JP2684401B2 - 植物体再生促進法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物組織培養を用いて植物組織あるいは培
養細胞からの植物体再生法に関する。

（従来の技術） 植物組織培養技術を用いて植物体を再生させる技術は
近年の植物バイオテクノロジーの進歩にともない益々重
要な技術になりつつある。一般に植物組織培養技術を用
いて植物体を再生させる方法としては出発材料により脱
分化系と分化系の２種に大きく分けられる。脱分化系は
カルスや液体培養細胞などの脱分化した状態を経由して
植物体を再生させる方法で、具体的にはクラスターカル
スから多くのシュートを発生させ、発生した各々のシュ
ートから発根させ幼植物体を再生させる方法と細胞に直
接不定胚（体細胞胚）を形成させ幼植物体にまで再生さ
せる方法がある。また、分化系では成長点を含む茎頂、
休眠芽、側芽、胚、種子などが出発材料になり、さらに
成長点を含まない胚軸、子葉、茎なども用いられる。こ
の系では上述した植物組織にマルチプルシュートを形成
させ、ついでこれらを切除した単一シュートから連続的
にマルチプルシュートを発生させる連続シュート生産シ
ステムを確立し、最終的に切除したシュートから発根さ
せ幼植物を再生させる。

脱分化系、分化系いずれの植物体再生法を行うにして
も、培養体からの不定胚形成及び不定胚からのシュート
・根の形成あるいは培養体からのシュート・根の形成に
おいては、温度、光量、光周期などの物理的条件、培地
の無機塩類、ビタミン、糖などの化学的条件、サイトカ
イニン・オーキシンなどの種類、サイトカイニン／オー
キシンの量比、ジベレリン類・アブシジン類等の添加な
どの植物ホルモン条件、用いる植物の齢、組織などの条
件、固体培養・液体培養（静置培養、回転培養、振盪培
養、タンク培養など）などの諸条件について種々検討さ
れている。

（発明が解決しようとする課題） 植物組織培養を用いて植物組織あるいは培養細胞から
の植物体再生法は種々の植物において検討されている。

脱分化系からの植物体再生では、培養細胞を長期間継
代培養していると、一般に分化能が低下することが多
く、培養細胞からの不定胚の形成率やカルスからのシュ
ート・根の形成率は低くなる。この主な原因としては、
遺伝的な変異が生じてしまったことが考えられるが、い
ずれにせよ再分化する細胞の割合を増加させることが産
業的には望まれる。人為的に不定胚を誘導する場合、前
述したように培地の無機塩組成もさることながら植物ホ
ルモンであるオーキシンやサイトカイニンの種類、濃
度、組合せについて検討することが一般的な手順となっ
ている。しかし、オーキシンやサイトカイニンの処理だ
けでは不定胚形成やカルスからのシュート・根の形成を
誘導できない植物種も多い。特に、不定胚は、生長段階
によって球状胚、心臓型胚、魚雷型胚、成熟胚と順次成
長していくが、魚雷型胚様体まで生長すると理由は定か
ではないが生長を停止して植物体にまで再分化する率は
極めて低下するという現象が起こる。

分化系での植物体再生では、種々の植物・種々の組織
を用いて脱分化系と同様にオーキシンやサイトカイニン
などの植物ホルモンの種類、濃度、組合せや培地の無機
塩類、微量有機成分組成などについて検討されている
が、いまだに植物や組織によってはシュート・根の形成
をしないものもある。

更に産業的に最も重要な点は培養体からのシュート・
根の発生率が高いこととシュート・根の発生が早いこと
で、これらにより速い連続育苗システムの回転が可能と
なる。すなわち幼植物の生産量の増大につながる。しか
しながら、現状ではシュート・根の発生速度、生産量と
も満足すべき結果は得られていない。このように、植物
培養技術を用いて植物組織あるいは培養細胞から植物体
を再生させるには、形態学的・生理学的に今だ不明な点
が多く、現在知られている植物組織培養技術を用いても
解決できない幾多の問題点がある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、上述せる課題に鑑みなされたもので、植物
組織培養を用いて植物組織あるいは培養細胞から植物体
を再生させる際に、微細藻類培養濾液及び／又は微細藻
類抽出物を含む培地により培養することを特徴とする植
物体再生促進法を要旨とするものである。

