JPH0622779A - アメリカヤマゴボウ培養細胞を用いたベタシアニンの製造法 - Google Patents
アメリカヤマゴボウ培養細胞を用いたベタシアニンの製造法Info
- Publication number
- JPH0622779A JPH0622779A JP8078592A JP8078592A JPH0622779A JP H0622779 A JPH0622779 A JP H0622779A JP 8078592 A JP8078592 A JP 8078592A JP 8078592 A JP8078592 A JP 8078592A JP H0622779 A JPH0622779 A JP H0622779A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- betacyanin
- medium
- pokeweed
- concentration
- sucrose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 アメリカヤマゴボウから誘導された培養細胞
を用いたベタシアニンの製造法及びそれに用いる液体培
地が提供される。 【構成】 アメリカヤマゴボウから誘導したベタシアニ
ン生産能を有する培養細胞塊を、カリウムイオン濃度が
６０ｍＭ−１５０ｍＭである液体培地中で培養し、更に
はショ糖及び／又はリン酸イオンを液体培地中に分割供
給することにより、培養細胞塊のベタシアニンの生産性
が著しく向上し、ベタシアニンを工業的に効率良く大量
に製造することが可能となる。
を用いたベタシアニンの製造法及びそれに用いる液体培
地が提供される。 【構成】 アメリカヤマゴボウから誘導したベタシアニ
ン生産能を有する培養細胞塊を、カリウムイオン濃度が
６０ｍＭ−１５０ｍＭである液体培地中で培養し、更に
はショ糖及び／又はリン酸イオンを液体培地中に分割供
給することにより、培養細胞塊のベタシアニンの生産性
が著しく向上し、ベタシアニンを工業的に効率良く大量
に製造することが可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アメリカヤマゴボウ培
養細胞を用いたベタシアニンの製造法に関する。更に詳
細には、アメリカヤマゴボウから誘導したベタシアニン
生産能を有する培養細胞塊を、特定量のカリウムイオン
を含有する液体培地中で増殖させて、得られる培養物か
らベタシアニンを採取するベタシアニンの製造法、並び
にアメリカヤマゴボウから誘導したベタシアニン生産能
を有する培養細胞塊を培養するための液体培地に関す
る。
養細胞を用いたベタシアニンの製造法に関する。更に詳
細には、アメリカヤマゴボウから誘導したベタシアニン
生産能を有する培養細胞塊を、特定量のカリウムイオン
を含有する液体培地中で増殖させて、得られる培養物か
らベタシアニンを採取するベタシアニンの製造法、並び
にアメリカヤマゴボウから誘導したベタシアニン生産能
を有する培養細胞塊を培養するための液体培地に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来、食品着色剤としては合成着色剤が
多く使用されていたが、最近では食品添加物の安全性が
重要視され合成着色剤の使用が禁止される傾向にあり、
従って植物性色素の需要が増大している。植物性色素の
１つとして赤色色素ベタシアニンが知られており、現在
ではビートレッド（砂糖大根）から得られるベタシアニ
ンが食品着色剤として市販されている。他方、アメリカ
ヤマゴボウから得られる赤色色素ベタシアニンも知られ
ており、アメリカヤマゴボウ由来のベタシアニンはビー
トレッド由来のベタシアニンに比べて耐熱性、耐光性な
どにおいて優れており、また色調の点においても赤キャ
ベツ由来の高価なアントシアニン系赤色色素に似てお
り、更には広いｐＨ範囲で使用可能であり、多くの利点
を有している。従って、アメリカヤマゴボウ由来のベタ
シアニンの用途拡大に併って、アメリカヤマゴボウ由来
のベタシアニンを大量に製造し得る工業的に有利な製造
法の開発が望まれている。
多く使用されていたが、最近では食品添加物の安全性が
重要視され合成着色剤の使用が禁止される傾向にあり、
従って植物性色素の需要が増大している。植物性色素の
１つとして赤色色素ベタシアニンが知られており、現在
ではビートレッド（砂糖大根）から得られるベタシアニ
ンが食品着色剤として市販されている。他方、アメリカ
ヤマゴボウから得られる赤色色素ベタシアニンも知られ
ており、アメリカヤマゴボウ由来のベタシアニンはビー
トレッド由来のベタシアニンに比べて耐熱性、耐光性な
どにおいて優れており、また色調の点においても赤キャ
ベツ由来の高価なアントシアニン系赤色色素に似てお
り、更には広いｐＨ範囲で使用可能であり、多くの利点
を有している。従って、アメリカヤマゴボウ由来のベタ
シアニンの用途拡大に併って、アメリカヤマゴボウ由来
のベタシアニンを大量に製造し得る工業的に有利な製造
法の開発が望まれている。
【０００３】アメリカヤマゴボウ由来のベタシアニンの
製造法としては、アメリカヤマゴボウから誘導された培
養細胞塊を培養してベタシアニンの一種であるベタニン
を製造する方法が報告されている（特公昭５５−３３７
８号公報）。この方法では培養培地として２，４−ジク
ロロフェノキシ酢酸等を添加したＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆
Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）〔Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌ
ａｎｔ，１５，４７３−４９７（１９６２）〕が用いら
れている。また、ベタシアニン生産能を有する培養細胞
塊を培養する際のリン酸イオン濃度とベタシアニン生産
との関係についての検討も行われている〔Ｊ．Ｐｌａｎ
ｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１２５，３３７−３４３（１９８
６）〕。そして、培地中にリン酸イオンが在存しないと
ベタシアニンが蓄積されず、またリン酸イオン濃度が１
ｍＭまではベタシアニン蓄積量に比例することも報告さ
