DE3786794T2

DE3786794T2 - Verahren zur vermehrung von knollen.

Info

Publication number: DE3786794T2
Application number: DE87907824T
Authority: DE
Inventors: Motomu Akita; Shinsaku Takayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-12-02
Filing date: 1987-11-27
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2007-11-28
Also published as: US5034327A; JPH078189B1; WO1988004136A1; EP0293488B1; DE3786794D1; EP0293488A1; EP0293488A4

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vermehrung in großem Maßstab von Knollen bildenden Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe Kartoffeln, Colocasia esculenta ("taro"), Amdophophallus konjak ("konjak"), geflecktem Aronstab, Scopolia japonica und Diosconea ("Chinese yam") und insbesondere Kartoffeln.
Verschiedene Verfahren der Gewebekultur sind zur Vermehrung von Kartoffeln vorgeschlagen worden.
Man weiß beispielsweise, daß Kartoffelknollen erhalten werden können, indem man Kartoffelgewebe züchtet bis eine Kartoffelpflanze entsteht, die Wurzeln und die Blätter von der erhaltenen Pflanze entfernt und den Stamm in Flüssigkultur züchtet bis die Knolle entstanden ist: CIP Circular, Bd. 13, Nr. 4, Dezember, (1985), Seite 1 bis 5; und Plant Cell, Tissue and Organ Culture 7 (1986), 3-10. In diesem Verfahren erfolgt die Züchtung in einer Flasche in einer dünn verteilten Schicht des Kulturmediums, so daß die Knollen in der Luftphase gebildet werden. Die Zahl der erzeugten Knollen ist jedoch nicht groß.
Man weiß auch, daß Kartoffelknollen in einem Kulturmedium durch eine wiederholte Teilung der Knolle vermehrt werden können: American Potato Journal 55 (1978), 691- 701. Selbst in den effizientesten Verfahren wurden jedoch nur 140 Knollen in 16 Wochen erhalten.
Außerdem sind kleine Kartoffelknollen mit einem Gewicht von 0,1 bis 0,7 g durch das in Soshiki Baiyo (Gewebekultur) 11 (9) (1985), 391-395, beschriebene Verfahren erhalten worden.
Die Züchtung erfolgte in einem kleinen Gefäß unter Verwendung eines einzigen Mediums, wobei die Herstellung der Knollen etwa 100 Tage dauerte, und ist in sich ungeeignet für eine Verwendung in großem Maßstab.
Colocasia esculenta ("Taro"), Diosconea ("Chinese yam") und der gefleckte Aronstab sind durch Verfahren zur Züchtung von Pflanzengewebe vermehrt worden, allerdings nur mit geringer Effizienz: Yasai Shikenjo Hokoku A (Bericht A der Laboratorien für Gemüse) 9 (1981), 1-46, und Soshiki Baiyo (Gewebekultur) 11 (1985), 372-376.
Es besteht somit noch ein Bedarf für ein effizientes Verfahren zur Züchtung von Gewebe zur Vermehrung in großem Maßstab von Geweben der Wurzelknollen von Kartoffeln, Colocasia esculenta ("Taro"), Amdophophallus konjak ("konjak"), geflecktem Aronstab, Scopolia japonica und Diosconea ("Chinese yam").
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein verbessertes Verfahren zur Vermehrung in großem Maßstab durch Gewebekultur von Knollen bildenden Pflanzen bereitgestellt, ausgewählt aus der Gruppe Kartoffeln, Colocasia esculenta ("taro"), Amdophophallus konjak ("konjak"), geflecktem Aronstab, Scopolia japonica und Diosconea ("Chinese yam") umfassend:
A) keimfreies Züchten des Pflanzengewebes der ausgewählten Species in einem Kulturmedium bis zu einer anfänglichen Pflanzengröße, die 10 cm nicht überschreitet, wobei das Gewebe zumindest einen Vegetationspunkt enthält,
B) keimfreies Aufteilen des gezüchteten, nach Schritt A) erhaltenen Pflanzenmaterials und überführen des aufgeteilten Materials in ein neues flüssiges Kulturmedium, das eine geeignete Kohlenstoffquelle mit einer Konzentration von 60 g/l oder weniger enthält,
C) Weiterzüchten des aufgeteilten Pflanzenmaterials in dem neuen Kulturmedium bei einer Beleuchtungsstärke von 200 bis 10 000 Lux zum Erhalt eines vermehrten Pflanzenmaterials mit einer durchschnittlichen Pflanzengröße im Bereich von 15 bis 30 cm,
D) Zugeben von neuer Kulturflüssigkeit im Falle, daß 90% des gezüchteten, nach Schritt C) erhaltenen Pflanzenmaterials in das Kulturmedium nicht eintauchen, bis 90% des gezüchteten Pflanzenmaterials eingetaucht sind,
E) Steigern der Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem flüssigen Kulturmedium auf 60 bis 150 g/l und Weiterzüchten, allerdings bei einer Beleuchtung von 200 Lux oder weniger,
F) fortschreitendes Reduzieren des Volumens der Kulturflüssigkeit während Schritt E) bis sich 50 bis 98% des vermehrten Pflanzenmaterials über dem Spiegel des Kulturmediums und sich im wesentlichen in der Luftphase über der Kulturflüssigkeit befinden, wobei ein vermehrtes Pflanzenmaterial hergestellt wird, umfassend die Knollen, Corme, Rhizome oder ein anderes knollenförmiges Wurzelgewebe der fraglichen Pflanze,
G) Gewinnen der besagten Knollen, Corme, Rhizome oder des anderen knollenförmigen Wurzelgewebes aus der Pflanzenkultur am Ende von Schritt F).
Die Erfindung wird hier nachstehend weitestgehend bezüglich Kartoffeln beschrieben, obwohl es sich von selbst versteht, daß die beschriebenen Verfahren, Bedingungen und Stoffe auch für die Züchtung der anderen aufgeführten Pflanzen gelten, nämlich für Colocasia esculenta ("taro"), Amdophophallus konjak ("konjak"), gefleckten Aronstab, Scopolia japonica und Diosconea ("Chinese yam").
Bezüglich der Vermehrung von Kartoffeln in großem Maßstab durch das erfindungsgemäße Verfahren wird zunächst eine Startkultur durch keimfreie Züchtung von Gewebe einer Kartoffelpflanze etabliert, beispielsweise von einen Vegetationspunkt enthaltendem Gewebe des Stamms, Blattes, der Wurzel oder Knolle, bis zu einer anfänglichen Pflanzengröße, die 10 cm nicht überschreitet. Das Pflanzenmaterial wird anschließend aufgeteilt und in ein neues flüssiges Kulturmedium überführt, vorzugsweise 5 bis 50 Stück/l, zum Weiterzüchten unter den Bedingungen, die hier nachstehend genauer beschrieben werden sollen.
Für jeden der Züchtungsschritte kann jedes geeignete natürliche oder synthetische Kulturmedium verwendet werden, sofern es die notwendigen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Stoffe etc. enthält.
Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Saccharose, Maltose, Fructose, Glucose, Melasse etc . .
