DE3343894A1

DE3343894A1 - Verfahren zur vermehrung von pflanzen

Info

Publication number: DE3343894A1
Application number: DE19833343894
Authority: DE
Inventors: William R. Narragansett R.I. Krul
Original assignee: Rhode Island Board of Education
Current assignee: Rhode Island Board of Education
Priority date: 1982-12-03
Filing date: 1983-12-05
Publication date: 1984-06-07
Also published as: FR2537157A1; IT8349435A0; FR2537157B1; US4532733A; IT1201069B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur klonalen Vermehrung bestimmter Angiospermen und insbesondere der kultivierten Hybridsorte Seyval der Gattung Vitis (Weinrebe).

Zur Vermehrung von Pflanzen der Art Vitis durch Gewebekulturverfahren gibt es nur wenig Stand der Technik. Derzeit liegt ein Bericht vor, aus dem die Vermehrung von Weinreben aus fragmentierten Schößlingspitzen hervorgeht (M. Barlass, K.G.M. Skeen, In vitro propagation of grapevine (Vitis vinifera L.) from fragmented shoot apices, Vitis 17 (1978) 335 bis 340).

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Ferner liegen zwei Publikationen vor, in denen die Möglichkeit der Erzeugung von Weinreben über somatische Erabryogenese nachgewiesen ist (Krul and Worley, Formation of Adventitious Embryo in Callus Cultures of Seyval, J. Amer. Soc. Hort. Sei. 102 ( 360 - 363 sowie M.G. Mullins et al., Somatic Embryos and Plantlets from an Ancient Clone of the Grapevine (cv. Cabernet-Sauvignon) by apomixis in vitro, J. Expt. Bot. 27 (1976) 1022 - 1030). Dabei besteht die Möglichkeit, daß die Vermehrung von Weinreben auf multiplikative Weise aus Schößlingsspitzen nur geringfügige oder keine Modifizierung eingeführter Verfahren erfordert und daher nicht berichtet ist (vgl T. Murashige, Plant Propagation Through Tissue Cultures, Annu. Rev. Plant. Physiol. 25 (1974) 135-166).

Die Pflanzenvermehrung durch somatische Embryogenese, dh durch Erzeugung von Embryostrukturen, die mit denen in Samen identisch sind, aus isolierten Pflanzenzellen wurde Ende der 50er Jahre beschrieben (F. C, Steward et al., Growth and Organized Development of Cultured Cells, II. Organization in cultures grown from freely suspended cells, Amer. J. Bot. 45 (1958) 705-708; und J. Reinert, über die Kontrolle der Morphogenese und die Induktion von Adventivembryonen an Gewebekulturen aus Karotten, Planta SZ_ ( ) 318 - 333.

Embryoide von Weinreben und anderen Pflanzen entstehen aus proembryonalen Massen, die in Calluszellen eingebettet sind. Die Faktoren, die bei der Initiierung der proembryonalen Massen eine Rolle spielen, sind nicht bekannt. Die Umwandlung der proembryonalen Massen in Embryoide tritt bei Wein-

reben ein, wenn sie von einem Medium, das ein aktives Auxin enthält, in ein Medium mit einem weniger aktiven Auxin übertragen werden, oder wenn die Cytokininkonzentra-

tion des Mediums verringert wird. Von der Sorte Seyval wurde ein hochembryogener Callus isoliert, der zum Wachstum keine Wachstumsregler erfordert. Bei diesem Callus tritt die Embryoidbildung ein, wenn er während einer kurzen Zeit in einem auxinhaltigen Medium wachsenjgelassen und anschließend in auxinfreien Medien weiter kultiviert wird, wenn die Calciumkonzentration nur halb so groß ist wie bei der Murashige-Skoog-Rezeptur oder wenn die Kulturen über lange Zeitintervalle ohne Subkultur gezüchtet werden. Die meisten aus dem Original-Seyval-Callus regenerierten Weinstöcke wiesen normales Aussehen auf. Eine Subpapulation dieser Embryonen entwickelte sich allerdings nicht normal, sondern erzeugte sekundäre somatische Weinrebenembryonen an der Übergangsstelle zwischen Wurzel und Schößling.

