DE3248379C1

DE3248379C1 - Verfahren zur Kultur und Selektion somatischer Hybriden

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Publication number: DE3248379C1
Application number: DE19823248379
Authority: DE
Inventors: Thomas Dipl.-Biol. Hein; Otto Dr. 5000 Köln Schieder
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1982-12-28
Filing date: 1982-12-28
Publication date: 1984-06-14

Description

Mit Hilfe des rfindungsgemäßen Verfahrens wird eine rasche Entwicklung mit 100%iger Sicherheit bei den somatischen Hybridkulturen erzielt. Mit diesem Verfahren ist es erstmals möglich, jeden beliebigen Wildtyp miteinander zu kombinieren und den entstandenen Hybriden zu regenerieren.
Derartige Kombinationen von Protoplasten unterschiedlicher Elternpflanzen sind bei Nutzpflanzen, beispielsweise der Kartoffel, von hohem züchterischen und ökonomischen Interesse, z. B. für die Züchtung von Nematodenresistenten Kartoffelsorten ohne Beeinträchtigung des Ertrages. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich somatische Hybriden sowohl von Pflanzen gleicher Art als auch unterschiedlicher Art sowie auch von Pflanzen unterschiedlicher Gattung in relativ kurzer Zeit erzeugen, die dann nach üblicher Entwicklung auf ihre Brauchbarkeit in der Praxis getestet werden können.
Das neue Prinzip der Förderung der Kultur durch eine auxotrophe Ammenkultur bei der Entwicklung des isolierten Fusionsprotoplasten ist auch anwendbar auf auxotrophe somatische Hybriden, vorausgesetzt, daß diese einen anderen Zusatz als essentiellen, d. h. als lebensnotwendigen Nährstoff benötigen als die Ammen-Zellkultur. Dem Nährmedium sind dann bei der gemeinsamen Kultur zunächst beide essentiellen Zusatzstoffe hinzuzufügen. Die Selektion der angestrebten Hybridlinien erfolgt auch in diesem Fall durch Absterben-lassen der auxotrophen Ammen-Zellkultur durch Entzug des essentiellen Zusatzes für diese Zell-Linie, während der für die betreffenden auxotrophen Hybrid-Zellen erforderliche essentielle Zusatz während der Selektion in dem Kulturmedium nicht verringert wird und daher der gewünschte auxotrophe somatische Hybride am Leben bleibt.
Gute Ergebnisse wurden mit Protoplasten der Nitratreduktase-defekten-Mutante cnx-68 von Nicotiana tabacum (Müller und Grafe, Mol. Gen. Genet (1978)161,S. 67-76) als Ammenkultur erzielt. Diese Mutante benötigt als Stickstoffquelle im Nährmedium Aminosäuren als essentiellen Zusatz. Andere bekannte brauchbare auxotrophe Zell-Linien höherer Pflanzen sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, jeweils mit den als Zusatz geeigneten Substanzen im Nährmedium, die diese Zell-Linien am Leben erhalten. Derartige auxotrophe Zell-Linien eignen sich gut als Ammenkultur für somatische Hybriden, z. B. auch für Kartoffel-Heterokarien oder für die Entwicklung anderer genetisch manipulierter Protoplasten oder Zellen.
Auxotrophe Zell-Linien höherer Planzen Art Defekt für: Literatur Datura innoxia 1. Nitratred uktase J. King, V. Khanna Plant Physiol. (1980) (Stechapfel) (Aminosäure 66 : 632-636 2. Adenin J. King, R. B. Horsch,. A. D. Savage, 3. Pantothensäure Planta(t980) 149 :480-484 Glycine max 1. Glutamin oder Aspargin E. l. Roth, K. G. Lark Plant Cell Reports (Soja) (1982)1:157-160 Hyoscyamus muticus 1. Nitratreduktase A. Strauß, F. Bucher, P. J. King, (Bilsenkraut (Aminosäuren) Planta(1981) 153 :75-80 2. Histidin CH. Gebhardt, V. Schnebli, P. J. King 3. Tryptophan Planta(1981) 153:81-89 4. Nicotinamid 5. Gruppen von Aminosäuren Nicotiana plumbaginifolia 1. Nitratreduktase L. Marton, T. M. Dung, R. R. Mendel, (Tabak) (Aminosäuren) P Maliga Mol.Gen. Genet (1982) 182 :301-304 2. Isoleucin V. Sidorov, L. Menczel, P. Maliga, 3. Uracil Nature(1981)294 :87-88 4. Leucin Petunia »Mitchel« 1. Nitratreduktase A. Steffen, O. Schieder pers. comm.