れている。
製造法としては、アメリカヤマゴボウから誘導された培
養細胞塊を培養してベタシアニンの一種であるベタニン
を製造する方法が報告されている（特公昭５５−３３７
８号公報）。この方法では培養培地として２，４−ジク
ロロフェノキシ酢酸等を添加したＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆
Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）〔Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌ
ａｎｔ，１５，４７３−４９７（１９６２）〕が用いら
れている。また、ベタシアニン生産能を有する培養細胞
塊を培養する際のリン酸イオン濃度とベタシアニン生産
との関係についての検討も行われている〔Ｊ．Ｐｌａｎ
ｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１２５，３３７−３４３（１９８
６）〕。そして、培地中にリン酸イオンが在存しないと
ベタシアニンが蓄積されず、またリン酸イオン濃度が１
ｍＭまではベタシアニン蓄積量に比例することも報告さ
れている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来報
告されている培養細胞塊を利用したベタシアニンの製造
法は、いずれもベタシアニンの生産性において十分に満
足し得るものとは言い難く、更に工業的に有利な製造法
の開発が望まれている。従って、本発明の目的は、アメ
リカヤマゴボウの培養細胞を用いた、ベタシアニンの生
産性の高い製造法を提供することにある。本発明の他の
目的は、上記の製造法に用いられる液体培地を提供する
ことにある。
告されている培養細胞塊を利用したベタシアニンの製造
法は、いずれもベタシアニンの生産性において十分に満
足し得るものとは言い難く、更に工業的に有利な製造法
の開発が望まれている。従って、本発明の目的は、アメ
リカヤマゴボウの培養細胞を用いた、ベタシアニンの生
産性の高い製造法を提供することにある。本発明の他の
目的は、上記の製造法に用いられる液体培地を提供する
ことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、アメリカ
ヤマゴボウの培養細胞塊を培養してベタシアニンを製造
するベタシアニン生産性の高い製造法を開発することを
目的として鋭意研究した結果、培養培地中のカリウムイ
オン濃度がベタシアニン生成に大きく影響し、従って特
定量のカリウムイオンを含有する培地を用いることによ
ってベタシアニンの生産性が向上すること、またカリウ
ムイオン濃度とともにリン酸イオン濃度及び／又はショ
糖濃度をコントロールすることによって更にベタシアニ
ンの生産性が改善することを見出し、本発明を完成させ
た。
ヤマゴボウの培養細胞塊を培養してベタシアニンを製造
するベタシアニン生産性の高い製造法を開発することを
目的として鋭意研究した結果、培養培地中のカリウムイ
オン濃度がベタシアニン生成に大きく影響し、従って特
定量のカリウムイオンを含有する培地を用いることによ
ってベタシアニンの生産性が向上すること、またカリウ
ムイオン濃度とともにリン酸イオン濃度及び／又はショ
糖濃度をコントロールすることによって更にベタシアニ
ンの生産性が改善することを見出し、本発明を完成させ
た。
【０００６】従って、本発明は、アメリカヤマゴボウ
（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）から誘
導したベタシアニン生産能を有する培養細胞塊（カル
ス）を、カリウムイオン濃度が６０ｍＭ〜１５０ｍＭで
ある液体培地中で培養して該培養細胞塊を増殖せしめ、
培養物からベタシアニンを採取すること特徴とするベタ
シアニンの製造法；並びにカリウム濃度が６０ｍＭ〜１
５０ｍＭである、アメリカヤマゴボウ由来の培養細胞塊
を培養するための液体培地である。
（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）から誘
導したベタシアニン生産能を有する培養細胞塊（カル
ス）を、カリウムイオン濃度が６０ｍＭ〜１５０ｍＭで
ある液体培地中で培養して該培養細胞塊を増殖せしめ、
培養物からベタシアニンを採取すること特徴とするベタ
シアニンの製造法；並びにカリウム濃度が６０ｍＭ〜１
５０ｍＭである、アメリカヤマゴボウ由来の培養細胞塊
を培養するための液体培地である。
【０００７】本発明で対象とするベタシアニンとは、下
記式
記式
【化１】 で表わされるブドウ糖を含む配糖体であるベタニンが主
成分であるが、その他に、ベタニジンあるいは糖の種類
が異なったりアグリコン部分が修飾されたベタニンであ
ってもよい。
成分であるが、その他に、ベタニジンあるいは糖の種類
が異なったりアグリコン部分が修飾されたベタニンであ
ってもよい。
【０００８】本発明で用いる培養細胞塊（以下カルスと
いう）は、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ
ａｍｅｒｉｃａ）〔別名：ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈ
ｙｔｏｌａｃｃａ ｄｅｃａｎｄｒａ）〕由来のもので
あり、カルスは以下のようにして調製することができ
る。即ち、アメリカヤマゴボウの根、茎、葉、果実その
他の部分を適当な大きさに切り取り、常法に従ってエタ
ノールと次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌水で洗浄
後、適当な大きさのものを固体培地上に置床する。ここ
で用いる固体培地としては、例えば以下の表１に示す組
成のＬｉｎ ＆Ｓｔａｂａ培地〔Ｆｕｊｉｍｕｒａ
ら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６４，１６２（１
９７９）〕に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸などの生
長調節物質を添加した寒天培地が挙げられる。
いう）は、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ
ａｍｅｒｉｃａ）〔別名：ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈ
ｙｔｏｌａｃｃａ ｄｅｃａｎｄｒａ）〕由来のもので
あり、カルスは以下のようにして調製することができ
る。即ち、アメリカヤマゴボウの根、茎、葉、果実その
他の部分を適当な大きさに切り取り、常法に従ってエタ
ノールと次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌水で洗浄
後、適当な大きさのものを固体培地上に置床する。ここ
で用いる固体培地としては、例えば以下の表１に示す組
成のＬｉｎ ＆Ｓｔａｂａ培地〔Ｆｕｊｉｍｕｒａ
ら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６４，１６２（１
９７９）〕に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸などの生
長調節物質を添加した寒天培地が挙げられる。
【表１】
【０００９】Ｌｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地の他にも、本
発明により開発された以下の表２に示す組成のＰＡ培地
の寒天培地を好ましいものとして挙げることができる。
発明により開発された以下の表２に示す組成のＰＡ培地
の寒天培地を好ましいものとして挙げることができる。
【表２】
【００１０】上記した如き寒天培地上に置床後、２０℃
−３５℃で光照射下（約３，０００ルクス）に２−４週
間培養するとカルスが形成される。カルスのなかでも赤
色で増殖の盛んな部分を選抜し、新鮮な上記した如き寒
天培地上で更に培養を続ける。このようにして継代培養
を行うことにより、増殖の速い安定なカルスを得ること
ができる。かくして得られるカルスを液体培養法により
培養増殖させる。液体培養法としては振とう培養法ある
いはガラス、金属製などの密閉した培養槽に無菌空気を
通気して培養する通常の培養法などを採用することがで
きる。培養は光照射下（例えば約５，０００ルクス）
で、２０℃−３５℃の温度で通常行なわれる。
−３５℃で光照射下（約３，０００ルクス）に２−４週
間培養するとカルスが形成される。カルスのなかでも赤
色で増殖の盛んな部分を選抜し、新鮮な上記した如き寒
天培地上で更に培養を続ける。このようにして継代培養
を行うことにより、増殖の速い安定なカルスを得ること
ができる。かくして得られるカルスを液体培養法により
培養増殖させる。液体培養法としては振とう培養法ある
いはガラス、金属製などの密閉した培養槽に無菌空気を
通気して培養する通常の培養法などを採用することがで
きる。培養は光照射下（例えば約５，０００ルクス）
で、２０℃−３５℃の温度で通常行なわれる。
【００１１】本発明では、カルス培養の際に用いる液体
培地は、カリウムイオン濃度が６０ｍＭ−１５０ｍＭ、
好ましくは６５ｍＭ−１２０ｍＭ、より好ましくは７０
ｍＭ−９５ｍＭである液体培地を用いる。カリウムイオ
ン源としては、特に限定されず例えばＫＮＯ3 、ＫＣｌ
等を用いることができる。リン酸イオン濃度は好ましく
は０．２５ｍＭ−４．０ｍＭ、更に好ましくは１．０ｍ
Ｍ−２．０ｍＭであり、リン酸イオン源としては、ＫＨ
2 ＰＯ4 、Ｋ2 ＨＰＯ4 、Ｋ3 ＰＯ4 などが挙げられ
る。またショ糖濃度は好ましくは３．５ｗｔ％以下、更
に好ましくは２．５ｗｔ％以下である。本発明ではリン
酸イオン及び／又はショ糖は液体培地に分割供給するの
が好ましい。リン酸イオン及び／又はショ糖を分割供給
することによってベタシアニン生産性の向上が実現され
る。分割供給する場合のリン酸イオンの供給量としては
培養初期供給量も含めて、合計５ｍＭ以下が好ましい。
分割供給の際のショ糖の量は、好ましくは１．５ｗｔ％
以下、初期供給量も含めてトータル５ｗｔ％以下がよ
い。リン酸イオンやショ糖の初期供給後の好ましい添加
時期は、細胞の対数増殖期である。対数増殖期は、培養
開始時の細胞量等により異なるが、７〜１２日程度であ
る。対数増殖期においては、その時点で添加してもよ
く、上記トータル量の範囲であれば添加の回数は特に制
限されず数日おきであってもよい。ただし、対数増殖期
３日目までは培地中のリン酸イオンやショ糖濃度が初期
添加濃度を越えない範囲で添加することが望ましい。リ
ン酸イオン及びショ糖は同時期に添加しても別々に添加
してもよい。
培地は、カリウムイオン濃度が６０ｍＭ−１５０ｍＭ、
好ましくは６５ｍＭ−１２０ｍＭ、より好ましくは７０
ｍＭ−９５ｍＭである液体培地を用いる。カリウムイオ
ン源としては、特に限定されず例えばＫＮＯ3 、ＫＣｌ
等を用いることができる。リン酸イオン濃度は好ましく
は０．２５ｍＭ−４．０ｍＭ、更に好ましくは１．０ｍ
Ｍ−２．０ｍＭであり、リン酸イオン源としては、ＫＨ
2 ＰＯ4 、Ｋ2 ＨＰＯ4 、Ｋ3 ＰＯ4 などが挙げられ
る。またショ糖濃度は好ましくは３．５ｗｔ％以下、更
に好ましくは２．５ｗｔ％以下である。本発明ではリン
酸イオン及び／又はショ糖は液体培地に分割供給するの
が好ましい。リン酸イオン及び／又はショ糖を分割供給
することによってベタシアニン生産性の向上が実現され
る。分割供給する場合のリン酸イオンの供給量としては
培養初期供給量も含めて、合計５ｍＭ以下が好ましい。
分割供給の際のショ糖の量は、好ましくは１．５ｗｔ％
以下、初期供給量も含めてトータル５ｗｔ％以下がよ
い。リン酸イオンやショ糖の初期供給後の好ましい添加
時期は、細胞の対数増殖期である。対数増殖期は、培養
開始時の細胞量等により異なるが、７〜１２日程度であ
る。対数増殖期においては、その時点で添加してもよ
く、上記トータル量の範囲であれば添加の回数は特に制
限されず数日おきであってもよい。ただし、対数増殖期
３日目までは培地中のリン酸イオンやショ糖濃度が初期
添加濃度を越えない範囲で添加することが望ましい。リ
ン酸イオン及びショ糖は同時期に添加しても別々に添加
してもよい。
【００１２】液体培地のｐＨは６．０程度が好ましく、
またアンモニウムイオン濃度１５ｍＭ程度が望ましい。
本発明で用いる液体培地としては、例えば前記したＰＡ
培地の組成を有する培地を好ましいものとして挙げるこ
とができる。このようなＰＡ培地を培養初期に用いて、
上記したようにしてリン酸イオン及び／又はショ糖を分
