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Verfahren zur Herstellung der Alkaloide Raubasin und
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Serpentin durch in vitro-Züchtung von Zellen von Catharanthus Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Ilrdolalkaloide
Rauhasin (Ajmalicin) und Serpentin durch in vitro-Züchtung von Catharanthus-Zellsuspensionskulturen.
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Es wurden schon zahlreiche Versuche unternommen, mit Hilfe von pflanzlichen
Zellkulturen pharmazeutisch oder technisch wichtige Inhaltsstoffe zu produzieren.
In den meisten Fällen enthalten pflanzliche Zellkulturen die gewünschten Inhaltsstoffe
jedoch gar nicht oder nur in solch geringen Konzentrationen, daß sich eine technische
Ausbeute nicht lohnt (E. Teuscher,Pharmazie 28, 6, (1973); DOS 22 24 336).
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Catharanthus-Pflanzen enthalten eine Reihe von Alkaloiden, von denen
u. a. das Serpentin bzw. sein Hydrierunasprodukt, das Raubasin, Bedeutung für die
Therapie von Durchblutungsstörungen verlangt hat.
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Es ist bekannt, daß die Zellen der höheren Pflanzen in vitro in einer
entdifferenzierten Form undefinierter Gestalt leben und sich vermehren können. Diese
Zellen liefern bei der Teilung entweder isolierte Elemente oder kleine Zellhaufen
oder auch größere Formen, die als "Kallus" bezeichnet werden (vgl. R. J. Gautheret,
"La culture des tissus véqétaux", Masson, Paris (1959)).
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Es ist ferner bekannt, daß die in vitro gezüchteten Zellen von höheren
Pflanzen unter gewissen Bedingungen durch Biosynthese Sekundärverbindungen bilden
können, die analog zu jenen Verbindungen sind, die die normalwachsende Pflanze liefert.
Als solche Sekundärverbindungen wurden vornehmlich Alkaloide beschrieben. So wurde
u, a. festgestellt, daß Kulturen entdifferenzierter Zellen von Catharanthus roseus
zur Produktion von Indolalkaloiden befähigt sind. Jedoch wurden diese Alkaloide
bisher nur in Spuren und lediglich aufgrund chromatographischer Vergleiche in diesem
Gewebe nachgewiesen.
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Ganz allgemein behalten die in vitro gezüchteten Pflanzenzellen die
Gesamtheit der genetischen Information der Pflanzen bei, aus denen sie hervorgegangen
sind, was als Totipotenz der Pflanzenzellen bezeichnet wird. Diese Tatsache wird
dadurch bestätigt, daß Teile oder ganze Pflanzen aus entdifferenzierten Zellen rückgebildet
werden können.
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Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnis müßte es daher möglich sein,
die genetische Information zur Sekundärstoffbiosynthese in entdifferenziertem Gewebe
auszunutzen und durch geeignete Kulturbedingungen eine Akkumulation des gewUnschten
Sekundärstoffes zu erreichen. Dies sollte eventuell durch Hormone und Nährstoffkomponenten
bzw. durch biosynthetische Vorstufen der gewünschten Sekundärstoffe zu erreichen
sein.
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Die Aufgabe bestand nun darin, zunächst Zellkulturen von Catharanthus
bereitzustellen, die eine Alkaloidbiosynthese von Raubasin und Serpentin ermöglichen.
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Die Aufgabe bestand weiterhin darin, ein Verfahren zur Auswahl von
Catharanthus-Zellkulturen zu finden, durch das eine besonders hohe Ausbeute der
gewünschten Alkaloide Raubastn und/oder Serpentin erzielt wird.
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Ferner bestand die Aufgabe darin, Züchtungsbedingungen zu finden,
unter denen die Catharanthuszellen optimal vermehrt und zur optimalen Biosynthese
von Alkaloiden stimuliert werden.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Erzeugung
der Alkaloide Serpentin und Raubasin unter Verwendung von Suspensionskulturen von
Catharanthus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) Pflanzen oder Samen mit
erhöhtem Serpentin- und/oder Raubasin-Gehalt selektiert, b) hiervon über Kallusgewebe
Zellkulturen anlegt, c) Einzelzellen oder Aggregate dieser Zellkulturen in einem
Produktionsmedium auf Agar plattiert, d) Zellen der erhaltenen Kolonien, die den
höchsten Serpentin- und/oder Raubasingehalt aufweisen, in einem Wachstumsmedium
zur Vermehrung bringt, e) diese Zellkulturen anschließend in einem Produktionsmedium
zur Alkaloidproduktion stimuliert und f) daraufhin aus diesen Zellen in an sich
bekannter Weise die Alkaloide gewinnt.
