum Züchten von Gewebe, das auf den neun Erkenntnissen gemäß vorliegender Erfindung beruht.
Die Natur und die vorteilhafte Wirkung der vorliegenden Erfindung wird nunmehr anhand von Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Schalen der Zwiebel der Trompetenlilie wurden nach Sterilisieren mit 70%igem Ethanol und einer wässerigen Lösung von Natriumhypochlorit (mit einer Menge an wirksamem Chlor von 1%) und Schneiden in Stücke von etwa 2 mm Breite zwischen Elektroden gebracht und es wurde ihnen eine 3 mM Lösung von Kalziumchlorid zugesetzt, die 100 ug/ml Calmodulin enthielt, das aus Zwiebeln der Trompeteniilie isoliert und gereinigt worden war, und es wurden bei einer Feldstärke von 500 V/cm drei Mal wahrend 200 uSek. Stromstöße einwirken gelassen. Dann wurde bei pH 6 festes keimfreies Murashige und Skoog Kulturmedium (1962) ( Konzentration von Gellite 0,2%) hergestellt, das 4% Rohrzucker, 0,01 mg/l Naphthalinessigsäure und 0,02 mg/l Benzyladenin enthielt. Dem Medium wurden 10 Stücke der oben beschriebenen Schalen der Trompetenlilie zugesetzt und 3 Wochen bei 25ºC an einem hellen Ort gezüchtet. Es wurden die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse als Zahl von gebildeten Knollen pro Gewebestück erhalten. Die durch Differenzierung erhaltene Zahl von Knollen wurde im Vergleich zu derjenigen von Vergleichsbeispiel 1 in allen behandelten Proben erhöht.

Vergleichsbeispiel 1

Gewebestäcke von Schalen der Trompetenlilie wurden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß anstelle der Calmodulin enthaltenden Lösung von Kalziumchlorid destilliertes Wasser verwendet wurde.

Beispiele 2 - 3

Das Verfahren der Gewebezüchtung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 auf die Trompetenlilie ange wendet, mit der Ausnahme, daß anstelle von in Beispiel 1 als Material verwendeten Gewebestücken von Blättern der Trompetenlilie Kalluszellen der Trompetenlilie verwendet wurden, um die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse zu erhalten. Die Zahl von differenzierten Knollen wurde im Vergleich mit derjenigen von Vergleichsbeispielen 2 - 3 in jeder der Proben erhöht.

Vergleichsbeispiele 2 - 3

Gewebestücke von Blättern der Trompetenlilie und Kalluszellen der Trompetenlilie wurden nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispielen 2 - 3 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß anstelle der in Beispielen 2 - 3 verwendeten, Calmodülin enthaltenden Lösung von Kalziumchlorid destilliertes Wasser verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Beispiele 4 - 5

Das Verfahren der Gewebezüchtung wurde bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 3 auf Kalluszellen der Trompetenlilie, angewendet mit der Ausnahme daß als eingebrachtes Calmodulin in diesem Beispiel ein Calmodulin verwendet wurde, das aus Rinderhirn und aus Samenbläschen von Ratten isoliert und gereinigt worden war. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Material Behandlung Zahl von gebildeten Knollen pro Gewebestück Beispiel Vergleichsbeispiel Gewebestücke aus Trompetenlilienschalen Gewebestücke aus Trompetenlilienblättern Kalluszellen von Trompetenlilie behandelt durch Einbringen von Calmodulin und Kalzium behandelt mit Wasser behandlt mit destilliertem Wasser

Beispiel 6 - 14

Das Verfahren der Gewebekultur wurde bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 1 angewendet, mit der Ausnahme, daß Gewebestücke von Tomatenblättern, Kalluszellen der Tomate, Gewebestücke von Blättern der Aubergine, Kalluszellen der Aubergine, Gewebestücke von Tabakblättern, Gewebestücke von Treniastengeln, Gewebestücke von Nelkenstengeln, Gewebestücke von Kohlkeimblättern und Gewebestücke von Zwiebelschalen als Material in Beispiel 1 verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Zahl von durch Differenzierung erhaltenen hinzugekommenen Knospen wurde im Vergleich zu derjenigen von Vergleichsbeispielen 4 - 12 bei jeder behandelten Probe erhöht.

Vergeichsbeispiele 4 - 12

Das Verfahren der Gewebezüchtung wurde auf Gewebestücke von Tomatenblättern, Kalluszellen der Tomate, Gewebestücke von Blättern der Aubergine, Kalluszellen der Aubergine, Gewebestücke von Tabakblättern, Gewebestücke von Treniastengeln, Gewebestücke von Kohlkeimblättern und Gewebestücke von Zwiebelschalen angewendet, mit der Ausnahme, daß anstelle der in den Beispielen verwendeten, Calmodulin enthaltenden Lösung von Kalziumchlorid destilliertes Wasser verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Material Behandlung Zahl von gebildeten Knollen pro Gewebestück Beispiel Vergleichsbeispiel Gewebestücke aus Tomatenblättern Kalluszellen von Tomaten Gewebestücke aus Auberginenblättern Kalluszellen von auberginen Gewebestücke von Tabakblättern Gewebestücke von Treniastengeln Gewebestücke von Nelkenstengeln Gewebestücke von Kohlkeimblättern Gewebestücke von Zwiebelschalen Gewebestücke von Tomatenblättern Gewebestücke von Auberginenblättern behandelt durch Einbringen von Calmodulin und Kalzium behandelt mit destilliertem Wasser

