DE2533437A1

DE2533437A1 - Verfahren zur ernaehrung von in vitro- kulturen von pflanzenzellen mit kohlenstoff

Info

Publication number: DE2533437A1
Application number: DE19752533437
Authority: DE
Inventors: Vincent Petiard
Original assignee: Synthelabo SA
Current assignee: Synthelabo SA
Priority date: 1974-07-26
Filing date: 1975-07-25
Publication date: 1976-02-05
Also published as: AU498174B2; NZ178230A; DE2533437B2; JPS5163982A; GB1506884A; FR2279327B1; FR2279327A1; CA1045067A; DK338375A; CH611774A5; BE831751A; AU8345575A; NL7508944A; SE7508481L; BR7504778A

Description

PATENTANWÄLTE

TER MEER - MÜLLER - STEINMEISTER

D-OOOO München 22 D-48OO Bielefeld

Tnftstralio 4 Siekerwall 7 ? R *3 3 Δ 3 7

25, Juli 1975

(ET) 9254/65
tM/th

SYNTHELABO, 1 avenue de Villars, Paris Frankreich

Verfahren zur Ernährung von in vitro-Kulturen von Pflanzenzellen mit Kohlenstoff

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ernährung von in vitro-Kulturen von Pflanzenzellen, die von der Gruppe der Samenpflanzen (Phanerogamen) zugehörenden Arten stammen, mit Kohlenstoff.

Es ist bekannt, daß Pflanzenzellen "in vitro" in nichtdifferenzierter und Undefinierter Form leben und sich vermehren können. Diese sich teilenden Zellen ergeben entweder isolierte Elemente, das heißt kleine Zellhaufen (mit etwa 2 bis 100 Zellen) oder größere Formen, die häufig als "Kallusse" (CaIs) oder Zellwucherungen bezeichnet werden, die ein verschiedenartiges

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LR MtL-R · MÜLLER · STL-ZINMEISTEiR

2 5 3 3 A 3 7

morphologisches Aussehen aufweisen. Die Kulturen von Pflanzenzellen benötigen eine Nährlösung, die flüssig oder mit Hilfe von Agar-Agar verfestigt sein kann, und die Mineralsalze, Wachstumssubstanzen, Vitamine etc. und mindestens eine Quelle für organischen Kohlenstoff enthalten muß. Dies ist notwendig, da die in vitro gezüchteten Pflanzenzellen, obwohl sie Chlorophyll enthalten, im allgemeinen nicht in der Lage sind, eine für ihre Kohlenstoffernährung ausreichende Photosynthese durchzuführen. In diesem Fall verwendet man im allgemeinen Kohlenhydrate, wobei in gewissen Fällen eine Säure oder ein Alkohol geeignet ist. Die am häufigsten verwendeten Quellen für organischen Kohlenstoff sind Glukose oder Saccharose. Unabhängig von der Art dieser Kohlenstoffquelle ermöglicht diese nur dann ein Wachstum, wenn die gezüchteten Zellen die genetische Information, die zur Umwandlung dieses Materials in eine für die Einführung in den allgemeinen Stoffwechselkreislauf der Pflanze geeignete Form notwendig ist, besitzen oder durch Einwirkung von Umwelteinflüssen zugeführt bekommen. Die Anwendung einer neuen Quelle für organischen Kohlenstoff setzt daher das Vorhandensein bzw. die Zuführung der die Enzymsynthese positiv beeinflussenden Information voraus, die für diese Umwandlung notwendig ist.

Von gewissen Forschern ist die Verwendung von Lactose jedoch praktisch ohne Erfolg, versucht wurden. Beispielsweise kann man unter anderem die folgenden Autoren nennen:

1. Nach der Veröffentlichung von R.J.Gautheret (La culture de tissus vegetaux, Masson, Paris, 1959) hat E.Ball an Sequoia sempervirens festgestellt, daß "wenn das Medium Mannose oder Lactose enthält, diese Zucker einfach denen hinzugefügt wurden, die in den Kolonien enthalten sind",

und Gautheret selbst, der normale Gewebe der Karotte (Daucus carota L.) untersucht hat und der zu dem Schluß gekommen ist, daß "die Saccharose die beste Kohlenstoffquelle darstellt, gefolgt von Glukose, Maltose und Raffinose, wo-

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nach sich Fructose und Galaktose anschließen, während Mannose und Lactose wesentlich weniger wirksam sind".

2. Andererseits haben gemäß einer jüngeren Veröffentlichung M.C.Mathes und Mitarbeiter (Plant and Cell Physiol. 14 (1973) 797-801) nur ein begrenztes Wachstum von Ahornzellen (Acer pseudoplatanus L.) in Gegenwart von Lactose festgestellt.

Weiterhin haben sämtliche Forscher, die ein geringes Wachstum auf Lactose berichtet haben, ihre Kulturen nach einem einmaligen Umpflanzen auf dieses Substrat beobachtet. Es ist daher wahrscheinlich, daß die Wucherung der Gewebe unter Ausnützung von zuvor angesammelten Reserven erfolgt ist.

Das Erreichen eines erheblichen Wachstums von Pflanzenzellen in einem Lactose-Medium ist daher nur dann möglich, wenn man die genetische Information, die zur Verarbeitung von Lactose, und insbesondere ihrer Hydrolyse notwendig ist, das heißt das Operon der ß-Galaktosidase, zuführt oder entwickelt. Diese positive Beeinflussung der Enzymsynthese kann durch Anpassung oder durch Selektion der Stämme erfolgen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Ernährung von in vitro-Kulturen von Pflanzenzellen, die von der Gruppe der Samenpflanzen (Phanerogamen) zugehörenden Arten stammen, mit Kohlenstoff, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Lactose oder eine ihrer natürlichen Ursprungsformen als Hauptquelle für organischen Kohlenstoff verwendet. Vorzugsweise benützt man als natürliche Ursprungsform der Lactose Rückstände der Milchindustrie.

Als erfindungsgemäß anzuwendende Pflanzenzellenkann man Zellen der Gruppe der Pflanzen verwenden, die der Gruppe der Samenpflanzen (Phanerogamen) zuzuordnen ist.

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit durch die Schaffung von Zellstämmen durchgeführt werden, die in der Lage sind, normal auf Lactosemedien zu wachsen. Dies kann dadurch erfolgen, daß man entweder primäre Kallusse direkt auf Lactose züchtet oder daß man ausgehend von Stämmen, deren Wachstum auf anderen Hauptkohlenstoffquellen abläuft, einer gegebenenfalls progressiven Selektion unterwirft.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Sämtliche beschriebenen Kulturen werden mit Hilfe von Nährmedien durchgeführt, die mit Ausnahme der Hauptquelle für organischen Kohlenstoff in klassischer Weise aufgebaut sind. Sie enthalten (vgl. die Beispiele 1 bis 15):

Eine Lösung von Mineralstoffen (mineralische Hauptelemente), wie eine Lösung nach Heller oder nach Murashigue und Skoog,

eine Lösung von Spurenelementen, wie die Lösung nach Heller oder Murashigue und Skoog,

eine Eisenquelle, beispielsweise Eisen(III)-chlorid oder die als FeEDTA bezeichnete Zusammensetzung,

einen Vitaminkomplex, beispielsweise die als "B.." bezeichnete Lösung,

Wuchsstoffe (Auxine oder Kinetine),

und gegebenenfalls weitere Substanzen, die weniger häufig angewendet werden, wie Aminosäuren, die Milch der unreifen Kokosnuß (cocos nucifera L.), Hefeextrakte, Kaseinhydrolysate etc. ,

eine Hauptquelle für organischen Kohlenstoff, bei der es sich erfindungsgemäß um Lactose handelt, die rein oder in einer ihrer natürlichen Ursprungsformen verwendet wird, insbesondere

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in Form von Lactoseren, Lactosesäften oder Ultrafiltrationsprodukten der Milch, und anderen Rückständen der Milchindustrie.

Die Mengenverhältnisse der obengenannten Elemente und die Züchtungsbedingungen können innerhalb weiter Bereiche variieren, was aus den in den folgenden Beispielen angegebenen experimentellen Einzelheiten hervorgeht. Die in den Beispielen angegebenen Mengenverhältnisse der Nährstoffe sollen die Erfindung nicht einschränken und können modifiziert werden. In der Mehrzahl der Fälle wurde die Verwendung von schlecht definierten Substanzen, wie die Milch von unreifen Kokosnüssen, vermieden, die eine mit der Lactose konkurrierende Zuckerquelle einführen könnten.