(Pctunie) (Aminosäuren) Rosa damascena 1. Nitratreduktase T. M. Murphy, C. W. Imrie (Damaszener Rose) (Aminosäuren) Plant Physiol (1981) 67: 9 : 910-916 Die als Ammenkultur dienende Protoplastsuspension der auxotrophen Zell-Linie enthält im Falle der cnx-68 Mutante von Nicotiana tabacum die üblichen Substrate des als Stickstoffquelle für die Hybrid-Zellen dienenden Nitrats und ist zusätzlich durch Aminosäuren ergänzt. Für das Absterben der Ammenkultur wird dann der Aminosäure-Zusatz im Kulturmedium weggelassen, wenn ein ausreichendes Wachstum der Hybriden erreicht ist.
Die Identifizierung der somatischen Hybriden kann in an sich bekannter Weise vorgenommen werden, beispielsweise mit Hilfe von Isoenzym-Untersuchungen aufgrund des von den Elternpflanzen verschiedenen elektrophoretischen Isoenzymmusters, oder mit Hilfe gaschromatographischer Untersuchungen.
Die Herstellung der Hybridprotoplasten durch Fusion der Protoplasten unterschiedlicher Elternpflanzen kann in an sich bekannter Weise erfolgen, z. B. mit Hilfe eines Polyethylenglykol, Ca(N03)2 und Mannit enthaltenden Fusionsmediums bei einem pH-Wert im alkalischen Bereich. Die hierfür benötigten Protoplasten werden aus dem Blattmesophyll der betreffenden Pflanzen, vorteilhafterweise aus aseptischen Schößlingsspitzen-Kultu- ren gewonnen, in einer Enzymlösung, enthaltend Cellulase und Macerozym, inkubiert und mit Meerwasser (600 bis 800 mOsm., vorzugsweise 700 bis 750 mOsm) gewaschen. Als sehr zweckmäßig hat sich dafür Nordseewasser von der Insel Sylt erwiesen. Nach einer Fusion können die entstandenen Fusionsprodukte mit Mikropipetten, die durch einen Mikromanipulator (Leitz) gehandhabt werden, isoliert werden.
Es hat sich nun gezeigt, daß man vorteilhafterweise die Fusion in einer Suspension der beiden Protoplastenarten durchführen soll. In diesem Falle werden schnell zahlreiche Hybridprotoplasten gebildet, die dann mit dem Mikroskop erkannt und leicht isoliert werden können, wodurch verhindert wird, daß die Protoplasten Klumpen bilden und am Boden der für die Kultur verwendeten Petrischale kleben bleiben. Daher können die Fusionsprodukte, d h. die Heterokarien früher und leichter isoliert werden, als nach bisher üblichen Verfahren, wie es bei Gleba und Hoffmann, Mol. Gen. Genet. 165, 257 -267, 1978, und Patnaik et al., Plant Sci. Lett.24, 105-110, 1982, beschrieben worden ist.
Das erfindungsgemäße Aufzuchtverfahren für die somatischen Hybride eignet sich besonders auch für die Herstellung von neuen Kartoffelsorten, die gegen Nematoden resistent sind. Besonders zwei Nematoden-Arten stellen in der Praxis eine ernsthafte Gefahr für die Kartoffelproduktion dar. Es sind dies: Globodera pallida und Globodera rostochiensis. Gegen die erste Art existiert noch keine resistente Kartoffelsorte, während bei der zweiten Art resistente Kartoffelsorten existieren, diese jedoch in ihrem Ertrag nicht die Werte anderer Sorten erreichen. Der Einsatz von Nematoziden bei der Bekämpfung der Schädlinge ist nicht nur teuer, sondern ist auch aus ökologischen Überlegungen immer stärkerer Kritik ausgesetzt.
