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Die Erfindung betrifft ein synthetisches Saatgut; insbesondere
betrifft die Erfindung ein synthetisches Saatgut mit einem
Pflanzenregenerationsgewebe, das in einem synthetischen Eiweiß
und einer synthetischen Membran eingebettet und eingeschlossen
ist, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Eiweiß ein
Kulturfiltrat und/oder einen Extrakt aus einem
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus darin enthält.
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Bei der Kultivierung von Pflanzengewebe werden allgemein ein
Gewebe oder ein Organ einer Pflanze, ein Teil hiervon oder
kultivierte Zellen unter Verwendung eines Mediums kultiviert, das
ein Pflanzenhormon (wie Auxin, Cytokinin, Gibberellin, Ethylen
usw.) zusätzlich zu den Nährstoffen enthält, die für das
Wachstum von Pflanzen essentiell sind (wie anorganische Salze,
Vitamine, Zucker usw.), um Kallusse zu bilden, die anschließend
mehrere Generationen lang kultiviert werden, wodurch eine
nutzbare Substanz produziert wird, oder der ursprüngliche
Pflanzenkörper hieraus regeneriert wird.
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Verfahren zur Regenerierung eines Pflanzenkörpers durch
Pflanzengewebekulturtechnologie können in zwei Arten klassifiziert
werden, d. h. Differenzierung und Entdifferenzierung,
entsprechend der Art des verwendeten Ausgangsmaterials. Das Verfahren
der Entdifferenzierung regeneriert einen Pflanzenkörper über
den entdifferenzierten Zustand der Kallusse oder der
flüssigkultivierten Zellen. Typische Beispiele umfassen das Verfahren
zur Entwicklung vieler Sprosse aus Cluster-Kallussen und die
Entwicklung von Wurzeln aus jedem Sproß (shoot), wodurch ein
juveniler Pflanzenkörper regeneriert wird, und das Verfahren
der direkten Bildung von Adventivembryos (somatischen Embryos)
in Zellen, wodurch ein juveniler Pflanzenkörper regeneriert
wird. Es ist bekannt, daß, wenn ein Pflanzenkörper über
Adventivembryos regeneriert wird, die Embryos zu kugelförmigen,
herzförmigen, torpedoförmigen und reifen Embryos, in dieser
Reihenfolge, wachsen. Andererseits verwenden die Verfahren zur
Differenzierung als Ausgangsmaterial Sproßspitzen, ruhende
Keime, laterale Keime, Embryos und Keimlinge, die
Wachstumspunkte enthalten, und ebenso Hypocotyle, Cotyledonen und
Stämme, die keinen Wachstumspunkt enthalten. Ein typisches Beispiel
ist das Verfahren, das die Entwicklung mehrerer Sprosse aus den
oben genannten Pflanzengeweben, das Abschneiden dieser mehreren
Sprossen, das Entwickeln mehrerer Sprosse aus den oben
genannten Pflanzengeweben, das Abschneiden dieser mehreren Sprosse,
das Entwickeln mehrerer Sprosse aus jedem derart erhaltenen
einzelnen Sproß und schließlich das Entwickeln von Wurzeln aus
jedem der abgeschnittenen Sprosse umfaßt, wodurch ein juveniler
Pflanzenkörper regeneriert wird.
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Bei der Regenerierung eines Pflanzenkörpers durch
Entdifferenzierung neigt die Zellkultivierung für mehrere Generationen
über einen langen Zeitraum dazu, die Fähigkeit zur
Differenzierung zu verringern, was zu einer verringerten Bildungsrate von
Adventivembryos aus kultivierten Zellen und einer verringerten
Bildungsrate von Sprossen und Wurzeln aus Kallussen führt. Wenn
Adventivembryos künstlich abgeleitet werden, ist es allgemein
üblich, die Art, die Konzentration und die Kombination von
Pflanzenhormonen (wie Auxin und Cytokinin), die zum
Kulturmedium zugegeben werden, von der Zusammensetzung der anorganischen
Salze ganz zu schweigen, zu untersuchen. Es gibt jedoch viele
Arten von Pflanzen, bei denen die Bildung von Adventivembryos
und die Bildung von Sprossen und Wurzeln aus Kallussen durch
die bloße Behandlung mit Auxin oder Cytokinin nicht erwartet
werden können. Insbesondere Adventivembryos tendieren dazu, ihr
Wachstum auf der Stufe der Torpedoform einzustellen, wodurch
die Redifferenzierungsrate des Pflanzenkörpers signifikant
verringert wird. Auch bei der Regenerierung eines
Pflanzenkörpers durch Differenzierung wurden Untersuchungen durchgeführt,
die die Art, die Konzentration und die Kombination von
Pflanzenhormonen (wie Auxin und Cytokinin), von anorganischen Salzen
und organischen Spurenelementen, die zum Kulturmedium zugegeben
werden, betrafen; es sind jedoch Fälle bekannt, bei denen keine
Bildung von Sprossen und Wurzeln beobachtet wurde, wobei dies
von der Pflanzenart und von der Gewebeart abhängt. Sowohl bei
der Differenzierung als auch bei der Entdifferenzierung hemmt
die Verwendung von Pflanzenhormonen in einigen Fällen das
Wachstum und die Differenzierung, in Abhängigkeit von der Art
und von der zugegebenen Menge des Hormons. Demnach bestand ein
Bedürfnis für ein verbessertes Verfahren, das die Bildungsrate
von Adventivembryos aus verschiedenen Pflanzengeweben, Organen
oder kultivierten Zellen erhöht, und das das Wachstum von
Adventivembryos und die Regenerierung eines Pflanzenkörpers
wirksam beschleunigt.