Beispiel 1

Bildung von Kallussen von Medicago sativa L. (Papilionaceae) und Vermehrung der erhaltenen Kallusse (cals).

Man sterilisiert Luzernekörner der Varietät Europe (INRA Nr. G 1748) während 45 Minuten in Gegenwart eines Netzmittels und unter vermindertem Druck in einer Calciumhypochloritlösung mit einer Konzentration von 40 g/l. Anschließend spült man diese Samenkörner dreimal mit sterilem Wasser. Von diesem Zeitpunkt an erfolgen im Verlaufe der Untersuchung die Manipulationen des Pflanzenmaterials unter streng aseptischen Bedingungen.

Die behandelten Samenkörner werden in sterile Kulturröhrchen eingebracht, die eines der im folgenden angegebenen Nährmedien enthalten:

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TER MCER · MÜLLER ■ STEINMEISTER

1. Knop-Medium

Bestandteil

Calciumnitrat-tetrahydrat Kaliumnitrat

Magnesiumsulfat-heptahydrat Monokaiiumpho sphat Agar-Agar

Konzentration in mg/1 des Mediums

500 125 125 125 7000

2. "Keimungs"-Medium

Heller-Mineralstofflösung Bestandteil

Kaliumchlorid

Natriumhydrat

Magnesiumsulfat-heptahydrat Mononatriumphosphat-monohydrat Calciumchlorid-dihydrat

Konzentration in mg/1 des Mediums

7 50 6OO 250 125 75

Heller-Spurenelementlösung ·,

- -i

Bestandteil

Zinksulfat-heptahydrat Borsäure

Mangansulfat-tetrahydrat Kupfersulfat-tetrahydrat Aluminiumchlorid-hexahydrat Kaiiumjodid

Nickelchlorid-hexahydrat Eisenquelle:

Eisen(III)-chlorid-hexahydrat Kohlenstoffquelle: Glukose Verfestigungsmittel: Agar-Agar Konzentration in mg/1 des Mediums

0,1

0,03

0,05

0,01

0,03

mg/1 des Mediums

000 mg/1 des Mediums

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f: R MEER ■ MUL LER · STtINMElSTER

Die Medien werden im Autoklaven während 20 Minuten bei einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert.

Nachdem man die Samenkörner auf die Oberfläche des in den Röhrchen enthaltenen Mediums aufgelegt hat, verschließt man die Röhrchen mit Parafilm (American Can Company, Neenah, Wisconsin) und setzt sie in einem Raum mit normaler Temperatur dem Tageslicht aus.

Etwa 3 Wochen nach den Maßnahmen zum Beginn des Keimens beobachtet man, daß die Keimlinge in den Röhrchen das "zweiblättrige" Stadium erreicht haben.

Anschließend nimmt man unter aseptischen Bedingungen von den Keimlingen entweder Wurzelfragmente, oder Stengelfragmente, die frei von jeglichen primären oder sekundären Knospen sind, oder Keimblätter ab.

Diese Fragmente werden in Röhrchen auf die folgende Nährmedien aufgebracht, die als "Luzerne-Entwicklungsmedien" bezeichnet werden.

Medium 1

Mineralstofflösung nach Murashigue und Skoog

Bestandteil Konzentration in mg/1 des Mediums

Ammoniumnitrat 1650

Kaliumnitrat 1900

Calciumchlorid-dihydrat 440

Magnesiumsulfat-heptahydrat 370

Monokaiiumphosphat 170

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"IER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

Heller-Spurenelementlösung: Identisch mit der für das Keimmedium verwendeten.

Als Fe EDTA bezeichnete Eisenquelle;

Bestandteil Konzentration in mg/1 des

Mediums

Äthylendiaminotetra- -.-, -,

eesigsäure-dihydrat

Eisen(II)-sulfat-heptahydrat 27,8 mg

Vitaminlösung B-:

Bestandteil Konzentration in mg/1 des

Mediums

Calciumpanthotenat 1

Pyridoxin 1

Nikotinsäure 1

Thiamin 1

meso-Inosit 10 Biotin 0,01

Wachstumsmodifizierungsmittel :

2-(2,4-Dichlor-phenoxy)-essigsäure 1 mg/1 des Mediums

6-(Furfurylamino)-purin (Kinetin) 1 mg/1 des Mediums

Kohlenstoffquelle: Glukose 30 000 mg/1 des Mediums

Verfestigungsmittel: Agar-Agar 6 000 mg/1 des Mediums

Man setzt Milch von unreifen Kokosnüssen bis zu einer Konzentration von 10%, das heißt 100 ml/1 des Mediums zu.

Das Medium wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und während 20 Minuten im Autoklaven unter einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert.

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Med ium 2

Das zur Bildung von primären Kallussen der Luzerne verwendete zweite Medium ist mit Ausnahme der Quelle für den organischen Kohlenstoff exakt identisch mit dem vorhergehenden Medium.

Im Fall des Mediums 2 ist die Glukose des Mediums 1 durch Lactose ersetzt. Quantitativ besitzt das Medium 2 eine solche Lactose-Konzentration, daß man nach der vollständigen Hydrolyse theoretisch die gleiche Hexosen-Konzentration erzielt wie mit dem Glukose-Medium 1.

Das Medium 2 enthält somit 30 000 mg/1 Lactose-monohydrat.

Nach dem Aufbringen der verschiedenen Pflanzenfragmente auf diese Medien hält man die mit Parafilm verschlossenen Röhrchen unter vollständig homogenen Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 23⁰C und unter Anwendung der folgenden Belichtungszyklen:

Lichtspektrum der Lampe des Typs Sylvania Gro-Lux, Lichtintensität = etwa 5000 Lux

Belichtungsperiode: 16 Stunden/Tag.

Diese Temperatur- und Belichtungsbedingungen sind jene, auf die in den folgenden Beispielen Bezug genommen ist.

Etwa 4 bis 6 Wochen nach dem Beginn des Züchtens der Pflanzenfragmente beobachtet man erhebliche Zellwucherungen.

Unabhängig von der Art des Organs (Wurzel, Stengel oder KeirtT-blatt), das zur Bildung der Zellwucherungen oder primären Kallusse verwendet wurde, beobachtet man auf den Medien 1 und äquivalente Erfolgsprozentsätze,

Weiterhin ist die Gestalt der Zellwucherungen auf den beider. Medien im wesentlichen identisch.

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Das Ausmaß und der Rhythmus des Wachsens der primären Kallusse der Luzerne wird daher nicht modifiziert, wenn man in den Nährmedien die Glukose durch Lactose ersetzt.

Nachdem man unter aseptischen Bedingungen die primäre Zellwucherung des Organfragments, das zu der Wucherung führte, abgetrennt hat, vermehrt man die Kallusse und züchtet die erhaltenen Stämme auf Medien, die identisch den Medien sind, die zur Bildung des primären Kallus verwendet wurden.

Die auf dem Medium 2 gezüchteten Stämme besitzen eine Wachstumsgeschwindigkeit, die im wesentlichen äquivalent derjenigen der Stämme ist, die auf dem Medium 1 gezüchtet werden.

Auch hier scheint die Form, in der der organische Kohlenstoff den Luzernezellen zugeführt wird (Glukose oder Lactose) keinen direkten Einfluß auf die Geschwindigkeit der Zellwucherung zu haben.

Beispiel 2

Bildung von Kallussen von Medicago sativa L. (Papilionaceae) auf einem modifizierten Medium und Vermehrung der Kallusse.

Bei dieser zweiten Untersuchungsreihe werden Bedingungen angewandt, die streng identisch sind mit den in Beispiel 1 angewandten, mit dem Unterschied, daß gleichzeitig eine Veränderung der Medien 1 und 2 erfolgt.

Das flüssige Eiweiß des unreifen Samenkorns des Kokosbaums (cocos nucifera L.) oder die "Kokosmilch" wird häufig als Mittel zur Förderung des Wachstums in Nährmedien verwendet, die zum Züchten von Pflanzengeweben eingesetzt werden.