割供給するが望ましい。液体培地は通常生長調節物質を
添加して用いられる。例えば生長調節物質としてナフタ
レン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、インドー
ル酢酸などを用いることができ、特に２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸が好ましい。また、液体培地の組成は種
々改変して使用することもでき、その他必要により、ア
ミノ酸類、ビタミン類等を加えることもできる。液体培
養は通常１０日間−２０日間行なわれ、かくして培養増
殖した細胞を集めて種々の通常の方法によってベタシア
ニンを採取することができる。例えば、培養液から培養
細胞をろ過し、得られる細胞をフリーズドライし、次い
でエタノールで抽出する。抽出液より他の蛋白を除き、
減圧濃縮し、次いでクロマトグラフィー等に付すことに
よって目的とするベタシアニンを得ることができる。以
下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。
またアンモニウムイオン濃度１５ｍＭ程度が望ましい。
本発明で用いる液体培地としては、例えば前記したＰＡ
培地の組成を有する培地を好ましいものとして挙げるこ
とができる。このようなＰＡ培地を培養初期に用いて、
上記したようにしてリン酸イオン及び／又はショ糖を分
割供給するが望ましい。液体培地は通常生長調節物質を
添加して用いられる。例えば生長調節物質としてナフタ
レン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、インドー
ル酢酸などを用いることができ、特に２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸が好ましい。また、液体培地の組成は種
々改変して使用することもでき、その他必要により、ア
ミノ酸類、ビタミン類等を加えることもできる。液体培
養は通常１０日間−２０日間行なわれ、かくして培養増
殖した細胞を集めて種々の通常の方法によってベタシア
ニンを採取することができる。例えば、培養液から培養
細胞をろ過し、得られる細胞をフリーズドライし、次い
でエタノールで抽出する。抽出液より他の蛋白を除き、
減圧濃縮し、次いでクロマトグラフィー等に付すことに
よって目的とするベタシアニンを得ることができる。以
下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【００１３】
実施例アメリカヤマゴボウからのカルスの誘導 アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒ
ｉｃａｎａ）の茎を常法に従いエタノールと次亜塩素酸
ナトリウムで殺菌し、滅菌水で洗浄後、髄の部分をコル
クボーラーで打ち抜き、輪切りにして０．２％ジュラン
ガムを含む前記した表１に示す組成のＬｉｎ ＆ Ｓｔ
ａｂａ寒天培地上に置床した。２５℃、光照射下（約
３，０００ルクス）で２−４週間培養するとカルスがで
きた。カルスのなかで赤色で増殖の盛んな部分を選抜
し、新鮮なＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ寒天培地上に移植し
た。この操作を２−３週間間隔で繰り返し、赤色色素ベ
タシアニンを多く含み、増殖の速い安定なカルスを得
た。このカルスを１００ｍｌのＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ
液体培地の入った５００ｍｌ三角フラスコに入れ、２５
℃、光照射下（約５，０００ルクス）、ロータリーシェ
イカー上１００ｒｐｍで振とう培養すると小さな細胞塊
が遊離してきた。この小さい細胞塊を選抜し、実験に使
用する培養細胞とした。培養細胞は、１００ｍｌのＬｉ
ｎ ＆ Ｓｔａｂａ液体培地の入った５００ｍｌ三角フ
ラスコまたは５０ｍｌの液体培地の入った２００ｍｌ三
角フラスコ中で７−１０日間隔で継代培養した。尚、Ｌ
ｉｎ＆Ｓｔａｂａ培地は、２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸１０-7Ｍを添加して使用した。以下の実験における
Ｌｉｎ＆Ｓｔａｂａ培地、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏ
ｏｇ培地も同様に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸１０
-7Ｍを添加して使用した。
ｉｃａｎａ）の茎を常法に従いエタノールと次亜塩素酸
ナトリウムで殺菌し、滅菌水で洗浄後、髄の部分をコル
クボーラーで打ち抜き、輪切りにして０．２％ジュラン
ガムを含む前記した表１に示す組成のＬｉｎ ＆ Ｓｔ
ａｂａ寒天培地上に置床した。２５℃、光照射下（約
３，０００ルクス）で２−４週間培養するとカルスがで
きた。カルスのなかで赤色で増殖の盛んな部分を選抜
し、新鮮なＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ寒天培地上に移植し
た。この操作を２−３週間間隔で繰り返し、赤色色素ベ
タシアニンを多く含み、増殖の速い安定なカルスを得
た。このカルスを１００ｍｌのＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ
液体培地の入った５００ｍｌ三角フラスコに入れ、２５
℃、光照射下（約５，０００ルクス）、ロータリーシェ
イカー上１００ｒｐｍで振とう培養すると小さな細胞塊
が遊離してきた。この小さい細胞塊を選抜し、実験に使
用する培養細胞とした。培養細胞は、１００ｍｌのＬｉ
ｎ ＆ Ｓｔａｂａ液体培地の入った５００ｍｌ三角フ
ラスコまたは５０ｍｌの液体培地の入った２００ｍｌ三
角フラスコ中で７−１０日間隔で継代培養した。尚、Ｌ
ｉｎ＆Ｓｔａｂａ培地は、２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸１０-7Ｍを添加して使用した。以下の実験における
Ｌｉｎ＆Ｓｔａｂａ培地、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏ
ｏｇ培地も同様に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸１０
-7Ｍを添加して使用した。
【００１４】培地の最適化 １．培地の評価方法 継代培養しているアメリカヤマゴボウ培養細胞を試験す
る各種液体培地で２回洗い、一定量の培養細胞を５０ｍ
ｌの各種液体培地の入った２００ｍｌ三角フラスコ中に
移植し、２５℃、光照射下（約５，０００ルクス）、ロ
ータリーシェイカー上１００ｒｐｍで１３−１５日間振
とう培養した。培養後、培養細胞を含む培養液５ｍｌを
等量の特級エタノールを加えてベタシアニンを抽出し、
０．２μｍのフィルターでろ過後、５４０ｎｍの吸光度
を測定し、各種培地でのベタシアニン生産量を評価し
た。 ２．ＭＳ培地とＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地 以下の表３に示す組成のＭｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋ
ｏｏｇ培地（ＭＳ培地）と前記した組成のＬｉｎ ＆
Ｓｔａｂａの２つの培地でのベタシアニン生産量を比較
すると、以下の表４に示したように、Ｌｉｎ ＆ Ｓｔ
ａｂａ培地の方が多いことが分かった。以後Ｌｉｎ ＆
Ｓｔａｂａ培地の成分を変化させ、ベタシアニン生産
量を調べた。
る各種液体培地で２回洗い、一定量の培養細胞を５０ｍ
ｌの各種液体培地の入った２００ｍｌ三角フラスコ中に
移植し、２５℃、光照射下（約５，０００ルクス）、ロ
ータリーシェイカー上１００ｒｐｍで１３−１５日間振
とう培養した。培養後、培養細胞を含む培養液５ｍｌを
等量の特級エタノールを加えてベタシアニンを抽出し、
０．２μｍのフィルターでろ過後、５４０ｎｍの吸光度
を測定し、各種培地でのベタシアニン生産量を評価し
た。 ２．ＭＳ培地とＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地 以下の表３に示す組成のＭｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋ
ｏｏｇ培地（ＭＳ培地）と前記した組成のＬｉｎ ＆
Ｓｔａｂａの２つの培地でのベタシアニン生産量を比較
すると、以下の表４に示したように、Ｌｉｎ ＆ Ｓｔ
ａｂａ培地の方が多いことが分かった。以後Ｌｉｎ ＆
Ｓｔａｂａ培地の成分を変化させ、ベタシアニン生産
量を調べた。
【表３】
【表４】
【００１５】３．リン酸イオン濃度 Ｌｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地中に含まれるリン酸濃度に
ついて検討した。表５および図１に示すとおり１−２ｍ
Ｍの濃度で培地あたりに含まれるベタシアニン量が多く
なった。１ｍＭと２ｍＭではほとんど違いがなかったの
で、以後の培地中のＫＨ2 ＰＯ4 濃度は１ｍＭに固定
し、試験を行った。
ついて検討した。表５および図１に示すとおり１−２ｍ
Ｍの濃度で培地あたりに含まれるベタシアニン量が多く
なった。１ｍＭと２ｍＭではほとんど違いがなかったの
で、以後の培地中のＫＨ2 ＰＯ4 濃度は１ｍＭに固定
し、試験を行った。
【表５】
【００１６】４．ｐＨ、ショ糖、アンモニウムイオン リン酸イオンの検討と同様にして、ＫＨ2 ＰＯ4 を１ｍ
Ｍに改変したＬｉｎ＆ Ｓｔａｂａ培地中のｐＨを５．
７から６．０に変えた方がベタシアニン生産量が多くな
ることが分かった。次に、ＫＨ2 ＰＯ4 を１ｍＭ、ｐＨ
を６．０に改変したＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地中のシ
ョ糖濃度について検討したところ２．５％でベタシアニ
ン生産量が最も多くなることが分かった。ちなみに、シ
ョ糖濃度が３．５％以上のときアメリカヤマゴボウ培養
細胞の増殖誘導期が長くなった。さらに、ＫＨ2 ＰＯ4
を１ｍＭ、ｐＨを６．０、ショ糖を２．５％に改変した
Ｌｉｎ＆Ｓｔａｂａ培地中のＮＨ4 + 濃度について検討
したところ１５ｍＭでベタシアニン生産量が最も多くな
ることが分かった。以後の培地中のｐＨは６．０、ショ
糖濃度は２．５％、ＮＨ4 + 濃度は１５ｍＭに固定し、
試験を行った。
Ｍに改変したＬｉｎ＆ Ｓｔａｂａ培地中のｐＨを５．
７から６．０に変えた方がベタシアニン生産量が多くな
ることが分かった。次に、ＫＨ2 ＰＯ4 を１ｍＭ、ｐＨ
を６．０に改変したＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地中のシ
ョ糖濃度について検討したところ２．５％でベタシアニ
ン生産量が最も多くなることが分かった。ちなみに、シ
ョ糖濃度が３．５％以上のときアメリカヤマゴボウ培養
細胞の増殖誘導期が長くなった。さらに、ＫＨ2 ＰＯ4
を１ｍＭ、ｐＨを６．０、ショ糖を２．５％に改変した
Ｌｉｎ＆Ｓｔａｂａ培地中のＮＨ4 + 濃度について検討
したところ１５ｍＭでベタシアニン生産量が最も多くな
ることが分かった。以後の培地中のｐＨは６．０、ショ
糖濃度は２．５％、ＮＨ4 + 濃度は１５ｍＭに固定し、
試験を行った。
【００１７】５．硝酸イオン、カリウムイオン、塩素イ
オン ＫＨ2 ＰＯ4 を１ｍＭ、ｐＨを６．０、ショ糖濃度を
２．５％、ＮＨ4 + を１５ｍＭに改変したＬｉｎ ＆
Ｓｔａｂａ培地中の硝酸イオン、カリウムイオン、塩素
イオンについて検討した結果は表６に示した通りであ
る。硝酸イオン濃度が４０−１００ｍＭ、塩素イオン濃
度が０−６０ｍＭでは、ベタシアニン生産量にほとんど
関係ないのに対し、カリウムイオン濃度はベタシアニン
生産量に大きく関係していると推定できる。そこで、培
地中のカリウムイオン濃度について詳細に検討すること
にした。
オン ＫＨ2 ＰＯ4 を１ｍＭ、ｐＨを６．０、ショ糖濃度を
２．５％、ＮＨ4 + を１５ｍＭに改変したＬｉｎ ＆
Ｓｔａｂａ培地中の硝酸イオン、カリウムイオン、塩素
イオンについて検討した結果は表６に示した通りであ
る。硝酸イオン濃度が４０−１００ｍＭ、塩素イオン濃
度が０−６０ｍＭでは、ベタシアニン生産量にほとんど
関係ないのに対し、カリウムイオン濃度はベタシアニン
生産量に大きく関係していると推定できる。そこで、培
地中のカリウムイオン濃度について詳細に検討すること
にした。
【表６】
【００１８】６．カリウムイオン ＫＨ2 ＰＯ4 を１ｍＭ、ｐＨを６．０、ショ糖濃度を