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Natürliche organische Verbindungen, die von Pflanzen produziert
werden, beispielsweise Alkaloide, Terpenoide und verschiedene
Pigmente, werden seit langem in großem Umfang als Arzneimittel
und Nahrungsmittel eingesetzt. Um diese nützlichen Substanzen
zu erhalten, machte man sich lange Zeit die Extraktion aus
natürlich gewachsenen oder kultivierten Pflanzen zu eigen; dies
ist jedoch kein effizientes Verfahren, um eine große Menge der
nützlichen Substanzen zu erhalten, da die Masse und die Natur
der Pflanzen stark von den natürlichen Bedingungen beeinflußt
werden und viel Arbeit und Zeit erforderlich sind, um die
Pflanzen zu ernten. In den vergangenen Jahren werden die
planmäßige und stabile Produktion dieser nützlichen Substanzen
durch Massenkultivierung von Pflanzenzellen, basierend auf der
Pflanzengewebekulturtechnologie, durchgeführt. Bei der
Durchführung dieses neuen Verfahrens ist es erforderlich,
kultivierte Zellen, die eine nützliche Substanz enthalten, schnell
wachsen
zu lassen. Es sind jedoch tatsächlich viele Fälle bekannt,
in denen überhaupt keine nützlichen Substanzen produziert
werden oder die Menge der Produkte sehr gering ist, und zwar in
Abhängigkeit von der verwendeten Zusammensetzung des
Kulturmediums. Demnach besteht in derartigen Fällen ein Bedürfnis für
ein verbessertes Verfahren, das die Produktion nützlicher
Substanzen beschleunigt.
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Weiterhin wurde ein verstärktes Augenmerk auf die Entwicklung
synthetischer Samen als ein Verfahren zur Kultivierung von
geklonten Pflanzen in großen Mengen durch die
Pflanzengewebekulturtechnologie gerichtet, und mit verschiedenen Arten von
Pflanzen, beispielsweise Gemüse- und Reispflanzen, wurden
praktische Anwendungen versucht. Synthetische Samen umfassen
pflanzenregenerierende Gewebe wie Adventivkeime oder -embryos, die
in einem synthetischen Eiweiß und in einer synthetischen
Membran eingebettet und umschlossen sind. Das synthetische Eiweiß
umfaßt Substanzen, die das pflanzenregenerierende Gewebe mit
Nahrung versorgen und die Keimung regulieren. Calciumalginat
wird z. Zt. als das beste Material für die synthetische Membran
angesehen. Es wurde jedoch auch die Verwendung vieler anderer
polymerer gelatierender Mittel untersucht. Um die Keimungsrate
in einem derartigen synthetischen Samen zu erhöhen, wurde
ebenfalls die Zugabe von Abscisinsäure (ein Pflanzenhormon) zum
synthetischen Eiweiß beschrieben. Es wird jedoch nicht immer
eine Zunahme in der Keimungsrate beobachtet, da die Auflösung
und die Diffusion dieser Säure in Wasser eine lange Zeit
benötigen. Weiterhin wurde ebenfalls eine Technik zur Zugabe eines
Zuckers oder einer ähnlichen Verbindung in einer hohen
Konzentration zum synthetischen Eiweiß vorgeschlagen; diese
Vorgehensweise fördert jedoch die Proliferation unerwünschter
Bakterien und hemmt in einigen Fällen das Wachstum von Pflanzen.
Vgl. beispielsweise Redenbaugh, K., et al., Bio/Technology, 4,
797-801, (1986). Demnach würden die praktischen Verwendungen
von synthetischen Samen weiter gefördert werden, falls das
Wachstum von pflanzenregenerierenden Geweben wie von
Adventivembryos in synthetischen Samen beschleunigt werden könnte, um
die Keimungsrate zu erhöhen.
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Weiterhin wird auf die US-A-4 583 320 verwiesen, die dem
Oberbegriff des Anspruchs 1 entspricht und die ein synthetisches
Saatgut bzw. einen synthetischen Samen offenbart, bei dem ein
Pflanzenregenerationsgewebe oder ein Meristemgewebe mit
vorteilhaften Hilfsmitteln, beispielsweise Pestiziden,
Düngemitteln, Nährstoffen, Energiequellen oder Mikroorganismen,
kombiniert wird und in einem Einschlußmedium oder einem
Gelierungsmittel eingeschlossen wird. Beispielhaft wird als
Einschlußmedium Natriumalginat genannt, und die dispergierten
Hilfsmittel und das Pflanzenregenerationsgewebe in der
Natriumalginatlösung können tropfenweise zu einem
Komplexierungsmittel, beispielsweise Calciumchlorid, unter Bildung von
Gel-Tröpfchen hinzugegeben werden. Beispielhaft werden
Cyanobakterien als Mikroorganismen für nützliche Hilfsmittel
genannt. In diesem synthetischen Saatgut werden die
Cyanobakterien jedoch als stickstoff-fixierende Bakterien verwendet, die
Stickstoff aus der Atmosphäre sammeln und zu
Stickstoffverbindungen umwandeln, die vom Regenerationsgewebe und dem so
erhaltenen Pflanzenkörper verwendet werden. Deshalb muß es sich bei
den in derartigem synthetischen Samen enthaltenen
Cyanobakterien um lebende Zellen handeln.