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Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt zunächst
mit der Auswahl geeigneter Catharanthus-Pflanzen, Bestimmung ihres Älkaloid-Gehalts
und Anlegen eines Kallusgewebes. Hierzu wurde als Vertreter der Catharanthus-Pflanzen
Catharanthus roseus gewählt, jedoch können auch andere Catharanthusarten verwendet
werden, wie z. B. Catharanthus longifolius, Catharanthus pusillus, Catharanthus
ovalis, Catharanthus scitulus, Catharanthus lanceus, Catharanthus trichophyllus
oder Hybriden dieser Arten.
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Von einer Vielzahl von Catharanthus roseus Pflanzen wird der Alkaloid-Gehalt
bestimmt, was durch Dünnschicht- oder Gaschromatographie etc. erfolgen kann. Sehr
vorteilhaft lassen sich jedoch diese Alkaloidanalysen mit einem Radioimmunassay
(RIA) -Verfahren durchführen, wobei ohne weiteres über 200 Proben pro Tag analysiert
werden können.
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Eine Analyse von 184 Pflanzen, die aus verschiedenen geographischen
Regionen stammten und unter gleichen Bedingungen 45 Tage gezüchtet wurden, ergab
ein weites Spektrum an Gehalten von Raubasin und Serpentin, gemäß einer Gaußschen
Verteilung, d.h. nur wenige Pflanzen hatten einen hohen bzw.
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niederen Alkaloid-Gehalt. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden
nun die Pflanzen ausgesucht, die den höchsten gehalt an Raubasin und/oder Serpentin
aufweisen. Damit sich eine technische Ausbeutung lohnt, sollte der Alkalold-Gehalt
in der Wurzel größer als 0,7 % Sein.
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Von diesen so ausgewählten Pflanzen werden Gewebekulturen angelegt,
indem man Wurzel, Stengel, Blatt, Blütenteile oder auch Teile von aus Samen sterilgezogenen
Keimpflanzen keimfrei auf ein geeignetes Nährmedium, das mit Agar verfestigt ist,
aufbringt und im Licht verschiedener Intensität
oder im Dunkeln
zwischen 150 C und 400 C vorzugsweise bei 300 C inkubiert. Es hat sich als vorteilhaft
erwiesen, bei Catharanthus roseus als Ausgangsmaterialien für Kalli Keimpflanzen
des Samens zu verwenden, da sich diese schneller weiterentwickeln als Ralli von
Pflanzenteilen der ausgewachsenen Pflanze.
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Nach 1 - 6 Wochen bildet sich, insbesondere an den Wundflächen der
Pflanzenteile, Kallusgewebe in Form von entdifferenzierten Zellmassen, die unter
Beachtung steriler Arbeitsbedingungen vom ursprünglichen Pflanzenteil getrennt und
in frische Gefäße mit Ågarmedium eingebracht werden.
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Nach jeweils 2 - 6 Wochen werden die neu heranwachsenden Zellmassen
geteilt und abermals auf frisches Nährmedium übertragen. Die Kulturen können gewöhnlich
auf den in der Gewebekultur verwendeten Nährmedien gezogen werden, bevorzugt jedoch
auf den von Linsmaier und Skoog angegebenen (Physiologia Plantarum 18, 100 (1965)).
Dem Medium können dabei Wuchsstoffe wie Indol-3-Essigsäure (IAA), Benzyladenin etc.
zugegeben werden.
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Von dem auf diese Weise gewonnenen Kallusgewebe werden --Suspenskulturen
angelegt. Hierzu wird das Kallusgewebe in ein flüssiges Wachstumsmedium gebracht,
wobei wiederum das von Linsmaier und Skoog bevorzugt ist. In diesem Medium zerfallen
die Zellklumpen und ergeben eine homogene Zellmasse, die aus Einzelzellen und kleinen
Zellaggregaten besteht.. Diese Zellsuspensionen werden durch regelmäßiges Uberimpfen
in 10 Tagesabständen in einer ständigen Wachstumsphase gehalten.
