CN1018048B - 增殖植物幼苗的方法 - Google Patents

Abstract

一种增殖物幼苗的方法，包括在向植物的组织片细胞或培养细胞内引进调钙蛋白和/或钙后进行组织培养。由于通过引进调钙蛋白和/或钙后植物的不定芽、不定胚和鳞茎的分化作用得到了显著的促进，所以能够以较高的效率大量地培养出高质量的植物体。

Description

本发明涉及一种用特定方法对植物进行组织培养以大量增殖幼苗的方法。

蔬菜类如甘蓝、蕃茄和黄瓜以及稻是用来作为食物的。另一方面，园艺植物如郁金香、矢车菊和金光菊可用以观赏。迄今为止这些植物是用幼苗、鳞茎或块茎的切块等来进行增殖的。然而，这样的增殖方法不仅需要大面积的土地和大量劳力，而且会出现由于近年病毒性疾病的蔓延而降低幼苗的生长率或降低花卉质量的问题。而采用无性繁殖对植物的生长及其品质的维持具有极佳的功效。以妥善解决这类问题与提高增殖率为目的而采用植物组织培养法的技术近年亦有报导（例：参见日本公开特许昭55-14734）。用组织培养技术的增殖是通过来自培养的组织片和细胞的不定芽、不定胚、鳞茎等分化作用实现的，而且据认为分化作用是由作为植物激素的细胞激动素与生长素之间的浓度比例控制[例，参见植物学年鉴（Annals    of    Botany）45卷，321-327，1980]，然而，仅仅在植物激素作用下，植物种群中有许多种类不产生分化作用，即使产生分化作用其分化作用的频率也极低，所以需要建立更为直接有效的方法来诱导分化作用。

基于对上述植物组织培养方法中所出现的诸问题的认视，本发明人已研究出一种比通常所用方法更为有效地增殖植物幼苗的方法。

本发明人从而发现了作用于植物细胞上能促进植物的不定芽、不定胚和鳞茎的分化作用的那些物质，并基于这些发现找到了一种有效地增殖植物幼苗的方法。即，本发明的方法提供了一种在将调钙蛋白和/或 钙引进植物的组织片或培养细胞之后通过组织培养以增殖植物幼苗的途径。

所以，本发明的目的是提供一种增殖植物幼苗的新方法，该方法是在组织培养之前引入调钙蛋白和/或钙，从而增加组织培养中植物的组织片或培养细胞的不定芽数或不定胚数。

本发明的组织培养方法对植物并无特别的限制，且该方法可以应用于所有植物。

可应用本发明的方法的那些植物包括（例如）：罂粟科、茄科、伞形科、蔷薇科、百合科、菊科、拢牛儿苗科、葫芦科和禾本科植物。上述植物具体例子还包括在由山岸（音译，yamagishi）编辑并由北隆馆（音译，Kokuryukan）于1974年出版的“植物系统分类的基础”一书的叙述之中。更为具体地说，这些植物是属于茄料的如茄子、蕃茄、马铃薯、甘薯和罗勒，属于罂粟科的如罂粟、油菜、甘蓝、萝卜、大白菜，属于伞形科的如胡萝卜、日本香芹菜（Japanese    parsley）和欧芹，属于蔷薇科的如蔷薇、草莓、大豆和樱桃，属于百合科的植物除百合外如洋葱和郁金香，属于菊科的如菊、矢车菊和向日葵，属于拢牛儿苗科的植物如天竺葵、拢牛儿苗和亚麻，属于葫芦科的如黄瓜和西葫芦，属于禾本科的如稻和玉米。在这些与本发明有关的植物之中，特别优选的植物是蕃茄、烟草、茄子，“特列尼亚”（trenia）;胡萝卜、甘蓝、洋葱、大豆、罗勒、矢车菊、金花菊、香石材、麝香百合、郁金香、石刁柏、亚麻、黄瓜和稻。