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Wie oben beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung ein
synthetisches Saatgut, das eine erhöhte Keimungsrate aufweist
und das ein Pflanzenregenerationsgewebe, beispielsweise einen
Adventivembryo, aufweist, das in einem synthetischen Eiweiß und
einer synthetischen Membran eingebettet und umschlossen
vorliegt. Das synthetische Eiweiß enthält darin ein Kulturfiltrat
und/oder einen Extrakt eines photosynthetischen prokaryotischen
Mikroorganismus.
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Bevorzugt enthält das synthetische Eiweiß eine hochmolekulare
Fraktion oder eine niedermolekulare Fraktion, die vom
Kulturfiltrat und/oder vom Extrakt des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus umfaßt wird.
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Der photosynthetische prokaryotische Mikroorganismus ist
bevorzugt ein Cyanobakterienstamm oder ein Stamm
photosynthetischer Bakterien.
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Als Beispiele für photosynthetische prokaryotische
Mikroorganismen können die Stämme von Cyanobakterien [wie sie von
R. Rippka und R.Y. Stanier, J. Gen. Microbiol., 111, 1-61
(1979) klassifiziert wurden] und photosynthetische Bakterien
genannt werden.
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Beispiele für Cyanobakterien umfassen Chlorogloeopisis sp.,
Dermocarpa sp., Nostoc sp., Synechococcus sp., Oscillatoria sp.
und ähnliche Arten. Beispiele, die diese Bakterien
veranschaulichen, umfassen Chlorogloeopisis sp. ATCC 27181, Dermocarpa
sp. ATCC 29371, Nostoc sp. ATCC 27895, Synechococcus sp. ATCC
27192, ATCC 29404, ATCC 29534 und ATCC 27170, und Oscillatoria
sp. ATCC 27906.
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Beispiele für photosynthetische Bakterien umfassen
Halobacterium sp., Rhodopseudomonas sp., Rhodospirillum sp. und ähnliche
Arten. Beispiele, die diese Bakterien veranschaulichen,
umfassen H. cutirubrum ATCC 33170, H. mediterranei ATCC 33500, H.
saccharovorum ATCC 29252, H. salinarium ATCC 19700, H.
sodomense ATCC 33755, R. acidophila ATCC 25092, R. rutila ATCC 33872,
R. spheroides ATCC 17024, R. viridis ATCC 19567, R. blastica
ATCC 33485, R. molischianum ATCC 14031, R. photometricum ATCC
27871, R. rubrum ATCC 277 und ATCC 17031, und R. tenue ATCC
25093.
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Zusätzlich zu den oben genannten Mikroorganismen können
erfindungsgemäß auch Varianten und Mutanten hiervon und verschiedene
photosynthetische prokaryotische Mikroorganismen, die aus der
Natur isoliert wurden, z. B. aus Salzwasser- oder
Frischwasserquellen, ebenfalls verwendet werden.
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Die photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismen können
unter Verwendung eines Mediums, das anorganische Salze und
andere Nährstoffe enthält, in einem Behälter kultiviert werden,
oder außerhalb unter Verwendung von Sonnenlicht, um hierdurch
eine Kulturlösung zu erhalten. Falls die Mikroorganismen
reichlich in der Natur vorkommen, kann die Salzwasser- oder
Frischwasserquelle, die die Mikroorganismen enthält, als Kulturlösung
verwendet werden.
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Das Kulturfiltrat des photosynthetischen Mikroorganismus kann
durch Filtration oder durch Zentrifugation der Kulturlösung,
die durch das oben genannte Kultivierungsverfahren erhalten
wurde, erhalten werden. Wenn die biologische Aktivität des so
erhaltenen Kulturfiltrats zu gering ist, kann es unter
verringertem Druck konzentriert werden. Wenn die Salzkonzentration im
konzentrierten Kulturfiltrat zu hoch wird, wird
bevorzugterweise das konzentrierte Kulturfiltrat nach der Entsalzung-
verwendet, bis kein nachteiliger Einfluß auf die Pflanzengewebe mehr
beobachtbar ist.
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Der Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen
Mikroorganismus wird dadurch erhalten, daß die Mikrobenzellen oder die
in geeigneter Weise zerstörten Mikrobenzellen mit einem
geeigneten Lösungsmittel bei Umgebungstemperatur oder bei einer
erhöhten Temperatur in Kontakt gebracht werden. Es kann ein
einzelnes Lösungsmittel oder eine Kombination von
Lösungsmitteln verwendet werden, und es kann in Abhängigkeit des Falles
ausgewählt werden; im allgemeinen werden jedoch wäßrige
Lösungsmittel bevorzugt. Typische Beispiele für derartige
wäßrige
Lösungsmittel umfassen Wasser und wäßrige Lösungen von
Säuren, Basen, Salzen und organischen Lösungsmitteln. Die
Mikrobenzellen können mit einem organischen Lösungsmittel wie
Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Ether und ähnlichen
Verbindungen extrahiert werden, gefolgt von der Entfernung des
Lösungsmittels und der Auflösung des Rückstandes in Wasser. In der
vorliegenden Erfindung kann ein wie oben hergestellter
Extrakt, eine Fraktion, die aus dem Extrakt erhalten wurde,
oder eine in geeigneter Weise konzentrierte oder verdünnte
Lösung verwendet werden, die aus dem Extrakt oder der Fraktion
erhalten wurde. Weiterhin kann ein Pulver, das dadurch erhalten
wurde, daß der Extrakt oder die Fraktion einer Vakuumtrocknung,
einer Gefriertrocknung oder einer Sprühtrocknung unterzogen
wurde, verwendet werden. Eine Fraktion mit einer hohen
Aktivität kann aus dem Extrakt dadurch erhalten werden, daß er einer
Dialyse, einer Gelfiltration, einer Ultrafiltration oder einem
anderen Reinigungsverfahren unterworfen wird, das gereinigte
Produkt auf der Basis des Molekulargewichts fraktioniert wird
und eine aktive Fraktion ausgewählt wird.