Beispiele 15 - 20

Das Verfahren der Gewebezüchtung wurde bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 1 angewendet, mit der Ausnahme, daß Gewebestücke von Blättern von Basilikum, Gewebestücke von Kornblumenkeimblättern, Gewebestücke von Rudbeckiablättern, Gewebestücke von Tulpenschalen, Gewebestücke von Flachsstengeln und Gewebestücke von Spargelstengein in diesem Beispiel verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Vergleichsbeispiele 13 - 18

Die Züchtung von Gewebe wurde mit Gewebestücken von Blättern von Basilikum, Gewebestücke von Kornblumenkeimblättern, Gewebestücke von Rudbeckiablättern, Gewebestücke von Tulpenschalen, Gewebestücke von Flachsstengeln und Gewebestücke von Spargelstengeln durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle der in Beispielen 15 - 20 verwendeten, Calmodulin enthaltenden Lösung von Kalziumchlorid destilliertes Wasser verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Material Behandlung Zahl von gebildeten Knollen pro Gewebestück Beispiel Vergleichsbeispiel Gewebestücke aus Basilikumblättern Gewebestücke aus Kornblumenkeimblättern Gewebestücke aus Rudbeckia gewebestücke aus Tulpenschalen Gewebestücke aus Flachsstengeln Gewebestücke aus Spargelstengen behandelt durch Einbringen von Calmodulin und Kalzium behandelt mit destilliertem Wasser

Beispiele 21 - 28 und Vergleichsbeispiel 19

Nach dem Schuneiden der in Beispiel 1 verwendeten Schalen von keimfrei gemachten Zwiebeln der Trompetenlilie auf eine Breite von 2 mm wurden sie zwischen Elektroden gebracht, denen eine Lösung zugesetzt wurde, welche aus Zwiebeln der Trompetenlilie isoliertes und gereinigtes Calmodulin in einer in Tabelle 4 angegebenen Konzentration und Kalziumchlorid in einer ebenfalls in Tabelle 4 angegebenen Konzentration enthielt. Dann wurden die Gewebestücke von Schalen der Trompetenlilie nach Anwendung von elektrischen Stromstößen unter den gleichen Bedingungen die in Beispiel 1 bei gleicher Verfahrensweise wie in Beispiel 1 gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Die Konzentration des in Beispiel 27 durch die Einbringungsbehandlung in die Zellen eingebrachten Calmodulins betrug etwa 33 ug/ml und die Konzentration von Ca²&spplus; in den Zellen wurde von 10&supmin;&sup7; Mol auf 6 10&supmin;&sup5; Mol erhöht. Tabelle 4 Konzentration in der Lösung Calmodulin (ug/ml) Zahl von gebildeten Knollen pro Gewebestück Vergleichsbeispiel Beispiel

Beispiele 29 - 37

Das Verfahren der Gewebezüchtung wurde bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 1 auf die in Beispielen 10, 11 und 14 verwendeten Materiallen unter Verwendung von Lösungen angewendet, die Kalziumchlorid in den in Tabelle 5 angegebenen Konzentrationen enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Material Konzentration von Ca²&spplus; in der Lösung (mMol) Zahl von gebildeten hinzugekommenen Knospen/Gewebestück Beispiel Gewebestücke von Tabakblättern Gewebestücke von Treniastengeln Gewebestücke von Zwiebelstengeln Gewebestücke von Zwiebelstengel

Beispiele 38 - 40

Nach dem Züchten von Gewebestücken oder gezüchteten Zellen der in Beispielen 3, 11 und 14 verwendeten Materialien wahrend je 3 bis 7 Tagen in einem Medium, das 10&supmin;&sup6; Mol A23187 enthielt, wurden elektrische Stromstöße auf die verwendete 100 ug/ml Calmodulin enthaltende Lösung einwirken gelassen und die Gewebezüchtung wurde weiter durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.

Beispiele 41 - 43

Nach dem in gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 100 ug/ml Calmodulin durchgeführten Einbringen von Calmodulin in die Materialien von Beispielen 3, 11 und 14 wurde die Züchtung von Gewebe unter Verwendung eines 10&supmin;&sup6; Mol A23187 enthaltenden Kulturmediums durchgefilhrt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Material Behandlung Zahl von gebildeten Knollen/Gewebestück Zahl von gebildeten hinzugekommenen Knopsen/Gewebestück Beispiel Kalluszellen von Trompetenlilie Gewebestücke von Treniastengeln Gewebestücke von Zwiebelschalen behandelt durch Einbringen von Calmodulin

Beispiele 44 - 49

Das Verfahren der Gewebezuchtung wurde bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 1 angewendet, mit der Ausnahme, daß Gewebestücke von Karottenkeimblättern, Kalluszellen der Sojabohne, Kalluszellen der Gurke, Kalluszellen von Reis, Kalluszellen von Anapdragon und Kalluszellen von Spargel als Materialien in diesem Beispiel verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Die Zahl von durch Differenzierung erhaltenen hinzugekommenen Keimen wurde im Vergleich mit der in Vergleichsbeispielen 20 - 25 erhaltenen injeder der behandelten Proben erhöht.