在本发明中，植物的组织培养可以用植物的组织片或培养的细胞来进行。组织培养片特别包括通过切割子叶、下胚轴、苗尖、茎、叶、鳞片、根或其它组织制备的组织片。这些组织片通常在用次氯酸钠或酒精灭菌之后使用。然而在采用无菌培养的植物的情况下，上述灭菌程序就不需要了。而且，在增殖不带有病害和病毒的植物幼苗的情况下，植物生长点附近的组织以及从生长点附近的组织处获得得植物组织片可用作培养材料。可用于本发明的植物组织培养的培养细胞是包括用已知的方法对组织片进行组织培养所获得的愈伤组织在内的未分化的无定形细胞。

在本发明中，采用下面具体讲述的方法来对用来形成幼苗的植物的组织片或培养细胞进行组织培养以获得植物的幼苗。

本发明所采用的组织培养的方法是：在向组织片的细胞或培养细胞中引进调钙蛋白和/或钙后进行组织培养。

本发明中所述的调钙蛋白是一种具有激活作用的蛋白质，诸如红血球膜中的与二价钙离子结合的腺苷三磷酸酶或脑中的磷酸二酯酶，该蛋白质在钙存在条件下进行电泳时迁移率下降。调钙蛋白可从（例如）麝香百合的鳞茎中，牛的大脑中、鼠的精囊中（等等）分离并提纯。

下面将对本发明在把调钙蛋白和/或钙引进细胞之后进行组织培养的方法将作更具体的说明。

（1）本发明的组织培养法，提供了一种在向植物的组织片细胞或培养细胞中引进一种称之为调钙蛋白的特殊蛋白质后进行组织培养的方法。

按本发明的引进调钙蛋白的方法可包括（例如）下列方法，其引进调钙蛋白的处理过程是这样实现的：把用于组织培养的植物组织培养片或培养细胞置于电极之间并在其中加入含调钙蛋白的溶液，在30伏/厘米至2.5千伏/厘米的电场强度下施加30微秒至1毫秒的电脉冲。此时，浓度在3微克/毫升至1毫克/毫升的调钙蛋白溶液是合乎需要的。除了上述的电注入过程外，还可以描述出多种方式，如在显微镜观察下用玻璃制微量移液管把含有调钙蛋白的溶液注入到细胞内的方法，一种用激光束脉冲照射放在含调钙蛋白溶液中的细胞以在其上穿出亚微米级直径的细小孔洞并通过小洞由日本专利文件昭62-7838提出的向活 细胞内部输送物质的方法，向细胞内部引进调钙蛋白的方法或者用近来报道的用钨把大分子子引植物细胞内部的方法，等等。通过本发明的上述方法引入细胞内部的调钙蛋白的量，能通过用荧光染料标记调钙蛋白并在引进细胞后测定荧光强度来确定，其数量通常在1微克/毫升至300微克/毫升的范围内，最好是在10微克/毫升至100微克/毫升范围内。

按照本发明的在引进调钙蛋白到植物的组织片细胞或培养细胞内部以后采用组织培养的方法，在引进调钙蛋白以后，尽管可以使用后文中所述的培养基进行组织培养，但一般使用钙离子含量大于1mM的培养基来进行组织培养则更佳，因其可以更进一步地促进植物的不定芽、不定胚及鳞茎的分化作用。此时，使用例如本发明人在日本专利文件昭61-308539中所建议的含钙离子载体的培养基A23187来进行组织培养是很合适的，其浓度范围通常在10^-8至10^-4M之间，如在10^-7至10^-5M之间则更佳，这时的分化作用很显著。进一步地说，在使用例如浓度范围为10^-8至10^-4M的含钙离子载体的培养基A23187后再引入调钙蛋白进行组织培养在本发明中是更佳的，因其可进一步促进分化作用。

