DE2311785C2

DE2311785C2 - Verfahren zur Herstellung eines modifizierten, aber undifferenzierten Stammes von Pflanzengewebe aus undifferenziertem Pflanzengewebe

Info

Publication number: DE2311785C2
Application number: DE19732311785
Authority: DE
Inventors: Claude London Gudin; Eric Twickenham Middlesex Peel
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1972-03-13
Filing date: 1973-03-09
Publication date: 1982-11-18
Also published as: DE2311785A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten, aber urfdifferenzterten Slamnies von Pflanzengewebe aus undifferenziertem Pflanzengewebe, welches auf einem ersten Nährmedium, das Zucker enthält, in Gegenwart von Licht und Kohlendioxid gezüchtet wird, wobei man einen Teil des wachsenden Gewebes entfernt und diesen Teil auf ein zweites Nährmedium überführt

Hierbei wird Pflanzengewebe durch Kultivierung eines Gewebekallus in einem Nährmedium, das einen Zucker und Nährstoffe enthält, gezüchtet Unter geregelten Bedingungen wächst das Gewebe durch Zellteilung, wobei weiteres Gewebe gebildet wird, ohne daß Differenzierung des Gewebes stattfindet

Die Züchtung von Pflanzengewebe in vitro in flüssigen Schüttkulturen oder auf Agar-N-Öhrmedien ist eine Methode, die für die Züchtung zahlreicher Pflanzenarten angewandt wird. Ein solches Verfahren der eingangs umrissenen Gattung wird ΐη American Journal of Botany, Jahrgang 50. 1963, S. 248—254, in einer Arbeit von A. C. Hildebrandt, |. C. Wilmar,

H. Johns und A. J. Riker beschrieben. Im Prinzip besteht vj S3 τ CTi αϊ ι PC Π U ST! Π, uSu ΓΐΐαΠ CiUCFi rvaiiüS, Wie cT beispielsweise bei Verletzungen entsteht, von einem Teil einer aseptischen Pflanze, die also ohne Infektionsgefahr von außen herangewachsen ist, entnimmt, ihn auf ein Nährmedium überführt und das Gewebe dem Licht aussetzt Das Gewebe wächst auf dem Nährmedium. Das Verfahren kann auch angewandt werden, um Pflanzenzellen in Suspension in einem flüssigen Nährmedium zu züchten.

Aus dem Artikel »Die Naturwissenschaften« 58, S. 318-320, (1971), ist ein Verfahren bekannt, bei welchem ebenso wie beim Anmeldegegenstand Wachstum von undifferenziertem Pflanzenmaterial aus isolierten Mesophyllprotoplasmen erzeugt wurde. Bei diesem Verfahren wurde ebenfalls ein Teil des Pflanzengewebes entfernt und auf ein zweites Nährmedium überführt, in welchem der Zuckergehalt geändert wurde. Bei diesem Verfahren wird jedoch im Gegensatz zum Anmeldegegenstand keine Modifizierung des undifferenzierten Gewebes vorgenommen, sondern es werden durch den Zuckergehalt nur verbesserte Wachstumsbedingungen geschaffen, wobei der Zuckergehalt im Gegensatz zum Anmeldegegenstand erhöht wurde. Ziel dieses bekannten Verfahrens ist die Gewinnung eines Materials, aus dem durch anschließende Anregung zur Differenzierung ganze Pflanzen zu gewinnen sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das eingangs umrissene Verfahren so weiterzubilden, daß das Gewebe eine erhöhte Kohlendic-idaufnahme hat und erhöhte Photosynthese gewährleistet. Diese Aufgabe v'ird dadurch gelöst, daß das zweite Nährmedium, auf welches man e^;nen Teil des wachsenden Gewebes überführt, weniger Zucker enthält. Diese Verringerung des Zuckergehaltes zwingt das Pflanzengewebe. den fehlenden Zucker aus dem angebotenen Licht und Kohlendioxid selbst zu erzeugen und dadurch erhöhtes Mengenwachstum zu gewährleisten. Dieses Material wächst schneller als die natürliche Pflanze.