Die Entwicklung normaler Weinreben aus diesen etiolierten sekundären Weinrebenembryonen ist aufgrund der getrennten Ruhezustände von Wurzeln, Hypocotyl, Keimblättern und Schößlingspitzen kompliziert, wobei jeder dieser Pflanzenteile auf unterschiedliche physikalische und chemische Reize anspricht.

Es ergab sich ferner, daß die Verfahren zur erfolgreichen Embryoidherstellung und die Verfahren zur Erzielung einer normalen Weinrebenentwicklung wechselseitig antagonistisch sind. So altern beispielsweise allgemein Embryoide, die Embryoide produzieren, und sterben kurz nach der Embryoidbildung ab. Im Gegensatz dazu verlieren Embryoide,

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7 -

die flache, grüne, getrennte Keimblätter oder normale Schößlinge entwickeln, im allgemeinen ihre Fähigkeit zur Produktion sekundärer Embryoide. Dementsprechend begünstigen Behandlungen, die die Embryoiderzeugung fördern, nicht die normale Weinrebenentwicklung, und umgekehrt verhindern Behandlungen, die die normale Weinrebenentwicklung fördern, die somatische Embryogenese.

Die Erzeugung von Weinreben und anderen Pflanzen aus isolierten Zellen durch somatische Embryogenese ist für die Weiterentwicklung bei der erhofften genetischen Modifizierung zur Erzielung verbesserter Pflanzen von wesentlicher Bedeutung. Derartige Strategien beinhalten beispielsweise die Manipulierung bei der Selektion von Zellen, die gegenüber physikalischem Streß (Kälte oder Hitze) oder chemischem Streß (Herbicide, bakterielle Toxine und

Pilztoxine) widerstandsfähig sind, oder der Aufnahme von Genvektoren durch Protoplasten aus embryogenen Zellen. Die Anwendung der somatischen Embryogenese als Al.ternativverfahren zur Massenherstellung von Pflanzen und insbesondere Weinreben ist daher vielversprechend, jedoch müssen entsprechende Verfahren für die meisten Kultursorten noch entwickelt werden.

Die grundlegenden Verfahrensweisen zur Massenproduktion von Pflanzen durch klonale Vermehrung bestimmter Pflanzen über Epidermalzellen somatischer Embryonen sind der Publikation von W. R. Krul und Myerson, In Vitro Propagation of Grape, Journal Article Number 1932, 1980, Rhode Island Agricultural Experimental Station, zu entnehmen. Eine detaillierte Diskussion zu diesem technischen Gebiet findet sich

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in der Dissertation von J. Myerson, Adventitious Embryo-genesis and Plantlet Development in Cultures of Vitis Vinifera L. Seyval, University of Rhode Island, Kingston, Rhode Island.

Der Erfindung liegt die überraschende Auffindung eines Verfahrens zugrunde, das so geführt werden kann, daß somatische Embryonen entweder den selbstreplizierenden Zustand annehmen oder zur normalen Pflanzenentwicklung übergehen. Dieses Konzept, das sich insbesondere für die Vermehrung von Weinreben eignet, umfaßt ferner auch die dabei resultierenden Pflanzen.

Beim bisherigen Stand der Technik lag die Situation vor, daß bei Anwendung eines erfolgreichen Verfahrens zur Erzeugung selbstreplizierender Embryonen die Entwicklung normaler Pflanzen aus derartigen Embryonen mit einer Häufigkeit von nur etwa 5 I eintrat. Im Gegensatz dazu erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Entwicklung funktioneller Pflanzen aus derartigen Embryonen mit einer Häufigkeit von mehr als 90 I. Aufgrund des Erfindungskonzepts ist es möglich, eine Anzahl von Pflanzen im replizierenden Zustand zu halten und die Ausbildung funktioneller Pflanzen zu Zeitpunkten zu induzieren, die für einen Produktionsplan günstig sind.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Kontrolle des Wachstums von Pflanzenembryonen zum Zustand der Selbstreplikation bzw zur normalen Pflanzenentwicklung anzugeben.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

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Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Kontrolle bzw Steuerung des Wachstums von Pflanzenembryonen zur Selbstreplikation bzw zur normalen Pflanzenentwicklung ist gekennzeichnet durch folgende Schritte:

(a) Initiierung der somatischen Embryogenese durch Einbringen somatischer Embryonen in ein ihre Selbstreplikation förderndes Medium für eine erste Zeitdauer, während der die Embryonen keimen und durch Embryonen im späten Torpedostadium vor der Verlängerung der Wurzel und des Schößlings ausgezeichnet sind,

(b) Kultivierung zur Pflanzenentwicklung wenigstens einiger der Embryonen von Stufe (a) in einem Medium mit Cytokinin-Aktivität während einer zweiten Zeitdauer, an deren Ende die Embryonen durch grüne,getrennte Keimblätter ausgezeichnet sind,

(c) Übertragen der Embryonen von Stufe (b) in ein Medium ohne Cytokinin-Aktivität und Belassen der Embryonen darin, bis sie zur Umpflanzung

in ein nährboden- bzw agarfreies Wachstums- und Trägermedium ausreichend entwickelt sind.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der klonalen Fortpflanzung von Weinreben über Epidermalzellen somatischer Embryonen von Vitis und speziell der Kultursorte des Hybrids Seyval beispielhaft erläutert.

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Das erfindungsgemäße Klonierverfahren umfaßt allgemein die Entnahme somatischer Embryonen von einer Mutterpflanze. In der Zeichnung, in der der Lebenszyklus eines sekundären somatischen Embryos schematisch dargestellt ist, entspricht dies dem Zyklus A. Derartige Embryonen werden dann während einer ersten Zeitdauer in einem Medium (MS-Medium ohne Wachstumsregler) kultiviert. In diesem Medium zeigen die Embryonen Selbstreplikation. Im Anschluß daran werden diejenigen Embryonen, die zur Entwicklung von Weinreben ausgewählt sind, in das gleiche Medium mit einem Wachstumsregler mit Cytokinin-Aktivität übertragen (Weg B der Zeichnung) und eine festgelegte Zeitdauer darin belassen, bis der erwünschte Entwicklungsgrad der Embryonen erreicht ist. In dieser Stufe werden dann die Embryonen in das gleiche Medium ohne Wachstumsregler übertragen und darin entwickeln gelassen, bis ein Umpflanzen in Erde möglich ist.

Die Erfindung wird im folgenden in Bezug auf die Embryoentwicklung im selbstreplizierenden Zustand sowie die Weinrebenentwicklung näher erläutert.

Die Kultivierung der Mutterpflanzen und die Entnahme von Embryonen von der Mutterpflanze ist in der oben angeführten Dissertation von J. Myerson, Adventitious Embryo-genesis and Plantlet Development in Cultures of Vitis Vinifera L., Seyval, University of Rhode Island, beschrieben, auf die hier Bezug genommen wird.

Die Entstehung von Adventiv-Embryonen, dh die Initiierung von Embryonen direkt von den somatischen Zellen eines anderen Embryos oder eines anderen

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Pflänzchens in der Kultur, ist nicht ungewöhnlich. In dem nachstehend erläuterten Beispiel wurden Adventiv-Embryonen kultiviert, die auf der Oberfläche des Übergangsbereichs von Wurzel zu Schößling sich entwickelnder Seyval-Pflänzchen gebildet worden waren, die ihrerseits aus Callus regeneriert worden waren. Diese Embryonen initiierten andere Embryonen, die ebenfalls Embryonen erzeugten, dh eine Klonierung. Typischerweise enthalten Mutterpflanzen etwa 0 bis 100 derartige Embryonen. Es ist ferner bekannt, daß es gewöhnlich nicht erforderlich ist, Adventiv-Embryonen von der Obergangszone der Elternpflanze physikalisch zu entfernen, da die meisten Embryonen keimen und sich spontan von der Elternpflanze ablösen.

Der Lebenszyklus eines sekundären somatischen Embryos von Vitis der Sorte Seyval, der in der Zeichnung dargestellt ist, umfaßt den Zyklus A der Selbstreplikation, wobei die Entwicklung eines Embryos in der Torpedostufe über die Stufen seiner Ausdehnung bis zur abschließenden 'reproduktiven' Stufe dargestellt ist. Dieser Zyklus dauert bis zum vollständigen Abschluß 30 bis 40 Tage. In dieser Weise erhaltene Embryonen bleiben, wenn sie in einem Medium nach Murashige und Skoog (1962), das mit Mineralsalzen und Vitaminen sowie Rohrzucker ergänzt ist (MS-Medium) und keine Pflanzenwachstumsregler enthält, unbegrenzt im reproduktiven Zustand. Zur Erzielung einer normalen Weinrebenentwicklung (Weg B in der Zeichnung) wird der Embryo im Torpedostadium in ein MS-Medium (wie oben) übertragen, das mit 2,5 μΐηοΐ/ΐ Benzyladenin (BA) ergänzt ist und darin 7 Tage belassen. Wenn die Keimblätter grün werden und sich zu trennen beginnen, wird der Embryo aus dem Medium entnommen und in das gleiche Medium