２．５％、ＮＨ4 ＮＯ3を１５ｍＭ、ＫＮＯ3 を２５ｍ
Ｍに改変したＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地中のカリウム
イオンをＫＣｌで４１−２２１ｍＭに変化させた培地で
ベタシアニン生産量を調べた結果は表７及び図２に示し
た。表７及び図２から明らかなようにカリウムイオン濃
度が７１−９１ｍＭのとき、ベタシアニン生産量が最も
多くなった。
２．５％、ＮＨ4 ＮＯ3を１５ｍＭ、ＫＮＯ3 を２５ｍ
Ｍに改変したＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地中のカリウム
イオンをＫＣｌで４１−２２１ｍＭに変化させた培地で
ベタシアニン生産量を調べた結果は表７及び図２に示し
た。表７及び図２から明らかなようにカリウムイオン濃
度が７１−９１ｍＭのとき、ベタシアニン生産量が最も
多くなった。
【表７】
【００１９】７．ＰＡ培地 以上の検討結果より、前記した表１に示すベタシアニン
生産のためのＰＡ培地ができた。Ｌｉｎ ＆ Ｓｔａｂ
ａ培地とＰＡ培地でアメリカヤマゴボウ培養細胞を培養
した場合を比べると、５４０ｎｍの吸光度から推定して
ＰＡ培地の方が培地あたり１．８９倍のベタシアニンを
生産していた。
生産のためのＰＡ培地ができた。Ｌｉｎ ＆ Ｓｔａｂ
ａ培地とＰＡ培地でアメリカヤマゴボウ培養細胞を培養
した場合を比べると、５４０ｎｍの吸光度から推定して
ＰＡ培地の方が培地あたり１．８９倍のベタシアニンを
生産していた。
【００２０】８．液追加試験 培養中の培地に含まれているリン酸イオン濃度と糖濃度
を調べてみると、培養中期にリン酸イオンと糖がかなり
消費されていることが分かった。そこで、アメリカヤマ
ゴボウ培養中の５０ｍｌＰＡ培地を含む２００ｍｌフラ
スコへ培養開始８日目にショ糖を３５％にしたＰＡ培地
を１．４２９ｍｌ（１％相当）のみ、ＫＨ2 ＰＯ4 を３
５ｍＭにしたＰＡ培地を１．４２９ｍｌ（１ｍＭ相当）
のみ、そしてショ糖を３５％、ＫＨ2 ＰＯ4 を３５ｍＭ
にしたＰＡ培地を１．４２９ｍｌそれぞれ追加した。た
だし、ｐＨは５．５に調整した。 コントロール実験と
して、ＰＡ培地、３．５％ショ糖を含むＰＡ培地、２ｍ
ＭＫＨ2 ＰＯ4 を含むＰＡ培地、３．５％ショ糖と２ｍ
ＭＫＨ2 ＰＯ4 を含むＰＡ培地を作った。以上の７種の
培地で１６日間アメリカヤマゴボウ培養細胞を培養し、
その後、培養細胞を含む培養液をキムタオルでろ過し、
細胞を集め、常法に従い、フリーズドライした。フリー
ズドライ後の細胞粉末５０ｍｇから５０％エタノール１
０ｍｌでベタシアニンを抽出し、０．２μｍのフィルタ
ーでろ過後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。ベタシア
ニンの主成分であるベタニンの百分率吸光係数Ａ1cm 1%
はＷｙｌｅｒらやＰｉａｔｔｅｌｌｉらによると１，
１００−１，１２０である〔Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，４２，１６９９−１７０２（１９５９）；及びＰ
ｈｙｔｏｃｈｅｍ．，３，３０７−３１１（１９６
４）〕。この値を使い、色素含有量を推定した結果は表
８に示した通りである。
を調べてみると、培養中期にリン酸イオンと糖がかなり
消費されていることが分かった。そこで、アメリカヤマ
ゴボウ培養中の５０ｍｌＰＡ培地を含む２００ｍｌフラ
スコへ培養開始８日目にショ糖を３５％にしたＰＡ培地
を１．４２９ｍｌ（１％相当）のみ、ＫＨ2 ＰＯ4 を３
５ｍＭにしたＰＡ培地を１．４２９ｍｌ（１ｍＭ相当）
のみ、そしてショ糖を３５％、ＫＨ2 ＰＯ4 を３５ｍＭ
にしたＰＡ培地を１．４２９ｍｌそれぞれ追加した。た
だし、ｐＨは５．５に調整した。 コントロール実験と
して、ＰＡ培地、３．５％ショ糖を含むＰＡ培地、２ｍ
ＭＫＨ2 ＰＯ4 を含むＰＡ培地、３．５％ショ糖と２ｍ
ＭＫＨ2 ＰＯ4 を含むＰＡ培地を作った。以上の７種の
培地で１６日間アメリカヤマゴボウ培養細胞を培養し、
その後、培養細胞を含む培養液をキムタオルでろ過し、
細胞を集め、常法に従い、フリーズドライした。フリー
ズドライ後の細胞粉末５０ｍｇから５０％エタノール１
０ｍｌでベタシアニンを抽出し、０．２μｍのフィルタ
ーでろ過後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。ベタシア
ニンの主成分であるベタニンの百分率吸光係数Ａ1cm 1%
はＷｙｌｅｒらやＰｉａｔｔｅｌｌｉらによると１，
１００−１，１２０である〔Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，４２，１６９９−１７０２（１９５９）；及びＰ
ｈｙｔｏｃｈｅｍ．，３，３０７−３１１（１９６
４）〕。この値を使い、色素含有量を推定した結果は表
８に示した通りである。
【表８】
【００２１】培養初期から高いショ糖濃度にすると細胞
増殖の誘導期が長くなり、結果的にベタシアニン生産量
はＰＡ培地とほぼ同じであった。また、培養初期から高
いリン酸濃度にすると細胞乾重量あたりのベタシアニン
の含有量が多くなるが、培地あたりの細胞乾重量は減少
し、ベタシアニン生産量はＰＡ培地とほぼ同じであっ
た。一方、１％相当のショ糖または１ｍＭ相当のＫＨ2
ＰＯ4 を追加すると、ＰＡ培地よりも培地あたりのベタ
シアニン生産量が多くなった。さらに、１％相当のショ
糖と１ｍＭ相当のＫＨ2 ＰＯ4 を同時に追加すると、そ
れぞれ単独に追加したフラスコよりも培地あたりのベタ
シアニン生産量が多くなり、ベタニンに換算して３７１
（ｍｇ／１）となった。
増殖の誘導期が長くなり、結果的にベタシアニン生産量
はＰＡ培地とほぼ同じであった。また、培養初期から高
いリン酸濃度にすると細胞乾重量あたりのベタシアニン
の含有量が多くなるが、培地あたりの細胞乾重量は減少
し、ベタシアニン生産量はＰＡ培地とほぼ同じであっ
た。一方、１％相当のショ糖または１ｍＭ相当のＫＨ2
ＰＯ4 を追加すると、ＰＡ培地よりも培地あたりのベタ
シアニン生産量が多くなった。さらに、１％相当のショ
糖と１ｍＭ相当のＫＨ2 ＰＯ4 を同時に追加すると、そ
れぞれ単独に追加したフラスコよりも培地あたりのベタ
シアニン生産量が多くなり、ベタニンに換算して３７１
