DE3228062A1

DE3228062A1 - Produktionsstamm von claviceps purpurea

Info

Publication number: DE3228062A1
Application number: DE19823228062
Authority: DE
Inventors: Jan RNDr Kybal; Ji&rcaron;í PhMr Opava Spá&ccaron;il; Karin Strnadová; Eduard Dipl.-Ing. Praha Svoboda
Original assignee: Spofa Spojene Podniky Pro Zdravotnickou Vyrobu; Spofa Vereinigte Pharma Werke
Current assignee: Spofa Spojene Podniky Pro Zdravotnickou Vyrobu; Spofa Vereinigte Pharma Werke
Priority date: 1981-07-28
Filing date: 1982-07-27
Publication date: 1983-02-17
Also published as: FR2510603A1; CS222391B1; FR2510603B1; US4447540A

Description

SPOFA, spojene podniky pro zdravotnickou vyrobu Prag, CSSR

Produktionsstamm von Claviceps purpurea

Die Erfindung betrifft einen Produktionsstamm des Mikroorganismus der.Gattung Claviceps purpurea (Fr.) TuI. CCM F-725, der neu ist. Der Stamm wurde durch Langzeitzüchtung eines Produktionsstamms entwickelt, der zur Feldproduktion von ergocornin- und ergokryptinhaltigem Mutterkorn bis 1974 verwendet wurde (K. Strnadova und J. Kybal, Folia Microbiol. 19 (1974) 272). Im Verlauf dieser Züchtung wurde der Stamm CCM F-508 (CS-Urheberschein 176 803) gewonnen, der ebenfalls zur Feldproduktion benutzt wurde. Auch dieser Stamm gehört zu den Ergocornin- und Ergokryptinproduzenten und produziert in der Feldkultur Sklerotien, die durchschnittlich 0,5 Gew.-SK Alkaloide, bezogen auf die Trockensubstanz, enthalten, wobei das Gewichtsverhältnis der genannten Alkaloide 6:4 bis 4:6 beträgt.

Nachteile des bisher benutzten Stamms CCM F-508 sind der verhältnismäßig niedrige Gehalt an Alkaloiden und vor allem auch das ungünstige Verhältnis der beiden Komponenten des Ergokryptins, dh von ot-Ergokryptin und ß-Ergokryptin, das stark zugunsten des oc-Ergokryptins verschoben ist.

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Ergokryptin selbst hat große Bedeutung als pharmazeutischer Wirkstoff und als Ausgangsstoff zur Herstellung von Derivaten, die zu Arzneimitteln weiterverarbeitet werden. Neuerdings haben sich in der Therapie Arzneimittelformen mit einem genau definierten Gewichtsverhältnis von α- und ß-Ergokryptin, und zwar von 1,5:1 bis 2,5:1, durchgesetzt, wodurch eine Standardisierung der therapeutischen Wirkung gewährleistet wird. Im Hinblick auf das ungünstige Gewichtsverhältnis dieser beiden Komponenten in den Mutterkornsklerotien des Produktionsstamms CCM F-508 (9:1) ist das Mutterkorn dieses Typs ein ungünstiger Rohstoff zur Gewinnung der gewünschten Präparate.

Bei der Züchtung des ursprünglichen Stamms wurde neben dem Stamm CCM F-508 nach dem Mutationseingriff mit salpetriger Säure durch Selektion eine auxotrophe asporogene Mutante erhalten, die befähigt war, Alkaloide nicht nur in der parasitären, sondern auch in der sapropbytischen Kultur zu synthetisieren. Im weiteren Verlauf der Züchtung dieser Mutante gelang es, eine spontan entstandene Supressormutante zu isolieren, bei der die genannten Produktionsmerkmale erhalten geblieben waren und bei der zugleich mit der Rückkehr zur Prototrophie auch die Fähigkeit zur Konidienbildung wiederhergestellt war.