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Es wurde gefunden, daß basische Substanzen, die aus dem oben
genannten Kulturfiltrat oder Extrakt photosynthetischer
prokaryotischer Mikroorganismen durch Fraktionierung unter
Verwendung eines organischen Lösungsmittels isoliert wurden, eine
besonders hohe biologische Aktivität aufweisen. Dieser
Fraktioniervorgang kann auf der Grundlage der Theorie und des
Verfahrens durchgeführt werden, die auf den S. 25-31 in "Isolation
and Purification of Substances" (herausgegeben 1976 von der
University of Tokyo Press) beschrieben wurden. Bei der normalen
Vorgehensweise in diesem Verfahren wird eine wäßrige Lösung
einer Probe auf pH 3 durch Zugabe einer Säure, beispielsweise
von Salzsäure, eingestellt und anschließend mit einem
geeigneten organischen Lösungsmittel behandelt, um die sauren
Substanzen zu extrahieren und zu entfernen. Die Extraktion kann jedoch
bei verschiedenen pH-Werten und unter anderen Bedingungen
durchgeführt werden. Als Lösungsmittel werden häufig Ethanol,
Chloroform, Ethylacetat, Butanol und ähnliche Verbindungen
verwendet; es sind jedoch auch viele andere Lösungsmittel
verwendbar. Die Fraktion aus basischen Substanzen, die oben
erhalten wurde, kann ebenfalls vom Lösungsmittel befreit werden,
gefolgt von einer Auflösung in Wasser zur Verwendung.
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Die wirksame Menge des Kulturfiltrats und/oder des Extrakts des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus, der zu
einem Grundmedium für die Pflanzengewebekultur zugegeben wird,
kann mit der Art des verwendeten Mikroorganismus, den
Kulturbedingungen, der Konzentration des Extraktes und anderen
unbestimmten Faktoren (wie den Veränderungen in der
Rückgewinnungsrate des aktiven Bestandteiles und im Volumen der Lösung nach
dem Fraktionierschritt) variieren; sie kann jedoch leicht durch
Versuche bestimmt werden. Wenn beispielsweise Synechococcus sp.
ATCC 27192 oder Rhodopseudomonas blastica ATCC 33485 als
photosynthetischer prokaryotischer Mikroorganismus verwendet wird,
kann ein um das 100fache konzentriertes Kulturfiltrat oder ein
Extrakt, hergestellt durch Extrahieren von 3 g getrockneter
Mikrobenzellen mit 100 ml des Extraktionslösungsmittels, zum
Grundmedium auf eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 20%
zugegeben werden. Höhere Konzentrationen können in einigen
Fällen verringerte Wirkungen ergeben.
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Die grundlegenden Kulturmedien und Kultivierungsverfahren, die
üblicherweise für die herkömmliche Pflanzengewebekultur
verwendet werden, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung
angewandt werden. Das Medium von Murashige und Skoog (1962) (im
folgenden als "MS-Medium" abgekürzt) kann als typisches
Grundmedium verwendet werden; von Fall zu Fall können jedoch auch
viele andere Medien verwendet werden, die zur Pflanzenkultur
geeignet sind, wobei auch Modifikationen dieser Medien
verwendbar sind. Zusätzlich zum Kulturfiltrat oder zum Extrakt des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus können auch
Pflanzenhormone, Kokosnußmilch, Casein-Abbauprodukte und
Hefeextrakt, die bei der herkömmlichen Kultivierung verwendet
werden, erforderlichenfalls zum Medium zugegeben werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf beliebige Pflanzenarten
angewandt werden, die totipotent sind und eine Gewebekultur
zulassen. Gewebe, Organe, Teile hiervon oder kultivierte Zellen
dieser Pflanzen können einer Kultivierung unterworfen werden,
und erfindungsgemäß können auch solche verwendet werden, die
einer Primärkultur oder einer Passagenkultur unterzogen wurden.
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Die nachfolgenden Beispiele werden die Erfindung weiter
veranschaulichen. In den Beispielen bedeutet die Beschreibung "%"
"% w/v".
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Die Herstellung von Karottenkulturzellen, Kultivierung ihrer
Adventivembryos und die Herstellung des Kulturfiltrats und des
Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus
wurden wie unten beschrieben ausgeführt.
(1) Herstellung von Karottenkulturzellen und Kultivierung
ihrer Adventivembryos:
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Hypocotyle, die aus sterilen Samen der Karotte (Daucus carota
L. cv. Kurodagosun) bis zu einer Länge von etwa 10 cm wuchsen,
wurden in Stücke von etwa 1 cm Länge geschnitten, und diese
Stücke wurden in einem modifizierten MS-Medium (MS-Medium mit
3% Sucrose und 1 mg/l 2,4-D (2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, die
eine Art von Auxin ist), die hierzu zugegeben wurden, pH 5,5
bis 5,7) bei 25ºC unter Dunkelbedingungen kultiviert. Nach der
Kultivierung für etwa einen Monat wurden die kultivierten Gewebe
auf ein neues Medium übertragen, das 2,4-D in einer
verringerten Konzentration von 0,11 mg/l enthielt, und einer
Schüttelkultur unter Verwendung eines Schüttelapparates, der sich 90
mal pro Minute vor- und zurückbewegte, unterworfen.