Da seine Zusammensetzung und seine Wirkung nicht ausreichend definiert sind, wurden die Untersuchungen des Beispiels 1 wiederholt, wobei dieses Material nicht in den Nährmedien 1 und 2 verwendet

^wurde· 509886/1093

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KK

Es wurde festgestellt, daß sich unter diesen neuen Bedingungen die primären Kallusse in einem Ausmaß und mit einer Gestalt bilden, die im wesentlichen identisch mit den auf den Medien 1 und 2 erhaltenen Materialien sind.

In den beiden Fällen erfolgt das Auftreten der primären Kallusse später als bei den beiden Untersuchungen des Beispiels 1; und ihr Wachstum scheint weniger schnell abzulaufen.

Diese Beobachtungen werden nach dem Umpflanzen und dem Züchten der Stämme bestätigt.

Die NichtVerwendung der Kokosmilch hat somit keinen merklichen Unterschied zwischen den Kulturen auf dem Medium 1 und denen auf dem Medium 2 zur Folge. Sie hat, so scheint es, lediglich und gleichzeitig ihre Wirksamkeit vermindert.

Beispiel 3

Herstellung von Kallussen von Medicago sativa L. (Papilionaceae) auf einem in unterschiedlicher Weise modifizierten Medium und Vermehrung oder Vervielfachung der Kallusse.

Bei dieser dritten Untersuchungsreihe werden strikt identische Bedingungen, wie sie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden, angewandt, mit dem Unterschied, daß die Medien 2 der Beispiele 1 und 2 erneut verändert wurden.

Die in den Medien 2 als Quelle für organischen Kohlenstoff verwendete Lactose wird in diesem Fall durch "Lactosesaft" (jus lactose) ersetzt, den man durch Ultrafiltrieren der Milch erhält, und dessen bekannte Zusammensetzung die folgende ist:

Wasser 2,3 %

Glührückstand 6,0 %

Gesamtstickstoff 0,68%

Lactose 88,6 %

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TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

In quantitativer Hinsicht werden, um in diesen Medien die gleiche Lactosekonzentration wie in den Medien 2 der vorhergehenden Beispiele zu erzielen, 33,86 g des Lactosesaftes zugesetzt.

Unter diesen neuen Bedingungen lassen sich die Beobachtungen der Beispiele 1 und 2 bestätigen, das heißt:

Die Medien 1 (Glukosemedium) und 2 (Lactosesaft) ergeben ähnliche Resultate hinsichtlich der Bildung der primären Kallusse und hinsichtlich der WeiterZüchtung der aus diesen primären Kallussen gewonnenen Stämme.

Die Abwesenheit der Kokosmilch in den Medien 1 und 2 hat gleichzeitig ihre Wirksamkeit vermindert, jedoch keinen Unterschied zwischen den mit diesen Medien erhaltenen Ergebnissen zur Folge.

Beispiel 4

Anpassung eines Stammes von Medicago sativa L. (Papilionaceae) an das Lactosemedium

Man hat zuvor einen Luzernestamm hergestellt und vermehrt. Dieser Stamm, der als Stamm R18 bezeichnet wird, besitzt die folgenden Eigenschaften:

Er wächst in sterilen Petrischalen, die sich in einem Behälter mit einer Temperatur von 25⁰C in vollständiger und ständiger Dunkelheit befinden.

Morphologisch sind die Kulturen gelblich und in sehr kleine Kallusse aufgeteilt. Die Zellwucherungen sind nicht morphogen.

Das zu seiner Züchtung verwendete Nährmedium wird als Nährmedium L.E.1 bezeichnet und besitzt die folgende Zusammensetzung:

Mineralstoff lösung nach Murashique und Skoog·. (vgl. Beispiel 1)

Spurenelementlösung nach Murashigue und Skoog :

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Bestandteil

to

Borsäure

Mangansulfat-monohydrat Zinksulfat-tetrahydrat Kaliumjodid

Natriummolybdat-dihydrat Kobaltchlorid-hexahydrat

Eisenquelle:Fe EDTA-Lösung (vgl. Beispiel 1)

Vitaminlösung B₁; (vgl.Beispiel 1) Wachstumsmodifizierungsmittel'.

2-(2,4-Dichlor-phenoxy)-essigsäure

6-(Furfurylamino)-purin Quelle für organischen Kohlenstoff:

Saccharose
Verfestigungsmittel: Agar-Agar

Konzentration in mg/1 des Mediums

6,2
19,6
8,6
0,83
0,025
0,025

0,5 mg/1 des Mediums

0,1 mg/1 des Mediums

000 mg/1 des Mediums

Das Medium wird auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und während 20 Minuten im Autoklaven unter einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert. Der Umpflanzrhythmus beträgt 6 Wochen.

Das obige Medium (L.E.1) wird zu dem Medium L.E.2 modifiziert, indem man die Saccharose durch Lactose ersetzt. Quantitativ weist das Medium L.E.2 eine Lactosekonzentration auf, die absolut identisch ist mit der der Saccharose des Mediums L.E.1. Man verwendet somit 31600 mg Lactose-monohydrat pro Liter des Mediums L.E.2.

Nach 6 Wochen der Züchtung unter diesen Bedingungen beobachtet man, daß der Stamm R18 auf dem Medium L.E.2 ein starkes Wachstum zeigt, das jedoch etwas geringer ist als das Wachstum des gleichen Stammes auf dem Medium L.E.1.

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TE;R MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

Trotz dieses Unterschiedes werden diese beiden Stämme regelmäßig auf das entsprechende Medium umgepflanzt. Nach 4 oder 5 Umpflanzzyklen ist dieser Unterschied im Grad des Wachstums nicht mehr zu beobachten. Somit ist der Luzernestamm R18 progressiv modifiziert und angepaßt worden, so daß er in der Lage ist, die Lactose mit einer Ausbeute zu verarbeiten,die der zuvor mit Saccharose erzielten äquivalent ist.

Beispiel 5

Gewinnung von Glycina hispida L. (Papilionaceae) und Vermehrung der erhaltenen Kallusse.

Unter den gleichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 für die Luzernesamenkörner beschrieben wurden, bewirkt man eine sterile Keimung von Sojasamenkörnern des Ursprungs INRA.

Etwa 3 Wochen später beobachtet man in den Züchtungsröhrchen stark entwickelte Keimlinge, die das gesamte freie Volumen der Röhrchen ausfüllen.

Dann entnimmt man unter Einhaltung aseptischer Bedingungen die Keimblätter dieser Keimlinge und bringt sie in Röhrchen auf die folgenden Nährmedien auf:

1. Medium S₁

Mineralstofflösung:

Bestandteil Konzentration in mg/lg

des Mediums

Kaliumnitrat 2500

Ammoniumsulfat 134

Mononatriumphosphat- 150 monohydrat

Magnesiumsulfat-heptahydrat 250

Calciumchlorid-dihydrat 150

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R MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

Spurenelementlösung ; Bestandteil

Mangansulfat-monohydrat Borsäure Zinksulfat-heptahydrat Natr iummolybdat-dihydrat Kupfer(II)-sulfat-pentahydrat Kobalt(II)-chlorid-heptahydrat

Kaliumjodid Eisenquelle:

Pe EDTA-Lösung (siehe Beispiel 1) Vitaminlösung: Bestandteil

meso-Inosit Nikot insäure Thiamin Pyridoxin Wachstumsmodifizierungsmittel:

2-(2,4-Dichlor-phenoxy)-essigsäure

Quelle für den organischen Kohlenstoff:

Saccharose Verfestigungsmittel: Agar-Agar

Konzentration in mg/lg des Mediums

10 3 2

0,250 0,025 0,025 0,750

Konzentration in mg/1 des Mediums

100 1

10 1

mg/1 des Mediums

000 mg/1 des Mediums 000 mg/1 des Mediums

Man stellt das Medium erforderlichenfalls auf einen pH-Wert von 6 ein und sterilisiert es während 20 Minuten im Autoklaven bei einem Dampfdruck von 0,7 bar.

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2. Medium S.

Das Medium S„ ist mit Ausnahme der Quelle für den organischen Kohlenstoff mit dem Medium S. identisch. Im Fall des Mediums ! ist die in dem Medium S₁ verwendete Saccharose durch Lactose ersetzt worden.

In quantitativer Hinsicht weist das Medium S₂ eine Lactose-Konzentration auf, die absolut identisch ist mit der Saccharose-Konzentration des Mediums S-. Es werden somit 21 050 mg Lactosemonohydrat pro Liter des Mediums S₂ verwendet.

