JP2717664B2 - 植物組織培養法 - Google Patents

植物組織培養法

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

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【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は,植物組織培養法に関する。
[従来の技術] 一般に,植物組織培養においては,植物体の一部ある
いは全部を植物の生長に必要な無機塩類,ビタミン,糖
などのほかに植物ホルモン(オーキシン類,サイトカイ
ニン類)を加えたものを培地として,カルスをつくらせ
(これをカルス誘導あるいは脱分化という)たり,その
カルスを植え継いて培養を続け有用物質を得たり,又は
そのカルスから植物体を再生(復元)させたりしてい
る。植物体の再生では,カルスから不定胚を経る場合や
園芸植物をランなどのように植物体組織(一般的には生
長点と呼ばれる分裂のさかんな部分)からプロトコーム
状球体を経て植物を再生することなども行なわれてい
る。
[発明が解決しようとする問題点] 上述される植物組織培養において,インドール酢酸,
ナフトール酢酸,2・4−ジクロロフェノキシ酢酸などの
オーキシン類やカイネチン,ベンジルアデニン,ゼアチ
ンなどのサイトカイニン類といった種々の植物ホルモン
を相互に種々の割合で添加したり,カゼイン分解物や酵
母抽出液などを加えてカルスの増殖や分化(植物体の再
生を伴う形態的分化,有用物質を生産する代謝的分化)
を制御する試みがなされている。しかしながら,実際に
は増殖や分化の制御は困難であり,特に植物ホルモン類
は,添加量によって,増殖や分化を阻害するなどの問題
があった。
[問題点を解決するための手段] 本発明は,上述せる問題点に鑑みなされたもので,光
合成原核微生物培養濾液を含む培地により植物組織培養
をすることを特徴とする植物組織培養法を要旨とするも
のである。ここで植物組織培養には,(1)植物体培養
(全体培養),(2)胚培養,(3)器官培養,(4)
組織培養,カルス培養,(5)細胞培養がある。
本発明で利用できる光合成原核微生物としては,シア
ノバクテリア類(「R.Rippka and R.Y.Stanier:J.Gen.M
icobiol.,111,1−61(1979)」により種々分類されてい
る。)や光合成細菌類等がある。シアノバクテリア類と
しては,例えば,クロログレオフィシス属(Chlorogloe
opisis sp.),デルモカルパ属(Dermocarpa sp.),ノ
ストック属(Nostoc sp.),シネココッカス属(Synech
ococcus sp.),オスシラトリア属(Oscillatoria s
p.)があり,具体例としては,クロログレオフィシス属
(Chlorogloeopisis sp.)ATCC 27181,デルモカルパ属
(Dermocarpa sp.)ATCC 2937,ノストック属(Nostoc
sp.)ATCC 27895,シネココッカス属(Synechococcus s
p.)ATCC 27192,ATCC 29404,ATCC 29534,ATCC 2717
0,オスシラトリア属(Oscillatoria sp.)ATCC 27906
などが挙げられ,また,光合成細菌類としては,例え
ば,ハロバクテリウム属(Helobacteriumu sp.),ロド
シュードモナス属(Rhodopseudomonas sp.),ロドスピ
リラム属(Rhodospirillum sp.)があり,具体例として
は,ハロバクテリウム・クチルブルム(Halobacterium
cutirubrum)ATCC 33170,ハロバクテリウム・メディテ
ラネイ(Halobacterium mediterranei)ATCC 33500,ハ
ロバクテリウム・サッカルボルム(Halobacterium sacc
harovorum)ATCC 29252,ハロバクテリウム・サリナリ
ウム(Halobacterium salinarium)ATCC 19700,ハロバ
クテリウム・ソドメンセ(Halobacterium sodomense)A
TCC 33755,ロドシュードモナス・アシドフィラ(Rhodo
pseudomonas acidophila)ATCC 25092,ロドシュードモ
ナス・ルティラ(Rhodopseudomonas rutila)ATCC 338
72,ロドシュードモナス・スフェロイデス(Rhodopseudo
monas spheroides)ATCC 17024,ロドシュードモナス・
ビリディス(Rhodopseudomonas viridis)ATCC 19567,
ロドシュードモナス・ブラスティカ(Rhodopseudomonas
blastica)ATCC 33485,ロドスピリラム・モリシアナ
ム(Rhodospirillum molischianum)ATCC 14031,ロド