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So erhaltene Einzelzellen bzw. kleinere Zellaggregate werden daraufhin
isoliert und in einem Alkaloid-Produktionsmedium unter Zusatz von 0,8 % Agar in
Petrischalen plattiert. Nach ca 3 3 - 6 Wochen sind kleine Kolonien herangewachsen,
die einzeln auf ihren Alkaloid-Gehalt untersucht werden. Eine Auswertung der erhaltenen
Analysenergebnisse von 160 verschiedenen Kolonien nach der RIA-Methode ergab ein
ähnlich g.estreutes Spektrum der Alkaloidwerte wie bei der ursprünglichen Pflanze,
wobei sich die Werte für Serpentin zwischen 0 und 1,4 t und für Raubasin zwischen
0 und 0,8 % bewegten. Damit ist der Beweis erbracht, daß die Einzelzellen von Catharanthus
roseus-Zellkulturen unterschiedlich sind, obwohl sie von genetisch einheitlichen
Pflanzenzellen abstammen.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.wer.den.nun die Kolonien, die
den höchsten Alkaloid-Gehalt aufweisen, von den Agar-Platten entfernt und in Petrischalen
überführt, die ein festes Wachstumsmedium enthalten. Auf diese Weise wird weiterer~Kallus
entwickelt, der dann wieder in ein flüssiges Wachstumsmedium überführt wird.
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Nach einer Wachstumsphase von etwa 2 - 4 Wochen wird, für den Fall,
daß bereits ein reiner Stamm eingesetzt wurde, dieser Stamm in einem Alkaloid-Produktionsmedium
zur Alkaloidproduktion gebracht. In der Regel werden aber die Ver--fahrensstufen
Plattieren, Züchtung von Kolonien, Bestimmung des Alkaloid-Gehaltes, Selektion der
besten Stämme etc. so oft wiederholt, bis ein erbbeständiger, reiner Stamm mit hohem
Alkaloid-Gehalt erhalten wird, der dann beliebig zur Alkaloid-Produktion eingesetzt
werden. kann.
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Aus dem Stand der Technik ist bereits bekannt, daß die Zusammensetzung
der Kulturmedien die Höhe der Akkumulation der Sekundärstoffe in den Zellstämmen
beeinflussen kann.
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So spielen z. B. Hormone, bestimmte Nährstoffkomporienten und biosynthetische
Vorstufen der Indolalkaloide in Kulturmedien eine wesentliche Rolle bei der Synthese
der gewünschten Alkaloide; desgleichen eine Kombination verschiedener Mineralsalze,
Vitamine und Kohlenstoffquellen.
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Als Wachstumsmedien werden Nährmedien verwendet, die als Komponenten
assimilierbare Quellen an Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Spurenelementen
enthalten.
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Dabei können als Quellen für Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Spurenelemente
Mineralsalze, wie z. B. Kaliumnitrat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Ammoniummolybdat
etc., Borsäure und Salze des Tetraäthylendiamintetraacetats eingesetzt werden, während
als Kohlenstoffquelle hauptsächlich Saccharose Verwendung findet. Ferner können
den Medien Vitamine wie z. B. Biotin, Thiamin, Inosit, Pyridoxin, Nicotinsäure,
Folsäure etc. und Auxin-aktive Verbindungen wie 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und
l-Naphthylessigsäure zugesetzt werden. Von den verschiedenen bekannten Medien wird
gemäß der Erfindung bevorzugt das Medium nach Linsmaier und Skoog verwendet.
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Als Basis für ein geeignetes Produktionsmedium wurde ein Medium gefunden,
das ebenfalls die assimilierbaren Quellen Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium
und Spurenelemente in Form von Mineralsalzen, Säuren, organischen Salzen und Saccharose
sowie Vitamine enthält.
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Als sehr vorteilhaft im Sinne des erfinderischen Verfahrens hat sich
nun gezeigt, daß ein Zusatz von bestimmten Hormonen die Alkaloidproduktion günstig
beeinflußt. Es wurde gefunden, daß ein Gemisch von 10 6 Mol/l Indolyl-3-essigsäure
(IAA) und 5 x 10 Mol/l N - Benzyladenin als Zusatz zum Basis-Medium optimale Ausbeuten
liefert, wobei große oder kleinere Zusätze um den Faktor 10 jedoch ebenfalls noch
erfindungsgemäß zu verwenden sind. Andere Hormone wie z. B. 2,4-Dichlorphenoxy-essigsäure
(2,4-D) und l-Naphthylessigsäure (NAA) sind nicht günstig. Sie senken die Alkaloidausbeute
und wirken wohl im Sinne von Inhibitoren.