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(MS-Medium), jedoch ohne BA, eingebracht, bis er zum Umpflanzen in ein Bodengemisch genügend entwickelt ist, was etwa 30 Tage in Anspruch nimmt.

Obgleich die detaillierte Erläuterung der Erfindung im Rahmen des Beispiels unter Bezug auf Seyval-Weinreben erfolgt, bei denen die Bildung von Adventiv-Embryonen in der Wurzelübergangszone der Pflanzenembryonen spontan erfolgt, ohne daß dazwischen eine Callusphase auftritt, umfaßt das Erfindungskonzept auch die Embryogenese bzw Pflanzenentwicklung nach anderen Verfahren der Embryoneninitiierung, zu denen andere Arten der somatischen Embryogenese gehören, zB aus Callus-, Anther- oder Pollenkulturen, Tumorzellen oder Zellen, die durch Zufügen fremder Gene transformiert wurden.Ferner sind auch andere Medien verwendbar.

Somatische Embryonen von Vitis sp. Seyval erzeugen sekundäre somatische Embryonen aus Epidermalzellen im Übergangsbereich zwischen Wurzel und Schößling. Diese Embryonenvermehrung (Zyklus A) tritt auf, wenn die Embryonen auf MS-Medien kultiviert werden, die mit organischen Verbindungen und 3 I Rohrzucker ergänzt sind (hormonfreie Medien). Durch Übertragung der auf Mutterembryonen erzeugten Embryonen in hormonfreie Medien schreitet die sekundäre somatische Embryogenese unbegrenzt fort. Die meisten der entstandenen Embryonen (95 I) entwickeln sich nicht zu normalen Weinreben, sondern bleiben stattdessen in einem Entwicklungszustand, der die Erzeugung sekundärer Embryonen eher begünstigt als die normale Schößlingsentwicklung (Zyklus A in der Zeichnung). In der embryonalen Multiplikationsphase besitzen die Embryonen in charakteristischer Weise weiße, nicht

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entfaltete, runzlige Keimblätter (anstelle von glatten, grünen Keimblättern) und eine Schößlingspitze/ die sich im Ruhezustand befindet. Etwa 5 % dieser Embryonen entwickeln sich zu normalen Weinreben, wobei die Keimblätter zunächst grün werden und dann die Schößlingspitze wächst (Weg B in der Zeichnung). Dabei ist es wünschenswert, über Mittel zu verfügen, mit denen sich die normale Weinrebenentwicklung fördern läßt, da dann eine Pflanzenvermehrung unter Ausnützung der Embryonenvermehrung im Zyklus A möglich wäre und normale Weinreben durch spezielle Behandlung der somatischen Embryonen zugänglich wären. Dies ist nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich.

Im nachstehenden Beispiel ist ein Verfahren erläutert, mit dem die normale Weinrebenentwicklung von somatischen Embryonen (Weg B) gefördert wird. Bei den Versuchen wurde die Wirkung von Benzyladenin auf die Entwicklung somatischer Embryonen zu normalen Weinreben (Weg B) untersucht. Somatische Embryonen dreier unterschiedlicher Größenklassen wurden dabei verwendet, um festzustellen, ob die Größe des Embryos von Einfluß auf die Empfindlichkeit gegenüber einer Behandlung mit Benzyladenin ist. Die kleinen Embryonen befanden sich im späten Torpedostadium und waren gekennzeichnet durch ihre Größe (2 mm), ihre Farbe (weiß) sowie fehlendes Wachstum an Wurzel und Schößlingspitze. Embryonen mittlerer Größe (2-6 mm) sind durch ihre kleine Primärwurzel, ihren kleinen grünen Stamm sowie die weißen, verschmolzenen, runzligen Keimblätter gekennzeichnet. Die großen Embryonen sind morphologisch den Embryonen mittlerer Größe ähnlich, jedoch größer (6-8 mm).