（ｍｇ／１）となった。
【００２２】
【発明の効果】以上に詳述したように、アメリカヤマゴ
ボウより誘導されたベタシアニン生産能を有する培養細
胞塊を、カリウムイオン濃度が６０ｍＭ−１５０ｍＭで
ある液体培地中で培養することにより、更には液体培地
にリン酸イオン及び／又はショ糖を分割供給することに
より、培養細胞塊のベタシアニン生産性が著しく向上す
る。従ってこのような培養条件下でベタシアニンを製造
することにより、工業的に有利にベタシアニンを大量生
産することが実現される。
ボウより誘導されたベタシアニン生産能を有する培養細
胞塊を、カリウムイオン濃度が６０ｍＭ−１５０ｍＭで
ある液体培地中で培養することにより、更には液体培地
にリン酸イオン及び／又はショ糖を分割供給することに
より、培養細胞塊のベタシアニン生産性が著しく向上す
る。従ってこのような培養条件下でベタシアニンを製造
することにより、工業的に有利にベタシアニンを大量生
産することが実現される。
【図１】液体培地中に含まれるリン酸イオン濃度を０−
２ｍＭまで変化させた時の培地あたりのベタシアニン量
（Ａ540)の違いを示す。
２ｍＭまで変化させた時の培地あたりのベタシアニン量
（Ａ540)の違いを示す。
【図２】ＫＨ2 ＰＯ4 を１ｍＭ、ショ糖を２．５％、ｐ
Ｈ６．０ＮＨ4 ＮＯ3 を１５ｍＭ、ＫＮＯ3 を２５ｍＭ
に改変したＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地中のカリウムイ
オン濃度をＫＣｌで４１−２２１ｍＭに変化させた培地
でのベタシアニン生産量（Ａ540)を示す。
Ｈ６．０ＮＨ4 ＮＯ3 を１５ｍＭ、ＫＮＯ3 を２５ｍＭ
に改変したＬｉｎ ＆ Ｓｔａｂａ培地中のカリウムイ
オン濃度をＫＣｌで４１−２２１ｍＭに変化させた培地
でのベタシアニン生産量（Ａ540)を示す。
Claims (5)
- 【請求項１】 アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃ
ｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）から誘導したベタシアニン
生産能を有する培養細胞塊（カルス）を、カリウムイオ
ン濃度が６０ｍＭ〜１５０ｍＭである液体培地中で培養
して該培養細胞塊を増殖せしめ、培養物からベタシアニ
ンを採取することを特徴とするベタシアニンの製造法。 - 【請求項２】 液体培地中に、ショ糖及び／又はリン酸
イオンを分割供給する請求項１の製造法。 - 【請求項３】 液体培地がＰＡ培地である請求項１又は
２の製造法。 - 【請求項４】 カリウム濃度が６０ｍＭ〜１５０ｍＭで
ある、アメリカヤマゴボウ由来の培養細胞塊を培養する
ための液体培地。 - 【請求項５】 ＰＡ培地である請求項４の液体培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8078592A JPH0728752B2 (ja) | 1992-04-02 | 1992-04-02 | アメリカヤマゴボウ培養細胞を用いたベタシアニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8078592A JPH0728752B2 (ja) | 1992-04-02 | 1992-04-02 | アメリカヤマゴボウ培養細胞を用いたベタシアニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622779A true JPH0622779A (ja) | 1994-02-01 |
| JPH0728752B2 JPH0728752B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=13728106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8078592A Expired - Lifetime JPH0728752B2 (ja) | 1992-04-02 | 1992-04-02 | アメリカヤマゴボウ培養細胞を用いたベタシアニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0728752B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5623857A (en) * | 1994-06-16 | 1997-04-29 | Hitachi Seiki Co., Ltd. | Method and apparatus for compensating for thermal distortion for a machine tool |
| JPH09140392A (ja) * | 1995-11-22 | 1997-06-03 | Kao Corp | 多糖類の生産方法 |
| US5795112A (en) * | 1995-09-22 | 1998-08-18 | Okuma Corporation | Method for compensating a component of a machine tool for displacement caused by heat |
| US5833407A (en) * | 1996-02-19 | 1998-11-10 | Okuma Corporation | Method for estimating heat-included displacment in a machine tool |
| US6019506A (en) * | 1997-08-19 | 2000-02-01 | Okuma Corporation | Method for estimating thermal displacement in a machine tool |
-
1992
- 1992-04-02 JP JP8078592A patent/JPH0728752B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5623857A (en) * | 1994-06-16 | 1997-04-29 | Hitachi Seiki Co., Ltd. | Method and apparatus for compensating for thermal distortion for a machine tool |