（2）根据本发明的组织培养方法，提供了一种在将钙引进植物的组织片或培养细胞之后进行组织培养的方法。

本发明的引进钙的方法可以与引进调钙蛋白时的方法相同。如在进行电注入时，将培养细胞的组织片放在电极之间，加入含钙溶液后施加电脉冲把钙引入细胞内部。

此时，含钙溶液中钙的浓度通常在100μM至30mM的范围内。含钙溶液可以包括（特别是）含有钙化合物如氯化钙、硝酸钙和碳酸钙的水溶液。在本发明中按上述方法引进到细胞内部的钙的数量，如用与表示调钙蛋白数量同样的方式来表示时，其浓度通常在10^-8摩尔至10^-5摩尔的范围内，而在10^-6摩尔至10^-5摩尔的范围内更佳。

（3）本发明的组织培养方法，提供了一种在将调钙蛋白和钙引进植物的组织片细胞或培养细胞之后进行组织培养的方法。

在本发明中，上述方法特别适用，因其与方法（1）、（2）相比，对植物的定芽与不定胚的分化作用有显著促进。其中调钙蛋白和钙可用与上述（1）和（2）中所述相同的程序引进细胞内部，例如通过将植物的组织片或培养细胞置于电极之间，并在加入含有调钙蛋白的含钙溶液之后按前述同样方式在相同的电场强度下施加脉冲以实现引进。此时溶液中的调钙蛋白与钙离子的浓度范围亦与上述（1）与（2）中所述范围相同。进一步说，引进细胞内部的调钙蛋白与钙离子的数量也在上述（1）与（2）中所述的范围之内。

在本发明中将调钙蛋白和钙引进细胞内部的方法，通常以采用上述的含调钙蛋白的含钙溶液同时引进结合在一起的钙离子与调钙蛋白为宜，但是如果需要也用前述方法分别将钙与调钙蛋白引入细胞内部，等等。然后进行组织培养。

适用于在引入调钙蛋白和/或钙后进行组织培养的培养基可以包括（例如）下面具体描述的那些培养基。

在本发明中使用的培养基是一种含无机成分及碳源作为其基本成分的培养基，其中添加有植物激素和维生素并根据需要加入氨基酸。培养基的无机成分可以是含下列元素如氮、磷、钾、钠、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、钼、氯、碘和钴的无机盐，其中特别值得一提的有（例如）：硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、氯化钾、氯化钙、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、钼酸钠、三氧化钼、碘化钾、硫酸锌、硼酸和氯化钴。

培养基的碳源可包括（例如）：植物生长素如萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）、对氯苯氧基乙酸、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）、吲哚丁酸（IBA）及其衍生物、细胞激动素如苄（基）腺嘌呤（BA）、激动素、玉米 素等。

用于培养基的维生素可包括（例如）：生物素、硫胺素（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、吡哆醛、吡哆胺、泛酸钙、抗坏血酸（维生素C）、肌醇、烟酸、烟酰胺和核黄素（维生素B2）。

用于培养基的氨基酸可包括（例如）：甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。

本发明的培养基通常采用约0.1μM至100mM的无机成分、约1克/升至100克/升的碳源、约0.01毫克/升至约10毫克/升的植物激素，约0.1毫克/升至约150毫克/升的维生素和0至约1000毫克/升的氨基酸比较合适。

本发明的用于组织培养的培养基特别可以包括那些已知的用于组织培养的培养基，例如：Murashige和Skoog培养基（′62）、Linsmaier和Skoog培养基（RM-1965）、White培养基（′63）、Gamborg    B-5培养基、“三井”（Mitsui）M-9培养基、Nitch和Nitch培养基等等。它们亦可根据需要按前面所述加入碳源和植物激素，还可进一步地加入维生素与氨基酸。其中用NN、LS或MS培养基制备的培养基更佳。本发明中也可使用前面所述的日本专利文件昭61-308539所建议的加入钙离子载体、环腺苷酸和多胺而制得的培养基。上面提到的已知的培养基成分，在（例如）竹内（Takeuchi）、中岛（，akajima）、古谷（Furnya）所著并由朝仑书店（Asakura    Shoten）在1979年出版的“新植物组织培养法”（New    Plant    Tissue    Culture）一书的第386至391页中讲到过。