Vergeichsbeispiele 20 - 25

Gewebestücke von Karottenkeimblättern, Kalluszellen der Sojabohne, Kalluszellen der Gurke, Kalluszellen von Reis, Kalluszellen von Anapdragon und Kalluszellen von Spargel wurden bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß anstelle der in Beispielen 44 - 49 verwendeten, Calmodulin enthaltenden Lösung von Kalziumchlorid destilliertes Wasser verwendet wurde. Tabelle 7 Material Behandlung Zahl von gebildeten hinzugekommen Keimen pro äußeres Gewebestück (0,1 g) Beispiel Vergleichbeispiel Gewebestücke von Mohrrübenkeimblatt Kalluszellen von Sojabohne Kalluszellen von Gurke Kalluszellen von Reis Kalluszellen von Anapdragon Kalluszellen von Spargel gewebestücke von Mohrrübenkeimblatt behandelt durch Einbringen von Calmodulin behandelt mit destilliertem Wasser

Beispiele 50 - 52

Mit Kallusgewebestücken von Spargelstengeln wurde eine Gewebetüchtung in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei für das Material von Beispiel 20 Lösungen verwendet wurden, die Calmodulin in den in Tabelle 8 angegebenen Konzentrationen und Kalziumchlorid in den ebenfalls in Beispiel 8 angegebenen Konzentrationen enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Die Zahl von durch Differenzierung erhaltenen hinzugekommenen Knospen wurde im Vergleich zu der in Vergleichsbeispiel 26 erhaltenen in jeder der behandelten Proben erhöht und der Durchmesser der Stengel wurde gegenüber den von Vergleichsbeispiel 26 ebenfalls vergrößert.

Vergleichsbeispiel 26

Gewebestücke von Spargelstengeln wurden in gleicher Weise wie in Beispielen 50 - 52 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß anstelle der in diesen Beispielen verwendeten, Calmodulin enthaltenden Lösung von Kalziumchlorid destilliertes Wasser verwendet wurde. Tabelle 8 Konzentration in der Lösung Ca²&spplus; (mMol) Calmodulin (ug/ml) Zahl von gebildeten hinzugekommenen Knopsen/Gewebestück Durchmesser der hinzugekommenen Knopsen (mm) Beispiel Vergleichsbeispiel

Beispiel 53

Das Verfahren der Gewebezuchtung wurde bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 1 angewendet, mit der Ausnahme, daß aus den Gewebestücken von Stengeln und Gewebestücken von Blättern der Miniaturrose (Sorte: Marie Antoinette) künstlich erzeugten Kalluszellen in diesem Beispiel verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Die Zahl der behandelten hinzugekommenen Knospen wurde im Vergleich mit der in Vergleichsbeispiel 27 erhaltenen erhöht.

Vergeichsbeispiel 27

Kalluszellen der Miniaturrose wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 53 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß anstelle der in Beispiel 53 verwendeten, Calmodulin enthaltenden Lösung von Kalziumchlorid destilliertes Wasser verwendet wurde. Tabelle 9 Material Behandlung Zahl von gebildeten hinzugekommenen Knopsen pro Kallusstück (0,1 g) Beispiel Vergleichsbeispiel Kalluszellen von Miniaturrose behandelt durch Einbringen von Calmodulin behandelt mit destilliertem Wasser

Claims

1. Verfahren zum Vermehren von Pflanzensetzlingen durch Züchten von Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß man das Züchten des Gewebes durchführt, nachdem man eine wässerige, Calmodulin und/oder Kalzium enthaltende Lösung direkt in die Zellen von Gewebestücken oder in die gezüchteten Zellen der Pflanzen eingebracht hat, wobei die erwähnte Lösung 3ug/ml bis 1 mg/ml Calmodulin und/oder 100 uMol bis 30 mMol Kalzium enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Calmodulin und/oder Kalzium durch Einspritzen der Lösung in die Zellen eingebracht wird, indem man elektrische Impulse auf sie anwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Calmodulin und/oder Kalzium durch Einspritzen unter Verwendung einer Mikropipette in die Zellen eingebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Calmodulin und/oder Kalzium dadurch in die Zellen einbringt, daß man eine Bestrahlung mit Laserstrahlen anwendet, um feine Poren in den Zellen zu erzeugen, und die Lösung durch die feinen Poren einbringt.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Calmodulin verwendet wird, das aus Knollen der Trompetenlilie, Rinderhirn oder Samenbläschen von Ratten durch Isolierung und Reinigung erhalten wurde.

6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Gewebezüchtung in einem Züchtungsmedium ausgeführt wird, das 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup4; Mol einer Kalziumionen enthaltenden Verbindung (Ca- Ionophor) enthält.

7. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Gewebezüchtung in einem Murashige- und Skoog-Medium durchgeführt wird.