Im Rahmen dieser Beschreibung ist unter Pflanzengewehe das Gewebe von Spermalophyta, d= h, also von Sarfienpflanzen, zu verstehen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann progressiv wiederholt Werden, indem jeweils ein Teil des Pflanzengewebes auf ein weiteres Nährmedium, das Weniger Zucker enlhältj übertragen Wird,

Dem zweiten Nährmedium wird Vorzugsweise eine Ungiftige, hichl verwertbare Substanz in einer solchen Menge zugesetzt, daß der osmotische Druck des

zweiten Nährmediums im wesentlichen der gleiche ist, wie der des ersten Nährmediums. Bevorzugt als Substanzen, die zur Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks des Nährmediums dienen, werden organische Verbindungen, z. B. Sorbit und Mannit und andere Zuckeralkohole. Auch anorganische Substanzen können verwendet werden, vorausgesetzt daß sie keine nachteiligen Wirkungen auf das Pflanzengewebe haben.

Die in jeder Stufe zuzusetzende Menge der Substanz kann berechnet werden, indem man den anfänglichen osmotischen Druck aus der anfänglichen molaren Zuckerkonzentration ermittelt und hieraus die Menge der Substanz berechnet, die zugesetzt werden muß, um den osmotischen Druck im wesentlichen aufrecht zu erhalten. Die Verwendung eines Zuckeralkohols hat z. B. den Vorteil, daß, da sein Molekulargewicht dicht bei dem des Zuckers liegt, die Gewichtskonzentration von Zucker plus Zuckeralkohol im wesentlichen konstant gehalten werden kann, wobei die Verminderung des Zuckergehalts durch eine Erhöhung des Zuckeralkoholgehalts ausgeglichen werden kann.

Es gibt zahlreiche bekannte Nährmedien, die für die Züchtung von Pflanzenzellgewebe verwendet werden. Sie enthalten im allgemeinen verschiedene Mineralstoffe, die als Nährstoffe benötigt und zuweilen als Makroelemente bezeichnet werden, und verschiedene Metallsalze, die zuweilen als Mikroeleirente bezeichnet werden. Ferner können verschiedene Aminosäuren, Vitamine und Pflanzenwachstumsregler vorhanden sein. Als Beispiele gebräuchlicher Nährmedien, die verwendet werden, sind die Nährmedien von Skoog, Heller, Knop, Skoog und l.'urashige, Gamborg, White und Street zu nennen. Diese Medien enthal-'^n unterschiedliche Mengen der verschiedenen Bestandteile. Als Quelle für Zucker werden Saccharose, Glucose >'rid Kokosnußmilch verwendet.

Zu den typischen Makroelementen gehören Stickstoff, Phosphor, Kalium, Calcium und Magnesium. Beispiele typischer Mikroelemente sind Eisen, Zink, Mangan. Kupfer, Nickel, Molybdän und Bor. -to

Die Zuckerkonzentrationen im ersten Nährmedium beim Verfahren gemäß der Erfindung betragen 20 bis 50 g/Liter, vorzugsweise etwa 30 g/Liter. Als Zucker wird vorzugsweise Glucose verwendet.

Die Nährmedien enthalten außerdem Pflanzenwachstumsregler, z. B. Auxine und Cytokinine, und Aminosäuren und Vitamine, z. B. Nicotinsäure. Thiamin, Glycin und Folsäure.

Vorzugsweise wird während der Züchtung des Pflanzengewebes eine erhöhte Lichtintensität angewendet. Beispielsweise kann mit Lichtintensitäten von 2600 bis 10 000 Lux, zum Beispiel etwa 7000 Lux gearbeitet werden, wobei während der ersten Züchtungsstufe das intensivere Licht angewandt wird, und beispielsweise Intensitäten von 5500 bis 10 000 Lux zur Einwirkung kommen.

Während der Züchtung des Pflanzengewebes wird die Konzentration von Kohlendioxid in der Atmosphäre vorzugsweise auf einen Wert erhöht, der höher ist als in der normalen Atmosphäre (0,03 bis 0,5 V0I./V0I.). Die Konzentration des Kohlendioxids kann erhöht werden, indem die Öffnung des Behälters, in dem das Gewebe Wächst, mit einer Membran, die für Kohlendioxid semipermeabel ist, bedeckt wird- Die Atmung in der Dunkelheit erhöht den Kohiendioxidgehalt der Atmo-Sphäre im Behälter. Wenn höhere Kohlendioxidkonzentrationen erforderlich sind, kann der Behälter Verschlossen Und der Partialdruck des Kohlendioxids im Behälter erhöht werden.