在本发明中适用的培养基是一种液体培养基或通常含有0.1%至2%的胶凝剂如琼脂或类凝胶的固体培养基。

在本发明中，可以用与本申请人在日本专利文件昭60-128348中所述相同的方式用充入含氧气体的液体培养基对上述的植物组织片或培养细胞进行组织培养。

按本发明的方法可高效率地由植物的组织片或培养细胞中获得大量的不定芽、不定胚、小鳞茎等等。更值得注意的是，按本发明的方法获得的不定芽能扎根于植物体内，然后将其切成组织片（小鳞茎也切片）并且进一步按上述本发明的培养方法进行组织培养即能大量地增殖植物幼苗。另外，按本发明所获得的植株通过常规栽培能长成完整的植物体。

使用本发明的方法，在将调钙蛋白和/或钙引入植物的组织片细胞或培养细胞内部后进行组织培养，由于显著地促进了植物的不定芽、不定胚和鳞茎的分化作用，因此，以这种方式可增殖出大量的幼苗。因此，按本发明的方法能比用传统的方法效率更高地从植物的组织片或培养细胞培养出大量高质量的植物体，故可以大量地增殖幼苗。另外，采用本发明的方法，分化出的不定芽的茎的直径可以增加，从而获得满意的幼苗。基于新颖的发现的本发明的方法是一种新颖的组织培养方法。

实施例：

本发明的内容及其积极效果将结合实施例来进行说明。

实例1：

将麝香百合的鳞茎鳞片用70%的酒精和次氯酸钠水溶液（有效氯含量1%）灭菌以后，将其切成约2毫米宽，放在电极之间，在其中加入含有100微克/毫升的从麝香百合的鳞茎中分离并提纯的调钙蛋白的3mM的氯化钙溶液，再施加电场强度为500伏/厘米的电脉冲，200微秒3次。然后制备出无菌的MS固体培养基（1962）（类凝胶浓度0.2%），其pH值为6.0，含有4%的蔗糖，0.01毫克/升的萘乙酸与0.02毫克/升的苄（基）腺嘌呤。将10片上述麝香百合鳞茎的鳞片置入培养基内，在温度25℃下置于光亮处培养3周，每片所产生的鳞茎片数见表1。与比较例1的情况相比，在所有处理过的样品中分化的鳞茎数量都增加了。

比较例1

除了用蒸馏水代替实例1中的含有调钙蛋白的氯化钙水溶液外，按例1的程序对麝香百合鳞片的切片进行培养。

实例2-3：

用与实例1相同的程序对麝香百合进行组织培养，但在实例1中被用作培养材料中的麝香百合叶子的切片被替换成麝香百合的愈伤组织细胞，得到如表1所示的结果。与在比较例2-3中的情况相比，在所有经处理的样品中分化的鳞茎的数目都增加了。

比较例2-3：

用与实例2-3相同的程序对麝香百合叶子的切片和愈伤组织细胞进行培养，但用蒸馏水代替例2-3中的含有调钙蛋白的氯化钙溶液，其结果如表1所示。

实例4-5

对麝香百合的愈伤组织细胞用与实例3相同的程序进行组织培养，但用从牛的大脑或鼠类的精囊中分离并提纯的调钙蛋白作为在本实例中的引进的调钙蛋白。其结果如表1所示。

实例6-14：

以与实例1相同的程序进行组织培养，但使用下述材料：蕃茄叶的切片、蕃茄的愈伤组织细胞、茄子叶的切片、茄子的愈伤组织细胞、烟草叶的切片、“特列尼亚”茎的切片、香石竹茎的切片、甘蓝下胚轴的切片和洋葱鳞片的切片。结果如表2所示。与其在比较例4-12中的情况相比，在所有处理过的样品中由分化产生的不定芽的数目都增加了。

