DE3401291C2

DE3401291C2 - Verfahren zur Massenvermehrung einjähriger Nutzpflanzen

Info

Publication number: DE3401291C2
Application number: DE19843401291
Authority: DE
Inventors: Hideo Ikeda; Takafumi Hiroshima Shimizu; Ryuso Tanaka
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 1983-01-20
Filing date: 1984-01-16
Publication date: 1986-10-30
Also published as: JPH038171B2; DE3401291A1; JPS59132823A; FR2539579B1; CA1217339A; FR2539579A1

Abstract

Verfahren zur perennierenden Massenvermehrung einjähriger Nutzpflanzen unter Verwendung des Schößlings-Primordiums, dadurch gekennzeichnet, daß man die Spitze von Schößlingen der einjährigen Nutzpflanzen abtrennt, die abgetrennte Spitze des Schößlings in ein künstliches Nährmedium verpflanzt, welches ein Gemisch anorganischer Salze und ein Pflanzenwuchshormon enthält, die Spitzen der Schößlinge einer Rotationskultur bei einer Temperatur von 15-30°C, einer Bestrahlungsintensität von 2000-9000 Lux und unter Einhaltung einer Umdrehungszahl von 0,5-10 Umdrehungen/min unterwirft und das Schößlings-Primordium so vermehrt und die so erhaltenen Schößlings-Primordien einer stationären Kultur zur Bildung von Jungpflanzen unterwirft. Die einjährigen Nutzpflanzen können in kurzer Zeit unter Erhaltung des Genotypus und des chromosomalen Typus über mehrere Jahre einer perennierenden Massenvermehrung zugeführt werden. Dieses Verfahren ist besonders wirksam bei der Vermehrung der triploiden Wassermelone, des bastardwüchsigen Mais, der bastardwüchsigen Reispflanze und der Winden-Hybride.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Massenvermehrung einjähriger Nutzpflanzen auf vegetativem Wege, gemäß Gattungsbegriff des Patentanspruchs 1.

Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet der Biologie, des Ackerbaus, des Gartenbaus, der Pharmakologie oder ähnlichen Gebieten anwendbar.
Es sind bereits Verfahren zur geschlechtlichen Vermehrung von Nutzpflanzen bekannt. Aus der DE-PS 23 26 944 und der US-PS 40 03 156 sind Verfahren zur Massenvermehrung einjähriger Nutzpflanzen auf vegetativem Wege bekannt geworden, bei welchen Gewebeteile von wachsendem Gewebe einjähriger Nutzpflanzen abgetrennt und in ein künstlicnes Nährmedium verpflanzt werden, in dem sowohl anorganische Salze, als auch Pflanzenwuchshormone enthalten sind, wobei die Gewebeteile einer bestimmten Bestrahlungsintensität, sowie einer Bewegung unterworfen worden. Die geschlechtliche Vermehrung und die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen folgende Nachteile auf:

1. Die geschlechtliche Reproduktion stellt eine Methode dar, in der die Samen durch Meiose und Befrachtung erhalten werden; hierdurch wird der Nachkömmling erzeugt. Diese Methode verlangt aber umfangreiche Screeninguntersuchungen großer Samenmengen, wenn man den brauchbaren Genotypus uk i chromosomalen Typus erhalten will. Es ist weiterhin praktisch unmöglich, den Genotypus und chromosomalen Typus z. B. bei Triploiden, bastardwüchsigen oder ähnlichen einjährigen Nutzpflanzen zu erhalten.

2. Die vegetative Vermehrung basiert auf Gewebe- oder Zellkulturen. Nach dieser Methode findet eine DedifFerenzierung der Gewebszellen statt und es kann ein Kallus (undifferenziertes Zellkonglomerat) erhalten werden, wenn man einen Teil des Stamms, der Spitze des Schößlings, des Blattes, der Wurzelspitze oder ähnliches sterilisiert und dann in einen künstlichen Nährboden unter Zusatz eines Pflanzenwuchshormons überführt und dort kultiviert. Ein so erhaltener Kallus kann für eine lange Zeit als vegetative Zelle gelagert werden und kann durch Weiterkultivieren der Massenvermehrung unterworfen werden. Wenn dieser Kallus zum Zwecke der Redifferenzierung in ein Kulturmedium verpflanzt wird, findet Embryogenese der Somazellen oder die Bildung von Nucellularembryonen, aus denen die juvenilen Jungpflanzen hervorgehen und wodurch diese reproduziert werden, statt. Dieses Verfahren kann bei allen einjährigen Pflanzen bis zum Stadium der Dediflerenzierung und Kallusvermehrung relativ einfach angewandt werden, aber bei der Vermehrung tritt häufig Chromosomenmutation und Genmutation auf, so daß der-elbe Genotypus und derselbe chromosomale Typus wie bei den Elternpflanzen nicht erhalten werden kann.

Bei der in der DE-PS 23 26 944 beschriebenen Schüttelkultur treten häufig Chromosomen- und Genmutationen auf, die es verhindern, daß derselbe Genotypus und derselbe chromosomale Typus wie bei den Elternpflanzen erreicht wird. Ebenso ist die aus der US-PS 40 03 156 bekannte Züchtung unter schneller Rotation deshalb nachteilig, weil sich hierdurch übermäßig viele Kallusanteile entwickeln.