Zu Stickstoffquellen gehören Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Calciumnitrat, Ammoniumsulfat, Aminosäuren (Glycin, Glutaminsäure, Lysin, Asparaginsäure etc.), Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Kokosmilch etc . .
Zu den in den Kulturmedien vorhandenen anorganischen Stoffen kann jeder der nachstehend aufgeführten gehören: Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Manganchlorid, Nickelchlorid, Kobaltchlorid, Aluminiumchlorid, Eisenchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Nickelsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat, Monokaliumphosphat, Kaliumiodid, Borsäure, Natriummolybdat etc . .
Falls erforderlich, und üblicherweise, werden die Medien auch weitere Wachstumsfaktoren enthalten, zu denen beispielsweise ein oder mehrere Cytokinine gehören können, Benzyladenin (hier nachstehend als BA bezeichnet), N-(2- Chlor-4-pyridin)-N-phenylharnstoff (hier nachstehend als 4PU bezeichnet), Kinetin, Chlorcholinhydrochlorid, Abscisinsäure, Vitamin B&sub1;, Inosit, Pyridoxinhydrochlorid, Nicotinsäure, Thiaminhydrochlorid, Biotin etc.
übliche geeignete Kulturmedien sind beispielsweise Murashige-Skoog-Medium, Erickson-Medium, White-Medium, Linsmayer-Skoog-Medium etc.
Die bevorzugten Kohlenstoffquellen sind Glucose und Saccharose, die in Schritt B bei einer Anfangskonzentration von 60 g/l oder weniger verwendet werden, während in Schritt E bei einer Beleuchtungsstärke von 200 Lux oder weniger weitergezüchtet wird.
Nach dem anfänglichen Züchten und Aufteilen wird in einem neuen Kulturmedium, in dem die Konzentration der Kohlenstoffquelle 60 g/l oder weniger, vorzugsweise 25 bis 35 g/l ist, weitergezüchtet und bei einer Tiefe des Mediums von 12 cm oder weniger, vorzugsweise 5 bis 10 cm, einer Temperatur von 10 bis 35ºC, einer Beleuchtungsstärke von 200 bis 10 000 Lux, einem pH-Wert von 4 bis 8 und einer Belüftungsrate von 0,01 bis 0,5 vvm, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 vvm, bis das gezüchtete Pflanzenmaterial durchschnittlich 15 bis 30 cm lang ist. Dies dauert üblicherweise 20 bis 60 Tage.
In dieser Phase werden die Kulturbedingungen verändert, um das Wachstum der Knollen zu induzieren.
Anfänglich wird der Kultur gegebenenfalls neues Medium zugesetzt, bis mindestens 30% des gezüchteten Pflanzenmaterials eingetaucht sind. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle, die bevorzugt Saccharose ist, wird anschließend auf 60 bis 150 g/l, vorzugsweise 80 bis 100 g/l, erhöht. Das Züchten wird bei einer Temperatur von 10 bis 35ºC, einer Beleuchtungsstärke von 200 Lux oder weniger, vorzugsweise im Dunkeln, und bei einem pH-Wert von 4 bis 8 fortgesetzt, wobei die Kulturflüssigkeit fortschreitend entfernt wird bis sich 50 bis 98% des gezüchteten Pflanzenmaterials über dem Kulturmedium befinden. Dies dauert üblicherweise 20 bis 90 Tage.
Die allmähliche Reduktion des Volumens des flüssigen Mediums kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden. Beispielsweise kann die Verdampfungsgeschwindigkeit der Kulturflüssigkeit durch Belüftung der Kultur erhöht werden. In einer anderen Ausführungsform kann das flüssige Medium einfach dekantiert werden, oder es kann eine Kombination von beiden verwendet werden.