比较例4-12：

对蕃茄叶的切片、蕃茄的愈伤组织细胞、茄子叶的切片、茄子的愈伤组织细胞、烟草叶的切片、“特列尼亚”茎的切片、香石竹茎的切片、甘蓝下胚轴的切片和洋葱鳞茎片的切片进行组织培养，但以蒸馏水代替各实例中的含调钙蛋白的氯化钙溶液。其结果如表2所示。

实例15-20

以与例1所述相同的程序进行组织培养，但材料分别替换成：罗勒叶的切片、矢车菊子叶的切片、金花菊叶子的切片、郁金香鳞片的切片、亚麻茎的切片与石刁柏茎的切片。结果如表3所示。

比较例13-18：

以蒸馏水取代矧15-20中的含调钙蛋白的氯化钙溶液对罗勒叶的切片、矢车菊子叶的切片、金花菊子叶的切片、郁金香鳞片的切片、亚麻茎的切片与石刁柏茎的切片进行组织培养，其结果如表3所示。

实例21-28及比较例19：

把在实例1中所用灭菌的麝香百合鳞茎的鳞片切成约2毫米宽后，将其置于电极之间，加入浓度如表4所示的从麝香百合鳞茎中分离并提纯的调钙蛋白溶液以及其浓度亦如表4所示的氯化钙溶液。然后，在与实例1相同的条件下施加电脉冲，再按与实例1相同的程序对麝香百合鳞片的切片进行培养，其结果如表4所示。

在实例27中通过引进处理引进细胞内部的调钙蛋白浓度约为33微克/毫升，而细胞内部的二价钙离子浓度从10^-7M增至6×10^-5M。

实例29-37：

在例10、11与14中，用浓度如表5所示的氯化钙溶液以实与例1相同的程序进行组织培养，结果如表5所示。

实例38-40：

在实例3、11和14中，在含有10^-6M的A23187培养基内培养组织片或培养细胞3-7天，然后对所用的100微克/毫升的调钙蛋白溶液施加电脉冲，再继续进行组织培养。结果如表6所示。

实例41-43：

在实例3、11和14中，按照与实例1相同的程序用100微克/毫升的调钙蛋白溶液进行调钙蛋白的引入后，使用含10^-6M的A23187培养基 进行组织培养。结果如表6所示。

例44-49：

除将材料替换成胡萝卜下胚轴切片、大豆的愈伤组织细胞、黄瓜的愈伤组织细胞、稻的愈伤组织细胞、金鱼草的愈伤组织细胞、石刁柏的愈伤组织细胞以外，采用与实例1相同的程序进行组织培养，其结果如表7所示。在与对比较20-25作比较时可以看出，所有经处理的样品中经分化作用而获得的不定胚的数量增加了。

比较例20-25：

除了以蒸馏水代替在实例44-49中所用的含调钙蛋白的氯化钙溶液外，按与实例1相同的程序对胡萝卜下胚轴切片、大豆愈伤组织细胞，黄瓜愈伤组织细胞、稻愈伤组织细胞、金鱼草愈伤组织细胞、石刁柏愈伤组织细胞进行培养。

实例50-52：

在实例20中采用浓度如表8所示的含调钙蛋白的溶液和浓度亦如表8所示的氯化钙溶液以与例1相同的程序对石刁柏的愈伤组织茎的切片进行组织培养，其结果如表8所示。与比较例26相比，所有经处理的样品由分化所产生的不定芽的数目都增加了，而且，茎的直径也都增加了。

比较例26

除了用蒸馏水代替含有调钙蛋白的氯化钙溶液外，以与实例50-52相同的程序培养石刁柏茎的切片。

实例53

除了采用由小型玫瑰（品种：Marie    Antoinette）茎的切片和叶的切片诱导产生的愈伤组织细胞作培养材料外，以与例1相同的程序进行组织培养。结果如表9所示。与比较例27相比，经过处理的不定芽的数量增加了。