Der erfindungsgemäße neue Produktionsstamm wurde durch weitere Züchtung der oben erwähnten Mutante durch übliche Mutationseingriffe gewonnen: Die Konidien wurden mit salpetriger Säure einer Konzentration von 0,0030 bis 0,0045 M je nach Empfindlichkeit der Konidien 5 min lang unter Rühren behandelt. Dann wurden die Konidien abgeschleudert, mit Wasser gewaschen, auf den üblichen Nährboden ausgeimpft und dann auf ihre Alkaloidproduktion untersucht. Die Behandlung mit der salpetrigen Säure wurde sechsmal wiederholt. Ferner wurde eine Konidiensuspension 5 h unter Rühren mit Ethylmethansulfonat

einer Konzentration von 0,01 M behandelt. Danach wurden die Konidien ebenfalls gewaschen, auf den üblichen Nährboden ausgeimpft und auf ihre Alkaloidproduktion untersucht. Diese Behandlung wurde dreimal wiederholt. Ferner wurde der Einfluß von 5-Bromuracil geprüft, das in einer Konzentration von 0,4 Gew.-% zusammen mit 0,1 Gew.-Si Sulfathiazol in den kompletten Nährboden auf die ausgeimpften Konidien gegeben wurde. Die Kultivierung wurde 14 Tage lang bei einer Temperatur von 24 ⁰C durchgeführt. Aus den aufgewachsenen Kulturen wurden Einzelkonidienkulturen isoliert und im weiteren auf ihre Alkaloidproduktion untersucht. Einzelne Mutationseingriffe wurden mit Selektionen der Monokonidienkulturen ohne Mutationseingriff kombiniert.

Der neue Produktionsstamm ist in. der Tschechoslovakischen Mikroorganismensammlung der J. E. Purkyne-Universität (Czechoslovak Collection of Microorganisms, CCM), Brno, Obrancu miru 10, unter der Nummer CCM F-725 hinterlegt.

Der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. CCM F-725 ist ein prototropher Stamm. Er ist befähigt, wie unter parasitären Bedingungen auf Kornähren sowie auch unter saprophytischen Be-V₁₁... dingungen in einer stationären Kultur auf einem flüssigen ,Nährmedium zu wachsen. In beiden Fällen produziert er Alkaloide.

Auf festem kompletten Nährboden (Bierwürze.5 ° Be, saures Caseinhydrolysat.1,0 Gew.-%, krist. Magnesiumsulfat 0,1, Gew.-%, Agar 3 Gew.-%, pH 6,3), der mit einer Konidiensuspension bßimpft wurde, bewächst er'die Oberfläche bei einer Temperatur von 25 ⁰C innerhalb von, .4 bis 5 Tagen und bildet danach ,eifv₍. ι Luftmycel, das zahlreiche Konidien abschnürt. Die Hyphen s^nd typisch qphazeliumartig, lang, wenig verzweigt und mit wenig

Querwänden. Die Zellen sind dünnwandig; ihr Gehalf an Fettinklusionen 1st gering. Das Mycel ist in den späteren Phasen der Entwicklung an der Unterseite violett pigmentiert, das Luftmycel ist farblos. Die Konidienbildung endet nach 21 Tagen Inkubation. Die Konidien sind oval, in der Regel 4 bis 7 pm lang und 3 bis 5 um breit, dünnwandig und einkernig. Nach dem Ausimpfen auf einen frischen Nährboden der gleichen Zusammensetzung keimen sie während 24 bis 48 h, zumeist an einem, selten an beiden Polen. Eine Kultur in einem Reagensglas von 20 χ 200 mm enthält etwa 3,0 · 10⁹ Konidien.