本発明で利用できる微細藻類としては、紅藻類、緑藻
類、黄緑藻類、珪藻類、黄色鞭毛藻類、渦鞭毛藻類など
がある。緑藻類としては、ブラキオモナス（Brachiomon
as）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、クロレ
ラ（Chlorella）属、ロボモナス（Lobomonas）属、ネフ
ェロクラミス（Nephrochlamys）属、ネフェロデエラ（N
ephrodiella）属、プロトシフォン（Protosiphon）属、
プロトテカ（Prototheca）属、セネデスムス（Scendesm
us）属、セレナストゥルム（Selenastrum）属などがあ
り、具体例としては、ブラキオモナス・スブマリナ（Br
achiomonas submarina）ATCC 30597、クラミドモナス
・ドルソベントラリス（Chlamydomonas dorsoventrali
s）ATCC 30594、クラミドモナス・オゥガメトス（Chla
mydomonas eugametos）ATCC 30401、クラミドモナス・
モノイカ（Chlamydomonas monoica）ATCC 30629、クラ
ミドモナス・プソウダグロエ（Chlamydomonas pseudagl
oe）ATCC 12235、クロレラ・エリップソイデア（Chlor
ella ellipsoidea）ATCC 11466、クロレラ・ルテオヴ
ィリディス（Chlorella luteoviridis）ATCC 30406、
クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）ATCC 3054
6、クロレラ・サッカロフィラ（Chlorella saccharophi
la var.saccharophila）ATCC 30408、クロレラ属（Chl
orella sp.）ATCC 11469、クロレラ・バリエガタ（Chl
orella variegata）ATCC 30409、クロレラ・ブルガリ
ス（Chlorella vulgaris）ATCC 11468、クロレラ・キ
サンセラ（Chlorella xanthella）ATCC 30411、ロボモ
ナス・ピリフォーミス（Lobomonas piriformis）ATCC
30403、ネフェロクラミス・スブソリタリア（Nephrochl
amys subsolitaria）ATCC 30433、ネフェロデエラ・ブ
レビス（Nephrodiella brevis）ATCC 30440、プロトシ
フォン・ボテリオイデス（Protosiphon botryoides）AT
CC 30436、プロトテカ・スタッグノラ（Prototheca st
agnora）ATCC 16528、セネデスムス・ビジュガトゥス
（Scenedesmus bijugatus）ATCC 11462、セネデスムス
・クゥアドリカウド（Scenedesmus quadricauda）ATCC
30428などが挙げられる。黄緑藻類としては、ボティ
リデウム（Botrydium）属、ミショコッカス（Mischococ
cus）属、モノダス（Monodus）属、オフィオシティウム
（Ophiocytium）属などがあり、具体例としては、ボテ
ィリデウム・ベケリアニウム（Botrydium becherianu
m）ATCC 30602、ボティリデウム・シストスム（Botryd
ium cystosum）ATCC 30589、ミショコッカス・スファ
エロセファラス（Mischococcus sphaerocephalus）ATCC
30592、モノダス・セブテラネウス（Monodus subterr
aneus）ATCC 30593、オフィオシティウム・マジュス
（Ophiocytium majus）ATCC 30601などが挙げられる。
黄色鞭毛藻類としては、オクロモナス（Ochromonas）属
などがあり、具体例としては、オクロモナス・ダニカ
（Ochromonas danica）ATCC 30004、オクロモナス・マ
ルハメンシス（Ochromonas malhamensis）ATCC 11532
などが挙げられる。また、微細藻類は、上記した微生物
あるいはその変種や変異株に限ることなく、天然から分
離した海洋性、淡水性の微細藻類も含まれる。微細藻類
の培養は、通常、無機塩類等を含む培地を用い、タンク
培養あるいは太陽光を利用した屋外開放培養で行い得る
が、本発明においては、目的とする微細藻類が天然にあ
る程度豊富に存在するならば、その微生物の生育存在す
る海水あるいは淡水を培養液とすることができる。微細
藻類培養濾液は上述した培養法で得られる培養液を遠心
分離あるいは濾過などを行って取得されるが、目的とす
る培養濾液の生物活性が弱い場合は、前記濾液を減圧濃
縮などにより濃縮して用いてもかまわない。この際、濃
縮倍率が大きくなり塩濃度が高くなると植物組織に悪影
響を与えることがあるので、電気透析などで植物組織に
悪影響がなくなるまで脱塩して使用するのが望ましい。
また、微細藻類の抽出物は、前記のようにして得られた
菌体または適度に破砕した菌体を常温または加熱した適
当な溶媒と接触させて行い得たものであるが、ここで用
いる溶媒としては、菌体によって種々の溶媒を単独また
は複数併用してもかまわないが、一般的には水性溶媒が
好ましい。例えば水性溶媒としては、水単独あるいは
酸、塩基、塩類、もしくは有機溶媒を溶解した溶液など
がある。また、メタノール、エタノール、酢酸エチルエ
ステル、エーテル等の有機溶媒で抽出後、有機溶媒を除
去し水に溶解させてもよい。本発明で使用できる抽出物
としては前記した方法により得られた抽出液、あるいは
これらを適宜濃縮あるいは希釈して使用できる。さら
に、これらの抽出液及び分画液を減圧乾燥、凍結乾燥、
噴霧乾燥等により乾燥し粉末としても使用できる。微細
藻類培養濾液及び／又は微細藻類抽出物の基本培地への
添加量は、0.0001〜50％で使用目的、使用方法によって
適宜選択できるが、望ましくは0.001〜10％である。