Anschließend
wurde die Überführung in ein neues Medium, das 0,11 mg/l
2,4-D enthielt, in einwöchigen Intervallen wiederholt, um
Karottenkulturzellen herzustellen.
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Es ist bekannt, daß kultivierte Karottenzellen in der Lage
sind, durch morphologische Differenzierung Adventivembryos zu
bilden. Demnach wurden die oben erhaltenen kultivierten Zellen
in MS-Medium (Grundmedium, enthaltend kein 2,4-D) kultiviert,
um Adventivembryos herzustellen.
II) Herstellung von Kulturfiltrat und Extrakt aus einem
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus:
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Synechococcus sp. ATCC 27192 wurde als Cyanobakterienstamm und
Rhodopseudomonas blastica ATCC 33485 wurde als
photosynthetischer Mikroorganismusstamm verwendet. Jeder dieser zwei Stämme
wurde unter den Bedingungen, die von der American Type Culture
Collection angegeben waren, kultiviert; die so entstandene
Kulturlösung wurde einer Zentrifugalfiltration unterzogen, und das
Filtrat wurde unter Verwendung eines Verdampfers auf das
100fache konzentriert. Das Konzentrat wurde anschließend in einem
Entsalzer vom mosaikbeschickten Membrantyp entsalzt (Desaltion
DS-103; Tosoh Co., Ltd.), gefolgt von einer Filtration durch
einen 0,45 µm-Membranfilter; anschließend wurde das so
erhaltene Filtrat als Kulturfiltrat des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus verwendet. Getrennt wurden Mikrobenzellen
aus der oben erhaltenen Kulturlösung gesammelt,
gefriergetrocknet und in Wasser auf eine Konzentration von 3% suspendiert.
Diese Suspension wurde bei 100ºC 60 Min. lang erhitzt, um die
Extraktion zu bewirken, und sie wurde anschließend
zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde über ein 0,45
µm-Membranfilter filtriert, und das so erhaltene Substrat wurde als
Extrakt eines photosynthetischen prokaryotischen
Mikroorganismus verwendet.
Beispiel 1:
Proliferierung von kultivierten Karottenzellen
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Die oben in (I) hergestellten kultivierten Karottenzellen
wurden in einer Schüttelkultur bei 25ºC unter Dunkelbedingungen
für 12 Tage in MS-Medium, enthaltend 3% Sucrose und 0,11 mg/l
2,4-D, und in einem modifizierten Medium hiervon (weiterhin
enthaltend 1% des oben (II) hergestellten Extrakts des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus) kultiviert, und
die Zahl der gewachsenen Zellen wurde bestimmt. Das Ergebnis
ist in der Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Additiv Zahl der Zellen pro ml* am 6. Tag am 12. Tag Keines Cyanobakterien Photosynthetische Bakterien Anmerkung *¹: Die Zahl der Zellen wurde wie unten beschrieben gemäß dem auf S. 38 in "Technology of Plant Tissue Culture" (1983; Takeuchi, Nakajima und Furuya; Asakura-shoten) beschriebenen Verfahren bestimmt.
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Das Schütteln wurde bei 30ºC 60 Min. lang (Amplitude: 7 cm;
Schüttelfrequenz: 90 pro Min.) unter Verwendung von 2%
Cellulase Onozuka R-10, 1% Macerozym R-10, 2% Driselase, 0,5%
CaCl&sub2;·2H&sub2;O und 0,7 M Mannitol fortgeführt, mit nachfolgendem
Schütteln bei einer Schüttelfrequenz von 50 pro Min. für 90
Min., und die Zahl der freigesetzten Protoplasten wurde unter
Verwendung eines Hämocytometers mit einer Tiefe von 0,1 mm
bestimmt.
Beispiel 2:
Regenerierung des Pflanzenkörpers aus
kultivierten Karottenzellen
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Die oben in (I) hergestellten kultivierten Karottenzellen
wurden bei 25ºC unter Dunkelbedingungen für 30 Tage in MS-Medium,
enthaltend 3% Sucrose, und in einem modifizierten Medium
hiervon (weiter enthaltend 1% des oben in (II) hergestellten
Kulturfiltrats oder des Extrakts des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus) in einer Schüttelkultur kultiviert,
und die so erhaltenen Adventivembryos wurden am 10., 20. und
30. Tag kontrolliert. Das Ergebnis ist in der Tabelle 2
angegeben.
Tabelle 2
Additiv Bildungsrate von Adventivembryos Keimungs- und Wurzelungsbedingungen Kulturperiode (Tage) am 10. Tage am 20. Tage am 30. Tage Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Anmerkungen: *² Bildungsrate von Adventivembryos: die Zahl der Adventivembryos, dividiert durch die Zahl der Gesamtzellen oder der Zellaggregate. *³ Erklärung der Symbole: o: morphologische Veränderungen der Adventivembryos (Keimung und Wurzelung) und das Wachstum waren je schnell. X: Es wurde keine schnelle morphologische Veränderung der Adventivembryos beobachtet.