An der Oberfläche eines flüssigen Produktionsbodens (Saccharose 25 Gew.-%, Maisextrakt 0,44 Gew.-%, Kaliumdihydrogenphosphat 0,06 Gew.-&, Citronensäure 0,946 Gew.-SK, krist. Calciumnitrat 0,16 Gew.-5S, krist. Magnesiumsulfat 0,11 Gew.-%, pH 6,8, eingestellt mit Ammoniak) wächst der Stamm während der 21 Tage dauernden Inkubation bei einer Temperatur von 24 ⁰C in Form eines kompakten, verkrümmten sklerotialen Mycels mit gelbbrauner bis braunvioletter Pigmentierung, das an der Unterseite zuwächst und an der Oberseite Konidien abschnürt. Die Hyphen sind kurz und breit; die Zellen besitzen nahezu gleichen Durchmesser, sind dickwandig und weisen einen hohen Fettgehalt auf. Die Konidien haben ähnliche Eigenschaften wie am festen kompletten Nährboden, jedoch weisen ihre Abmessungen in der Regel geringere Schwankungen auf.

In der parasitären Kultur auf Kornähren bilden sich längliche Sklerotien, gewöhnlich 2 bis 6 mm dick und 10 bis 30 mm lang, die gerade oder sichelförmig gekrümmt sind und in Richtung zum apikalen Ende enger werden. Die reifen Sklerotien sind an der Oberfläche braunrot und an der Bruchfläche gelblich weiß gefärbt·

Aufgrund des Spektrums äet produzierten Alkaloide gehört

der neue Stamm zur Rasse der Ergocornin-Ergokryptin-Produzenten. Die sowohl in den parasitären Mutterkornsklerotien als auch im Mycel aus der saprophytischen Kultur enthaltenen Hauptalkaloide sind Ergocornin und Ergokryptin, die in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:1 vorliegen. Die Ergokryptinkomponente liegt in Form von i£-Ergokryptin sowie ß-Ergokryptin in den parasitären Sklerotien in einem Gewichtsverhältnis von etwa 2:1 bis 1:1 und im saprophytischen Mycel ohne Präkursoren in einem Gewichtsverhältnis von etwa 5:1 vor. Neben diesen Hauptalkaloiden ist das obligate Ergometrin eine der Komponenten des Alkaloidspektrums; ferner liegen kleine Mengen Ergosin und Spuren von Ergokristin, Ergotamin, Lysergsäurevalinamid, Ergoxin/Ergosin, Ergonin und Ergoptin sowie von drei weiteren nichtidentifizierten Alkaloiden vor.

Ein bedeutendes Merkmal des neuen Stamms gemäß der Erfindung ist die hohe Alkaloidproduktion, und zwar sowohl bei der parasitären als auch bei der saprophytischen Kultivierung. Die Sklerotien aus der parasitären Kultur enthalten ebenso wie das saprophytisch aufgewachsene Mycel bis zu 1,5 Gew.-% der Alkaloidsumme. Während der saprophytischen Oberflächenkultivierung wird darüber hinaus ein weiterer Anteil der Alkaloide in den Produktionsboden hinein freigesetzt, der nach Beendigung der Fermentation bis zu 250 pg/ml Alkaloide, berechnet als Ergometrin, enthält.

Claims

BEETZ & PARTNER. : Steinsdorfstr. 10 · D-8000 München 22 Telefon (0 89) 2272 01 - 22 72 44 - 29 5910 Telex 5 22 048 - Telegramm Atlpat München

233-33.992P

•Patentanwälte European Patent Attorneys

Dipl.-Ing. R. BEETZ sen.

Dr.-Ing. R. BEETZ jun.

Dr.-Ing. W. TIMPE Dipl.-Ing. J. SIEGFRIED

Prlv.-Doz. Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. W. SCHMITT-FUMIAN

Dipl.-Ing. K. LAMPRECHT 11981

27. Juli 1982

Anspruch

Produktionsstamm des Mikroorganismus der Gattung Claviceps purpurea (Fr.) TuI. CCM F-725, der Ergocornin und Ergokryptin produziert.

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