スピリラム・ホトメトリクム(Rhodospirillum photome
tricum)ATCC 27871,ロドスピリラム・ルブラム(Rhod
ospirillum rubrum)ATCC 277,ATCC 17031,ロドスピ
リラム・テヌエ(Rhodospirillum tenue)ATCC 25093
などが挙げられる。また,光合成原核微生物は,上述し
た微生物あるいはその変種や変異株に限ることなく,天
然から分離した海洋性,淡水性の光合成原核微生物も含
まれる。
光合成原核微生物の培養は,通常,無機塩類等を含む
培地を用い,タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外
開放培養で行ない得るが,本発明においては,目的とす
る光合成原核微生物が天然にある程度豊富に存在するな
らば、その微生物の生育存在する海水あるいは淡水を培
養液とすることができる。
上述のように得られた光合成原核微生物培養液は遠心
分離あるいは濾過などにより除菌され,光合成原核微生
物培養濾液が得られる。目的とする培養濾液の生物活性
が弱い場合は,前記濾液を減圧濃縮などにより濃縮後用
いてもかまわない。この際,濃縮倍率が大きく塩濃度が
高くなり植物組織に悪影響を与えるとき,電気透析など
で植物組織に影響がなくなるまで脱塩して使用するのが
望ましい。光合成原核微生物培養濾液の基本培地への添
加量は,0.001〜50%で使用目的,使用方法によって適宜
選択できるが,望ましくは0.01〜10%である。
以上述べた,光合成原核微生物培養濾液抽出物を基本
培地に添加し,その培地により植物組織培養をするので
あるが,基本培地,培養方法などは通常の植物組織培養
におけるものと同様である。すなわち基本培地として
は,ムラシゲ(Murashige)&スクーグ(Skoog)(196
2)の無機塩,微量成分,およびビタミン等を含む基本
的合成培地,あるいは植物組織培養に適した種々の改変
培地を適宜選択して使用できる。更に,通常の培養に使
用される植物ホルモン,ココナッツミルク,カゼイン分
解物や酵母抽出物等を目的に応じて併せて添加してもよ
い。
また,培養の対象となる植物は,分化全能性を有して
いることが知られている。すなわち外植体(植物体全体
又はそれらの一部)が培養可能である。また,前記した
植物体全体又はそれらの一部の初代培養あるいは継代培
養したものも培養可能である。特に,茎頂部,形成層,
若い胚軸等が好ましい。
[実施例] 以下,実施例によってさらに詳しく説明する。
実施例1 (I)ニンジン培養細胞の作製 ニンジンの無菌種子の芽ばえにおいて胚軸が10cm位に
生長したものを約1cm位に切断し,下記培地中で25℃,
暗条件下で培養した。培地は基本培地としてMurashige
& Skoog培地を使用し,これに3%,2・4−D1mg/
(オーキシン類)を添加しpH5.5〜pH5.7に調整した。約
1ヶ月の培養後,培地中の2・4−D濃度を0.11mg/
に減少させた培地に移植し,振盪速度90回/分のレシプ
ロ式シェーカーを用いて振盪培養した。その後,1週間に
1回の割合で,2・4−D0・11mg/を含む培地に植え継
いで生長の早いニンジン培養細胞を得た。
(II)光合成原核微生物培養濾液の作成 シアノバクテリア類としてシネココッカス属(Synech
ococcus sp.)ATCC 27192、ロドシュードモナス・ブラ
スティカ(Rhodopseudomonas blastica)ATCC 33485を
用いて作成した。
前記光合成原核微生物を培養後、培養液を遠心濾過し
濾液を得,エバポレイターで100倍に濃縮した。この濃
縮液をモザイク荷電膜脱塩器(デザルトン DS−103:東
ソー株式会社)で脱塩し,0.45μmのメンブランフィル
ターを用いて濾過し,得られた濾液を光合成原核微生物
培養濾液とした。
(III)ニンジン培養細胞の培養 (I)で作製したニンジン培養細胞を用いて培地に対
して(II)で得られた光合成原核微生物抽出液を培地に
対して1%添加した培地と,無添加の培地で12日培養し
た結果を表−1に示す。
p.38に準じて下記のように測定した。
セルラーゼ・オノズカR−102%,マルセロチームR
−101%,ドリセラーゼ2%,塩化カルシウム(CaCl2
2H2O)0.5%,マンニトール0.7Mを用いて,30℃,60分
間,振幅7cm,振盪回数90回/分で振盪し,次に50回/分
の振盪を90分間行ない,遊離してきたプロトプラストの
数を0.1mmの深さのヘモサイトメーターを用いて計測し
細胞を測定した。
実施例2 実施例1の(I)で作製したニンジン培養細胞は,形
態的分化を行ない,不定胚を形成することが知られてい
るが,その際における光合成原核微生物培養濾液の添加
による影響を調べた。
培地は実施例1の(I)で用いた培地において,植物
ホルモンである2・4−Dを含まない基本培地を用い
た。実施例1の(II)で作製された光合成原核微生物培
養濾液を培地に対して1%添加した培地と,無添加の培
地で温度25℃,暗条件下で30日間培養し形成された不定