Andererseits ist die Redifferenzierung bei einigen einjährigen Pflanzenarten schwierig. Selbst in den Fällen von einjährigen Pflanzen, bei denen eine Redifferenzierung möglich ist, schwächt eine Langzeitkultur die Redifferenzierungsfähigkeit erheblich.

Wie oben erwähnt, ist es in Fällen der konventionellen vegetativen Vermehrung

;^:i :i) schwierig, die Genotypen und chromosomalen Typen von einjährigen Pflanzen so lange zu erhalten, wie bei

fe perennierenden Pflanzen, und

U b) ist es in den meisten Fällen unmöglich, denselben Typus wie bei den Elternpflanzen zu redifferenzieren.

Si! Weiterhin werden im Fall von Kalluszellen weder Plastidien, Olkörper, Vakuolen, Assimilationsgewebe, noch

Tg Speichergewebe gebildet. Infolgedessen können diejenigen Metaboliten, welche auf biochemischem, ackerbau-

|tf lichem oder pharmakologischen Gebiet nützlich sind, im wesentlichen nicht gewonnen warden.

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„ Es wurde gefunden, daß man die genannten Nachteile unter Einhaltung einer ganz bestimmten langsamen

Rotationsgeschwindigkeit und bei gleichzeitiger Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Intensität in einem bestimmten Temperaturbereich vermeiden kann, so daß gemäß der Aufgabe der Erfindung die einjährigen Nutzpflanzen unter Beibehaltung des Genotypus und des chromosomalen Typus über mehrere Jahre hinweg der vegetativen Massenvermehrung zugänglich sind. Zur Lösung dieser Aufgabe wird bei dem gattungsgemäßen Verfahren zur Massenvermehrung, welches aus der DE-PS 23 26 944 entnehmbar ist, erfindungs-[„ gemäß vorgeschlagen, daß man als Gewebeteile die Spitze von Schößlingen einjähriger Nutzpflanzen abtrennt,

^ή"' die abgetrennte Spitze des Schößlings in das Nährmedium verpflanzt, diese zur Vermehrung des Schößlingsprimordiums bei ununterbrochener Bestrahlung einer Rotationskultur unter Einhaltung einer Umdrehungszahl ' vonO,5bis lOUmdrehungen/minunterwirftunddiesoerhaltenenSchößlingsprimordieneinerstationärenKul-, ' tür zur Bildung von Jungpflanzen unterwirft.

Der Begriff »Schößlings-Primordium«, wie er hier verwendet wird, bedeutet solche Schößlings-Primordien, welche aus primären Primordien der Schößlinge des Zellkonglomerats, die einen Durchmesser von 50-1000 μτη aufweisen, in welchen die Zellen mit Piastiden ungeschichtet sind, und aus sekundären Primordien ' der Schößlinge des Zelikonglomerats mit einem Durchmesser von 100-5000 μΐη, in denen die Zellen doppelt.

', geschichtet sind, bestehen, in welchen diese Primordien sich ausbreiten und sich vegetativ vermehren, indem

sie halbkugelige Zellkonglomerate bilden.

Bei diesem Verfahren werden Plastidium, Ölkörper, Vakuole, Assimilations- und Speichergewebe welche auf H dem Gebiet der Pharmakologie und Medizin nutzvoll sind, in einem Teil des Schößlingsprimordiums erzeugt,. fi welches als Ausgangsmaterial für die Vermehrung und Reproduktion dient Folglich kann GiS Verfahren der p vorliegenden Erfindung für die Herstellung von Substanzen verwendet werden, welche auf den Gebieten der |! Pharmakologie und der Medizin nützlich sind.

l| Weiterhin kann das Verfahren auch angewandt werden für die Vermehrung und Reproduktion von eßbsren

|g Pflanzen und Schmuckpflanzen.

H Diese und weitere Gegenstände der Erfindung können anhand der folgenden Beschreibung der Erfindung in

|| Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gut verstanden werden, wobei davon ausgegangen wird, daß der ρ Fachmann etwaige Modifikationen, Abänderungen und/oder Varianten der Erfindung ohne weiteres durchfühjj| ren kann, ohne den Erfindungsgedanken und den Rahmen der beiliegenden Ansprüche zu verlassen.
p F i g. 1 zeigt das Konglomerat des Primordiums eines Schößlings einer triploiden Wassermelone in fünffache r

% Vergrößerung;

% Fig. 2 zeigt das Konglomerat des Primordiums eines Schößlings von bastardwüchsigem Mais in 2'Macher

ψ. Vergrößerung;

M F i g. 3 zeigt das Konglomerat des Primordiums eines Schößlings der bastardwüchsigen Reispflanze in 6facher

Ü Vergrößerung;

Il Fig. 4 zeigt das Konglomerat des Primordiums eines Schößlings der Winden-Hybride in 8facher Vergröße-

ί'^; Fig. 5 zeigt eine senkrechte Schnittdarstellung, welche das primäre Primordium eines Schößlings der tri-

\r~ ploiden Wassermelone in 30facher Vergrößerung in zentraler Projektion zeigt;

;* Fig. 6 7eigt eine senkrechte Schnittdarstellung, welche das sekundäre Primordium der triploiden Wasser-

■$, melone in 84facher Vergrößerung wiedergibt; und

Ej F i g. 7 zeigt die Chromosomen 2n = 33 im Primordium des Schößlings der triploiden Wassermelone während

,Ί des mittleren Meiosestadiums, wobei die Ansichten der rechten und linken Seite Photographien desselben BiI-

k: des darstellen, welche aus verschiedenen Entfernungen aufgenommen wurden.

(1 Mit der Erfindung steht ein Verfahren zur Verfugung, mit dem Triploide, Heteroploide, auf Chromososnen-

\\ mutationen oder Chromosomenumbau beruhende Typen, Mutations-Genotypen, bastardwüchsige Typen und

% Hybrid-Genotypen der einjährigen Nutzpflanzen für einen langen Zeitraum erhalten und vermehrt werden

κ können.

S Die Erfindung kann in weitem Umfang auf einjährige Nutzpflanzen angewandt werden, einschließlich einjäh-

jj"i riger medizinischer Pflanzen, Pflanzen des Ackerbaus und des Gartenbaus, speziell auf die triploide Wasser-

f melone (Citrullus battich), bastardwüchsigen Mais (Zea mays) und die bas&rdwüchsige Reispflanze (Oryza

t'S sativa) und die Winden-Hybride (Ipomoea nil Roth) zum Zwecks der Massenproduktion unter Erhalt des trij/! pioidsn, bastardwüchsigen und hybriden Charakters. Über die oben genannte Wassermelone, den Mais, die

] Reispflanze und die Winde hinaus kann die Erfindung auch auf medizinische Pflanzen, wie z. B. den grünen

·';■ japanischen Enzian (Swertia japonica) und den Mohn (Papaver somniferum), a.uf nützliche eßbare Pflanzen, wie :;■; z. B. Weizen (Triticum Salivum), die Sojabohne (Glycine max), nützliche Pflanzen für die industrielle Verwer-

r- tung, wie Raps (Brassica campestris) und die Färberdistel (Carthamus tinctorius), sowie auf nützliche Garten-

ί pflanzen, wie z. B. die Petunie (Petunia hybrida) usw., angewandt werden.

i: Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden näher erläutert.

% Zunächst wird der Teil, der die Spitze des Schößlings bildet, unter Beobachtung mit einem Stereomikroskop

'-}', abgeschnitten, nachdem die Spitze des Schößlings der einjährigen Nutzpflanze mit einer Sterilisationslösung £0

sterilisiert und mit sterilem Wasser gewaschen wurde. Die so gewonnene Spitze des Schößlings wird in ein künstliches Nährmedium, welches ein anorganisches Salzgemisch und ein Pflanzenwuchshormon enthält, verpflanzt und einer Kultur unter Rotation (im folgenden als »Rotationskultur« bezeichnet) Bedingungen unterworfen, wonach die Temperatur 15-30°C, die Bestrahlungsintensität 200C-9000 Lux und die Anzahl der Umdrehungen 0,5-10 Umdrehungen/min beträgt, un die Primordien des Schößlings zu erhalten.

Bei der Herstellung t?.er Primordien des Schößlings, sollte die Zusammensetzung und Konzentration im künstlichen Kulturmedium abhängig von den zu erzielenden Pflanzen leicht variiert werden. Als anorganisches SaIzßemisch kann in dem künstlichen Nährmedium ein solches verwendet werden, wie es in bekannten Kultur-

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medien enthalten ist, wie z. B. das Murashige-Skoog (im folgenden als »MS« abgekürzt) und Gamborg B₅ (im folgenden abgekürzt als »B₅«) oder ähnliches, wobei deren Bestandteile leicht verändert werden können Als Pflanzenwuchshormone können Auxine, wie z. B. Indolessigsäure, Naphthalinessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Cytokinine, wie z. B. Kinetin, oder Benzylaminopurin verwendet werden. Als Temperatur für die Kultur wird eine konstante Temperatur im Bereich von 15-30⁰C bevorzugt. Wenn die Temperatur unter 15°C beträgt, ist die Vermehrungsrate niedrig, wenn jedoch die Temperatur zu hoch ist, führt dies zu schlechtem und unstabilem Wachstum.

Zur Kultur des Promordiums des Schößlings ist eine Bestrahlung mit starkem Licht notwendig. Die Beleuchtungsintensität der ununterbrochenen Bestrahlung sollte bevorzugt 2000-9000 Lux betragen. Unterhalb dieser Bestrahlungsintensität ist das Wachstum des Primordiums des Schößlings schwach. Im Hinblick auf die Kultur ist die Rotationskultur gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbarer als eine stationäre Kultur, in der das Kulturmedium nicht rotiert, sondern ruhiggehalten wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung können gute Erfolge erreicht werden, wenn die Umdrehungszahl im Bereich von 0,5-10 Umdrehungen/min gehalten wird. Bei der Anwendung der stationären Kultur ist das Wachstum langsam und es bildet sich das Gewebe des Primordiums des Schößlings nur schwierig, wenn jedoch die Umdrehungszahl zu hoch gewählt wird, bilden sich viel mehr Kallusanteile, so daß hervorragende Resultate nicht erhalten werden können.

Wenn das erfindungsgemäße Vermehrungsverfahren insbesondere auf die triploide Wassermelone, den bastardwüchsigen Mais, die bastardwüchsige Reispflanz?· und die Winden-Hybride angewandt wird, können Schößlings-Primordien erhalten werden, welche sich vegetativ vermehren. Die Tabellen I bis IV zeigen Beispiele optimaler Kulturmedien, die durch Variation der Zusammensetzung und Konzentration erhalten wurden, in welchen die Primordien der Schößlinge dieser Pflanze erzeugt werden. Das künstliche Nährmedium, in dem die rascheste und stabilste Vermehrung des Schößlings-Primordiums erzielt wurde, ist dasjenige, welches aus B₅ und Benzylaminopurin (BAP 20 ppm) für die triploide Wassermelone besteht (Tabelle I); dasjenige bestehend aus B₅ und Naphthalinessigsäure (NAA, 0,25 ppm) und Benzylaminopurin (BAP, 0,125 ppm) für bastardwüchsigen Mais (Tabelle II); dasjenige bestehend aus R₅ und Naphthalinessigsäure (NES, 0,25 ppm) und Benzylaminopurin (BAP, 0,125 ppm) für die bastardwüchsige Reispflanze (Tabelle III); und eine solche bestehend aus B₅ und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D, 0,2^Γ· ppm) für die Winden-Hybride (Tabelle IV).

In den folgenden Tabellen bedeuten die Abkürzungen NES, 2,4-D, BAP und K Naphthalinessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Benzylaminopurin bzw. Kinetin.

Tabelle I

	Cytokinin (mg/1) \	NAA	0,25	0	BAP	2,0	K	2,0
AUX!S (mg/1)	0	2,4-D	1,0	abgestorben	0,125	Schößlings- Primordium*)	0,125	Juvenile Pflanze
0,25	abgestorben	Juvenile Pflanze	Schößlings- Primordium	Juveniles Primordium	abgestorben
1,0	abgestorben	Schößlings- Primordium	abgestorben	Schößlings- Primordium	abgestorben
abgestorben	abgestorben	abgestorben	abgestorben	abgestorben
abgestorben	abgestorben	abgestorben	abgestorben	abgestorben
abgestorben	abgestorben

*) Optimales Kulturmedium für die Bildung des Schößlings-Primordiums der triploiden Wassermelone.

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Tabelle II

\	Cytokinin (ηιμ/Ι> \	NAA	0,25	0	HAI»	2,0	K	2,0
Auxin (mg/1)	O	2.4-D	1,0	Juvenile Pflanze	0,125	abgestorben	0,125	abgestorben
0,25	Juvenile Pflanze	Juvenile Pflanze	Juvenile Pflanze	Juvenile Pflanze	abgestorben
1,0	Juvenile Pflanze	Schößlings- Primordium*)	Juvenile Pflanze	Juvenile Pflanze	abgestorben
Juvenile Pflanze	Schößlings- Primordium	Juvenile ι Heinze	Juvenile Pflanze	abgestorben
Juvenile Pflanze	Juvenile rnäuze	Juvenile Pflanze	Juvenile DflorWA 1 IIUItLV	abgestorben
Juvenile Pflanze	Juvenile Pflanze

*) Optimales Kulturmedium für die Bildung des Schößlings-Primordiums des bastardwüchsigen Mais.

Tabelle 111

	Cytokinin (mg/1) \	NAA	0,25	0	BAP	2,0	K	2,0
Auxin (mg/1)	0	2.4-D	1,0	Juvenile Pflanze	0,125	abgestorben	0,125	abgestorben
0,25	Kallus	abgestorben	Schößlings- Primordium	abgestorben	-
1,0	Kallus	Schößlings- Primordium*)	abgestorben	-	-
abgestorben	Schößlings- Primordium	Schößlings- Primordium	-	Kallus
abgestorben	Schößlings- Primordium	abgestorben	Kallus	Kallus
Kallus	abgestorben

*) Optimales Kulturmedium für die Bildung des Schößlings-Primordiums der bastardwüchsigen Reispflanze.

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Tabelle IV

\	Cytokinin (mg/1)	0	NAA	0,25	0	BAP	2,0	K	2,0
Auxin (mg/l)	2,4-D	1,0	abgestorben	0,125	Juvenile Pflanze	0,125	Juvenile Pflanze
0,25	Kallus	Juvenile Pflanze	Kallus	Juvenile Pflanze	Kallus
1.0	Schößlings- Primordium	Kallus	Kallus	Kallus	Kallus
Schößlings- Primordium*)	Kallus	Kai i us	Kallus	Kaiius
Schößlings- Primordium	Kai i us	Kallus	Kaiius	Kallus
Kallus	Kallus

·) Optimales Kulturmedium für die Bildung des Schößüngs-Primordiums der Winden-Hybride.

Man erhält Schößlings-Primordien in Form eines halbkugeligen Konglomerats. Die Konglomerate der triploiden Wassermelone (vgl. Fig. 1) und der Winden-Hybride (vgl. Fig. 4) weisen eine hellgrüne oder dunkelgrüne Farbe auf und haben den Kallus an ihrem Basisteil. Die Konglomerate des bastardwüchsigen Mais (F i g. 2) und der bastardwüchsigen Reispflanze (F i g. 3) zeigen indessen eine hellgrüne Farbe. Diese erfindungsgemäß hergestellten Primordien der Schößlinge, sind jetzt über einen Zeitraum von 6-7 Monaten vegetativ vermehrt worden. Wenn diese Schößlings-Primordien dann auf feste Kulturmedien überpflanzt werden, um Jungpflanzen zu bilden, und die Kulturmedien einer stationären Kultur bei 15-30⁰C und einer Bestrahlungsstärke von 1000-4000 Lux unterworfen werden, bilden sich zunächst eine große Zahl feiner Kormusse sowie Wurzeln ausgehend von deren Basisteil. Nach einer Kultur von 2-4 Monaten kann man eine Pflanze erhalten, welche denselben Genotypus. chromosomalen Typus und Phenotypus aufweist wie die Eltemnflanze,

Das Primordium des Schößlings besteht aus einer Ausbuchtung, welche einen Durchmesser von 50-80 um aufweist und deren Oberfläche im Anfangsstadium weich ist (Fig. 5). Die die Bausteine bildenden Zellen bestehen aus einheitlichen kleinen polygonalen Zellen, welche eine polyaxiale Teilung bewirken, bei der die Teilungsachse vertikal, parallel, schräg oder ähnlich verläuft. Wenn das Primordium des Schößlings 'primäres Schößlings-Primordiuiij) sich langsam vergrößert und der Durchmesser 100-1000 μτη (vgl. F i g. 6) erreicht, bilden sich zwei Schichten eines epidermalen und eines kortexalen Systems. Die äußerste Schicht besteht aus ein oder zwei Zellschichten, in welcher die Achse der Zellteilung nur parallel verläuft, während das körtexale System auf der inneren Seite der äußersten Schicht aus einer Anzahl mehr oder weniger großer Zellenkonglomerate besteht und auf der Innenseite dieses innwendigen kortexalen Systems eine Anzahl gut entwickelter Chloroplasten, Vakuolen und Körnern von Speichersubstanz beobachtet wird. Das letztere Schößlings-Primordium (sekundäres Schößlings-Primordium) wächst heran in Form einer trapezoiden Ausbuchtung mit einem Durchmesser von nicht weniger als 500 μΐη, und in den Zellen des epidermalen Systems der äußersten Schicht befinden sich in diesem Stadium große Ölkörper und in den Zellen des endodermalen Systems der inneren Schicht ist die Anzahl der Chloroplasten vermehrt und die Vakuole ist stark angewachsen. In diesem Stadium bilden sich um die trapezoide Ausbuchtung hemm eine Reihe primärer Schößlings-Primordien. Auf diese Weise wächst das Schößlings-Primordium gleichmäßig und ein Zyklus dieses Vorgangs ist in 7 bis 14 Tagen beendet. Dementsprechend vermehrt sich ein Schößlings-Primordium etwa viermal innerhalb von 7 bis 14 Tagen.

Die Beobachtung der Chromosomen der triploiden Wassermelone (2 η = 33) wurde durchgeführt, um die Gleichmäßigkeit der Vererbung von deren Schößlings-Primordien zu überwachen, und es wurde bestätigt, daß alle untersuchten Schößlings-Primordien dieselbe Chromosomenzahl von 2 η = 33 aufwiesen wie die Eltempflanze (F i g. 7). Es ist daher jetzt möglich, die triploide Wassermelone vegetativ zu vermehren und gleichzeitig ein perennierendes Triploid zu erhalten. So wird die Massenvermehrung einjähriger Nutzpflanzen mit demselben Genotypus und chromosomalen Typus über eine Reihe von Jahren ermöglicht, indem hierfür die Schößlings-Primordien eingesetzt werden.

Andererseits werden die Piastiden, Vakuolen, Ölkörper, Körner der Speichersubstanz (Stärke, Protein usw.) aktiv in den Schößlings-Primordien produziert. Im Gegensatz dazu werden nach der konventionellen Kalluszellmethode praktisch keine sichtbaren sekundären Metaboliten erzeugt Nunmehr besteht erfindungsgemäß die Möglichkeit, daß Nutzpflanzen durch Verwendung der Schößlings-Primordien ausgehend von lebenden Zellen gewerbsmäßig in Massen produziert werden können.

Es ist auch möglich, die Schößlings-Primordien vegetativ in bezug auf Vererbung und Chromosomensatz stabil innerhalb von 0,5—2 Monaten durch Subkultur weiterzuvermehren.

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Die Leistungen, die durch die Erfindung erzielt werden, bestehen darin, daß es nunmehr möglich ist, die einjährigen Nutzpflanzen durch Verwendung der Schößlings-Primordien vegetativ und perennierend zu vermehren, und daß es darüber hinaus möglich ist, den Pflanzenbestand in einer großen Menge zu erhalten, wobei gleichzeitig der Genotypus und der chromosomale Typus der einjährigen Nutzpflanzen perennierend erhalten wird. Weiterhin ist es möglich, für medizinische, Nahrungs- und industrielle Zwecke nützliche Substanzen zu s gewinnen, indem hierfür die Produkte lebender Zellkulturen herangezogen werden.

Die Vermehrungsgeschwindigkeit der Schößlings-Primordien ist extrem hoch und geht so weit, daß nur eine einzige Schößlingsspitze pro Jahr4^l2-4⁵² Schößlings-Primordien erzeugen kann, was eine Massenproduktion in großem Stil ermöglicht.

Die Erfindung soll unter Verweis auf die einzelnen Beispiele näher erörtert werden, jedoch ist hierdurch to keinesfalls beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu beschränken.

Beispiel 1
Triploide Wassermelone (Cirrullus battich)

Herstellungsmethode

. I D * I I * »1' j · ι Jl+ ^~* L* D ti λ ' „^ (*·' J * YS ]· J \1/ »ν» I

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wendet, dessen Zusammensetzung in Tabelle V dargestellt ist.

Tabelle V

Gamborg B₅-modifiziertes Kulturmedium für die
triploide Wassermelone

mg/1 25

NaH₂PO₄ -2 H₂O 170,0

KNO₃*) 2500,0

(NH₄)^SO₄ 134,0

MgSO₄ · 7 H₂O*) 250,0 ³⁰

CaCl₂ 113,0

Fe-EDTA 40,0

MnSO₄ · 4 H₂O 13,0

H₃BO₃ 3,0 ³⁵

ZnSO₄ ■ 7 H₂O 2,0

Na₂MoO₄ ■ 2 H₂O 0,25

CuSO₄ · 5 H₂O 0,025

CoCl₂ · 6 H₂O 0,025 ⁴⁰

KI 0,75

Nikotinsäure 1,0

Thiamin · HCl 10,0

Pyridoxin · HCl 1,0 ⁴⁵

Myoinosit 100,0

Rohrzucker 20 000,0

Naphthalinessigsäure*) 0-0,25

6-Benzylaminopurin*) 0,125-2,0

pH-Wert: 5,7-5,8

*) Diese Verbindungen wurden zur Modifizierung verwendet.

Zunächst wurde die Schößlingsspitze mit einer Länge von etwa 15 mm von einer juvenilen Jungpflanze einer aktiv wachsenden Wassermelone abgeschnitten. Nach dem Waschen mit einer Sterilisationslösung, wurden die Blätter nacheinander von der äußeren zur inneren Seite hin unter Beobachtung mit einem Stereomikroskop mit einer Pinzette und einem Messer abgelöst und eine Schößlingsspitze von etwa 1 -1,5 mm, welche auf der inne- 60 ren Seite zwei oder drei feine Blattpnmoidien aufwies, aufgenommen. Die so aufgenommene Schößlingsspitze wurde in dem oben genannten Basisiiahrmedium kultiviert. Die Rotationskultur wurde durchgeführt in einem Reagenzglas von 27 mm Durchmesser und 200 ml Länge, das mit 25 ml der Basiskultur beschickt war. Hierbei wurde die Temperatur bei 15-30⁰C, die Beleuchtungsstärke bei 2000-9000 Lux und die Anzahl der Umdrehungen bei 0,5—10 Umdrehungen/min gehalten. Das Konglomerat des grünen Schößlings-Primordiums von etwa 65 mm Durchmesser wurde 1 Monat nach Beginn der Kultur erhalten. Danach wurde dieses Konglomerat jeweils nach Ablaufeines Monats in Unterteilungen von etwa 5-10 mm Durchmesser zerschnitten, welche dann in frische Kulturmedien, wie oben beschriebe.!, verpflanzt und weitervermehrt wurden.

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Verfahren zur Erzeugung von Jungpflanzen

Als Basismedium für die Bildung von Jungpflanzen wurde ein fesxes Kulturmedium verwendet, welches hergestellt wurde, indem das oben genannte Basiskulturmedium unter Ausschluß von Rohrzucker, Naphthalinessigsäure und 6-Benzylaminopurin 5mal verdünnt wurde; hierzu wurden 20 g/l Rohrzucker, 0,05-0,5 ppm 6-Benzylaminopurin und 8 g/l Gelatine gegeben. Der pH-Wert des so erhaltenen Kulturmediums wurde auf 5,7-5,8 eingestellt Etwa 80 ml dieses Kulturmediums wurden in einen 300 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, in welchem feststehend ein Stück des Konglomerats des Schößlmgs-Primordiums mit einem Durchmesser von 3 -5 mm gegeben wurde. Die Kultur wurde stationär und unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Die Temperatur betrug 15-30"^C, die Bestrahlungsintensität betrug 4000 Lux (Beleuchtung während 16 h und ohne Beleuchtung während 8 h). Nach 2 -3 Wochen stationärer Kultur hatten sich aus einem Konglomerat des Schößlings-Primordiums 4-6 Stück dunkelgrüne Kormusse mit einer jeweiligen Länge von 3—4 mm gebildet.

Erfindungsgemäß ist es möglich, Einjahrespflanzen in großen Mengen perennierend zu vermehren. Im Falle der triploiden Wassermelone beträgt die Vermehrungsrate etwa 3mal/Monat und erreicht somit eine Vermeh-

rungsrate von 3 ^u sr 5 x 10⁵ pro Jahr. Das bedeutet, daß etwa 500 000 juvenile Jungpflanzen pro Jahr von einer Eiterapilanze erzeugt werden können. Es können also erfindungsgemäß die einjährigen Pflanzen in zufriedenstellender Weise gewerblich produziert werden. Es wurde sichergestellt, daß die so erhaltenen Schößlinge dasselbe Triploid wie die Elternpflanzen aufwiesen. Demgemäß kann ein Besatz mit demselben chromosomalen Typus und Genotypus wie die Elternpflanzen der gewerblichen Massenproduktion zugeführt werden.

Beispiel 2
Bastardwüchsiger Mais (Zea mays)

Vermehrungsverfahren

Als Basiskulturmedium für bastardwüchsigen Mais wurde dasselbe feste Kulturmedium wie in Beispiel 1 verwendet; es wurden lediglich 0,25-1 mg/1 Naphthalinessigsäure und 0,125 mg/1 6-Benzylaminopurin angewandt. In analoger Weise wie in Beispiel 1 wurde etwa 1 mm der Schößlingsspitze abgeschnitten und der Kultur in dem oben genannten Basiskulturmedium unterworfen. Einen Monat nach dem Beginn der Kultur wurde ein grünes Konglomerat des Schößlings-Primordiums mit einem Durchmesser von 20 mm erhalten. Jeweils nach einem Monat wurde dieses Konglomerat des Schößlings-Primordiums in Stücke mit 5-10 mm Durchmesser aufgeteilt, die dann wie oben beschrieben in frisches Basiskulturmedium verpflanzt wurden.

Methode zur Herstellung von Jungpflanzen

Zur Erzeugung von Jungpflanzen wurde dasselbe feste Kulturmedium wie in Beispiel 1 verwendet. Etwa 80 ml dieses Kulturmediums wurde in einen 300 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben gegeben, und das Konglomerat des Schößlings-Primordiums von etwa 15 ml Durchmesser wurde in das eingegossene Kulturmedium verpflanzt Die Kultur wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach 2-3 Wochen dauernder Kultur waren Kormusse von 10-20 mm Länge gebildet, von deren Basisteilen aus sich Wurzeln gebildet hatten. Nach einer stationären Kulturdauer von etwa 2 Monaten hatten sich pro Konglomerat des Schößlings-Primordiums 2-3 juvenile Jungpflanzen gebildet, die jeweils eine Länge von 100-150 mm aufwiesen. Im Falle des bastardwüchsigen Mais beträgt die Vermehrungsrate ungefähr 4mal/Monat und erreicht so die Rate von 4'² ^r 6 x 10⁶/Jahr. Das bedeutet etwa 16 000 000 juvenile Jungpflanzen pro Jahr, welche aus einer Elternpflanze erzeugt werden können. So kann die Einjahrespflanze gemäß der vorliegenden Erfindung in gewerblichem Maße vermehrt werden. Es wurde weiterhin bestätigt, daß die so erhaltenen Schößlinge dieselbe Bastardwüchsigkeit wie die Eltzrnpflanzen aufwiesen. Es kann daher ein Bestand mit derselben Bastardwüchsigkeit der gewerblichen Massenproduktion zugeführt werden.

Beispiel 3

Bastardwüchsige Reispflanze (Oryza sativa)

Vermehrungsmethode

Als Basiskulturmedium für die bastardwüchsige Reispflanze wurde dasselbe modifizierte Kulturmedium wie in Beispiel 1 verwendet, jedoch wurden 0,25-1,0 mg/1 Naphthalinessigsäure verwendet. In Analogie zur Methode des Beispiels 1 wurde ein etwa 1 mm langes Stück der Schößlingsspitze abgeschnitten und in dem oben genannten Basiskulturmedium kultiviert, bis ein hellgrünes Konglomerat des Schößlings-Primordiums von 5 mm Durchmesser innerhalb eines Monats nach Beginn der Kultur erhalten wurde. In Abständen von jeweils 1 Monat wurde dieses Konglomerat des Schößlings-Primordiums in Stücke von 3-4 mm Durchmesser aufgeteilt, die dann wie oben beschrieben in ein frisches Kulturmedium verpflanzt und vermehrt wurden.

Verfahren zur Bildung von Jungpflanzen

Als Kulturmedium für die Anzucht von Jungpflanzen wurde dasselbe Teste Kulturmedium wie in Beispiel 1 angewandt, und zwar so, daß das Basiskulturmedium unter Ausschluß von Rohrzucker, Naphthalinessigsäure und 6-Benzylaminopurin 5mal verdünnt wurde; dann wurden 20 g/I Rohrzucker und 8 g/l Gelatine zugegeben und der pH-Wert des Mediums auf 5,7-5,8 eingestellt.

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Etwa 80 ml des so hergestellten Kulturmediums wurden in einen 300 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben gegossen, und das Konglomerat des Schößlings-Primordiums mit einem Durchmesser von 3-5 mm wurde auf das Medium verpflanzt Die Kultur wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach einer Kultur von 2-3 Wochen hatten sich Kormusse mit einer jeweiligen Länge von 5-100 mm gebildet, und aus den Basisteilen derselben waren Wurzeln entstanden. Nach einer Kultur von 2 Monaten hatten sich pro Konglomerat des Schößlings-Primordiums 1-2 Stück derjuvenilen Jungpflanzen mit einer Länge von jeweils etwa 70 mm gebildet.

Im Falle der bastardwüchsigen Reispflanze ist die Vermehrungsrate ziemlich hoch und erreicht ein Verhältnis von ungefähr 5mal/Monat, d. h. eine Rate von 5¹² » 2,5 x 10⁸/Jahr. Das bedeutet, daß etwa 250 000 000 juvenile Jungpflanzen pro Jahr aus einer Eltempflanze erzeugt werden können. Es wurde bestätigt, daß die so erhaltenen Schößlinge dieselbe Bastardwüchsigkeit wie die Elternpflanze aufwiesen. Damit ist die gewerbliche Massenproduktion eines Besatzes mit derselben Bastardwüchsigkeit möglich.

Beispiel 4
Winden-Hybride (Ipomoea nil Roth)

Als Basiskulturmedium für die Winden-Hybride wurde dasselbe modifizierte Kulturmedium wie in Beispiel 1 eingesetzt; es wurden lediglich 0,25 -1,0 mg/12,4-Dichlorphenoxyessigsäure anstelle von Naphthalinessigsäure und 6-Benzylaminopurin verwendet Wie beim Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde eine Schößlingsspitze mit einer Länge von 0,5-1,0 rnm abgeschnitten and in dem oben genannten Basiskulturmediurn kultiviert. Einer. Monat nach Beginn der Kultur wurde ein grünes Konglomerat des Schößlings-Primordiums mit einem Durchmesser von etwa 5 -mm erhalten. In Abständen von jeweils einem Monat danach wurde das so erhaltene Konglomerat des Schößlings-Primordiums in Stücke von etwa 3—5 mm Durchmesser aufgeteilt und in einem frischen Kulturmedium wie oben beschrieber» vermehrt.

Verfahren zur Bildung von Jungpflanzen

Zur Anzucht von Jungpflanzen wurde dasselbe feste Kulturmedium wie in Beispiel 1 eingesetzt, indem das eben genannte Kulturmedium unter Ausschluß von Rohrzucker und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 5mal verdünnt wurde; dann wurde es mit 20 g/l Rohrzucker, 0,05-0,5 ppm 6-Benzylaminopurin und 8 g/l Gelatine versetzt und auf einen pH-Wert von 5,7-5,8 eingestellt.

Etwa 80 ml des so erhaltenen Kulturmediums wurden in einen 300 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben gegossen; darauf wurde das Schößlings-Primordium mit einem Durchmesser von 3-5 mm verpflanzt. Nach lwöchiger Kultur hatten sich Ausbuchtungen gebildet, die man als feinen Kormus mit einer Größe von 1-2 mm ansehen konnte. ^

Im Falle der Winden-Hybride betrug die Fortpflanzungsrate 2mal/Monat und erreichte eine Rate von 2¹² a 4 x lOVJahr. Dementsprechend können ungefähr 4000 juvenile Jungpflanzen jährlich aus einer Eltempflanze erzeugt werden. Die Massenproduktion kann folglich voll gewerblich erfolgen.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

34 Ol 291 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Massenvermehrung einjähriger Nutzpflanzen auf vegetativem Wege, wobei Gewebeteile von wachsendem Gewebe einjähriger Nutzpflanzen abgetrennt und in ein künstliches Nährmedium verpflanzt werden, in dem sowohl anorganische Salze, als auch Pflanzenwuchshormone enthalten sind und die

Gewebeteile bei einer Temperatur von 15-30⁰C einer Bestrahlungsintensität von 2000 bis 9000 Lux sowie einer Bewegung unterworfen werden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gewebeteile die Spitze von Schößlingen einjähriger Nutzpflanzen abtrennt, die abgetrennte Spitze des Schößlings in das Nährmedium verpflanzt, diese zur Vermehrung des Schößlingsprimordiums bei ununterbrochener Bestrahlung ίο einer Rotationskultur unter Einhaltung einer Umdrehungszahl von 0,5 bis 10 Umdrehungen/min unterwirft

und die so erhaltenen Schößlingsprimordien einer stationären Kultur zur Bildung von Jungpflanzen unterwirft.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als einjährige Nutzpflanzen die triploide Wassermelone, der bastardwüchsige Mais, die bastaniwüchsige Reispflanze, die Windenhybride, der grüne

is japanische Enzian, der Mohn, der Weizen, die Sojabohne, der Raps, die Färberdistel und die Petunie verwendet werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als anorganisches Salzgemi^ch ein Gamborg B₅-Kulturmedium und als Pflanzenwuchshormon Naphthalinessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäi« ;, Kinetin oder Benzylaminopurin verwendet wird.

4. Verfahren gernäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die stationäre Kultur bei einer Temperatur von 15-30⁰C und einer Bestrahlungsintensität von 1000-4000 Lux durchgeführt wird.