Es hat sich gezeigt, daß Resistenzen gegen G. pallida in einigen Kartoffel-Wildtypsorten, z. B. bei Solanum gourlayi und Solanum vernei, vorkommen. Diese Eigenschaften werden polygen vererbt, das heißt, mehrere Gene sind für die Ausprägung dieser Resistenzen verantwortlich. Bei üblichen Kreuzungen spalten diese Gene auf, weshalb die Resistenz dann nach und nach verlorengeht. Die einzige Möglichkeit solche Resistenzen auf Sortenniveau zu transferieren, besteht darin, durch somatische Hybridisierung eine vollständige Übertragung aller an einer Resistenz beteiligten Gene zu gewährleisten. Durch Fusion der Protoplasten können Heterokarien erhalten werden, die die gewünschte Kombination von Eigenschaften der Elternpflanzen aufweisen, so daß-die Resistenz in einem Zuchtklon enthalten ist, der als Ausgangsmaterial für neue, dringend notwendige, hochresistente Sorten dienen kann. Dabei spielen neben der Nematodenresistenz auch solche gegen verschiedene Viren, Bakterien und Pilze in der Praxis eine große Rolle. Das erfindungsgemäße Fusionsverfahren ebenso wie das neue Kultur- und Selektionsverfahren ermöglicht nun viel schneller und sicherer als bisher die neuen Hybriden bis zur Kallusbildung zu propagieren und dann zur neuen Pflanze zu entwickeln, worauf die tatsächlichen praktischen Eigenschaften der neuen Sorte ermittelt und verglichen werden können. Die neue Methode zur Gewinnung der somatischen Hybriden ist natürlich nicht nur bei der Kartoffel, sondern bei jedem beliebigen pflanzlichen Ausgangsmaterial anwendbar.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen und an Hand der Figuren näher erläutert.
Die Beispiele 1 und 2 beziehen sich auf die Hybridisierung von Nicotiana tabacum mit Nicotiana paniculata bzw. Nicotiana sylvestris.
Beispiel 3 beschreibt die Erzeugung somatischer Hybriden aus Nicotania tabacum und Petunia hybrida.
Derartige Hybriden aus den beiden unterschiedlichen Gattungen Nicotiana und Petunia sind bisher noch nicht beschrieben worden.
Fig. 1 zeigt eine Mikrophotographie eines fusionierten Protoplasten von Nicotiana paniculata und Nicotiana tabacum cnx-68, eine Stunde nach der Fusion mit eingestellter Pipette (Vergrößerung x 200), neben Protoplasten nicht fusionierter Elterntypen. Der fusionierte Protoplast (N. tabacum cnx 68 + N. paniculata), der aufgrund seiner Chloroplasten und seines starken Cytoplasmas zu erkennen ist, befindet sich direkt vor der Mikrokapillare, die zur Selektion der fusionierten Protoplasten verwendet wird.
Fig. 2 zeigt, ebenfalls in M'ikrophotographie, regenerierende Hybridkalli von Nicotiana paniculata und Nicotiana tabacum cnx-68, selektiert durch allmählichen Entzug der als Wirkstoff in der Ammenkultur notwendigen Aminosäuren und dadurch bedingtem verringertem Wachstum der Mutanten-Zell-Linie (Vergrößerung x 3). Es sind einige gut wachsende (größere) Kolonien und viele schlecht wachsende (kleine, absterbende) der Ammenkultur zu erkennen.
F i g. 3 zeigt das Esterase-Isoenzymmuster der aus Nicotiana tabacum cnx-68 und Petnunia hybrida (»Mitchell«) erhaltenen Hybrid-Zell-Linien und der beiden Elternpflanzen bzw. Eltern-Zell-Linien. Isoenzyme sind Enzyme gleicher Funktion, aber verschiedener Struktur. Aufgrund dieser verschiedenen Strukturen lassen sich mit Hilfe von Polyacrylamidgelelektrophorese Unterschiede sowohl zwischen den Elternlinien als auch im Vergleich zu den Hybridlinien feststellen.