Die Röhrchen werden unter Züchtungsbedingungen gezüchtet, die ähnlich den Bedingungen sind, die in Beispiel 1 für die Luzernekulturen angewandt wurden.

Nach 4 bis 6 Wochen nach dem Beginn des Züchtungsvorganges beobachtet man primäre Zellwucherungen, die sich an der Peripherie der Keimblätter ausgebildet haben. Die Geschwindigkeit des Auftretens dieser ZeilWucherungen und ihre Gestalt sind auf den Medien S₁ und S₂ im wesentlichen gleich.

Das Ausmaß der Bildung und der Wachstumsrhythmus der primären Kallusse der Sojapflanzen scheinen somit nicht modifiziert zu werden, wenn man in den Nährmedien die Saccharose durch Lactose ersetz-t.

Beispiel 6

Anpassung eines Stammes von Vinca minor L. (Apocynaceae) an das Lactose-Medium,

Man bildet und züchtet eine erhebliche Population von Stämmen des blaublühenden Immergrüns. Diese Stämme unterscheiden sich durch verschiedene morphologische oder physiologische Eigenschaften.

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IR MEER · MÜLLER ■ STEINMEISTEiR

Einer dieser Stämme, der als Stamm 3 bezeichnet wird, weist die folgenden Eigenschaften auf:

Er wächst in den Röhrchen auf einem halbfesten Medium unter den Temperatur- und Beleuchtungs-Bedingungen, die in Beispiel 1 angegeben sind.

Morphologisch besitzen die Kallusse das folgende Aussehen:

Sie sind weiß und damit völlig ohne Chlorophyll, sie sind nicht morphogen,

sie sind nicht getrennt und

sie sind relativ wenig leicht zerreibbar oder bröckelnd.

Das zur Züchtung dieses Stammes verwendete Nährmedium, das als Nährmedium VO₁ bezeichnet wird, besitzt die folgende Zusammensetzung:

Heller-Mineralstofflösung:(vgl. Beispiel 1) Heller-Spurenelementlösung; (vgl. Beispiel 1) Eisen-Quelle: Eisen(III)-chlorid-hexahydrat 1 mg/1 des Mediums Vitaminlösung B..: (vgl. Beispiel 1)

Wachstumsmodifizierungsmittel:

2-(2,4-Dichlor-phenoxy)-essigsäure 0,1 mg/1 des Mediums Kohlenstoffquelle:

Glukose 30 000 mg/1 des Mediums

Verfestigungsmittel:

Agar-Agar 7 000 mg/1 des Mediums

Das Medium wird erforderlichenfalls auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt und während 20 Minuten im Autoklaven unter einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert.

Der Umpflanzrhythmus beträgt 6 Wochen.

Das Medium VO₁ wird in das Medium VO₂ verändert, indem man die Glukose durch Lactose ersetzt. Quantitativ weist das Medium V0_o eine solche Lactosekonzentration auf, daß man nach der voll"

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ständigen Hydrolyse eine theoretische Hexosen-Konzentration erhält, die identisch ist mit der Glukose-Konzentration des Mediums VO₁. Man verwendet somit 30 000 mg Lactose-Monohydrat pro Liter des Mediums VO2.

Nach dem normalen Wachstumszyklus, das heißt nach 6 Wochen, stellt man folgendes fest:

Kein Kallus der Kultur auf dem Medium VO2 ist nekrotisch, kein auf dem Medium VO₂ gezüchteter Kallus ist morphologisch von den auf dem Medium VO₁ gezüchteten zu unterscheiden, das mittlere Wachstum der auf dem Medium VO₂ gezüchteten Kallusse scheint geringfügig langsamer zu verlaufen als das Wachstum der auf dem Medium VO₁ gezüchteten Kallusse.

Die Steigerung des Frischgewichts, bezogen auf das Ausgangsimplantat, beträgt im ersten Fall etwa 150% und im zweiten Fall etwa 200%.

Die Stämme werden in den gleichen Medien und unter den gleichen Bedingungen während mehrerer Wachstumszyklen umgepflanzt. Nach 4 oder 5 aufeinanderfolgenden Umpflanzungen scheint kein merklicher Unterschied mehr zwischen dem Wachstumsgrad des Stammes 3, der auf dem Medium VO₁ gezüchtet wurde und dem des gleichen Stammes, der an das Medium VO₂ angepaßt worden ist, zu bestehen.

Der Stamm 3 ist damit derart modifiziert, daß er die Lactose als Quelle für den organischen Kohlenstoff mit einer Ausbeute verarbeiten kann, die der Ausbeute entspricht, mit der der Stamm vorher die Glukose verarbeitet hat.

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Beispiel 7

Anpassung eines Stammes von Vinca minor L. (Apocynaceae) an das Lactosemedium durch Selektion.

Von der Population der in Beispiel 6 beschriebenen Stämme des blaublühenden Immergrüns verwendet man den Stamm 13 zur Durchführung neuer Untersuchungen hinsichtlich der Verwendung von Lactose zur Züchtung von Pflanzengeweben.

Dieser Stamm besitzt die folgenden Eigenschaften: Er wächst unter den gleichen Bedingungen, wie der Stamm Nr.3 von Beispiel 6.

Morphologisch besitzen die Kallusse das folgende Aussehen: Sie sind sehr intensiv grün gefärbt und daher stark chlorophyllhalt ig,

sie sind nicht morphogen,
sie sind deutlich nicht getrennt und sie sind wesentlich leichter zu zerreiben als die des Stammes 3 von Beispiel 6.

Das Nährmedium, auf dem der Stamm gezüchtet wird, ist genau gleich dem, das zur Züchtung des Stamms 3 in Beispiel 6 angewandt wurde. Der Umpflanzrhythmus dieses Stammes 13 beträgt 6 Wochen.

Wie im Fall der in Beispiel 6 beschriebenen Untersuchungen trägt man die Kallusse des Stammes 13 gleichzeitig auf die Medien VO₁ und VO₂ auf.

Nach einer Züchtungszeit von 6 Wochen lassen sich die folgenden Beobachtungen machen:

80% der Kallusse, die auf dem Medium VO₂ gezüchtet wurden, sind nekrotisch,

gewisse der auf dem Medium VO₂ gezüchteten Kallusse sind morphologisch von jenen unterschieden, die auf dem Medium VO₁ gezüchtet wurden (beispielsweise was den Chlorophyllgehalt angeht), und

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das Wachstum der nicht-nekrotischen, auf dem Medium VO₂ gezüchteten Kallusse ist wesentlich geringer als das der Kallusse, die auf dem Medium VO- gezüchtet wurden.

Trotz dieser Ergebnisse werden die auf dem Medium VO₂ gezüchteten, nicht-nekrotischen Kallusse während mehrerer Wachstumszyklen auf das gleiche Medium umgepflanzt. Die beigefügte Fig.1 verdeutlicht die Entwicklung des Nekrose-Grades der auf dem Medium VO₂ gezüchteten Kallusse im Verlaufe der aufeinanderfolgenden Umpflanzungen. Man kann aus dieser Figur erkennen, daß der Prozentsatz der Nekrose nach dem fünften Wachstumszyklus auf dem Medium VO₂ im wesentlichen identisch ist mit dem, den man bei dem Medium VO₁ gezüchteten Stamm 13 beobachtet, das heißt 3%.

Vom Ende des dritten Wachstumszyklus an kann man anhand von morphologischen (Chlorophyllzustand) und physiologischen (mittlerer Wachstumsgrad) Kriterien, die aus dem auf dem Medium VO₂ gezüchteten Stamm 13 hervorgegangenen Kallusse in drei neue Stämme auftrennen, die als Stämme 13,..*, 13 .-, und 13 ,.. bezeichnet werden.

Der Stamm 13... ist ein chlorophyllhaltiger Stamm mit starkem Wachstumsgrad,

der Stamm 13,₂\ i-^{st e}iⁿ chlorophyllhaltiger Stamm mit mittlerem Wachstumsgrad und

der Stamm 13,^, in ein kein Chlorophyll enthaltender Stamm mit schwachem Wachstumsgrad.

Die Untersuchung der Wachstumsgrade oder Wachstumsgeschwindigkeiten während des vierten Umpflanzzyklus des auf dem Medium VO₁ gezüchteten Stammes 13 und des auf dem Medium VO₂ gezüchteten Stammes 13,... führt zu folgenden Ergebnissen;

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Das mittlere Wachstum bzw. die mittlere Zunahme des Frischgewichtes während eines Umpflanzzyklus, bezogen auf das Implantat, beträgt:

Im Fall des auf dem Medium VO₁ gezüchteten Stammes 13 265% und
im Fall des auf dem Medium VO₂ gezüchteten Stammes 13 ,^. 310%.