Beispiel 3:
Regenerierung des Pflanzenkörpers von
Adventivembryos der Karotte
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Die oben in (I) hergestellten Adventivembryos wurden unter
Verwendung von 148 µm- und 200 µm-Nylonsieben ausgewählt, und die
so ausgewählten Proben (kugelförmige bis torpedoförmige
Embryos) mit einer Größe von 148 bis 200 µm wurden in diesem
Beispiel verwendet. Diese Adventivembryos wurden einer
Schüttelkultur bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 16
Stunden) über einen Zeitraum von 30 Tagen in MS-Medium, das kein
Pflanzenhormon enthielt, und in einem modifizierten Medium
hiervon (enthaltend 1,5% des oben in (II) hergestellten
Kulturfiltrats oder des Extrakts des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus), unterzogen und die Beschaffenheit der
entstandenen Adventivembryos wurde untersucht. Das Ergebnis ist
in der Tabelle 3(1) angegeben.
Tabelle 3(1)
Additiv Beschaffenheit der Adventivembryos kultiviert für 30 Tage)*&sup4; Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Anmerkung *&sup4;, Erklärung der Symbole: X: Es wurde kaum ein Wachstum der Embryos beobachtet. : Es wurde innerhalb des obigen Zeitraums keine Regenerierung des Pflanzenkörpers beobachtet, obwohl ein Wachstum der Embryos beobachtet wurde. : Es wurde eine Regenerierung des Pflanzenkörpers bis zu den reifen Embryos hin beobachtet.
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Weiterhin wurden, wie unten beschrieben wird, die Wirkungen der
Fraktionen mit dem hohen Molekulargewicht und mit dem niedrigen
Molekulargewicht, die im Kulturfiltrat und im Extrakt des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthalten sind,
auf die Regenerierung des Pflanzenkörpers untersucht. Das
Kulturfiltrat und der Extrakt des oben in (II) hergestellten
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus (je 50 ml)
wurden gegen 1 l destilliertes Wasser durch ein Celluloserohr
zur Dialyse ("Cellulose Tube 30/32" der Fa. VISKASE Inc.)
dialysiert, und das so erhaltene Dialysat wurde als die Fraktion
mit dem hohen Molekulargewicht verwendet, während die
Außenlösung (die Lösung, die durch das Celluloserohr nach außen
diffundierte) unter reduziertem Druck auf 50 ml konzentriert
wurde, und das so erhaltene Konzentrat wurde als die Fraktion
mit dem niedrigen Molekulargewicht verwendet. Andererseits
wurden die oben in (I) hergestellten Adventivembryos unter
Verwendung von 425 µm- und 800 µm-Nylonsieben ausgewählt. Die
so erhaltenen Proben mit einer Größe von 425 µm bis 800 µm
wurden einer Schüttelkultur bei 25ºC unter hellen Bedingungen
(2000 lux · 16 Std.) über einen Zeitraum von 10 Tagen in MS-
Medium, enthaltend kein Pflanzenhormon, und in einem
modifizierten Medium hiervon, enthaltend 200 µg/ml der Fraktion mit
dem hohen Molekulargewicht oder der Fraktion mit dem niedrigen
Molekulargewicht, die im Kulturfiltrat oder im Extrakt des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthalten
waren, unterzogen, und die Regenerierungszustände des
Pflanzenkörpers wurden beobachtet. Das Ergebnis ist in der Tabelle 3(2)
angegeben.
Tabelle 3(2)
Additiv Gesamtzahl der Embryos Unreife Pflanze Reife Pflanze Zahl Menge (%) Keines Cyanobakterien - Extrakt Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion - Kulturfiltrat - Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion Photosynthetische Bakterien - Extrakt Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion - Kulturfiltrat Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion
Beispiel 4:
Regenerierung des Pflanzenkörpers von
protocormähnlichen Körpern von Cattleya
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Das in diesem Beispiel verwendete Ausgangsmaterial sind
protocorm-ähnliche Körper (im folgenden als PLBs = protocorm-like
bodies abgekürzt), die aus dem meristematischen Gewebe nahe am
Wachstumspunkt der lateralen Keime von Laeliocattleya stammen,
und zur Kultivierung der PLBs wurde ein Medium verwendet, das
Hyponex (6.5-6-19), 7% Kartoffelsaft und 2% Sucrose als
Kohlenstoffquelle enthielt.
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Reife PLBs wurden nach ihrer frühen Kultur ausgewählt, und
jeder der ausgewählten PLBs wurde in vier Teile geschnitten,
wodurch PLB-Proben hergestellt wurden.
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Die PLB-Proben wurden bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000
lux · 16 Std.) über einen Zeitraum von 60 Tagen auf einem
Agarmedium, das das Medium zur Kultivierung der PLBs enthält, und
auf einem hiervon modifizierten Agarmedium (weiterhin
enthaltend 0,5% des oben in (II) hergestellten Kulturfiltrats oder
des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen
Mikroorganismus) kultiviert. Die Beschaffenheit der PLBs auf diesen
Agarmedien wurde nach 40 Tagen untersucht, und die Zahl der
gewachsenen PLBs und die Zahl der Sprossen, die hiervon
ausgingen, wurden nach 60 Tagen untersucht. Das Ergebnis ist in
der Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
Additiv Beschaffenheit nach 40 Tagen (pro 50 angesetzten PLBs) Zahl der toten PLBs Zahl der gewachsenen PLBs Gesamtzahl der PLBs (nach 60 Tagen) Gesamtzahl der PLBs Zahl der PLBs mit Sprossen Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt
Beispiel 5:
Regenerierung des Pflanzenkörpers aus
Tabakkallussen
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Das in diesem Beispiel verwendete Ausgangsmaterial sind
Kallusse, die aus den caulinen Markgeweben von Nicotiana tabacum L.
cv. Bright Yellow stammen. Die Kallusse wurden auf einem
Agarmedium aus MS-Medium, enthaltend 1 mg/l Indolessigsäure und 0,1
mg/l Kinetin, einer Passagenkultur unterzogen.