Somatische Embryonen (Zyklus A) vom Wurzel-

Hypocotyl-Übergangsbereich der Mutterembryonen wurden in MS-Medien mit Zusatz von Vitaminen, 3 % Rohrzucker und 2,5 μΜ Benzyladenin (ΒΑ-Medien) bzw MS-Medien mit Zusatz von Vitaminen und 3 I Rohrzucker (hormonfreie Medien) übertragen. Nach einer Woche Wachstum in ΒΑ-Medium oder hormonfreiem Medium wurden die Embryonen in hormonfreie Medien übertragen. Während dieser Woche wurden die Keimblätter der auf BA-Medium gewachsenen Embryonen grün, und die Entwicklung des Schößlings begann. Im Gegensatz dazu blieben die Keimblätter der unbehandelten Embryonen weiß, und die Schößlingspitze verblieb im Ruhezustand (Tabelle 1), Die ΒΑ-Behandlung war bei kleinen Embryonen am wirkungsvollsten, wie die Ergebnisse von Tabelle 1 zeigen. Wenn ΒΑ-behandelte Embryonen in hormonfreie Medien übertragen wurden, schritt die normale Schößlingentwicklung fort, und es wurden normale Weinreben ohne weitere ΒΑ-Behandlung erhalten. Wenn zur BA-Behandlung andererseits größere Embryonen verwendet wurden, wurden weniger normale Weinreben erhalten, wie die Ergebnisse der Tabellen 1 bis 3 zeigen. Wenn die Embryonen länger als 1 Woche auf ΒΑ-Medien kultiviert wurden, trat anomal großes Wachstum der Keimblätter und Blättrigkeit auf, wobei keine normalen Weinreben erhalten werden konnten. In den Tabellen sind entsprechend keine diesbezüglichen Daten angegeben. Nicht mit BA behandelte Embryonen unterliegen andererseits der sekundären somatischen Embryogenese und erzeugen nach 28 Tagen die hohe Zahl von 70 Embryonen pro Mutterembryo. Eine Woche mit BA behandelte Embryonen erzeugen ebenfalls sekundäre Embryonen, jedoch allgemein nicht in dem Ausmaß wie unbehandelte Embryonen.

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Beispiel

Von Mutterpflanzen wurden Embryonen abgenommen und in hormonfreien Medien (Zyklus A) kultiviert und daraus entnommen, wenn sie nach 30 bis 40 Tagen den reproduktiven Zustand erreichten. Die abgenommenen Embryonen wurden in die drei Größenklassen (klein, mittelgroß, groß) klassifiziert, wobei die kleinen Embryonen (späte Torpedostufe) < 2 mm groß waren, die mittelgroßen Embryonen (Beginn des Keimens von Wurzel und Keimling) eine Größe von 2 bis 6 mm besaßen und die großen Embryonen (ältere Embryonen mit Wurzel und weißen, getrennten Keimblättern) 6 bis 10 mm groß waren.

60 Embryonen (20 kleine, 20 mittelgroße und 20 große) wurden für die Versuche herangezogen. Davon wurden während 7 Tagen 10 kleine, 10 mittelgroße und 10 große Embryonen in hormonfreien Medien und 10 kleine, 10 mittelgroße und 10 große Embryonen in ΒΑ-Medien in 25 x 150 mm-Röhrchen gehalten, die mit Kappen verschlossen waren. Die ΒΑ-Medien enthielten 10 mm Murashige-Skoog-Medium einschließlich Vitaminergänzung und 3 % Rohrzucker, 0,8 % Agar und 2,5 μποΐ/ΐ BA; der pH wurde mit KOH auf 6 eingestellt (Stammkultur gleich wie Kultur der Mutterpflanze). Die hormonfreien Medien waren identisch, jedoch ohne BA. Der End-pH-Wert der Medien nach dem Autoklavieren betrug 5,7. Die Röhrchen wurden in 45° schräge Gestelle eingesetzt und mit Fluoreszenzlicht (10 χ 25 uE^m ) gehalten, wobei die Hellphase 16 h betrug, der sich eine Dunkelphase von 8 h anschloß. Die Temperatur betrug 21 bis 27 ⁰C.