Die Entwicklung des Wassergehalts der Kallusse während des Wachstumszyklus war in beiden Fällen identisch und, im übrigen, praktisch zu vernachlässigen.

Ein klassischer statistischer Test zum Vergleich von Mittelwerten, das heißt der Test "t", zeigt, daß die beiden durchschnittlichen Prozentsätze des Wachstums einen signifikanten Unterschied mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von OC= 0,01 aufweisen.

Andererseits läßt die Fig.2 erkennen, daß die Verteilung der Wachstumsgrade in Abhängigkeit von dem Gewicht des Implantats einen deutlichen Unterschied zwischen dem auf dem Medium gezüchteten Stamm 13,... und dem auf dem Medium VO.. gezüchteten Stamm 13 aufweist.

Durch eine Selektion mit Hilfe von 5 Umpflanzungszyklen erhält man somit einen Stamm des blaublühenden Immergrüns (13,...), der Lactose als Hauptquelle für organischen Kohlenstoff mit einer Ausbeute verarbeitet, die größer ist als die zuvor mit Glukose erzielte.

Beispiel 8

Anpassung von Stämmen von Vica minor L. (Apocynaceae) an ein modifiziertes Lactosemedium.

In Beispiel 7 sind der Stamm 13 definitionsgemäß auf dem Medium VO. und der Stamm 13,... definitionsgemäß auf dem Medium VO₉ gezüchtet worden.

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TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

In diesem Beispiel wird versucht, diese beiden Stämme auf dem im folgenden angegebenen Medium VO, zu züchten.

Das Medium VO₃ ist mit dem Medium VO₁ und VO₂ mit Ausnahme der Quelle für den organischen Kohlenstoff identisch. Die in dem Medium VO₁ verwendete Glukose oder die in dem Medium VO₂ verwendete Lactose sind in dem Medium VO₃ durch "Lactosesaft", das heißt ein Ultrafiltrationsprodukt der Milch, ersetzt worden, dessen bekannte Zusammensetzung bereits in Beispiel 3 beschrieben wurde.

In quantitativer Hinsicht werden, um in dem Medium VO-. eine theoretisch zur Verfügung stehende Hexosekonzentration aufrechtzuerhalten, die mit der in dem Medium VO- oder der nach der potentiellen Hydrolyse der Lactose in dem Medium VO₂ erzielten identisch ist, 33 860 mg Lactosesaft pro Liter des Medxums VO₃ verwendet.

Für die beiden Stämme 13 und 13,... beobachtet man im wesentlichen identische Selektionsphänomene (Entwicklung des Prozentsatzes der Nekrose), wie sie in Beispiel 7 beschrieben wurden.

Der einzige merkliche Unterschied ist darin zu sehen, daß die Rückkehr zu dem normalen Nekrosegrad des Stammes 13 auf dem Medium VO. (etwa 3%) bei der Anpassung des Stammes 13 ,., auf das Medium VO₃ schneller verläuft als bei der Anpassung des Stammes 13 an das gleiche Medium,

Nach 4 oder 5 Umpflanzungszyklen sind die mittleren Wachstumsgrade der Stämme 13 und 13, ^ auf dem Medium VO₃ äquivalent denen des Stammes 13 auf dem Medium VO₁ oder des Stammes 13,.. auf dem Medium VO₂·

Der Ersatz der Glukose oder der Lactose durch "Lactosesaft" in den Nährmedien VO₁ und VO₂ ist somit, nach der Selektion, ohne Folge für die Ausnützung der Quelle des organischen Kohlenstoffs

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ER MEER · MÜLLER ■ STEINMEISTER

durch die Stämme des blaublühenden Immergrüns, die unter der Bezeichnung 13 definiert und klassifiziert sind.

Beispiel 9

Anpassung von Stämmen von Vinca minor L. (Apocynaceae) an ein in anderer Weise modifiziertes Lactosemedium.

In den Beispielen 7 und 8 sind der Stamm 13 auf dem Medium der Stamm 13,... auf dem Medium VO₂ Ui
auf dem Medium VO₃ gezüchtet worden.

der Stamm 13... auf dem Medium VO₂ und die Stämme 13 und 13

In diesem Beispiel werden die Stämme auf dem im folgenden angegebenen Medium VO. gezüchtet.

Das Medium VO₄ ist mit Ausnahme der Hauptquelle für den organischen Kohlenstoff absolut identisch mit den Medien VO₁, VO₂ und VO₃. Die Glukose des Mediums VO₁, die Lactose des Mediums VO₂ und der Lactosesaft des Mediums VO₃ sind in dem Medium VO- durch ein Lactoserum ersetzt, dessen bekannte Zusammensetzung die folgende ist:

Lactose	von	79,7	bis	81,6
Salze	von	8,65	bis	9,6
Essigsäure Stickstoffhaltige Materialien	von von	2,4 1 ,92	bis bis	3,84 2,88
Fettmaterialien	von	0,144	bis	0,173
Wasser	von	4	bis	5

Quantitativ verwendet man, um in dem Medium VO₄ eine Konzentration der theoretisch verfügbaren Hexose zu erzielen, die identisch ist mit der des Mediums VO₁ oder der der Medien VO₂ und VO₃ nach einer potentiellen Hydrolyse der Lactose, 37 190 mg Lactoseserum pro Liter des Mediums VO₄. Diese Konzentration ergibt sich auf der Grundlage eines mittleren Lactosegehalts von 80,65% in den Lactoserumproben.

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IER ML ER · MÜLLER ■ STEINMEISTER

In sämtlichen vier Stämmen (13 auf dem Medium VO₁, 1³(_Ίj dem Medium VO₂, 13 und 13₍₁, auf dem Medium VO₃), die man auf dem Medium VO₄ züchtet, beobachtet man ähnliche Selektionsphänomene (Entwicklung des Prozentsatzes der Nekrose), wie sie bei den Beispielen 7 und 8 festzustellen sind.

Es ist jedoch auf folgende bemerkenswerte Punkte hinzuweisen: Unter den angewandten experimentellen Bedingungen ist die direkte Anpassung des Stammes 13 auf dem Medium VO. auf das Medium VO₄ nicht möglich.

Wie in dem Beispiel 8 erfolgt die Rückkehr auf den üblichen Nekrosegrad des Stammes 13 auf dem Medium VO₁ (etwa 3%) bei der Anpassung des Stammes 13,... auf dem Medium VO₃ auf das Medium VO₄ schneller als die Anpassung des Stammes 13,.. ν auf dem Medium V0„ auf das Medium VO₄.

Nach 4 oder 5 Umpflanzzyklen sind die mittleren Wachstumsgrade der Stämme 13,.. χ auf dem Medium VO₄ im wesentlichen identisch mit denen der Stämme 13/., ^ auf den Medien VO₂ oder VO₃.

Der Ersatz der Lactose oder des Lactosesaftes durch Lactoserum in den Nährmedien VO₂ oder VO₃ ist daher, nach der Selektion der Stämme, ohne Folge auf die Verwertung der organischen Kohlenstoffquelle durch den Stamm des blaublühenden Immergrüns, der unter der Bezeichnung 13^x definiert und klassifiziert ist.

Beispiel 10

Anpassung eines Stamms von Vinca minor L (Apocynaceae) an das Wachstum auf einem filtrierten Medium,

In Beispiel 7 ist die Herstellung und die Züchtung des Stammes 13,.,» des blaublühenden Immergrüns beschrieben,dessen Eigenschaften die folgenden sind;

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TER MEER · MÜLLER ■ STEINMEISTER

Das Wachstum erfolgt unter den gleichen Bedingungen wie sie für den Stamm 13 des Beispiels 7 angewandt werden.

Morphologisch besitzen die Kallusse das folgende Aussehen; Sie sind sehr intensiv grün und daher stark chlorophyllhaltig,

sie sind nicht morphogen,

sie sind strikt nicht getrennt und

sie sind relativ leicht zu zerreiben.

Dieser Stamm wird auf dem in Beispiel 7 beschriebenen Medium VO₂ gezüchtet.