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Es wurde eine Vielzahl an Teströhrchen hergestellt, wobei jedes
der Teströhrchen das gleiche Agarmedium erhielt, das in der
Passagenkultur oder in einem hiervon modifizierten Agarmedium
(weiterhin enthaltend 1,5% des oben in (II) hergestellten
Kulturfiltrats oder Extrakts des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus) verwendet wird. Von jeder Medienart
wurden 25 Teströhrchen hergestellt. Die der Passagenkultur
unterzogenen Kallusse wurden unter Verwendung einer
Rasierklinge in 5 mm² große Stücke geschnitten. Jedes geschnittene Stück
wurde in den jeweiligen Teströhrchen auf das Agarmedium
gegeben, und bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 16 Std.)
über einen Zeitraum von 14 Tagen kultiviert. Anschließend wurde
die Bildung von Sprossen untersucht. Das Ergebnis ist in der
Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5
Additiv Zahl der verwendeten Callusse Zahl der gebildeten Sprosse Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt
Beispiel 6:
Regenerierung des Pflanzenkörpers von Afrikanischen
violetten (Saintpaulia ionatha) Petiolen
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MS-Medium, enthaltend 1 mg/l Naphtalinessigsäure und 1 mg/l
Kinetin und ein modifiziertes Medium hiervon (weiterhin
enthaltend 2,0% des oben in (II) hergestellten Extrakts des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus), wurde hergestellt.
Saintpaulia-Petiolen wurden in etwa 5 mm lange Stücke
geschnitten. Jedes geschnittene Stück wurde auf ein Agarmedium eines
jeden der obigen Medien gegeben und in einen 300 ml-Erlenmeyer-
Kolben gegeben und unter dunklen Bedingungen eine Woche lang
kultiviert und anschließend bei 20ºC 30 Tage unter hellen
Bedingungen (2000 lux · 16 Std.) kultiviert; die Beschaffenheit
der gebildeten Sprosse und Blätter wurden untersucht. Das
Ergebnis ist in der Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6
Additiv Beschaffenheit der Sproßbildung Zahl der Blätter Mittlere Größe (cm) (Blatt + Petiole) Keines Cyanobakterien Photosynthetische Bakterien
Beispiel 7:
Herstellung von Carotinoiden aus kultivierten
Karottenzellen
-
Zellen, die in der Lage sind, Carotinoid zu produzieren und die
aus den Wurzeln der Karotten (Daucus carota L. cv. Kintoki)
stammen, wurden in diesem Beispiel als Ausgangsmaterial
verwendet.
-
MS-Medium, enthaltend 3% Sucrose, 1 mg/l 2,4-D und 1% Agar (pH
5,5 bis 5,7) und ein modifiziertes Medium hiervon (weiterhin
enthaltend 1% des Kulturfiltrats oder des Extrakts des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus, wurde
hergestellt. Die Zellen wurden je auf den obigen Medien bei
25ºC 50 Tage lang unter dunklen Bedingungen kultiviert, und die
in den Zellen akkumulierte Carotinoidmenge wurde bestimmt.
-
Die Carotinoidmenge wurde bestimmt durch Messen des Naßgewichts
der kultivierten Zellen, Aufbrechen der Zellen in einem Mörser,
Extrahieren der aufgebrochenen Zelle mit einem kleinen Volumen
Aceton, Zugabe von 3 ml Petrolether zum Extrakt, um das
Carotinoid aus der Acetonschicht in die Petroletherschicht zu
überführen, und Bestimmen der Absorption der Etherschicht bei 453
nm mit einem Spektralphotometer. Das Ergebnis ist in der
Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7
Additiv Naßgewicht Carotinoidmenge (µg/g Naßgewicht) Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt
Beispiel 8:
Herstellung von Betacyanin aus kultivierten Zellen
von Pokeweed (Phytolacca americana)
-
Zellen, die in der Lage sind, Betacyanin zu produzieren und die
von den Stengeln von Phytolacca americana abstammen, wurden in
diesem Beispiel als Ausgangsmaterial verwendet.
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MS-Medium, enthaltend 3% Sucrose und 0,1 mg/l 2,4-D (pH 5,5 bis
5,7) und ein modifiziertes Medium hiervon (weiterhin enthaltend
l% des oben in (II) hergestellten Kulturfiltrats oder Extrakts
des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus), wurde
hergestellt. Die Zellen wurden einer Flüssigsuspensionskultur
in jedem der obigen Medien bei 25ºC 14 Tage lang unter hellen
Bedingungen (2000 lux) unterzogen, und die Menge des in den
Zellen akkumulierten Betacyanins wurde bestimmt.
-
Die Betacyaninmenge wurde bestimmt durch Messen des
Naßgewichtes der kultivierten Zellen, Aufbrechen der Zellen in einem
Mörser, Extrahieren der aufgebrochenen Zellen mit einem kleinen
Volumen Wasser, Zentrifugieren der erhaltenen Mischung und
Bestimmen der Absorption des Überstandes bei 535 nm mit einem
Spektralphotometer. Das Ergebnis ist in der Tabelle 8
angegeben.