Das auf dem ersten Nährmedium wachsende Pflanzengewebe nimmt einen Teil des Kohlendioxids aus der Luft auf und absorbiert Licht, damit die Photosynthese stattfinden kann, wobei die im Gewebe vorhandenen Chloroplaste ausgenutzt werden. Der Wirkungsgrad der photosynthetischen Fähigkeit des Gewebes kann durch die Kohlendioxidaufnahme des Gewebes bestimmt werden. Ein Maß für die relativen photosynthetischen Fähigkeiten verschiedener Teile des wachsenden Gewebes kann durch visuelle Prüfung des wachsenden Gewebes erhalten werden, da die grüneren Teile aktivere Chloroplaste enthalten. Vorzugsweise wird der grünere Teil auf das zweite Näh.-medium überführt Durch Wiederholung des Vorganges der Oberführung eines Teils der Pflanze auf ein Nährmedium, das weniger Zucker enthält, ist es möglich, die Fähigkeit des Pflanzengewebes zur Photosynthese zu steigern. Das wachsende Pflanzengewebe entnimmt dann einen größeren Teil des Kohlenstoffs, den es zum Wachstum benötigt, aus dem Kohlendioxid in der Luft und einen geringeren Teil aus dem Zucker.

Das Gewebe kann aseptisch auf Agar in beliebigen geeigneten Behältern, die lichtdurchlässig sind, gezüchtet werden. Vorzugsweise werden Glasbehälter verwendet, weil sie indifferent und leicht sterilisi^rbar sind. Der Behälter sollte während der Züchtung des Gewebes bedeckt gehalten werden, um die Gefahr einer Verunreingiung durch Bakterien weitgehend auszuschalten.

Erfindungsgemäß ist es möglich, einen photosynthetischen Stamm gewisser Gewebe herzustellen, der den gesamten Kohlenhydratbedarf aus dem Kohlendioxid entnehmen und auf einem zuckerfreien Medium gezüchtet werden kann.

Zu den Pflanzengeweben, die in dieser Weise gezüchtet werden können, gehören die Gewebe von Gräsern wie Luzerne, Klee, Gemüse, r. B. Karotten, und Pflanzen,z. B.Tabak.

Beispiel 1

Kallus von der Pflanze Psoralea bituminosa wurde in Gläsern auf Skoog-Medium gezüchtet, das 3 Gew.-% Saccharose enthielt (30 g/Liter). Die Öffnungen der Gläser wurden mit einer Folie aus Polyäthylen hoher Dichte verschlossen. Das Gewebe wurde unter Bedingungen von langen Tagen (16 Stunden hell) in einer Lichtintensität von 7000 Lux unter farbgemischten Quecksilberwolfram-Widerstandslampen gezüchtet. Es wurde einige Zeit dem Wachstum überlassen, worauf die Gewebeteile der intensivsten grünen Farbe ausgewählt und auf frisches Medium verpflanzt wurden. Dieser Prozeß von Wachstum und Auswahl wurde während einer Zeit Von 6 Monaten wiederholt. Die Atmungs* und Photosyntheseraten des Kaliüs iri jeder Auswahlstufe wurden durch Infraröt-Gäsanalyse (für CC^-VerbraUch) Und mit der Sauerstoffelektrode (für ÖVbh)

) g

Die Zusammensetzung des Skoog-Mediums ist in Beispiel 2 genannt.

Tabelle I

Zustand von Psoralea-Kallus

Geschwindigkeit der Photo-

synthese*)

(μ.ΜοΙ gebundenes CO₂Zg

Trockengewicht/Stunde)

Zu Beginn hellgrün 1

mittelgrün 16

sehr grün 38

nach lömonatiger Auswahl 78

mit Neubildungen 119

Nachdem durch diesen Prozeß ein dunkelgrüner Kai- ^I5 lus erhalten worden war, wurde die Saccharosekonzentration im Medium verringert

Tabelle 2

20

Saccharose	Geschwindigkeit	Gerchwmdrgkeit
konzentration	der Photosynthese*)	der Photosynthese/
des Mediums	(μ,Μο! freigesetztes	Atm üngsgesch win
	O₂/g Frischgewicht/	digkeit 25
	Std.