以上述べた、微細藻類培養濾液及び／又は微細藻類抽
出物を基本培地に添加し、その培地を用いて培養体から
の不定胚形成及び不定胚からのシュート・根の形成ある
いは培養体からのシュート・根の形成のため培養を行う
ものであるが、基本培地、培養方法などは通常の植物組
織培養におけるものと同様である。すなわち基本培地と
しては、ムラシゲ（Murashige）＆スクーグ（Skoog）培
地が代表的なものとして挙げられるが、その他の植物組
織培養に適した種々の培地、あるいはそれらの改変培地
を適宜選択して使用できる。更に、通常の培養に使用さ
れる植物ホルモン、ココナッツミルク、カゼイン分解物
や酵母抽出物等を目的に応じて併せて添加してもよい。
本発明において培養の対象となる植物としては、特に制
限はなく、どんな植物にも適用可能である。また、これ
らの植物の茎頂、休眠芽、側芽、胚、種子、胚軸、子
葉、茎、などの組織が適用可能で、更にこれら組織の初
代培養体、継代培養体も用いることができる。

（実施例） 以下、実施例によってさらに詳しく説明するが、これ
らによって限定されるものではない。

実施例１ （１）微細藻類培養濾液及び微細藻類抽出物の調製 クラミドモナス・ドルソベントラリス（Chlamydomona
s dorsoventrlis）ATCC 30594、クロレラ・ブルガリス
（Chlorella vulgaris）ATCC 11468、セネデスムス・
ビジュガトゥス（Scenedesmus bijugatus）ATCC 1146
2、ボティリデウム・ベケリアニウム（Botrydium beche
rianum）ATCC 30602、オクロモナス・ダニカ（Ochromo
nas danica）ATCC 30004を用いて調製した。前記微細
藻類をATCC指定の培養条件にて培養後、培養液を遠心濾
過し濾液を得、エバポレイターで100倍に濃縮した。こ
の濃縮液をモザイク荷電膜脱塩器（デザルトン DS−10
3:東ソー株式会社）で脱塩し、0.45μｍのメンンブラン
ンフィルターを用いて濾過し、得られた濾液を微細藻類
培養濾液とした。微細藻類抽出物は菌体を集菌後凍結乾
燥し、水に対して３％になるように菌体を懸濁させ、10
0℃で60分間熱水抽出し、遠心分離して上澄液を0.45μ
ｍメンブランフイルターを用いて濾過して得た。

（２）ニンジン培養細胞の不定胚形成への影響 ニンジン培養細胞は、形態的分化を行ない、不定胚を
形成することが知られているが、その際における微細藻
類培養濾液及び微細藻類抽出物の添加による影響を調べ
た。ニンジンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が10cm位
に生長したものを約1cm位に切断し、下記培地中で25
℃、暗条件下で培養した。培地は、基本培地としてムラ
シゲ（Murasige）＆スクーグ（Skoog）培地を使用し、
これに植物ホルモンのオーキシン類である２・４−Ｄを
1mg/lの濃度で添加しpH5.5〜5.7に調整したものであ
る。得られたカルスを液体培養にて継代培養し、不定胚
の形成に用いた。不定胚の形成は植物ホルモンである２
・４−Ｄを含まない前記基本培地を用いて行った。

（１）で調製された微細藻類培養濾液及び微細藻類抽
出物を培地に対して１％添加した培地と、無添加の培地
で温度25℃、暗条件下で30日間液体振盪培養し、形成さ
れた不定胚について10日目、20日目、30日目に観察した
結果を表−１に示す。