Beispiel l Hybridisierung von Nicotiana tabacum mit Nicotiana paniculata a) Herstellung der Protoplastsuspensionen Die Protoplasten von Nicotiana paniculata wurden aus dem Blattmesophyll von Blättern aseptischer Schößlingsspitzen-Kulturen (Schieder, Z. Pflanzenphysiologie 76, 462-466, 1975) gewonnen. Die Schößlingsspitzen wurden auf Agar-Medium B5 (Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50, 151 - 158, 1968) ohne irgendwelche Pflanzenhormone kultiviert. Zur Protoplastisolierung wurde Blattmaterial mit einer Rasierklinge in kleine Stücke geschnitten und 5 Stunden in einer Enzymlösung vom pH-Wert 5,5 kultiviert, die mit 1% Cellulase R 10 (Onozuka), 0,2% Macerozym R 10 und 0,6 M Mannit hergestellt worden war. Zellsuspensionen der Nitratreduktase-defekten-Mutante cnx-68 von N. tabacum wurden auf einer Schüttelvorrichtung in dem AA-Medium nach Müller und Grafe (Mol. Gen. Genet. 161, 67-76, 1978) unter kontinuierlichem Dämmerlicht bei 150 UpM kultiviert. Alle 5 Tage wurden sie in frisches Medium überführt Die Protoplastgewinnung erfolgte in der oben angegebenen Enzymlösung, jedoch während 16 Stunden über Nacht.
Nach der Enzym-Inkubation wurden die Protoplasten beider Nicotiana Arten zweimal mit 80%igem Nordseewasser (Sylt, ca. 730 mOsm) gewaschen und in 0,6 M Saccharoselösung (Krumbiegel u. Schieder, Planta 145, 371-375, 1979) aufgeschlämmt. Die N. tabacum Protoplasten, die in der überstehenden Flüssigkeit schwammen und für die Ammenkultur vorgesehen waren, wurden in dem Protoplast-Regenerationsmedium V 47 (Binding, Z.
Pflanzenphysiologie 74, 327-356, 1974) suspendiert, dem folgende Aminosäuren zugesetzt worden waren: Arginin (174 mg/l), Asparaginsäure (266 mgil), Glutamin (877 mg/l); dies führte zu einer Protoplast-Enddichte von ca. 104/ml. Jeweils 2 ml dieser Protoplastsuspension wurden in Kunststoff-Petrischalen mit einem Durchmesser von 60 mm gegeben.
b) Fusion der Protoplasten \Die Suspensionen der zur Fusion vorgesehenen Protoplasten von N. paniculata und der cnx-68 Mutanten-Zell-Linie von N. tabacum in der Saccharoselösung wurden mit 80%igem Nordseewasser verdünnt, gemìscht und zentrifugiert. Mit einer Pipette wurde das erhaltene Sediment der Protoplastmischung zwischen jeweils 2 Tropfen des Fusionsmcdiums überführt, die sich dicht nebeneinander in Kunststoff-Petrischalen befanden, worauf die beiden Tropfen und die Protoplastmischung zusammenliefen. Das Fusionsmedium bestand aus 0,1 M Ca(NO3)2, 25% Polyethylenglykol (MG 6000) und 0,45 M Mannit und war mit KOH auf pH 9 eingestellt worden.
Nach 10 Minuten langer Inkubation der Protoplasten mit dem Fusionsmedium wurden jeweils 3 ml 0,275 M Ca(NO3)2 mit pH 6 zugegeben. 5 Minuten später wurde das gesamte Gemisch mit einer Pipette entnommen und in einem Zentrifugenröhrchen mit 100 g zentrifugiert. Das die Protoplasten enthaltende Sediment wurde in V 47 Medium, das durch die oben angegebenen Aminosäuren ergänzt war, erneut suspendiert und in Kunststoff-Petrischalen gegeben.
c) Isolierungder Heterokarien und Klonen in der Ammenkultur Mit Hilfe des beschriebenen Fusionsverfahrens konnten bis zu 3% Heterokarien beobachtet werden. Da sie weder zusammen noch am Boden der Petrischale klebten, konnten sie leicht unmittelbar nach der Fusion isoliert werden (Fig. 1). Sie unterschieden sich durch ihren intermediären Phänotypus von den Zellen der Eiternpflanzen: grüne Chloroplasten, die von den Mesophyllprotoplasten von N. paniculata stammten und zahlreiche Cytoplasmastränge aus den Suspensionsprotoplasten, die unterschieden werden konnten, da die Cytoplasmen beider Partner noch nicht miteinander vermischt waren.