Gläsern auf Skoog-Medium gezüchtet, das 3Gew.-% Saccharose enthielt (30 g/Liter). Die öffnungen der Glaser wurden mit einer Folie aus Polyäthylen hoher Dichte verschlossen. Das Gewebe wurde unter Bedingungen von langen Tagen (16 Stunden hell) in einer Lichtintensität von 7000 Lux unter farbgemischten Queci-'silberwolfram-Widerstandslampen gezüchtet Das Gewebe wurde einige Zeit dem Wachstum überlassen, worauf die Gewebeteile mit der intensivsten grünen Farbe ausgewählt und auf frisches Medium verpflanzt wurden. Bei Verwendung des gleichen Mediums, das Glucose enthielt, wurde durch in Augenscheinnahme gefunden, daß die Zahl von Chloroplasten pro Pflanzenzelle von 6 bis 8 bei dem auf Saccharose gezüchteten Gewebe auf 14 bis 18 bei dem auf Glucose gezüchteten Gewebe gestiegen war.

Dieser Prozeß wurde unter Verwendung verschiedener Mengen von Glucose wiederholt Die Atmungsgeschwindigkeiten wurden durch Infrarot-Gasanalyse (für CO2-Verbrauch) und mit der Sauerstoffelektrode (für 02-Raten) gemessen.

30 g/Liter
3,75 g/Liter

2,5
2,8

0,3 0,7

30

*) Jedes ^iMoI gebundenes CO₂ setzt 1^MoI O₂ frei.

35

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Erfindung die Züchtung von Gewebe auf einem Medium mit verringertem Zuckergehalt ermöglicht

Beispiel 2
Kallus ton der Pflanze Psoralea bituminosa wurde in

40

Makroeleinente	g/Liter
KNO₃ MgSO₄7H₂O CaCI₃ · 2H₂O KH₂PO₄ NH₄NO₃	1,900 0,370 0,440 0,170 1.650
Mikroelemente	mg/Liter

H,BO₃	10,000
MnSO₄ · 4H₂O	25,00
CuSO₄ · 5H₂O	0,025
Na₂MoO₄ - 2H₂O	0,250
Na₂EDTA	0,027
FeSO₄ · 7H₂O	0,037

Aminosäuren und Vitamine, mg/Liter

Pflanzenwachstumsregler
mg/Liter

Nicotinsäure	0,005
Mesoinosit	0,100
Pyrodoxin HCl	5X10"¹
Thiamin HCI	5 X10-"
Biotin	5X10-5
Folsäure	5 X10-»
Glycin	0,002
Glutamin	0,200

Naphthylessigsäure 3 X10—*
Kinetin 2X10-⁴

Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 genannt. Das gebundene CO₂ ist dem freigesetztem Sauerstoff äquivalent.

Tabelle 3

Medium

LilrarotgasanalyseU
PD RD

PU/RD

Sauerstoflelektrode2)

P2J/R2)

normales Skoög-Medium
Skoog + 3Og Giucnse/l
Skoog + 2Og Glucose/1
Skoog + 1Og Glucose/i

4,81	8,36	0,58	7,30	8,80	0,83
2,53	8,57	0,29	2,45	4,55	0,54
2,61	5,74	0,45	3,25	9,25	0,35
3.21	6.42	0.50	6.65	10 fiS	Odd

Fortsetzung

Medium

Infrarotgasanalyse»
pi) RD

Sauerstoffeiektrode2>

p2) R2) P2I/R2)

Skoog +5g Glucose/1
Skoog + 1 g Glucose/I
Skoog +Og Glucose/1 + 1% CO₂

P = Ptiotosynthese; R = Atmung.

D die Zahlen bedeuten y MoI CO₂/g Frischgewicht/Stunde.

²> die Zahlen bedeuten y Mol CVg Firschgewicht/Stunde.

3,24	10,52	0,31	4,85	6,65	0,73
3,39	2,26	1,50	4,90	5,25	0,93
1,81	1,81	1,00	4,20	4,60	0,91

Die Ergebnisse auf Basis des Trockengewichts an der Sauerstofielektrode sind in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4

Glucosegehalt des Mediums	Geschwindigkeit der	Atmungsgeschwindigkeit	P/R
g/i	Photosynthese P	R
	(jiMol Oj/g Trocken	(_μΜο1O₂/g Trocken
	gewicht/Stunde	gewicht/Stunde
30	52,5	111	0,54
20	40,5	115	0,35
10	93,0	168	0,66
5	227,0	311	0,73
1	130,0	140	0,93
0 + 1% CO,	69,0	75	0,91