比较例27

除了用蒸馏水代替实例53中含调钙蛋白的氯化钙溶液外，小型玫瑰的愈伤组织细胞以与实例53中所述相同的程序进行培养。

表1

培养材料    处理方式    每个切片所形

成的鳞茎数

实例1    麝香百合鳞的切片    引进调钙蛋白处理    4.7

比较例1    麝香百合鳞片的切片    用蒸馏水处理    2.1

实例2    麝香百合叶的切片    引进调钙蛋白处理    12.8

实例3    麝香百合的愈伤组织    引进调钙蛋白处理    21.5

细胞

比较例2    麝香百合叶的切片    用蒸馏水处理    1.4

比较例3    麝香百合的愈伤组织    用蒸馏水处理    2.3

细胞

实例4    麝香百合的愈伤组织    引进调钙蛋白处理    17.6

细胞

实例5    麝香百合的愈伤组织    引进调钙蛋白处理    18.5

细胞

表2

培养材料    处理方式    每个切片所形

成的不定芽数

实例6    蕃茄叶切片    引进调钙蛋白处理    4.2

实例7    蕃茄愈伤组织细胞    引进调钙蛋白处理    8.5

实例8    茄子叶切片    引进调钙蛋白处理    4.0

实例9    茄子愈伤组织细胞    引进调钙蛋白处理    6.4

实例10    烟草叶切片    引进调钙蛋白处理    7.0

实例11    “特列尼亚”茎切片    引进调钙蛋白处理    32.4

实例12    香石竹茎切片    引进调钙蛋白处理    0.7

实例13    甘蓝下胚轴切片    引进调钙蛋白处理    3.4

实例14    洋葱鳞片切片    引进调钙蛋白处理    9.8

比较例4    蕃茄叶切片    用蒸馏水处理    2.8

比较例5    蕃茄愈伤组织细胞    用蒸馏水处理    3.8

比较例6    茄子叶切片    用蒸馏水处理    2.4

比较例7    茄子愈伤组织细胞    用蒸馏水处理    3.2

比较例8    烟草叶切片    用蒸馏水处理    1.6

比较例9    “特列尼亚”茎切片    用蒸馏水处理    8.4

比较例10    香石竹茎切片    用蒸馏水处理    0

比较例11    甘蓝下胚轴切片    用蒸馏水处理    0.2

比较例12    洋葱鳞片切片    用蒸馏水处理    4.6

表3

培养材料    处理方式    每个切片所形

成的不定芽数

实例15    罗勒叶切片    引进调钙蛋白处理    8.4

实例16    矢车菊子叶切片    引进调钙蛋白处理    7.6

实例17    金花菊叶切片    引进调钙蛋白处理    5.0

实例18    郁金香鳞片切片    引进调钙蛋白处理    8.6

实例19    亚麻茎切片    引进调钙蛋白处理    13.8

实例20    石刁柏茎切片    引进调钙蛋白处理    3.8

比较例13    罗勒叶切片    用蒸馏水处理    3.2

比较例14    矢车菊子叶切片    用蒸馏水处理    2.2

比较例15    金花菊叶切片    用蒸馏水处理    2.0

比较例16    郁金香鳞片切片    用蒸馏水处理    3.8

比较例17    亚麻茎切片    用蒸馏水处理    6.0

比较例18    石刁柏茎切片    用蒸馏水处理    0.6

表4

溶液中Ca²⁺溶液中调钙蛋 每个切片所形

浓度（mM）    白浓度（微克/    形成的鳞茎数

毫升）

比较例19    0    0    2.8

实例21    0    100    3.5

实例22    0.1    100    7.5

实例23    0.3    100    13.0

实例24    1    100    14.0

实例25    3    0    9.5

实例26    3    10    10.5

实例27    3    100    21.5

实例28    10    100    11.5

表5

培养材料 溶液中Ca²⁺每个切片所形