Sein Umpflanzrhythmus beträgt 5 Wochen, das heißt eine Woche weniger als der des Stammes 13. Dies manifestiert sich in einem schnelleren Wachstum des Stammes 13 ,.>, im Vergleich zu dem Wachstum des Stammes 13 (vgl. Fig.2 und Beispiel 7).

Dieser Stamm wird auf den folgenden beiden Medien gezüchtet: Dem in Beispiel 7 definierten Medium VO₂, das mit Hilfe eines Autoklaven sterilisiert worden ist, und dem gleichen Medium VO₂, das jedoch durch eine Membranfiltration sterilisiert worden ist.

Nach Ablauf des normalen Züchtungszyklus, das heißt nach Ablauf von 5 Wochen, ist es unmöglich, die Kallusse zu unterscheiden, die auf dem mit dem Autoklaven sterilisierten Medium VO₂ und dem durch Filtration sterilisierten Medium VO₂ gezüchtet worden sind, da sämtliche morphologischen und Wachstums-Eigenschaften identisch sind.

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TER MEER ■ MÜLLER · STEINMEISTER

Beispiel 11

Anpassung eines Stammes von Vinca minor L.( Apocynaceae) an das Wachstum auf einem Lactosemedium unter modifizierten Züchtungsbedingungen.

In Beispiel 7 ist die Gewinnung des Stammes 13,-, beschrieben, dessen Eigenschaften in dem Beispiel 10 angegeben sind.

Dieser Stamm 13,.., ist erneut in Röhrchen umgepflanzt worden, die das sterile Medium VO₂ enthalten. Dann bringt man die Röhrchen bei einer Temperatur von etwa 25⁰G in eine totale und ständige Dunkelheit ein.

5 Wochen nach Beginn des Züchtungsvorganges lassen sich folgende Feststellungen treffen;
Etwa 50% der Kallusse sind nekrotisch, die nicht-nekrotischen Kallusse besitzen ein anderes morphologisches Aussehen als die des anfänglich verwendeten Stammes 13,..,, da sie weißlich und damit praktisch nicht-chlorophyllhaltig und stärker getrennt sind.

Anschließend werden die nicht-nekrotischen Kallusse regelmäßig umgepflanzt. Nach 4 oder 5 Umpflanzzyklen beträgt der Prozentsatz der Nekrosen etwa 3%, das heißt er ist im wesentlichen identisch mit dem, den man normalerweise bei dem UrSprungsstamm 13,.., beobachtet,

Die Kallusse des blaublühenden Immergrüns, die als Stamm 13,.., definiert und klassifiziert sind, können somit nach der Anpassung in vollständiger und anhaltender Dunkelheit auf einem Lactosemedium gezüchtet werden.

Bei der gleichen Untersuchung wird der Stamm 13 auf dem Medium VO₁ gezüchtet. Bei diesem Stamm und bei diesen Bedingungen des Mediums kann man die gleichen Beobachtungen machen, wie sie oben hinsichtlich des Stammes 13,.., gemacht wurden.

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"ER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

Die Anpassung der Zellen des blaublühenden Immergrüns an ein Wachstum in vollständiger und permanenter Dunkelheit scheint somit absolut identische Phänomene zur Folge zu haben, ob man nun Zellen des Stammes 13 auf dem Glukosemedium oder Zellen des Stammes 13₍₁> auf dem Laktosemedium verwendet.

Beispiel 12

Züchtung eines Stammes von Vinca minor L. (Apocynaceae) auf einem flüssigen Lactosemedium

In den Beispielen 7 und 10 ist der Stamm 13,., auf einem halbfesten Lactosemedium gezüchtet worden.

Unter aseptischen Bedingungen entnimmt man die unteren Teile der Kallusse des Stammes 13,.,, das heißt die Teile, die mit dem halbfesten Medium VO₂ in Kontakt stehen. Sie sind leicht zu zerkleinern. Man überführt sie in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, der 50 ml des Mediums (VO₂)- enthält, das mit dem Medium VO₂ absolut identisch ist, mit Ausnahme der Tatsache, daß es kein Agar-Agar enthält. Es handelt sich somit um ein flüssiges Medium.

Nach dem Inokulieren mit den getrennten Fragmenten dieser unteren Teile der Kallusse des Stammes 13,... behandelt man die Kolben unter folgenden Bedingungen:

Man führt horizontale Kreisbewegungen ständig mit etwa 120 Umdrehungen pro Minute durch,

man wendet eine Umgebungstemperatur von etwa 23⁰C an und bewirkt pro 24 Stunden eine Belichtung während 16 Stunden mit einer Intensität von 250 bis 500 Lux.

Von den ersten 24 Stunden der Züchtung an beobachtet man eine Aufteilung der inokulierten Gewebemassen in Elemente kleinerer Gestalt mit flockigem Aussehen,

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ER MEIER -MÜLLER · STEINMEISTER

Man pflanzt die Kulturen jede Woche um. Bei den ersten Umpflanzungen erneuert man lediglich das Nährmedium, um die Dichte der Kultur progressiv zu steigern. Nachdem sie ausreichend hoch ist, reinokuliert man den das frische Medium enthaltenden Erlenmeyer-Kolben nur mit einem Teil der umgepflanzten Kultur. Im allgemeinen macht das Inokulum zwischen einem Drittel und der Halte der im Verlaufe von 7 Tagen erhaltenen Kultur aus.

Die Zunahme des Frischgewichts der Kulturen im Verlaufe einer Periode von 7 Tagen liegt, bezogen auf das Ausgangsinokulum, im Bereich von 100% bis 200%. Dieses Ergebnis ist im wesentlichen identisch mit dem, das man beim Züchten des Stammes 13 auf einem flüssigen Glukosemedium VO- unter den gleichen Bedingungen erzielt.

Die Tatsache der Züchtung der Zellen des Stammes des blaublühenden Immergrüns, der unter der Bezeichnung 13·... definiert und klassifiziert ist, auf dem halbfesten Medium VO₂, das als Hauptquelle für den organischen Kohlenstoff Lactose enthält, ist somit in keiner Weise mit einer Auftrennung und einer Züchtung dieses Stammes in einem flüssigen Medium unverträglich.

Der in dem flüssigen Medium VO₂ gezüchtete Stamm 13₍>> ergibt andererseits eine Lactoseausnützung, die äquivalent der Glukoseausnützung des in dem flüssigen Medium VO₁ gezüchteten Stammes 13 ist.

Beispiel 13

Progressive Anpassung eines Stammes von Atropa belladonna L. (Solanaceae) durch Selektion an ein Lactosemedium.

Man gewinnt und züchtet eine Population von Stämmen von Belladonna. Diese Stämme unterscheiden sich durch verschiedene morphologische und physiologische Eigenschaften.

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ER MEiER - MüLLLR · STEINMEISTER

Einer dieser Stämme, der Stamm Ab 709, besitzt die folgenden Eigenschaften:

Er wächst in Röhrchen auf einem halbfesten Medium unter den in Beispiel 1 angegebenen Temperatur- und Beleuchtungs-Bedingungen, morphologisch sind die Kallusse hellgrün und damit schwach chlorophyllhaltig; sie sind schwach morphogen, eindeutig nicht getrennt, sehr dicht und nicht zu zerreiben, das zur Züchtung bzw. Aufrechterhaltung dieser Stämme verwendete Nährmedium, das als Medium HGA₅ bezeichnet wird, besitzt die folgende Zusammensetzung:

Heller-Mineral stoff löung.· (vgl. Beispiel 1) Heller-Spurenelementlösung·, (vgl. Beispiel 1) Eisenquelle:

Eisen(III)-chlorid-hexahydrat 1 mg/1 des Mediums Vitaminlösung B^ ·. (vgl. Beispiel 1)
Wachstumsmodifizierungsmittel:

2-(2,4-Dichlor-phenoxy)-essigsäure 5 mg/1 des Mediums Kohlenstoffquelle:

Glukose 30 000 mg/1 des Mediums

Verfestigungsmedium:

Agar-Agar 7 000 mg/1 des Mediums

Milch von unreifen Kokosnüssen 100 mg/1 des Mediums.

Das Medium wird auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und während 20 Minuten im Autoklaven bei einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert.

Der Umpflanzrhythmus oder Pikierrhythmus dieses Stammes beträgt 7 Wochen.