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Während der 7 Tage begannen die Embryonen zu keimen, dh Keimlinge, Wurzeln udgl zu entwickeln. In Tabelle sind die Eigenschaften der Embryonen nach einer Kultivierungsdauer von 1 Woche in homonfreien Medien bzw ΒΑ-Medien angegeben.

Anschließend wurden 10 kleine, 10 mittelgroße und 10 große Embryonen, die in hormonfreiem Medium gehalten worden waren, weitere 7 Tage in hormonfreien Medien weiterkultiviert, während 10 kleine, 10 mittelgroße und 10 große Embryonen, die in ΒΑ-Medium gehalten worden waren, in ein hormonfreies Medium wie oben erläutert übertragen wurden.

In Tabelle 2 ist die Pflanzenentwicklung dieser Embryonen, die im Medium mit Cytokinin-Aktivität gehalten worden waren, mit der Pflanzenentwicklung der Embryonen verglichen, die in einem Medium ohne Cytokinin-Aktivität kultiviert wurden.

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τ, , ,_ Größe des Behandlungs- _ursprüngl.

medium Bmhrvos

Tabelle 1

Wirkung von BA auf die Entwicklung sekundärer Embryonen im Halbruhezustand nach einer Woche Behandlung (28 ⁰C, Hellphase 16 h, Dunkelphase 8 h)

BA	klein
HP	klein
BA	mittelgroß ··
UF	mittelgroß
BA	groß
HF	groß

pp_ *2° embryos · % %

GC-O GC-O GC-O GC-O WC-O GC-O GC-O GC-O GC-O GC-O 90 GC 10 WC

WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O 10OWC

GC-O WC-O WC-O WC-O WC-O GC-O WC-O WC-O GC-O GC-O 40 GC 60 WC

WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-2 WC-O WC-O WC-O lOOWC

WC-O GC-O WC-O WC-O GC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O 20 GC 80 WC

WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-I WC-2 WC-O WC-O . 100 WC

Behandlungsmedien: BA = Benzyladenin HF = hormonfrei

Pflanzenentwicklung (PD) GC = grünes Keimblatt WC = weißes Keimblatt

Tabelle

Wirkung von BA auf die Entwicklung somatischer Embryonen im Halbruhezustand nach einer Woche Behandlung und einer Woche Wachstum in hormonfreiem Medium

CD	Behand- lungs- medTi im	Größe des- urstjrüngl. EmBryos^s
O
DRIGIM	BA HF	klein klein
	BA HF BA	mittelgroß mittelgroß ^groß
	HF	groß

GC-I GC-O IP 3GCA 5GC IWC WC-2 WC-O

PD &2° Embryos

GCA-O GC-O GC-I GC-O WC-O GCA-O GCA-O P-O

WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O

GCA-5 WCA-6 WC-O WC-O WC-5 GC-I WC-O WC-O GC-O GC-O IWCA IGCA 3GC 5WC

WC-O WC-O WC-O WC-O WC-O WC-3 WC-I WC-2 WC-I WC-2 ^1OWC

WC-O GC-O WC-2 WC-O GC-O WC-O WC-O WC-I . WC-3 WC-O

WC-O WC-O WC-O WC-I WC-O WC-3 WC-I WC-2 WC-O WC-O 2GC

10WC

■ Behandlungsmedien:

BA = Benzyladenin HF = hormonfrei

Pflanzenentwicklung (PD)

GC = grünes- Keimblatt '
WC = weißes Keimblatt

A = Schößlingspitze zwischen GC oder WC P = Pflanze

Tabelle 3

Wirkung von ΒΑ-Behandlung auf die normale Pflanzenentwicklung nach einer Woche Behandlung und 4 Wochen Wachstum in hormonfreiem Medium

Behandlungsmedium

% normaler Pflanzen, nach einer

Größe des Embryos'vor der Behandlung (mm)

BA	klein (< 2 mm)
HP	klein
BA	mittelgroß (2-6 mm)
HP	mittelgroß
BA	groß (6-10 mm)
HF	groß

90 0

40 0

20 0

Die Kultivierung der in den Cytokinin enthaltenden Medien gehaltenen Embryos wurde in cytokininfreien Medien wie oben erläutert fortgesetzt. Sie entwickelten sich schließlich zu normalen Pflanzen, wie aus Tabelle 3 hervorgeht.