実施例２ ニンジンの不定胚の発芽発根の際に及ぼす微細藻類培
養濾液及び微細藻類抽出物の効果を調べた。

不定胚の調製は実施例１（２）に記載の方法で行った
が、この際微細藻類培養濾液及び微細藻類抽出物を含ま
ない培地を用いた。得られた球状から魚雷型までの不定
胚を植物ホルモンを含まないムラシゲ（Murasige）＆ス
クーグ（Skoog）培地で液体振盪培養した。この際、実
施例１（１）で調製された微細藻類培養濾液及び微細藻
類抽出物1.5％を添加した培地と無添加の培地を用い
た。25℃、明条件下（2000ルックス、12時間照明）で１
ヶ月間培養した結果を表−２に示す。

実施例３ ラン科植物であるカトレアの生長点培養において、培
地中に微細藻類培養濾液及び微細藻類抽出物を添加して
プロトコーム状球体（以下、「PLB」と呼ぶ。）への影
響について調べた。

材料は、カトレア類に属するレリオカトレア（Laelio
cattleya）の側芽の生長点付近の分裂組織から誘導され
たPLBである。PLB培養培地としては、ハイポネックス
（Hyponex;6.5−６−19）にジャガイモジュース７％、
炭素源としてショ糖２％を含むものを使用した。

初期誘導のPLBの中から成熟したPLBを選び、さらに各
々の１個のPLBを４つに分割し、供試用PLBを調整した。

PLB培養培地に対して実施例１（１）で作製した微細
藻類培養濾液及び微細藻類抽出物を0.5％添加した培地
と、無添加の培地で２ヶ月間液体振盪培養した結果を表
−３に示す。

実施例４ タバコのカルスからの植物体の再生における微細藻類
培養濾液及び微細藻類抽出物の添加による影響について
調べた。

材料は、タバコ（Nicotiana tabacum L.cv.Bright Ye
llow）の茎の髄組織由来のカルスである。カルスの培養
は、ムラシゲ（Murashige）＆スクーグ（Skoog）培地を
使用し、これに植物ホルモンとして、インドール酢酸
（1mg/l）とカイネチン（0.1mg/l）を添加した寒天培地
上で継代培養した。

芽の分化誘導の基本培地としては、ムラシゲ（Murash
ige）＆スクーグ（Skoog）培地に植物ホルモンであるイ
ンドール酢酸（1mg/l）とカイネチン（0.1mg/l）を加え
た寒天培地を使用した。

上記基本培地に対して、実施例１（１）で調製した微
細藻類培養濾液及び微細藻類抽出液を1.5％添加した培
地と無添加の培地を作製した。それぞれの培地に対し
て、継代培養されたカルスをカミソリの刃を用いて5mm
角の大きさに切断し、カルス切片を試験管中の寒天培地
に試験管１本に１個の割合で移植したものを各々25本用
意し14日間培養し、発生したシュートを観察した。その
結果を表−４に示す。

実施例５ セントポーリア葉柄からの植物体再生における微細藻
類抽出物の添加効果を調べた。

ナフタレン酢酸（1mg/l）とカイネチン（1mg/l）を含
むムラシゲ（Murashige）＆スクーグ（Skoog）培地を基
本培地とし、実施例１（１）で調製した微細藻類抽出物
を2.0％添加した培地と無添加の培地を作製した。それ
ぞれの300ml容の三角フラスコ中の寒天培地に5mm位に切
断したセントポーリア葉柄を置床し、置床後１週間は暗
所培養し、その後20℃、明条件（2000ルックス、16時間
照明）で30日間培養し、発生したシュート及び葉の状態
を観察した。その結果を表−５に示す。

（発明の効果） 本発明によれば、微細藻類培養濾液及び／又は微細藻
類抽出液を含む培地を用いて培養することによって、培
養細胞から直接効率良くシュート・根あるいは不定胚を
形成させ、更に、その不定胚の生長を効率良く行なわせ
ることができる。また同様に、植物組織からシュート・
根を効率良く形成させることもでき、従って最終的に植
物組織あるいは培養細胞から効率良く植物体を再生させ
ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅津 博紀 埼玉県草加市吉町４―１―８ ぺんてる 株式会社草加工場内 (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町２―41―13 府中第三 住宅２―304 審査官 郡山 順

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】植物組織培養を用いて植物組織あるいは培
   養細胞から植物体を再生させる際に、微細藻類培養濾液
   及び／又は微細藻類抽出物を含む培地により培養するこ
   と特徴とする植物体再生法。