Das Medium HGA₅ wird progressiv modifziert, indem man einen Teil der Glukose und schließlich die gesamte Glukose durch Lactose ersetzt. Quantitativ bereitet man 4 Typen von neuen Medien;

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TER MEER · MÜLLER ■ STEINMEISTER

Medium (HGAj-) . = 75% der Quelle für organischen Kohlenstoff

werden durch Glukose (22 500 mg/1) und 25% durch Lactose (das heißt 7500 mg Lactosemonohydrat pro Liter des Mediums) gestellt,

Medium (HGA₅J₂ = 50% Glukose und 50% Lactose, Medium (HGA₅J₃'= 25% Glukose und 75% Lactose, Medium (HGA₅J₄ = 100% Lactose, das heißt 30 0OO mg Lactose-

monohydrat pro Liter des Mediums.

Anschließend paßt man den Stamm Belladonna Ab 709 progressiv an das Medium (HGA₁-J₄ an, indem man ihn nacheinander und chronologisch auf den Medien (HGA₅J₁, (HGA₅J₂, (HGA₅J₃ und schließlich (HGA₅J₄ züchtet.

Die Anzahl der Umpflanzungen auf jedes der Medien erfolgt in Abhängigkeit von der Anpassungsgeschwindigkeit an das Medium. Nachdem die Anpassung an eines dieser Medien als vollzogen erscheint, pflanzt man den Stamm auf das folgende Medium usw., bis man eine Kultur des Stammes Ab 7O9 auf dem Medium (HGA₁. )₄ erhält.

In dieser Weise gewinnt man einen Stamm von Belladonna Ab 709, der modifiziert und darauf angepaßt ist, als Hauptquelle für organischen Kohlenstoff Lactose mit einer Ausbeute zu verwerten, die äquivalent seines vorherigen Glukoseverbrauchs ist.

Beispiel 14

Anpassung eines Stammes von Papavär Somniferum L. (Papaveraceae) an ein Lactosemedium.

Man gewinnt und züchtet eine Population von Mohnstämmen. Einer dieser Stämme, der Stamm P 501 besitzt die folgenden Eigenschaften:

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ER MEER · MÖLLER ■ STEINMEISTER

Er wächst in Röhrchen auf einem halbfesten Medium unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen hinsichtlich der Beleuchtung und der Temperatur,

morphologisch besitzen die Kallusse das folgende Aussehen: Sie sind gelblich und daher schwach chlorophyllhaltig, sie sind nicht morphogen,

sie sind sehr stark in kleine Elemente aufgeteilt und sind sehr leicht zu zerreiben.

Das zur Züchtung oder Aufrechterhaltung dieses Stammes verwendete Nährmedium G. besitzt folgende Zusammensetzung: Heller-Mineralstoff lösung.· (vgl. Beispiel 1) Heller-Spurenelementlösung: (vgl. Beispiel 1) Eisenquelle:

Eisen(III)-chlorid-hexahydrat 1 mg/1 des Mediums Vitaminlösung B. (vgl. Beispiel 1)
Wachstumsmodifizierungsmittel:

2-(2,4-Dichlor-phenoxy)-essigsäure 10 mg/1 des Mediums

6-(Furfurylamino)-purin 10 mg/1 des Mediums

Kohlenstoffquelle:

Glukose 30 000 mg/1 des Mediums

Verfestigungsmittel:

Agar-Agar 7 000 mg/1 des Mediums.

Das Medium wird auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt und im Autoklaven während 20 Minuten bei einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert.

Der Umpflanzrhythmus oder Pikierrhythmus dieses Stammes beträgt 5 Wochen.

Das Medium G. wird durch Ersatz der Glukose durch Lactose zu dem Medium G„ modifiziert.

Quantitativ besitzt das Medium G₂ eine Konzentration an Lactosemonohydrat von 30 000 mg/1, damit nach der theoretischen vollständigen Hydrolyse der Lactose die gleiche Hexosen-Konzentration vorliegt wie die Glukose-Konzentration des Mediums G-.

'-■ P, q R R G / 1 0 9 3

UiR MLl.R ■ MÜLLER · STEINMEISTER

Nach 5 Wochen der Züchtung des Stammes P_s 501 auf dem Medium G₂ beobachtet man folgendes:

Keiner der auf dem Medium G₂ gezüchteten Kallusse ist nekrotisch,

keiner der auf dem Medium G₂ gezüchteten Kallusse ist morphologisch von den auf dem Medium G₁ gezüchteten Kallussen zu unterscheiden,

das mittlere Wachstum der auf dem Medium G„ gezüchteten Kallusse ist nicht signifikant unterschiedlich von dem Wachstum der auf dem Medium G₁ gezüchteten Kallusse.

Demzufolge ist im ersten Wachstumszyklus auf dem Lactosemedium (G-,) festzustellen, daß die Mohnzellen des Stammes P_ 501 Lac-

Z, S

tose als Quelle für organischen Kohlenstoff mit einer Ausnutzung verwenden, die äquivalent ist ihrer vorhergehenden Ausnutzung der Glukose.

Beispiel 15

Anpassung eines Stammes von Digitalis purpurea L. (Scrofulariaceae) an ein Lactosemedium.

Man gewinnt und züchtet eine Population von Fingerhutstämmen. Einer dieser Stämme, der Stamm D 1 besitzt folgende Eigenschaften:

Er wächst entweder in Petrischalen oder in Röhrchen auf einem halbfesten Medium bei Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Temperatur- und Beleuchtungs-Bedingungen; morphologisch besitzen die Kallusse das folgende Aussehen: Sie sind sehr hellgrün, das heißt sehr schwach chlorophyllhaltig,

sie sind nicht morphogen,

sie sind sehr stark in kleine körnige Elemente aufgeteilt und sie sind sehr leicht zu zerreiben.

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TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

Das zur Züchtung dieses Stammes verwendete Nährmedium, das Medium M-, besitzt die folgende Zusammensetzung:

Mineralstofflösung nach Murashigue und Skoog:(vgl. Beispiel 1) Heller-Spurenelementlösung:(vgl. Beispiel 1) Eisen-Quelle:

Eisen(III)-chlorid-hexahydrat 1 mg/1 des Mediums Vitaminlösung B₁ '.(vgl. Beispiel 1)
Wachstumsmodifizierungsmittel:

OC-Naphthalin-essigsaure 1 mg/1 des Mediums

Verschiedenartige Verbindungen:

Glycin 3 mg/1 des Mediums

Quelle für organischen Kohlenstoff:

Glukose 30 000 mg/1 des Mediums

Verfestigungsmittel:

Agar-Agar 7 000 mg/1 des Mediums.

Das Medium wird auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und im Autoklaven während 20 Minuten unter einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert.

Der Umpflanzrhythmus des Stammes D 1 beträgt 6 Wochen.

Durch Ersetzen der Glukose durch Lactose modifiziert man das Medium M₁ zu dem Medium M₂-

Man verwendet in dem Medium M₂ 30 000 mg/1 Lactose-monohydrat, damit man nach der theoretisch vollständigen Hydrolyse dieses Materials eine Hexose-Konzentration erzielt, die identisch ist mit der Glukose-Konzentration des Mediums M₁,

Nach einem normalen Umpflanzzyklus, das heißt nach 6 Wochen der Züchtung des Stammes D 1 au
den Feststellungen treffen:

Züchtung des Stammes D 1 auf dem Medium M₂ kann man die folgen

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FER MEER · MÜLLER ■ STEINMEISTLR

Kein auf dem Medium M₂ gezüchteter Kallus ist nekrotisch, keiner der auf dem Medium M₂ gezüchteten Kallusse ist morphologisch von jenen unterscheidbar, die auf dem Medium M. gezüchtet worden sind,

das mittlere Wachstum der auf dem Medium M₂ gezüchteten Kallusse ist deutlich geringer als das der auf dem Medium M^ gezüchteten Kallusse. In der Tat zeigen etwa 25% der auf dem Medium M₂ gezüchteten Kallusse ein identisches Wachstum wie die auf dem Medium M₁ gezüchteten, während etwa 75% ein mehr oder weniger stark vermindertes Wachstum zeigen.

Trotz der nach dem ersten Umpflanzen erzielten mittleren Ergebnisse züchtet man die Kallusse mit einem guten Wachstum auf dem Medium M₂ weiter.

Nach 4 oder 5 Züchtungszyklen ist das mittlere Wachstum der auf dem Medium M„ gezüchteten Kallusse im wesentlichen identisch mit dem der auf dem Medium M₁ gezüchteten Kallusse.