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Weitere Zusätze, die die Alkaloidproduktion beeinflussen, sind die
biosynthetischen Vorstufen der Indolalkaloide, wobei u. a. Tryptophan, Tryptamin,
Anthranilsäure, Loganin, Loganinsäure, Secologanin, Secologaninsäure und das Reaktionsprodukt
aus Secologanin mit Tryptamin in Frage kommen.
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Dabei zeigte ein Zusatz von 10 3 - 5 bloc3 Mol/l, insbesondere von
2,5 x 10 3 Mol/l L-Tryptophan überraschend eine bemerkenswerte Steigerung der Alkaioidausbeuten,
da dieser Stoff in einer solch hohen Konzentration gewöhnlich als Inhibitor wirkt.
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Als- erfindungsgemäßes Alkaloidproduktionsmedium wird nun hunter Berücksichtigung
der oben aufgeführten Erkenntnisse ein Medium verwendet, das vorwiegend aus dem
Basismedium (Mineralsalzen, EDTA, Vitaminen und Saccharose) und den iusätzen an
Indolyl-3-essigsäure, N6-Benzyladenin und L-Tryptophan besteht, wobei es vorteilhaft
ist, den Saccharose-Gehalt, der in üblichen Medien ca. 5 % beträgt, auf 8 - 9 z
zu erhöhen. Die Zusaminensetzung der erfindungsgemäß verwendeten Medien ist in den
nachstehend aufgeführten Beispielen angegeben.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden zwei Hochleistungsstämme
isoliert, die im oben aufgezeigten Produktionsmedium optimale Ausbeuten an Alkaloiden
liefern und ihre Prpduktionseigenschaften über mehr als 2 Jahre beibehalten haben.
Der eine isolierte Stamm produziert vorwiegend Serpentin (Stamm S), während der
andere v.orwiegend Raubasin liefert (Stamm A>.
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Die erfindungsgemäß hergestellten Hochleistungsstämme Stamm S und
Stamm A sind unter dieser Bezeichnunq am Institut für Pflanzenphysiologie, Ruhr-Universität
Bochum, D-4630 Bochum, BRD, hinterlegt.
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Zusammenfassend werden die einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen
Verfahrens anhand des Ubersichtsschemas gemäß Abb. 1 erläutert: 1. Untersuchung
einer Vielzahl differenzierter Pflanzen auf ihren Alkaloidgehalt und Auswahl der
Pflanzen, die in ihren Wurzeln einen hohen Alkaloidgehalt, vorzugsweise von mehr
als 0,7 %,aufweisen 2. Anlegen von Kalluskulturen von diesen ausgewählten .. Pflanzen
(oder deren Samen) 3. Isolierung, Suspendierung und Vermehrung der Kalluskulturen
in einem flüssigen Wachstumsmedium 4. Plattierung von Einzelzellen oder Zellaggregaten
dieser Kulturen auf festem Agar in einem geeigneten Produktionsmedium
5.
Analysieren der entstehenden Kolonien auf ihren Alkaloid-Gehalt 6. Selektion von
Kolonien mit hohem Alkaloidgehalt und Vermehrung dieser Kolonien in einem flüssigen
Wachstumsmedium 7. Überführung der so erhaltenen Suspensionskulturen in ein flüssiges
Produktionsmedium, wenn sie die gewünschten Konzentrationen an Zellen aufweisen
8. Trennung von Gewebe und Nährmedium, Trocknung des Gewebes, Extraktion des Rückstandes
und Isolierung der Alkaloide nach bekannten Methoden Die Inkubation des selektierten
Stammes (Stufen 6 und 7 des Verfahrens) wird vorzugsweise bei 300 C in einem Fermenter
durchgeführt, wobei das Produktionsmedium gemäß Verfahrensschritt 7 mit 0,1 - 0,5
Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute.begast wird.