Bei der Reduktion des Volumens des flüssigen Mediums durch Verdunstung kann die Belüftungsrate auf einen Wert im Bereich von 0,8 bis 2,2 vvm erhöht werden, der über dem in Schritt (A) verwendeten liegt. Die direkte Dekantierung des flüssigen Mediums wird vorzugsweise in 3 bis 10 aufeinander folgenden Schritten durchgeführt, wobei begonnen wird, wenn die Bildung von Kartoffelknollen im Bereich der Phasengrenze zwischen dem Medium und der Luftphase beobachtet wird. In dieser Phase können beispielsweise 10 bis 20% des Mediums verworfen werden.
Am Ende der Züchtung werden Kartoffelknollen erhalten, von denen viele ein Gewicht von 1 g oder mehr aufweisen.
Bei den anderen Arten, wie Colocasia esculenta ("taro"), Amdophophallus konjak ("konjak"), geflecktem Aronstab, Scopolia japonica und Diosconea ("Chinese yam"), erfolgt die Züchtung genau in der gleichen vorstehend für Kartoffelkulturen beschriebenen Weise.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Kartoffel-Corme wurden (20 Minuten bei 121ºC) in 10 ml sterilisiertem Murashige-Skoog-Medium gepflanzt, das eine in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung aufwies und sich in einem Teströhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Länge von 125 mm befand, und bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) etwa einen Monat gezüchtet, wonach 20 auf eine Größe von etwa 10 cm herangewachsene Kartoffelpflanzen erhalten wurden. Die Pflanzen wurden anschließend an jedem Glied geteilt und in einen 16 l Fermenter überführt, der 5 l eines flüssigen, bis zu 9 cm tiefen Mediums enthielt. Das flüssige Medium wies die in Tabelle 1 dargestellte, allerdings Agar-freie Zusammensetzung auf. Es wurde 3 Wochen bei 25ºC unter kontinuierlicher Beleuchtung (4000 Lux) gezüchtet, wobei ständig mit einer Geschwindigkeit von 0,1 vvm belüftet wurde. Nach drei Wochen hatten die Pflanzen eine durchschnittliche Länge von 20 cm erreicht. Das Kulturmedium wurde anschließend durch 10 l eines neuen flüssigen Mediums mit der gleichen, allerdings Agar-freien und Saccharose in einer Konzentration von 9% (Gew./Vol.) enthaltenden, in Tabelle 1 dargestellten Zusammensetzung vollständig ersetzt.
Das Medium im Fermenter war nun 18 cm tief. Die Züchtung wurde bei 25ºC bei einer Belüftungsrate von etwa 0,1 vvm fortgesetzt, allerdings in vollständiger Dunkelheit. Nach fünf Tagen wurde eine Knollenbildung im wesentlichen im Bereich der Phasengrenze zwischen dem Medium und der Luftphase festgestellt. 2 l des Kulturmediums wurden anschließend zur Senkung der Flüssigkeitsoberfläche dekantiert und die Züchtung fortgesetzt. Vier weitere 2 l Volumina Medium wurden in Abständen von 5 Tagen entnommen, wodurch der Spiegel der Kulturflüssigkeit fortschreitend gesenkt wurde.
Nach 45 Tagen kontinuierlicher Züchtung blieb eine Restmenge Kulturflüssigkeit von 0,8 l mit einer Tiefe von 1 cm. In dieser Phase reichten etwa 95% des gezüchteten, jedoch nicht verdorbenen Pflanzenmaterials in die Luftphase hinein. Insgesamt wurden etwa 370 Knollen aus der Luftphase und der Phasengrenze des Mediums mit der Luftphase gesammelt. 80 von ihnen wogen 1 g oder mehr.