Zur Erzielung des Übergangs vom replikativen Embryonalstadium zur Weinrebenentwicklung können im Rahmen der Erfindung auch andere, natürliche und synthetische Cytokinine verwendet werden.

Aufgrund des Erfindungskonzepts werden die Pflanzen, wenn sie im selbstreplizierenden Stadium verbleiben sollen, nicht in das Medium mit Cytokinin-Aktivität übertragen, sondern unter diesen Bedingungen weiter entwickeln gelassen, wobei nur eine geringe oder keine Pflanzenentwicklung auftritt, jedoch eine sehr zufriedenstellende Vermehrung der Embryonen. Wenn sich die Embryonen andererseits zu Weinreben entwickeln sollen, werden sie, wie oben beschrieben, in das Medium mit Cytokinin-Aktivität übertragen.

Im oben erläuterten Beispiel wurde eine Cytokinin-Aktivität von 2,5 μιηοΐ Benzyladenin angewandt. Im Rahmen der Erfindung sind auch andere natürliche und synthetische Cytokinine verwendbar, die einen Obergang vom embryonalen Replikationsstadium zum normalen Wachstums- und Entwicklungsstadium von Weinreben ermöglichen; hierzu gehören Zeatin und sein Ribosid und Ribotid, Isopentenyladenin und sein Ribosid und Ribotid, Kinetin, Ethoxyethyladenin, 2-2-Hydroxyzeatin, N,N -Diphenylharnstoff und 8-Azakinetin. Die oben beispielhaft angegebene Cytokinin-Aktivität bei einer Konzentration von 2,5 μπιοί ist erfindungs-

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gemäß nicht zwingend; im Rahmen der Erfindung können auch andere Cytokinin-Konzentrationen angewandt werden, bei denen die erwünschte Aktivität vorliegt. Die Cytokinine können ferner allein oder kombiniert eingesetzt werden.

Es wird angenommen, daß zwei Faktoren bei der Entwicklung normaler Pflanzen aus diesen Embryonen eine Rolle spielen, nämlich die Größe des Embryos bei der Übertragung in das Medium mit Cytokinin-Aktivität und die Zeitdauer, während der die Pflanze im Medium mit Cytokinin-Aktivität verbleibt. Im einzelnen besteht der erste Schritt in der Kontrolle des Wachstums der Embryonen in irgendeinem geeigneten Medium bis zu einer Zeit, bei der die Embryonen Anzeichen einer Keimung, dh der Entwicklung von Wurzeln, Keimen udgl, zeigen. Wenn der Embryo zur Übertragung in Medien mit Cytokinin-Aktivität physikalisch entfernt werden soll, kann er allgemein wie folgt charakterisiert werden: (a) Länge unter 2 mm; die Embryonen bestehen aus einem sichtbaren Keimblatt, Hypocotyl und Wurzel. Ihre Farbe ist in den meisten Fällen opak-elfenbeinfarben, wobei sich die Wurzelzone durch gelblich durchscheinendes Gewebe auszeichnet. Die Keimblätter sind zusammengepreßt und zeigen noch keine vollständige Expansion, wobei die Endform noch nicht erkennbar ist. Etwa ein Drittel der Embryonenmasse besteht aus Keimblattgewebe. Die Wurzelzone erscheint noch als im Primordialstadium befindlich, dh noch in der Stufe der Zellteilung, da noch keine Zellverlängerung erkennbar ist. Die Wurzelmasse beträgt etwa 1/4 oder weniger des gesamten Embryos. Die korrekte morphologische Beschreibung für Embryonen in diesem Entwicklungsstadium ist das späte Torpedo-

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stadium.