| US5795112A (en) * | 1995-09-22 | 1998-08-18 | Okuma Corporation | Method for compensating a component of a machine tool for displacement caused by heat |
| JPH09140392A (ja) * | 1995-11-22 | 1997-06-03 | Kao Corp | 多糖類の生産方法 |
| US5833407A (en) * | 1996-02-19 | 1998-11-10 | Okuma Corporation | Method for estimating heat-included displacment in a machine tool |
| US6019506A (en) * | 1997-08-19 | 2000-02-01 | Okuma Corporation | Method for estimating thermal displacement in a machine tool |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0728752B2 (ja) | 1995-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Emershad et al. | In ovulo embryo development and plant formation from stenospermic genotypes of Vitis vinifera | |
| JPS63192383A (ja) | トウモロコシにおけるフリー・プール・リジン含有量の増加方法 | |
| Sung | Relationship of indole-3-acetic acid and tryptophan concentrations in normal and 5-methyltryptophan-resistant cell lines of wild carrots | |
| JPH0622779A (ja) | アメリカヤマゴボウ培養細胞を用いたベタシアニンの製造法 | |
| EP0171593A1 (en) | Sunflower regeneration through embryogenesis and organogenesis | |
| US3710512A (en) | Process for preparing licorice extract-like material for tobacco flavoring | |
| De-Eknamkul et al. | Rosmarinic acid: production in plant cell cultures | |
| CA1284465C (en) | Method and composition for plant tissue and cell culture | |
| JPH0220226A (ja) | ナガイモの不定胚培養法 | |
| US5212076A (en) | Production of quercetin glucuronide | |
| JPH0463599A (ja) | ベタシアニン系天燃赤色色素の製造方法 | |
| EP0134536A2 (de) | Verfahren zur Erhaltung und Vermehrung von defekten, nicht-infektiösen Virusgenomen | |
| US5066595A (en) | Process for increasing free pool lysine content in maize | |
| Geerts et al. | Development of an in vitro pod culture technique for young pods of Phaseolus vulgaris L. | |
| JPH03244328A (ja) | シクラメンの組織培養培地および同培地を用いるシクラメンの組織培養方法 | |
| JPH07184679A (ja) | アントシアニン系色素の製造方法及び当該色素の製造方法に用いる培地 | |
| JP2699569B2 (ja) | イチゴ培養細胞によるアントシアニンの製造方法 | |
| Howell et al. | Tissue culture and plant regeneration of Indigofera potaninii Craib. | |
| JPH05153995A (ja) | イチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法 | |
| Ravishankar et al. | Regulation of nicotine biogenesis 2: Increased production of nicotine by urea in tobacco tissue cultures | |
| JPH05184380A (ja) | イチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法 | |
| JP2684401B2 (ja) | 植物体再生促進法 | |
| Kazimierski | Studies on the hybrid Lupinus graecus boiss. X Lupinus jugoslavicus kazim. et now. | |
| JPS61265087A (ja) | プロトプラストの培養方法 | |
| AU4255500A (en) | Cultured cells of sweetpotato with high anthocyanin content, and method of establishing/culturing such cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19960312 |