胚について10日目,20日目,30日目に顕微鏡観察した結果
を表−2に示す。
実施例3 ラン科植物であるカトレアの生長点培養において,培
地中に実施例1の(II)で作製した光合成原核微生物培
養濾液を0.5%添加してプロトコール状球体(以下,「P
LB」と呼ぶ。)への影響について調べた。
材料は,カトレア類に属するレリオカトレア(Laelio
cattleya)の側芽の生長点付近の分裂組織から誘導され
たPLBである。PLB培養培地としては,ハイポネックス
(Hyponex;7−6−19)にジャガイモジュース7%,炭
素源としてショ糖2%を含むものを使用した。
初期誘導のPLBを15個まで増殖し,1個のPLBを4つに分
割し,分割された60個のPLBを調整した。
PLB培養培地に対して実施例1の(II)で作製した光
合成原核微生物培養濾液を0.5%添加した培地と,無添
加の培地で1ヶ月間培養した結果を表−3に示す。
実施例4 タバコのカルスからの植物体の再生において光合成原
核微生物培養濾液の添加による影響について調べた。
材料は,タバコ(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Ye
llow)の茎の髄組織由来のカルスである。カルスの培養
は,Murashige & Skoog培地を使用し,これに植物ホル
モンとして,インドール酢酸(1mg/)とカイネチン
(0.1mg/)を添加した寒天培地上で継代培養した。
芽の分化誘導の基本培地としては,Murashige & Skoo
g培地に植物ホルモンであるインドール酢酸(0.1mg/
)とカイネチン(1mg/)を加えた寒天培地を使用し
た。
上記基本培地に対して,実施例1の(II)で作製した
光合成原核微生物培養濾液を1.5%添加した培地と無添
加の培地を作製した。それぞれの培地に対して,継代培
養されたカルスをカミソリの刃を用いて5mm角の大きさ
に切断し,カルス切片を試験管1本に1個の割合で移植
したものを各25本用意し14日間培養した結果を表−4に
示す。
実施例5 ニンジン培養細胞β−カロチン産生株に対して,光合
成原核微生物培養濾液の添加による影響を調べた。
培地は,Murashige & Skoog培地を使用し,これにシ
ョ糖3%,2・4−D1mg/を添加し,pH5.5〜5.7に調整し
寒天を1%加えた寒天固体培地を基本倍地として使用し
た。
実施例1の(II)で作製した光合成原核微生物培養濾
液を基本培地に対して1%添加した培地と,無添加の培
地で温度25℃,暗条件下で50日間培養し細胞内に蓄積さ
れたβ−カロチン量を測定した。β−カロチン量は,培
養細胞の生重量を測定後,乳鉢中で細胞を破砕し,少量
のアセトンを加えてβ−カロチンを抽出し,3mlの石油エ
ーテルを加え,石油エーテル層中にβ−カロチンを移行
させ,分光光度計を用いて,石油エーテル層の453nmの
吸光度を測定し,培養細胞内に蓄積されたβ−カロチン
量を算出した。その結果を表−5に示す。
[発明の効果] 本発明によれば,植物組織培養において,光合成原核
微生物培養濾液を添加することにより,細胞の増殖およ
び分化を促進し効率よく培養を行なうことができ,か
つ,合成植物ホルモンの悪影響を極力おさえるための処
置法となることができる。従って,植物を一定の条件下
で培養し,その器官,組織及び細胞を目的に応じる形態
に誘導でき,有用物質産生細胞の産生能を向上させるこ
とができる。あるいは,細胞の生長(増殖)を促進する
効果を併せ持つ為,有用物質産生細胞の大量作出を容易
に行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅津 博紀 埼玉県草加市吉町4―1―8 ぺんてる 株式会社草加工場内 (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町2―41―13 府中第三 住宅2―304 審査官 種村 慈樹 (56)参考文献 特開 昭57−65178(JP,A) Enzyme microl.Tec hnol.,vol.8(1986)P. 386−394 Fiziol.Rast.,vol. 32,no.6(1985)P.1158−1165 hzv,akad,nauk,SSS R Ser,Biol.,vol.o, no,5(1985)p.645−651

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】光合成原核微生物培養濾液を含む培地によ
    り植物組織培養をすることを特徴とする植物組織培養
    法。
  2. 【請求項2】光合成原核微生物はシアノバクテリア類又
    は光合成細菌類である特許請求の範囲第1項記載の植物
    組織培養法。
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Fiziol.Rast.,vol.32,no.6(1985)P.1158−1165
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