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Zur Aufarbeitung wird nach ca. 20 - 30 Tagen der Inhalt des Fermenters
in Gewebe und Nährlösung getrennt. Das Gewebe wird daraufhin getrocknet und in der
für die Catharanthuswurzeln bekannten Weise mit organischen Lbsüngsmitteln extrahiert,
die in den Extrakten vorhandenen Alkaloide durch multiplikative Verteilung oder
Adsorptionschromatographie aufgetrennt und die gesuchten Alkaloide kristallisiert.
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Der Reaktionsverlauf und der Zeitpunkt optimaler Ausbeute an Alkaloiden
kann - wie bereits aufgeführt - durch den Radioimmunoassay auf Serpentin bzw. Raubasin
bzw. durch qualitative und quantitative Dünnschichtchromatographie von Probeextrakten
der Gewebe und Nährmedien aus den Versuchsansätzen verfolgt werden. Für die Dünnschichtchromatographie
verwendet man am besten: DC - Fertigplatten Kieselgel G, Fließmittel I = Benzol:
Aceton: Diäthylamin = 70:20:in Fließmittel II = Xylol: Methyläthylketon: Diäthylamin
= 60:30:1,8.
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Die quantitative Alkaloidmessung erfolgt dünnschichtchromatographisch
direktfluorimetrisch.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den nachfolgenden Beispielen
näher erläutert:
Beispiel 1 Erzeugung von Serpentin Als Wachstumsmedium
wird eine Lösung. folgender Zusammensetzung (pro Liter Lösung) verwendet (nach Linsmaier
und Skoog): Komponente Konzentration mq/l Kaliumnitrat 1900 Ammoniumnitrat 1650
Magnesiumsulfatheptahydrat 370 Calciumchloriddihydrat 440 Kaliumdihydrogenphosphat
170 Mangansulfatmonohydrat 22,3 Borsäure 6,2 Zinksulfatheptahydrat 8,6 Kaliumjodid
0,83 Kupfersulfatpentahydrat 0,025 Natriummolybdatdihydrat 0,25 Kobaltchloridhexahydrat
0,025 Äthylendiamintetraessigsäure 37,3 Dinatriumsalz Eisensulfatheptahydrat 27,8
meso-Inosit * 100 Thiaminiumdichlorid 0,4 l-Naphthylessigsäure 0,186 2, 4-Dichlorphenoxy-essigsäure
0,22 Saccharose 30 pH-Wert 6,0
In zwei Erlenmeyerkolben (1 Liter)
werden Suspensionskulturen aus vorkultivierten Kulturen von Catharanthus roseus
Kallusgewebe (ein aus tausenden Einzelkalli selektierter hauptsächlich Serpentin
liefernder Stamm) in je 250 ml Nährmedium herangezogen. Die Anzucht erfolgt bei
230 C auf einer Rundschüttelmaschine mit 100 Umdrehungen /Min. unter Belichtung.
Die Inkubationsdauer beträgt 14 Tage. Danach wird der Inhalt der Kolben in einen
Erlenmeyerkolben (5 Liter) mit 3,5 Liter Wachstumsmedium steril überführt.
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Nach 10 Tagen Inkubation unter obigen Bedingungen aber bei 300C wird
mit dieser Suspensionskultur ein 30 Liter Schlaufenreaktor mit 20 Liter Produktionsmedium
steril angeimpft.
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Als Produktionsmedium wird eine Lösung folgender Zusammensetzung
(pro Litermedium) verwendet: Komponente . . Konzentration mg/l Kaliumnitrat 900
Ammoniumnitrat 700 Magnesiumsulfatheptahydrat 150 Calciumchloriddihydrat 160 --~
Kaliumdihydrogenphosphat 60 Mangansulfatmonohydrat 7 Borsäure 2,5 Zinksulfatheptahydrat
4,0 Ammoniummolybdattetrahydrat 0,01 Kupfersulfatpentahydrat 0,01 thylendiamintetraessigsäure
37,3 Eisensulfatheptahydrat 27,8
Glycin 2,0 meso-Inosit 100 Nicotinsäure
5,0 Pyridoxolhydrochlorid 0,5 Thiaminiumdichlorid 0,5 Biotin 0,05 Folsäure 015 je
N -Benzyladenin 1,13 Indol-3-essigsäure 0,18 Saccharose 50 L-Tryptophan 500 pH-Wert
5,0 ° Der Fermenter wird bei 30 C mit 0,1 - 0,5 Volumen Luft pro Volumen Medium
pro Minute begast. Nach Erreichen der maximalen Alkaloidausbeute (nach etwa 20 -
30 Tagen) wird der Inhalt des Fermenters in Gewebe und Nährlösung getrennt.
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Ein Aliquot des Gewebes wird für die Trockengewichtsbestimmung getrocknet,
das Restsewebe mit 80 % wässrigem Äthanol am Rückfluß extrahiert. An.einem Aliquot
des äthanolischen Extraktes wird der Serpentin- und Raubasingehalt dc chromatographisch
bestimmt.