Nachdem die Embryonenentwicklung das oben beschriebene Stadium erreicht hat, werden die Embryonen, wenn sie sich weiterhin zur Selbstreplikation hin entwickeln, dh mehr Embryonen erzeugen sollen, in einfacher Weise im gleichen oder einem ähnlichen Medium belassen. Wenn andererseits angestrebt ist, daß die Embryonen in das Weinrebenentwicklungsstadium übergehen, werden sie in ein Medium mit Cytokinin-Aktivität übertragen. Die festge-

der
legte Zeitdauer, während die Embryonen im Medium mit

Cytokinin-Aktivität bleiben, ist entscheidend. Diese festgelegte Zeitdauer ist ausreichend, um sicherzustellen, daß die keimenden Embryonen weder unternoch überentwickelt werden, da in diesen Fällen keine normale Weinrebenentwicklung eintritt. Das Entwicklungsstadium, in dem die Embryonen entfernt werden müssen, kann wie folgt beschrieben werden: Getrennte und grüne Keimblätter, Keimspitze ggf sichtbar.

Das Erfindungskonzept ist nicht auf die Anwendung auf Seyval-Weinrebenhybriden beschränkt, sondern läßt sich auch auf alle übrigen Arten von Pflanzen anwenden, die zur Ausbildung somatischer Embryonen aus isolierten Zellen befähigt sind.

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Das Murashige-Skoog-Medium (MS-Medium) hat folgende Zusammensetzung (vgl. A revised medium for rapid growth

and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant. t5 (1962) 473-497):

(mg/ml) Nährstoffe:

NH₄NO₃ ■ 1650

KNO₃ .1900

CaCl₂-2H₂O 440

MgSO₄-7H 0 370

KH₂PO₄ 170

KJ 0,83

H₃BO₃ 6,2

MnSO₄-4H₂O 22,3

ZnSO₄-7H₂O 8,6

Na₂MoO₄.2H₂O 0,25

CuSO₄-5H₂O 0,025

CoCl₂-6H₂O 0,025

Na₂-EDTA · 37,3

FeSO₄-7H₂O 27,8

Vitamine:

Inosit 100

Nicotinsäure 0,5

Pyridoxin-HCl 0,5

Thymin-HCl 0,1

Glycin 2,0

2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 1,0

Benzyladenin +) 0,1

Naphthylessigsäure 2,0

weitere Bestandteile:

Rohrzucker 30 g/l

pH-Wert (Endwert) 5,7

+) fakultativ

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Leerseite

Claims

Ansprüche

erfahren zur Steuerung des Wachstums von Pflanzenembryonen zur Selbstreplikation bzw zur normalen Pflanzenentwicklung,

gekennzeichnet durch

(a) Initiierung der somatischen Embryogenese durch Einbringen somatischer Embryonen in ein ihre Selbstreplikation förderndes Medium für eine erste Zeitdauer, während der die Embryonen keimen und Embryonen im späten Torpedostadium vor der Verlängerung der Wurzel und des Schößlings aufweisen,

(b) Kultivierung zur Pflanzenentwicklung wenigstens einiger der Embryonen von Stufe (a) in einem Medium mit Cytokinin-Aktivität während einer zweiten Zeitdauer, an deren Ende die. Embryonen durch grüne,getrennte Keimblätter ausgezeichnet sind,

und

Cc) Übertragen der Embryonen von Stufe Cb) in ein Medium ohne Cytokinin-Aktivität und Belassen der Embryonen darin, bis sie zur Umpflanzung in ein nährbodenfreies Wachstums- und Trägermedium ausreichend entwickelt sind.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Einsatz von Embryonen von Pflanzen, deren isolierte Pflanzenzellen zur Bildung somatischer Embryonen befähigt sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch Verwendung initiierter Embryonen von Callus-, Anther- oder Pollenkulturen, Tumorzellen und/oder durch Hinzufügen fremder Gene transformierten Zellen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Verwendung von mit Rohrzucker ergänztem Murashige-Skoog-Medium mit Mineralsalzen und Vitaminen (MS-Medium).
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch Verwendung eines unter Zeatin und seinem Ribosid und Ribotid, Isopentenyladenin und seinem Ribosid und Ribotid, Kinetin, Ethoxyethyladenin, 2-2-Hydroxyzeatin, N,N-Diphenylharnstoff, Benzyladenin und/oder 8-Azakinetin ausgewählten Cytokinins

in einer wirksamen Menge im Medium von Stufe (b).
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch Verwendung von Benzyladenin als Cytokinin.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Verwendung von Weinreben-Embryonen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch Verwendung von Embryonen der Kultursorte Seyval.
9. Pflanzen, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich sind.

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10. Weinreben der Kultursorte Seyval, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich sind.