Es wurden jeweils 20 Heterokarien mit einer Mikropipette, die durch einen Mikromanipulator (Leitz, Deutschland) gehandhabt wurde, aufgenommen und in eine wie oben beschriebene Kunststoff-Petrischale mit Durchmesser 60 mm überführt, die 2 ml der oben beschriebenen Protoplastsuspension der cnx-68 Mutante von N. tabacum als Ammenkultur enthielt Insgesamt wurden in jede Schale 100 Heterokarien überführt, die innerhalb einer Stunde isoliert werden konnten. Sie wurden jeden Tag untersucht und konnten lange Zeit durch ihre grün gefärbten Chloroplasten identifiziert werden. Nach 2 Tagen waren noch 70% der isolierten Heterokarien am Leben. Erste Teilungen begannen nach 3tägiger Kultur. Nahezu 30% der isolierten Heterokarien zeigten Teilungen. Nach 12 bis 14 Tagen war die grüne Farbe der somatischen Hybrid-Kolonien so weit verringert, daß sie nicht länger identifiziert werden konnten. Zu dieser Zeit hatten sich Kolonien von 8 bis 16 Zellen gebildet.
Nach 3 Wochen wurden die entwickelten Zell kolonien mit 0,4% weichem Agar, gelöst in V 47 Medium; dem Aminosäuren zugesetzt worden waren, verdünnt. Weitere 3 Wochen später wurden die Zellkolonien auf Agarmedium B5 überführt, das jeweils 0,5 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 6-Benzylaminopurin und 2-Naphthylessigsäure enthielt.
d) Selektion und Identifizierung der somatischen Hybriden Die Selektion wurde in 2 alternativen Versuchsreihen durchgeführt: a) Durch Verdünnen der Kulturen mit weichem Agar; dies führte zu einem verminderten Aminosäuregehalt und damit zu einem verminderten Wachstum der auxotrophen Mutanten-Zellkolonien von N. tabacum, während die autotrophen Hybridzellkolonien unverändert weiter wuchsen und den anorganischen Stickstoff metabolisierten (F i g. 2). b) Nach dem Übertragen der entwickelten Zellkolonien auf Agarmedium B5 ohne Zusatz von Aminosäuren, was zu einer stärkeren Verringerung der Aminosäuren und folglich zu einem Absterben der Mutanten-Zellkolonien führte. Zwischen diesen beiden Selektionsmethoden wurden keine Unterschiede beobachtet.
Von 200 Heterokarien, die ursprünglich isoliert worden waren, bildeten 29 (14,5%) Kolonien, die nach 4 bis 5 Wochen durch ihren Umfang sichtbar wurden. Nach 3 Monaten waren diese Kolonien groß genug, um die lsoenzymuntersuchung zu beginnen.
Die erhaltenen somatischen Hybriden wurdenaurch ihr elektrophoretisches Isoenzymmuster charakterisiert.
Untersucht wurden jeweils die elektrophoretische Mobilität der Esterase- und Malatdehydrogenase-Isoenzyme auf Polyacrylamidgelen. Für Esterase-lsoenzym-Untersuchungen wurden 10%ige Gele, für Malatdehydrogenase 10% ige Gele mit 5% Spacer angewandt. Die Trennung wurde bei einer konstanten Spannung von 50 mV durchgeführt. Die Esterasen wurden nach Brewbaker et al (Physiol. Plant. 21, 930-940, 1968) und die Malatdehydrogenasen nach Scandalios (Biochem.Genet.3, 37-74,1969) angefärbt.
Alle Hybriden zeigten das gleiche Esterase-Muster, das zwischen demjenigen der beiden Elternlinien N.
tabacum cnx-68 und N. paniculata lag, die unterschiedliche elektrophoretische Isoenzymmuster sowohl für Esterasen als auch für Malatdehydrogenasen aufweisen.
Außerdem wurde der Hybridcharakter einiger identifizierter Hybride zwischen N. tabacum cnx-68 und N.
paniculata durch gaschromatographische Untersuchungen nach Ninnemann und Jüttner (Z. Pflanzenphysiol.
103,95-107,1981) bestätigt.
Beispiel 2 Hybridisierung von Nicotiana tabacum und Nicotiana sylvestris Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, mit folgendem Ergebnis: Innerhalb von 90 Minuten wurden 160 Heterokarien isoliert, von denen 29 (18,1%) Kallus bildeten. 10 somatische Hybriden wurden untersucht. Sie zeigten alle das intermediäre Isoenzymmuster im Vergleich mit den beiden Elternlinien.
Beispiel 3 Hybridisierung von Nicotiana tabacum und Petunia hybrida Es wurde analog Beispiel 1 gearbeitet, ausgehend von Protoplasten von P. hybrida Linie W43 (Linskens und Straub, Incompatibility Newsletters 10, 123-131, 1978), die aus Blättern von aseptischen Schößlingskulturen gewonnen wurden und der cnx-68 Zell-Linie von N. tabacum. Die Schößlinge waren auf MS-Ag-armedium kultiviert worden (Murashige und Skoogy Physiol. Plant 15,473-497, 1962).
Es wurden 200 Heterokarien mechanisch isoliert und kultiviert. Unter den Selektionsbedingungen entwickelten sich drei kleine Kalli, von denen einer abstarb. Die beiden anderen, mit H und H2 bezeichnet, wuchsen langsam weiter. Nach einer Wachstumsperiode von etwa 6 Monaten wurden die lsoenzymuntersuchungen durchgeführt. Der Hybridcharakter der Zellkolonien wurde für beide Hybridlinien H1 und H2 durch das elektrophoretische Muster von Esterasen, Malatdehydrogenasen, saure Phosphatasen und Peroxidasen auf 10% Polyacrylamidgelen nachgewiesen. Die Gele und Proben wurden entsprechend der Methode von Lönnendonker und Schieder (Plant Sci. Lett. 17, 135-139, 1980) hergestellt. Beide Hybridlinien zeigten Hybridbanden, die sich von den Banden der beiden Fusionspartner deutlich und auch untereinander leicht unterschieden. In F i g. 3 bezeichnet A das Isoenzymmuster der Elternlinie N. tabacum cnx-68; B und C sind die Isoenzymmuster der beiden somatischen Hybridlinien Hl und H2; D ist das Isoenzymmuster für die Elternlinie P. hybrida W43.
Das Wachstumsmuster der beiden Hybridlinien auf MS-Agarmedium unter Zusatz von Benzylaminopurin, 2-Naphthylessigsäure und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure war sehr langsam. Eine bessere Wachstumsrate wurde auf B5 Agarmedium ohne irgend ein Phytohormon erzielt.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Kultur und Selektion somatischer Hybriden, bei dem Protoplasten unterschiedlicher Elternpflanzen miteinander fusioniert, die optisch erkennbaren Fusionsprodukte mechanisch isoliert, kultiviert und die entstandenen somatischen Hybriden selektiert werden, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man die isolierten Fusionsprodukte zusammen mit Protoplasten einer auxotrophen Zell-Linie als Aminenkultur in einer Suspension kultiviert, deren Medium den für diesen auxotrophen Zellen erforderlichen essentiellen Zusatz enthält, und die entstandenen angestrebten Hybrid-Zellkulturen durch Absterben-lassen der auxotrophen Ammen-Zellkulturen durch den Entzug des essentiellen Zusatzes im Medium selektiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ammenkultul eine auxotrophe Zell-Linie verwendet, die als essentiellen Zusatz Aminosäuren benötigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als auxotrophe Zell-Linie die Nitratreduktasemangel-Mutante cnx-68 von Nicotiana tabacum verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusionsprodukte kultiviert, die durch Fusion der Protoplasten in einer Suspension erhalten worden sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Fusionsprodukte verwendet, die durch Fusion von auxotrophen Protoplasten mit autotrophen Protoplasten erhalten worden sind Die Erzeugung somatischer Hybriden durch Fusion von Protoplasten unterschiedlicher Elternpflanzen sowie Isolieren und Kultivieren der optisch erkennbaren Fusionsprodukte nach dem im Gattungsbegriff vorausgesetzten Verfahren ist bekannt (vgl. O. Schieder in Plant Improvement and Somatic Cell Genetics, Acad. Press Inc.

1982,S.239-253). Somatische Hybriden sind Zell-Linien oder Pflanzen, die durch Verschmelzung zweier Zellen, die nicht wie der Pollen und die Eizellen der geschlechtlichen Vermehrung dienen, entstanden sind. Ein ernsthaftes Problem ist dabei die Selektion und die Regeneration bzw. Vermehrung dieser durch Fusion unterschiedlicher Protoplasten, d. h. zellkernhaltiger Zelleiber der Pflanzenzellen, entstandenen somatischen Hybriden, da in dem Kulturmedium nicht nur die somatischen Hybriden, sondern auch die nicht fusionierten Protoplasten regenerieren, d. h. Kallus bilden.

Eine Möglichkeit der Selektion ist die Komplementations-Selektion, d. h. die Selektion mit Hilfe eines Erbgutausgleichs durch Zusammenführen verschiedener Erbanlagen, und zwar unter Verwendung von Protoplasten auxotropher (d. h. auf optimale Nährböden angewiesener), resistenter (widerstandsfähig z. B. gegen Antibiotika oder Herbizide) und chlorophylldefekter Mutanten (Formen, die keinen grünen Farbstoff mehr aufweisen) oder von sich nicht regenerierenden wilden Linien. Sie beruht auf dem Auftreten eines von den Elternpflanzen oder den sich gleichzeitig entwickelnden Pflänzchen verschiedener Phänotyps oder Wachstumsmusters (Schieder und Vasil, Internat. Rev. Cyt. Suppl. 11B, 21-46, 1980). Es ist jedoch schwierig, solche Mutanten herzustellen und sie sind daher nicht für jede Pflanzenart verfügbar. Außerdem kann eine mutagene Behandlung einen zusätzlichen negativen Einfluß auf das interessierende Zuchtmaterial der Pflanze ausüben.

Eine andere Möglichkeit der Selektion von somatischen Hybriden ist die unmittelbare mechanische Isolierung von Heterokarien nach der Fusion der Protoplasten und ihre individuelle Kultur in Mikrotröpfchen (Kao, Mol.

Gen. Genet 150,225-230, 1977;Glebau.Hoffmann, Mol. Gen. Genet. 165,257-264,1978) oder ihre Überführung in eine aus Chlorophyll-defekten-Mutanten erhaltene Protoplastsuspension (Menczel et al., Planta 143, 29-32, 1978).

Für die Kultur in Mikrotröpfchen sind jedoch komplizierte Regenerationsmedien notwendig, die je nach Pflanzenart verschieden sein können. Die isolierten einzelnen Fusionsprotoplasten regenerieren, wenn überhaupt, nur sehr langsam, d. h. ein Kallus aus diesen neuen Protoplasten bildet sich erst nach längerer Zeit, wenn sie auf einem Kulturmedium z. B. einer Agarplatte gezüchtet werden.

Bei Verwendung einer Chlorophyll-defekten Mutante als Ammenkultur kann die Selektion der somatischen Hybriden erst sehr spät erfolgen, da ein selektives Abtöten der Ammenkulturzellen nicht möglich ist. Dadurch besteht die Gefahr, daß die somatischen Hybriden durch die Ammenkultur überzuckert werden und somit nicht auffindbar sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein wirksames und einfacheres Verfahren zur Kultur und Selektion von somatischen Hybriden zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird bei dem eingangs umrissenen Verfahren erfindungsgemäß durch die im Kennzeichen des Hauptanspruchs angegebenen Verfahrensschritte gelöst. Durch die erfindungsgemäße gemeinsame Kultur der Hybridprotoplaston bzw. Fusionsprodukte - Heterokarien - in. Gegenwart der Protoplasten einer auxotrophen Zell-Linie wird ein schnelleres Wachstum erreicht, da die Protoplasten dieser anderen auxotrophen Zell-Linie die Entwicklung der somatischen Hybridzellen fördern. Die auxotrophe Zell-Linie kann daher als eine Ammenkultur (nurse-culture) bezeichnet werden. Wenn sie ihre Aufgabe erfüllt hat, kann sie in der gemeinsamen Kultur durch das selektive Absterben-lassen aufgrund des Entzugs des für das Wachstum dieser auxotrophen Zell-Linie essentiellen Zusatzes eliminiert werden, so daß nurmehr die gewünschten Hybrid-Zellen in dem Kulturmedium übrig bleiben. Nach erreichter Kallus-Bildung durch die kultivierten Hybrid-Zellkolonien kann dann in bekannter Weise durch die Zugabe von Wuchsstoffen die Bildung (Regenerierung) der neuen Hybridpflanze erreicht werden.