的浓度（mM）    成的不定芽数

实例29    烟草叶切片    1    2.6

实例30    烟草叶切片    3    6.2

实例31    烟草叶切片    10    4.0

实例32    “特列尼亚”茎切片    1    10.2

实例33    “特列尼亚”茎切片    3    22.6

实例34    “特列尼亚”茎切片    10    14.2

实例35    洋葱鳞片切片    1    4.8

实例36    洋葱鳞片切片    3    8.0

实例37    洋葱鳞片切片    10    5.2

表6

培养材料    处理方式    每个切片所    每个切片

形成鳞茎数    所形成不

定芽数

实例38    麝香百合愈    引进调钙蛋白处理    18.6

伤组织细胞

实例39    “特列尼亚”    引进调钙蛋白处理    26.8

茎切片

实例40    洋葱鳞片切片    引进调钙蛋白处理    8.6

实例41    麝香百合愈    引进调钙蛋白处理    22.0

伤组织细胞

实例42    “特列尼亚”    引进调钙蛋白处理    30.6

茎切片

实例43    洋葱鳞片切片    引进调钙蛋白处理    10.2

表7

培养材料    处理方式    形成不定胚数

/表面切片

（0.1克）

实例44    胡萝卜下胚轴切片    引进调钙蛋白处理    0.4

实例45    大豆愈伤组织细胞    引进调钙蛋白处理    1.0

实例46    黄瓜愈伤组织细胞    引进调钙蛋白处理    2.4

实例47    稻愈合伤组织细胞    引进调钙蛋白处理    2.2

实例48    金鱼草愈伤组织细胞    引进调钙蛋白处理    3.6

实例49    石刁柏愈伤组织细胞    引进调钙蛋白处理    4.2

比较例20    胡萝卜下胚轴切片    用蒸馏水处理    0

比较例21    大豆愈伤组织细胞    用蒸馏水处理    0

比较例22    黄瓜愈伤组织细胞    用蒸馏水处理    0

比较例23    稻愈伤组织细胞    蒸馏水处理    0.8

比较例24    金鱼草愈伤组织细胞    用蒸馏水处理    0.6

比较例25    石刁柏愈伤组织细胞    用蒸馏水处理    2.4

表8

在溶液中的浓度    每个切片所

Ca（mM）    调钙蛋白    形成不定芽    不定芽直

微克/毫升）    数    径（毫米）

对照例26    0    0    0.5    1.1

实例50    0    100    2.4    2.3

实例51    1    100    3.2    2.6

实例52    3    100    4.4    4.2

表9

培养材料    处理方式    形成不定芽数/愈

伤组织片（0.1克）

实例53    小型玫瑰愈伤    引进调钙蛋白处理    5.2

组织细胞

比较例27    小型玫瑰愈伤    用蒸馏水处理    2.4

组织细胞

Claims (8)

1、一种增殖植物幼苗的方法，它包括向组织片细胞或培养细胞中人工引入调钙蛋白、钙或调钙蛋白和钙然后将所述组织片或培养细胞进行培养。

2、按权利要求1所限定的方法，其特征在于引进细胞内的调钙蛋白在溶液中的浓度为3微克/毫升至1毫克/毫升。

3、按权利要求1所限定的方法，其特征在于用向其施加电脉冲的方法将含有调钙蛋白的溶液引进细胞内。

4、按权利要求1所限定的方法，其特征在于用微量移液管注入的方法将含有调钙蛋白的溶液引进细胞内。

5、按权利要求1所限定的方法，其特征在于用激光束照射的方法将含有调钙蛋白的溶液引进细胞内。

6、按权利要求1所限定的方法，其特征在于所述培养基为一种含钙培养基，其含钙量为100μM至30mM。

7、按权利要求1所限定的方法，其特征在于所用的培养基中钙离子载体的含量在10^-8至10^-4M范围之内。

8、按权利要求1所限定的方法，其特征在于调钙蛋白是从麝香百合的鳞茎，牛的大脑和鼠类的精囊中分离并提纯而得的。