Tabelle 8
Additiv Naßgewicht Betacyaninmenge (µ/g Naßgewicht) Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt
Beispiel 9:
Wachstum von Karottenadventivembryos
-
Die im Kulturfiltrat und Extrakt des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus enthaltenen basischen Substanzen
wurden, wie unten beschrieben, fraktioniert. Zum in (II)
hergestellten Kulturfiltrat und Extrakt des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus wurden je 1N-HCl zugegeben, um den
pH auf 3 einzustellen; anschließend wurde Chloroform zum
Extrakt zugegeben und die enthaltenen sauren Substanzen wurden
entfernt. Anschließend wurde die erhaltene wäßrige Schicht
durch Zugabe von 1N-NaOH auf pH 12 eingestellt, und Chloroform
wurde zugegeben, um die basischen Substanzen zu extrahieren.
Vom Extrakt wurde Chloroform unter reduziertem Druck
abdestilliert,
der Rückstand wurde in ultrareinem Wasser von pH 4
aufgelöst, und die Lösung wurde gefriergetrocknet, um eine Probe
der basischen Substanzen zu erhalten.
-
Andererseits wurden die oben in (I) hergestellten
Karottenadventivembryos durch ein 148 µm-Nylonsieb abgetrennt, und
diejenigen, die zu einer Größe von 148 µm oder darüber gewachsen
waren, wurden gesammelt. Die meisten der gesammelten Embryos
waren von kugelförmiger bis herzförmiger Gestalt.
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Diese Adventivembryos wurden kultiviert in MS-Medium,
enthaltend kein Pflanzenhormon; in einem modifizierten Medium
hiervon, enthaltend 1,5% des Kulturfiltrats oder des Extrakts des
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus; und in
einem anderen modifizierten Medium hiervon, enthaltend 100 ppm
der basischen Substanzen, isoliert aus dem Kulturfiltrat oder
dem Extrakt; bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 12
Std.) über einen Zeitraum von einem Monat, und die
Wachstumsbedingungen der Embryos wurden überprüft. Das Ergebnis ist in
der Tabelle 9 angegeben.
Tabelle 9
Additiv Zahl der gewachsenen Adventivembryos*&sup5; (pro ml) Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt - Basische Substanzen im Kulturfiltrat - Basische Substanzen im Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt - Basische Substanzen im Kulturfiltrat - Basische Substanzen im Extrakt Anmerkungen: *&sup5; Die gewachsenen Adventivembryos sind diejenigen, die zu einer Länge von wenigstens 5 mm gewachsen waren. *&sup6; Werte in ( ) sind die Anzahl der Adventivembryos, die Keime und Wurzeln regeneriert hatten.
Beispiel 10:
Herstellung synthetischer Samen unter Verwendung
von Karottenadventivembryos
-
Der oben in (II) hergestellte Extrakt des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus (50 ml) wurde gegen 1 l
destilliertes Wasser durch ein Celluloserohr zur Dialyse ("Cellulose
Tube 30/32" der Fa. VISKASE Inc.) dialysiert, und das so
erhaltene Dialysat wurde als die Fraktion mit dem hohen
Molekulargewicht
verwendet, während die Außenlösung unter verringertem
Druck auf 50 ml konzentriert wurde, und das so erhaltene
Konzentrat wurde als die Fraktion mit dem niedrigen
Molekulargewicht verwendet.
-
Andererseits wurden die oben in (I) hergestellten
Karottenadventivembryos durch ein 148 µm-Nylonsieb gesiebt, und
diejenigen, die auf eine Größe von 148 µm oder darüber gewachsen
waren, eingesammelt. Die meisten der gesammelten Embryos wiesen
eine kugelförmige bis herzförmige Gestalt auf.
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Diese Adventivembryos wurden in 25 ml MS-Medium suspendiert;
diese Suspension wurde mit 75 ml MS-Medium, enthaltend 3%
Natriumalginat als Einbettungsmittel, vermischt. In die so
erhaltenen 100 ml der vermischten Lösung wurde das oben in (II)
hergestellte Kulturfiltrat oder der Extrakt des photosynthetischen
prokaryotischen Mikroorganismus zugegeben, oder die oben
erhaltene Fraktion mit dem hohen Molekulargewicht oder die oben
erhaltene Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht, auf eine
Konzentration von 10%. Die so hergestellte gemischte Lösung
wurde tropfenweise in eine 50 mM CaCl&sub2;-Lösung gegeben, um
kugelförmige synthetische Samen mit einer aus Calciumalginat
gebildeten synthetischen Membran zu erhalten.
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Diese synthetischen Samen wurden in steriler Weise bei 25ºC
unter hellen Bedingungen (2000 lux · 12 Std.) über einen
Zeitraum von einem Monat kultiviert, und die Keimung und die
Wurzelbildung wurden kontrolliert. Das Ergebnis ist in der Tabelle
10 angegeben.
Tabelle 10
Additiv Zahl der synthetischen Samen Zahl der Wurzeln Zahl der Keime Keines Cyanobakterien - Kulturfiltrat - Extrakt - Hochmolekulare Fraktion im Extrakt - Niedrigmolekulare Fraktion im Extrakt Photosynthetische Bakterien - Kulturfiltrat - Extrakt - Hochmolekulare Fraktion im Extrakt - Niedrigmolekulare Fraktion im Extrakt
-
Die verwandte Anmeldung EP-B-380692 betrifft ein Verfahren zur
Kultivierung von Pflanzengewebe, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß es die Kultivierung wenigstens eines Teils eines
Pflanzengewebes, wenigstens eines Teils eines Pflanzenorgans oder von
kultivierten Zellen dieses Organs in einem Kulturmedium umfaßt,
das ein Kulturfiltrat und/oder einen Extrakt aus einem
photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthält.