AT403233B - Verbesserungen in oder bei der kultivierung von nadelbäumen - Google Patents

Description

AT 403 233 B

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Kultivierung von Nadelbäumen und bezieht sich auf ein Verfahren 2ur Herstellung eines embryonalen Kallus aus Nadelbaumexplantaten und ein Verfahren zur Herstellung von Pflänzchen.

Hintergrund der Erfindung

Die Forstwirtschaft betrifft nahezu ausschließlich Nadelbäume, insbesondere Bäume der Gattung Fichte (z.B. Gemeine Fichte, Picea abies), der Gattung Kiefer (z.B. die Weihrauchkiefer, Pinus taeda), die Douglasfichte (Pseudotsuga menziesii) und die Lärche (Larix sp.).

Ihre kommerzielle Bedeutung führte zu umfassenden Forschungen hinsichtlich der Kultivierung und Züchtung derartiger Nadelbäume. Diese Forschungen wurden durch die Entwicklung von in vitro-Kultursy-stemen unterstützt, welche die Klonierung ausgewählter Stämme ermöglichen.

Derzeit gibt es zwei Hauptverfahren zur Herstellung multipler Klone von Nadelbäumen.

Ein Verfahren, die Organogenese, involviert die Entnahme eines geeigneten Explantats und Kultivierung des Gewebes in Kulturmedien, die sorgfältig kontrollierte Nährstoff- und Hormonspiegel enthalten, wobei ein Kallus gebildet wird. Dieser Kallus kann dann auf Knospungsmedien gegeben werden. Die erhaltenen Knospen werden getrennt und können gezüchtet werden, wobei einzelne Pflänzchen gebildet werden (wie von von Arnold, 1984, beschrieben).

Das andere routinemäßig eingesetzte Verfahren ist jenes der somatischen Embryogenese, wie von Arnold & Hackman (1988) und in der WO 91/05854 geoffenbart. Dieses Verfahren, das weniger arbeitsaufwendig ist als die Organogenese, involviert die in vitro-Bildung eines embryonalen Kallus aus zygotischen Embryoexplantaten. Dieser Kallus führt zu vielen proembryonalen Strukturen, die getrennt und zu Pflänzchen gezogen werden können.

Die somatische Embryogenese kann jedoch nur unter Verwendung von Embryos oder jungen Keimblättern als Ausgangsmaterialien durchgeführt werden. Beispielsweise wurden Erfolge mit Keimblattexplantaten aus sieben Tage alten Picea abies-Sämlingen (Lelu et al., 1984) und 30 Tage alten Sämlingen von Picea mariana und Picea galuca (Attree et al., 1990), jedoch nicht aus älteren Bäumen erzielt. Ähnlich ist die Organogenese nur dann vollständig erfolgreich, wenn das Explantat aus sehr jungen Sämlingen entnommen wird. Wenn Explantate von älteren Pflanzen verwendet werden, ist es möglich, Adventivknospen zu erhalten, diese können jedoch nicht zu Pflänzhen gezogen werden (Jansson & Bornman, 1973; von Arnold, 1984).

Dies stellt ein Problem dar, da es unmöglich ist, die Qualität des vollentwickelten Baumes an einem jungen Sämling oder Pflänzchen vorherzusagen. So könnte eine schwache Probe kloniert werden. Die vorliegende Erfindung soll dieses Problem überwinden.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines embryonalen Nadelbaumkallus vor, welches umfaßt: Kultivieren von somatischem, wachstumsfähigen Gewebe, das von einem Nadelholz stammt, das eine Ruheknospe ausgebildet hat, wobei ein nicht-embryonaler Kallus gebildet wird, und anschließendes Kultivieren des nicht-embryonalen Kallus in Anwesenheit eines embryonalen Kallus in einer Nährkultur, wobei ein embryonaler Kallus hergestellt wird.

Ruheknospen werden am Ende der Wachstumsperiode gebildet. So muß ein Nadelholz gemäß der Erfindung, wie oben definiert, das eine Ruheknospe ausgebildet hat, zumindest das Ende einer Wachstumsperiode erreicht haben.

Typischerweise ist das somatische, wachstumsfähige Gewebe ein Explantat, das aus Nadel-, Knospen-, Schößlings- oder Wurzelgewebe eines in fortpflanzungsmäßiger Hinsicht voll entwickelten Baumes entnommen wird.

Das Gewebe kann aus einem vollentwickelten Baum entnommen weren, wodurch die Auswahl von Elitearten zur Klonierung ermöglicht wird. Das Alter des Baums kann für verschiedene Arten variieren, die Technik wurde jedoch unter Verwendung von Explantaten einer Probe einer 26 Jahre alten Picea abies erfolgreich durchgeführt. "Vollentwickelt” bedeutet in diesem Zusammenhang geschlechtsreif. Wie Fachleuten jedoch wohlbekannt ist, muß ein vollentwickelter Baum noch nicht geblüht haben, da Gemeine Fichten allgemein alle 5 bis 8 Jahre gemeinsam blühen. So kann ein Baum die Fähigkeit zu blühen besitzen (und daher "vollentwickelt'’ sein), tut dies jedoch nicht bis zur geeigneten Zeit. So kann eine Gemeine Fichte das erste Mal im Alter von etwa 15 Jahren erblühen, dies ist jedoch außergewöhnlich. Die Bäume sind bei der 2

AT 403 233 B ersten Blüte allgemein 20 bis 25 Jahre alt.

Forscher auf diesem Gebiet stimmen allgemein überein, daß die Gemeine Fichte (Picea abies) der Nadelbaum ist, der am schwersten zu kultivieren ist. Daher kann diese Technik bei allen Nadelbäumen verwendet werden, ist jedoch besonders geeignet für andere Fichtenarten (Weiß-, Schwarz- und Zimmerfichte), die Douglasfichte, die Korsische Kiefer, Nordamerikanische Kiefer sowie die Japanischen und Europäischen Lärchen und Hybride hievon. Wie ersichtlich ist, kann ein auf diese Weise erhaltener, embryonaler Kallus verwendet werden, um Pflänzchen z.B. durch herkömmliche Wachstumstechniken zu erhalten. Nährkulturen sind Fachleuten im allgemeinen wohlbekannt, da sie beispielsweise in Transformationsversuchen verwendet werden. In einer typischen Nährkultur sind der embryonale Kallus unreifen Ursprungs und der nicht-embryonale Kallus eng beieinander an gegenüberliegenden Seiten von mikroporösen Membranen angeordnet, so daß kein direkter Kontakt zwischen den beiden Kalli besteht, und die einzige Kommunikation über die Membranporen erfolgt. Das Wachstum und die Aufrechterhaltung der Kalli wird durch ein geeignetes Kulturmedium unterstützt.

Typischerweise haben die Membranporen einen Durchmesser von 0,22 um. Die Membran kann Nitrocellulose oder ein anderes geeignetes Material sein, wie für Fachleute ersichtlich ist.

Vorzugsweise umfaßt die Nährkultur embryonales Gewebe der gleichen Art wie jener, von welcher der nicht-embryonale Kallus stammt, das embryonale Gewebe kann jedoch von einem anderen Stamm oder einer anderen Art stammen, wie für Fachleute ersichtlich ist.

In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung von Pflänzchen vor, welches das Kultivieren von durch das oben definierte Verfahren hergestelltem, embryonalen Gewebe auf eine zur Erzeugung von Pflänzchen geeignete Weise umfaßt.

Medien für diesen Zweck sind Fachleuten bekannt.

In noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Nadelbaumpflänzchen vor, welches umfaßt: Kultivieren von somatischem, wachstumsfähigen Gewebe, das von einem Nadelholz stammt, das eine Ruheknospe ausgebildet hat. wobei ein nicht-embryonaler Kallus gebildet wird; und Kultivieren des nicht-embryonalen Kallus in Anwesenheit eines embryonalen Kallus in einer Nährkultur, wobei ein embryonaler Kallus hergestellt wird; und Kultivieren des erhaltenen embryonalen Kallus auf zur Erzeugung von Pflänzchen geeignete Weise.

Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf das folgende erläuternde Beispiel und die Figur besser verständlich, wobei Fig.1 ein Foto eines embryonalen Kallus zeigt, der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurde.

Beispiel

Es wurden drei Proben untersucht, um nicht-embryonale Explantate der Gemeinen Fichte vorzusehen (Picea abies). 1. Axenische Schößlingskulturen

Diese waren das Ergebnis einer Organogenese aus zygotischen Embryoexplantaten nach 2 h Anregung mit Cytokinin (von Arnold und Hackman, 1988). Schößlinge, die ursprünglich auftraten, wurden als Klone behandelt und regelmäßig seit 1988 transferiert. Die hier beschriebenen Versuche begannen etwa 1990, als die Kulturen etwa 2 Jahre lang aufrechterhalten worden waren. Sie wuchsen frei während der gesamten Dauer, und aus blattachselständigen Knospen erfolgte eine begrenzte Vermehrung. Die ursprünglich verwendeten Samen stammten aus Henndorf in Österreich. 2. Sechsjährige Bäume

Diese wurden aus fünf eingetopften kommerziellen Sämlingen gezüchtet, die von der Forestry Commission-Baumschule in Scarborogh erhalten wurden und unbekannten deutschen Ursprungs sind. 3. Ableger eines vollentwickelten Baums

Einige Ableger mit Wurzeln wurden verwendet, die aus Versuchen der IUFRO (International Union of Forestry Research Organisations) stammten. Dieses Material hatte früher in anderen Gewebekultursystemen - beispielsweise bei der Organogenese aus Ruheknospen - die besten Ergebnisse gezeigt. Der Herkunftsort ist Jilove n Prahy in der Tschechoslovakei, und die Sämlinge wurden 1968 aus Sämlingssammlungen von 3

AT 403 233 B 1964 eingepflanzt. Die vollentwickelten Bäume waren zum Zeitpunkt des in diesem Beispiel beschriebenen Versuchs 26 Jahre alt. Als Ursprung von Ablegern mit Wurzeln wurde auch ein einzelner 26-jähriger Baum verwendet, wobei direkt aus dem Baum entnommene Knospenexplantate erhalten wurden ("embryonale Schößlingsexplantate", nachstehend beschrieben). Die entnommenen Explantate umfassen daher drei Entwicklungsstadien der Gemeinen Fichte.

Kulturverfahren

Der Großteil der Explantate waren Ruhenadeln, welche aus Schößlingen der sechs Jahre alten Bäume und Ableger entnommen wurden, die vorher oberflächensterilisiert worden waren. Eine Sterilisation der Schößlinge in der Kultur war nicht notwendig. Die Konzentration und Dauer der Behandlung in Chlorox-Lösungen wurde variiert, vorher erfolgte jedoch immer ein Eintauchen in 70 % Ethanol. Viele Chargen von Nadelexplantaten waren, häufig zur Gänze, ungeachtet der Sterilisationsbehandlung, mit Pilzen verseucht. Die aus einer Nadel und unterem Stammgewebe bestehenden Explantate wurden auf Medien gegeben, die routinemäßig zur Feststellung und Aufrechterhaltung eines embryonalen Kallus aus zygotischen Embryos und Gametophyten verwendet werden. Die Replikation betrug in verschiedenen Versuchen 20 bis 1000. Das verwendete Medium, i ES bezeichnet, enthielt folgendes (in umol pro I): KNO3 (8400), Mg SO» 7H2 PO* -(1200), CaCI2.2H20 (520), NH»N03 (15000), ZnS0».7H20 (5), MnS0».4H20 (5), H3BO3 (5), Kl (2,3), Na2MoO».5H20 (0,05), CuSO».5H20 (0,008), CoCl2.6H20 (0,008), Na2EDTA.2H20 (0,03), FeS0».7H20 (0.03), Mesoinitositol (500), Nikotinsäure (0,8), Thiamin (1,4), Pyrodoxin-HCl (0,5), Glycin (2,6), Glutamin (0,002), Naphthylessigsäure (10), Benzylaminopurin (5) plus 88 mmol Saccharose und 0,8 % Difco-Agar.

Embryonale Schößlingsexplantate wurden auch als Explantate aus einem vollentwickelten Baum verwendet, wobei vegetative Knospen abgeschnitten wurden. Diese Explantate wurden während der Ruheperiode (Oktober bis April) gesammelt, und können am besten beschrieben werden als embryonale Schößlinge, die Meristem, viele Primordialnadeln und die Krone umfassen. Die Explantate wie auch jeglicher erhaltene Kallus wurden regelmäßig alle sechs Wochen in das gleiche Medium transferiert. Nach sechs oder mehr Transfers ab dem Anlegen der Kultur wurden jegliche erzeugte embryonalen Kalli in eine Nährkultur mit einem embryonalem Kallus gegeben. Diese Nährkulturen umfaßten einen embryonalen Kallus von einer Linie, die von Joachim Buttgereit 1989 aus zygotischen Embryopflanzen aus Gerlitz-Samen (die routinemäßig zur Erzeugung somatischer Embryos induziert werden kann) erzeugt wurden, und einen nicht-embryonalen Nadel- oder Knospenkallus, der vom embryonalen Kallus durch eine 0,22 Millipore Filtermembran physikalisch getrennt war, wie in Fig.1 gezeigt. Es wurden immer die gleichen Medien verwendet. Nährkulturen wurden alle vier Wochen äußerst vorsichtig in frisches Medien transferiert, um die beiden Kalli nicht zu vermischen. Alle Kulturen wurden bei 22 °C im Dunklen gehalten.

Tabelle 1 faßt die Anzahl von Explantaten zusammen, die nach drei Transfers embryonale Kalli produzierten. Alle Kalli bildeten sich aus dem unteren Nadelstamm, und aus Tabelle 1 geht hervor, daß das Alter der Pflanze, aus der die Explantate entnommen wurden, die Fähigkeit zur Kallusproduktion beeinflußte. Die direkt aus dem 26 Jahre alten Baum entnommenen Knospenexplantate waren produktiver als Nadelex-plantate aus Ablegern mit Wurzeln. Während nachfolgender Transfers nahm die Anzahl der Kalli ab, bis bei Transfer sechs 98 der 139 axenischen Schößlingskulturen zurückblieben, die ursprünglich einen nichtembryonalen Kallus erzeugten. 2 der 6 Jahre alten Bäume hatten keine Explantate mit einem nichtembryonalen Kallus, und von den 180 Kalli aus den dem 26 Jahre alten Baum entnommenen Knospenexplantaten überlebten 51.

Dann wurden Nährkulturen aus einer repräsentativen Probe der nicht-embryonalen Kalli angelegt. Nach 8 bis 10 Transfers traten embryonale musilagine Sektoren in acht Kulturen, die für 3 der axenischen Schößlingskulturklone repräsentativ waren, und in allen des 6 Jahre alten Baums auf, die überlebende Kalli aufwiesen. Wie in Fig.1 gezeigt, ist der embryonale Kallus 10 leicht als schnell-wachsend und mit sich ausbreitendem Wachstum zu erkennen. Seine Identität wurde durch das Vorliegen von Proembryonen und trägerartigen Zellen nach Anfärben und Lichtmikroskopie bestätigt. Der gesamte neue embryonale Kallus wurde vom ursprünglichen nicht-embryonalen Material abisoliert. Nährkulturen ermöglichten das Überleben des nicht-embryonalen Kallus: nur sechs Kalli, die zwei der axenischen Schößlingskulturklone repräsentieren, überlebten nach zwölf Passagen (ohne in die Nährkulturen gegeben worden zu sein). 19 der gleichen Linien (sieben axenische Schößlingskulturklone) waren jedoch als Nährkulturen aktiv, und 26 der ursprünglichen 180 Kalli aus dem 26 Jahre alten Material überlebten in den Nährkulturen. Keine Kalli des 26 Jahren alten Baums überlebten, ohne in eine Nährkultur gegeben worden zu sein. Keines dieser Materialien produzierte embryonale Sektionen vor Transfer 15.

Die somatische Embryogenese wird durch die Verwendung von Explantaten des jüngsten verfügbaren Gewebes gefördert. Die hier angegebenen Ergebnisse zeigen jedoch, daß bei niedriger Frequenz ein 4

Claims (6)

1. AT 403 233 B embryonaler Kallus aus Explantaten älterer Bäume produziert werden kann. Die verwendeten Nährkulturen förderten das Wachstum und das Überleben des langsam wachsenden Kallus, der von älteren Bäumen erhalten wurde, und förderten die Bildung des embryonalen Kallus. Die produktivste Gruppe von Explantaten stammte von den 6 Jahre alten Bäumen, wobei 5 der 96 angelegten Nährkulturen zur Produktion eines embryonalen Kallus führten. Ein wichtiger Einschränkungsfaktor bei älteren Geweben ist die geringe Frequenz der ursprünglichen Kallusbildung, insbesondere aus Nadeln, was durch die Unzuverlässigkeit der Oberflächensterilisation der Explantate dieser im Freien wachsenden Bäume verstärkt wird. Obwohl Knospenexplantate produktiver sind, wirken sie zerstörerisch für den ursprünglichen Baum. Eine weitere bedeutende Einschränkung ist die Zeit, die für das Aufrechterhalten von Kulturen während mehr als 12 Monaten erforderlich ist. Es besteht eine natürliche Grenze für die zulässige Zeit, da Kalli mit einer hohen Rate sterben, was sich in der Tatsache zeigt, daß nur Material von 2 der ursprünglichen 139 axenischen Schößlingskulturklone 12 Transfers überlebten, ohne in Nährkulturen gegeben worden zu sein. Die Periode von 6 Transfers vor Versuchen zur Induzierung einer Embryogenese wurde absichtlich gewählt, um Zellteilungen in einem desorganisierten Zustand auftreten zu lassen, die der vollentwickelte Status des Gewebes eliminieren könnte. Die Nährkulturen unterstützten das Überleben der Kalli und förderten die Embryogenese. Obwohl sie physikalisch getrennt sind, befinden sich der Nähr- und nichtembryonale Kallus in innigem chemischen Kontakt, und es gibt einige potentielle aktive Promotor-Moleküle, wie einige Iso-Formen von Peroxidase (van Engelen & de Vries, 1992) und Arabinoglulactan-Proteine (EP-A-91810315.1). Tabelle 1 Alter des Baums 1990 Typ des Explantats Anzahl der Explantate Anzahl jener mit Kallus % verwendete Genotypen 2 (axenische Nadel 2920 2277 77,9 146 (139 Genotypen mit Kallus) Schößlingskulturen) 6 Nadel 1440 212 14,7 5 26 Nadel (aus Ablegern) 1212 2 0,2 1 Knospen 3120 180 5,7 1 Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines embryonalen Nadelbaumkallus, welches umfaßt: Kultivieren von somatischem, wachstumsfähigen Gewebe, das von einem Nadelholz stammt, das eine Ruheknospe ausgebildet hat, wobei ein nicht-embryonaler Kallus gebildet wird, und Kultivieren des nicht-embryonalen Kallus in Anwesenheit eines embryonalen Kallus in einer Nährkultur, wobei ein embryonaler Kallus hergestellt wird.
2. 2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das somatische, wachstumsfähige Gewebe ein Explantat ist, das aus Nadel-, Knospen-, Schößlings- oder Wurzelgewebe eines in fortpflanzungsmäßiger Hinsicht voll entwickelten Baumes entnommen wird.
3. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährkultur einen embryonalen Kallus unreifen Ursprungs der gleichen Art wie der nicht-embryonale Kallus, mit dem er kultiviert wird, umfaßt.
4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der embryonale Kallus unreifen Ursprungs und der nicht-embryonale Kallus eng beieinander an gegenüberliegenden Seiten einer mikroporösen Membran angeordnet sind.
5. 5. Verfahren zur Herstellung von Nadelbaumpflänzchen, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivieren eines embryonalen Kallus, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, auf zur Erzeugung von Pflänzchen geeignete Weise umfaßt. 5 AT 403 233 B
6. 6. Verfahren zur Herstellung von Nadelbaumpflänzchen, welches umfaßt: Kultivieren von somatischem, wachstumsfähigen Gewebe, das von einem Nadelholz stammt, das eine Ruheknospe ausgebildet hat, wobei ein nicht-embryonaler Kallus gebildet wird. Kultivieren des nicht-embryonalen Kallus in Anwesenheit eines embryonalen Kallus in einer Nährkultur, wobei ein embryonaler Kallus hergestellt wird, und anschließendes Kultivieren des dadurch hergestellten embryonalen Kallus auf zur Erzeugung von Pflänzchen geeignete Weise. Hiezu 1 Blatt Zeichnungen 6