Nach dem Anpassen können die Fingerhutzellen des Stammes D 1 somit die Lactose als Quelle für den organischen Kohlenstoff mit einer Ausnützung verarbeiten, die äquivalent ist ihrer vorherigen Ausnützung der Glukose.

Ausgehend von den in den obigen Beispielen angegebenen Ergebnissen kann man mehrere Hypothesen formulieren, die das Wachstum der Zellen von höheren Pflanzen auf Medien erklären, die als Hauptquelle für organischen Kohlenstoff nur Lactose enthalten.

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ER MEER ■ MÜLLER ■ STEINMEISTER

1. Hypothese

Die Lactose wird von den Zellen nicht verbraucht, da diese die notwendige Quelle für den organischen Kohlenstoff in der Milch der unreifen Kokosnüsse finden. Diese Hypothese wird insbesondere durch die gemäß den Beispielen 2 und 3 erzielten und dort beschriebenen Ergebnisse und auch durch die anderen Beispiele widerlegt, bei denen die Nährmedien keine Kokosmilch enthalten.

2. Hypthese

Die Lactose wird von den Zellen nicht verbraucht und der Mangel an organischem Kohlenstoff wird durch eine gesteigerte Photosynthese kompensiert. Diese Hypothese wird insbesondere durch die gemäß den Beispielen 4 und 11 erhaltenen und dort beschriebenen Ergebnisse (Züchtung im Dunkeln) und sämtliche Beispiele widerlegt, bei denen die Kallusse kein Chlorophyll enthalten.

3. Hypothese

Die Lactose wird von den Pflanzenzellen verbraucht, die jedoch nicht die für ihre Ausnützung notwendige Hydrolyse sicherstellen, da die Behandlung des Mediums im Autoklaven zu Veränderungen seiner Zusammensetzung und unter anderem zu einer Umwandlung der Lactose in Hexose zur Folge haben kann. Diese Hypothese kann aufgrund der in Beispiel 1O beschriebenen Ergebnisse nicht richtig sein.

4. Hypothese

Die Lactose wird durch die Zellen verbraucht, die in der Lage sind, sie zu hydrolysieren. Diese Hypothese wird dadurch bestätigt, daß die angepaßten oder selektionierten Pflanzenzellen tatsächlich in der Lage sind, die Lactose zu hydrolysieren. So konnte deutlich die Anwesenheit des Enzyms ß-Galaktosidase in den Kallussen von angepaßten oder selektionierten Stämmen und in dem Medium, in dem die Zellwucherung stattfand, festgestellt werden.

^u, η 9 B R R /1 η 9

TER MEER ■ MÜLLER ■ STEINMEISTER

3fr

Für diesen Nachweis wurde die folgende Technik angewandt:

Nach der Gewinnung von Extrakten der Enzyme aus den Kallussen und den Kulturmedien inkubiert man sie bei 37⁰C in Gegenwart eines spezifischen Substrats (ß-Phenyl-galaktosid, das von der Societe SIGMA erhältlich ist) und in Gegenwart eines Puffers mit einem pH-Wert von 7,7 (Natriumacetat/Essigsäure, 0,10 m). Man unterbricht die Reaktion durch Zugabe von Natriumhydroxid.

Das freigesetzte Phenol wird dann spektrophotometrisch bei 285 nm unter Bedingungen bestimmt, bei denen das Substrat nicht absorbiert.

Das in dieser Weise bestimmte freigesetzte Phenol verdeutlicht eine ß-Galaktosidase-Aktivität des genannten Substrats, das heißt die Anwesenheit des Enzyms ß-Galaktosidase in den Extrakten der Kallusse und der verwendeten Kulturmedien.

Durch Anpassung oder durch Selektion ist die genetische Regelung der Stämme modifiziert worden, sowohl was das Operon der ß-Galaktosidase anlangt als auch was andere Eigenschaften anlangt. So beschreibt das Beispiel 7 die Gewinnung von 3 Stämmen, 13,-w ¹^ (2) ^und ^³ (3)' deren Chlorophyllgehalte und Wachstumsverhalten unterschiedlich sind. Ihre Eigenschaften unterscheiden sich ferner von denen des UrsprungsStamms 13.

Weitere Beispiele bestätigen dieses Ergebnis und verdeutlichen ein verbessertes Wachstum der Stämme durch die Anpassung an das Lactosemedium.

Alle selektionierten oder angepaßten Stämme verhalten sich klassisch. Sie können, wie aus den vorhergehenden Beispielen hervorgeht, auf einem flüssigen oder einem verfestigten Medium wachsen, so daß sämtliche Techniken der industriellen Züchtung, beispielsweise die auf Pflanzenzellen angewandte Gärungstechnik, in diesem Fall angewandt werden können.

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ER MlIER ■ MÜLLER · STEINMEIS [ ER

Die industrielle Nutzung der mit Hilfe der beschriebenen Techniken in vitro gezüchteten Zellen kann ebenso unterschiedlich sein, wie es die Zellen oder die Gewebe der gleichen Arten, die unter Anwendung üblicher Bedingungen (insbesondere auf Glukose oder Saccharose) in vitro gezüchtet werden, oder die Pflanzen, von denen sie herstammen, sind.

Somit kann man mit Hilfe dieser Techniken pflanzliche Nahrungsmittelmassen herstellen, beispielsweise Proteine, ausgehend von Hülsenfrüchten, wie Luzerne oder Soja, Alkaloide, insbesondere ausgehend von Belladonna, Immergrün oder Mohn, Glukoside, beispielsweise ausgehend von Fingerhut, und unbeschränkt kann man jedes Produkt pflanzlichen Ursprungs gewinnen, das man ausgehend von einer Pflanze der Gruppe der Samenpflanzen (Phanerogamen) gewinnen kann, nämlich rohe Pflanzenmaterialien, Proteine, Enzyme, Essenzen, Duftstoffe, Pigmente, Steroide, Alkaloide, Flavone, Glukoside, antibakterielle Verbindungen, antivirale Verbindungen und gegen Tumore wirkende Verbindungen etc.

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Claims

TER MEER ■ MÜLLER ■ STEINMEISTER Patentansprüche

1. Verfahren zur Ernährung von in vitro-Kulturen von Pflanzenzellen, die von der Gruppe der Samenpflanzen (Phanerogamen) zugehörenden Arten stammen, mit Kohlenstoff, dadurch gekennzeichn et, daß man Lactose oder eine ihrer natürlichen Ursprungsformen als Hauptquelle für organischen Kohlenstoff verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lactose in Form des Zuckers selbst einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lactose in Form eines Rückstands der Milchindustrie verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichn et, daß man als Rückstand der Milchindustrie einen Lactosesaft oder ein Ultrafiltrationsprodukt der Milch verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Rückstand der Milchindustrie ein Lactoserum verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennz eichnet, daß das Medium zur Züchtung der Pflanzenzellen, mit Ausnahme der Hauptquelle für organischen Kohlenstoff, die durch Lactose oder eine ihrer natürlichen Ursprungsformen gestellt wird, die üblichen Nährstoffelemente enthält.

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TlIR MEER · MÜLLER · S TE1NMEISTER

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium mit Agar-Agar verfestigt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium in flüssiger Form verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8,dadurch gekenn-

z e i ch η e t, daß man das flüssige Kulturmedium in einer Fermentiereinrichtung verwendet.

10. Verfahren zur Schaffung von Pflanzenzellen, die in der Lage sind, in vitro normal auf einem Lactosemedium zu wachsen,' dadurch gekennzeichnet, daß man Stämme von Pflanzenzellen, die von der Gruppe der Samenpflanzen zugehörenden Arten stammen, an die Lactose anpaßt oder durch Selektion die geeigneten Stämme auswählt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennz eichnet, daß man direkt einen primären Kallus an das Lactosemedium anpaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nicht-progressive Selektion durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine progressive Selektion durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 1O, dadurch gekennzeichnet,daß man neue Stämme durch Modifizierung der genetischen Regelung dieser Zellen schafft.

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IER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Hauptmodifizierungen der genetischen Regulierung darin besteht, daß man das Operon der ß-Galaktosidase in Bezug auf die Enzymsynthese positiv beeinflußt.

16. Verwendung der gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 erhaltenen in vitro-Kulturen der Pflanzenzellen zur industriellen Gewinnung von Produkten pflanzlichen Ursprungs.

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