B e i s ρ i e I 3 _J5

Kallus von der Pflanze Psoralea bituminosa wurde in Gläsern auf Skoog-Medium gezüchtet, das 3 Gew.-% Glucose (30 g/Liter) enthielt Die Öffnungen der Gläser wurden mit einer Folie aus Polyäthylen hoher Dichte verschlossen. Das Gewebe wurde unter Bedingungen von langen Tagen (16 Stunden hell) in einer Lichtintensität von 7000 Lux unter farbgemischten Quecksilberwolfram-Widerstandslampen gezüchtet Es wurde einige Zeit dem Wachstum überlassen, worauf die Gewebeteile mit der intensivsten grünen Farbe ausgewählt und auf frisches Medium verpflanzt, das weniger Glucose, aber Sorbit in einer genügenden Menge enthielt, um die Konzentration von Glucose plus Sorbit konstant zu halten. Dieser Prozeß wurde über einen Zeitraum von Wochen wiederholt. Die Geschwindigkeiten der Atmung und Fotosynthese des Kallus in jeder Auswahlstufe wurden durch Infrarot-Gasanalyse (CO₂-Verbrauch) und mit der Sauerstoffelektrode (O₂-Raten) gemessen. Die Kohlendioxidkonzentration wurde auf 1 VoL-% erhöht. Das Skoog-Medium hatte die in Beispiel 2 genannte Zusammensetzung.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Das gebundene CO₂ ist dem freigesetzten Sauerstoff äquivalent

Tabelle 5

Glucose	Sorbit	R*^MolO₂/g	Ρ*)μΜθ1 O₂/g	P/R
g/Liter	g/Liter	Trockengewicht/Stunde	Trockengewicht/Stunde
30	0	111	52,5	0,54
20	10	115	40.5	035
10	20	168	93,0	0,66
5	25	311	227	0,73
1	29	140	130	0,93
0	30	77,6	77,6	1,00
0 +1% CO₂	30	47,5	474	1,00

*) gemessen bei 16500 Lux.

Claims

1 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten, aberundifferenzierten Stammes von Pflanzengewebe aus undifferenziertem Pflanzengewebe, welches auf einem ersten Nährmedium, das Zucker enthält, in Gegenwart von Licht und Kohlendioxid gezüchtet wird, wobei man einen Teil des wachsenden Gewebes entfennt und diesen T;il auf ein zweites Nährmedium überführt, dadurch gekennzeichnet, dalil· das zweite Nährmedium weniger Zucker enthält

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem zweiten Nährmedium eine ungiftige, nicht verwertbare Substanz in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß der osmotische Druck des zweiten Nährmediums im wesentlichen der gleiche ist wie der des ersten Nährmediums, und die ungiftige, nicht verwertbare Substanz ein Zuckeralkohol ist und der geannnte Zucker Glucose ist und in einer Konzentration von 20 bis 50 Gramm pro Liter im ersten Nährmedium vorliegL

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtintensität während des Gewebewachstums zwischen 2600 und 10 000 Lux, vorzugsweise zwischen 5500 und 10 000 Lux, beträgt

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Kohlendioxids in der Atmosphäre, in welcher das Gewebe gezüchtet wird, während das Wachstums erhöht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung des Züchtungsgefäßes mit einer für Kohlendioxid semipermeablen Membran verschlossen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchtungsgefäß verschlossen ist und der Partialdruck des Kohlendioxids im Gefäß vergrößert wird.

7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des wachsenden Gewebes, welcher entfernt wird, grüner ist als der zurückbleibende Teil.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7. dadurch gekennzeichnet, daß nach Übertragung eines Teils des Pflanzengewebes auf das zweite Nährmedium das Gewebe dort gezüchtet wird und ein Teil des auf dem zweiten Nährmedium wachsenden Gewebes auf ein drittes Nährmedium übertragen wird, welches weniger Zucker als das zweite Nährmedium enthält

Q. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von Nährmedien, die immer geringere Zuckerkonzentration aufweisen, verwendet werden und jeweils ein Teil des wachsenden Gewebes von einem Nährmedium mit höherer Zuckerkonzentralion zu einem Nährmedium mit niedrigerer Zuckerkonzentration übertragen wird, wobei das Nährmedium niedrigster Zuckerkonzentration Vorzugsweise keinen oder praktisch keinen Zückergehalt riie'hf¹ aufweist