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Die Analysen ergeben: pro Liter Medium Trockenrückstand des Gewebes:
20 g pro Liter Medium Serpentin:162 mg pro Liter Medium Raubasin: 15 mg pro Liter
Medium
Beispiel 2 Erzeugung von Raubasin Die Versuchsanordnung
und Kulturbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur
wird ein vornehmlich Raubasin liefernder Stamm verwendet, der aus tausend von Einzelkalli
mit Hilfe des Radioimmunoassay selektiert wurde.
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Die Analysen ergeben: Trockentückstand des Gewebes: 26 g pro Liter
Medium Raubasin: 264 mg pro Liter Medium Serpentin: 77 mg pro Liter Medium B e i
s p i e 1 3 Die Versuchs-Anordnungen und Kultur-Bedingungen sind die gleichen,wie
in Beispiel- 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird der gleiche vorselektierte,
Serpentin liefernde Hochleistungsstamm verwendet. Die Ansätze wurden in 1 Liter
Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 250 ml Medium durchgeführt.
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Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Wachstuinsmedium (nach Linsmaier
und Skoog), l.c.) Trockenrückstand des Gewebes: 23 g pro Liter Medium Serpentin:
8 mg pro Liter Medium b) Inkubation im Produktions-Medium, aber ohne Zusatz von
L-Tryptophan Trockenrückstand des Gewebes: 21 g pro Liter Medium Serpentin: 62 mg
pro Liter Medium
Beispiel 4 Die Versuchsanordnung und Kulturbedingungen
sind die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird ein
normaler, nicht selektierter Stamm verwendet, der von einer differenzierten Pflanze
stammte, die 0,3 % Serpentin und nur Spuren Raubasin in der Droge aufwies. Die Ansätze
wurden in 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml Medium durchgeführt.
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Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Wachstums-Medium (nach Linsmaier
und Skoog, l.c.) Trockenrückstand des Gewebes: 13 g pro Liter Medium Serpentin:
1,9 mg pro Liter Medium b) Inkubation im Produktions-Medium (siehe Beispiel 1),
aber ohne L-Tryptophan-Zusatz Trockenrückstand des Gewebes: 15 g pro Liter Medium
Serpentin: 6,4 mg pro Liter Medium c) Inkubation im Produktions-Medium (siehe Beispiel
1), aber mit L-Tryptophan (500 mg/l) Trockenrückstand des Gewebes: 16 g pro Liter
Medium Serpentin: 12 mg pro Liter Medium B e i s p i e 1 ~ 5 Die Versuchs-Anordnung
und Kulturbedingungen sind die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur
wird der gleiche vorselektierte, Serpentin liefernde Hochleistungsstamm verwendet.
Die Ansätze wurden in 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml Medium durchgeführt.
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Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Produktions-Medium (nach Beispiel
1), aber ohne Zusatz von L-Tryptophan Trockenrückstand des Gewebes: 20 g pro Liter
Medium Serpentin: 60 mg pro Liter Medium b) Inkubation im Produktionsmedium (nach
Beispiel 1) ohne Zusatz von L-Tryptophan, äber mit Zusatz vorn Loganin (250 mg pro
Liter)-Trockenrückstand des Gewebes: 22 g pro Liter Medium Serpentin: 114 mg pro
Liter Medium B e i s p i e 1 6 Die Versuchs-Anordnungen und Kultur-Bedingungen sind
die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird der gleiche
vorselektierte Serpentin liefernde Hochleistungsstamm verwendet. Die Ansätze wurden
in 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml Medium durchgeführt.
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Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Produktions-Medium (nach Beispiel
1), aber mit 8 % Saccharose Trockenrückstadd des Gewebes: 22 g pro Liter Medium
Serpentin: 193 mg pro Liter Medium
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