Tabelle 1. Murashige-Skoog-Medium

Ammoniumnitrat 1650 mg
Kaliumnitrat 1900 mg
Calciumchlorid Dihydrat 440 mg
Magnesiumsulfat Heptahydrat 370 mg
Kaliumdihydrogenphosphat 170 mg
Na&sub2;·EDTA-Dihydrat 37,3 mg
Eisensulfat Heptahydrat 27,8 mg
Borsäure 6,2 mg
Mangansulfat Tetrahydrat 22,3 mg
Zinksulfat Heptahydrat 8,6 mg
Kaliumiodid 0,83 mg
Natriummolybdat Dihydrat 0,25 mg
Kupfersulfat 0,025 mg
Kobaltchlorid 0,025 mg
Vitamin B&sub1; 0,40 mg
Inosit 100 mg
Pyridoxinhydrochlorid 0,50 mg
Nicotinsäure 0,50 mg
Glycin 2,00 mg
Saccharose 30,0 g
Agar 8,0 g
Entionisiertes Wasser bis zu 1 Liter
0,1 N NaOH bis zu pH-Wert 6,2

Beispiel 2

Kartoffel-Corme wurden in 10 ml Murashige-Skoog-Medium gepflanzt, das die in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung aufwies und sich in einem Teströhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Länge von 125 mm befand, und bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) gezüchtet, bis das Pflanzenmaterial auf etwa 10 cm herangewachsen war. Das Pflanzenmaterial wurde anschließend an jedem Glied geteilt, wobei 100 Pflanzenteile erhalten wurden, die anschließend in einen 8 l Fermenter überführt wurden, der 2 l eines neuen flüssigen Mediums enthielt, das die in Tabelle 1 gezeigte, allerdings Agarfreie Zusammensetzung aufwies und 8 cm tief war. Es wurde vier Wochen bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (4000 Lux) gezüchtet, wobei ständig mit einer Rate von 0,1 vvm belüftet wurde. Nach vier Wochen waren die Pflanzen auf eine durchschnittliche Länge von 25 cm herangewachsen. Das Kulturmedium wurde anschließend durch 6 l eines neuen flüssigen Mediums vollständig ersetzt, das die in Tabelle 1 dargestellte, allerdings Agar-freie und eine erhöhte Saccharose-Konzentration von 9% (Gew./Vol.) enthaltende Zusammensetzung aufwies; Tiefe des Mediums: 23 cm. Die Züchtung wurde bei Dunkelheit 4 Wochen bei 25ºC mit einer Belüftungsrate von 0,8 vvm fortgesetzt. Nach Ablauf dieser Zeit waren etwa 2 l Kulturmedium mit einer Tiefe von 8 cm übrig, wobei etwa 70% des gezüchteten Pflanzenmaterials in die Luftphase hineinreichten. Insgesamt wurden etwa 390 Kartoffelknollen mit einem Gesamtgewicht von mehr als 300 g erhalten. 110 der Knollen wogen 1 g oder mehr.
In einem gesonderten Experiment wurde die Züchtung in einer ähnlichen Weise durchgeführt, abgesehen davon, daß die Belüftungsrate auf 0,1 vvm reduziert wurde. Am Ende der Züchtung verblieben etwa 5,2 l Medium bei einer Tiefe von 19 cm. 250 Kartoffelknollen mit einem Gesamtgewicht von etwa 210 g wurden erhalten. 80 der Knollen wogen 1 g oder mehr.

Beispiel 3

Gewebeschnitte, die Vegetationspunkte enthielten, wurden durch Präparieren der Knospen der Corme von Colocasia esculenta ("taro") (Art: Ishikawa Wase) unter einem Stereomikroskop unter keimfreien Bedingungen erhalten. Die gesammelten Gewebeschnitte wurden anschließend in 10 ml Murashige-Skoog-Medium gegeben, das die in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung aufwies, wobei das Teströhrchen einen Durchmesser von 25 mm und eine Länge von 125 mm aufwies. Diese Schnitte wurden etwa 3 Monate bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) gezüchtet. Die erhaltenen Pflanzen wurden anschließend in eine 300 ml-Flasche überführt, die 100 ml neues flüssiges Medium mit der in Tabelle 1 dargestellten, allerdings Agar-freien Zusammensetzung enthielt. Die Schüttel-Suspensionskultur (180 UpM) wurde bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) durchgeführt. Nach zwei Monaten kontinuierlicher Züchtung wurden 250 Pflanzen erhalten. Diese wurden aus der Flasche steril entfernt, in 10 Gruppen von 25 Pflanzen aufgeteilt, von denen jede Gruppe in eine 300 ml-Flasche überführt wurde, die 100 ml neues flüssiges Medium enthielt, das die gleiche vorstehend beschriebene Zusammensetzung aufwies. Mit jeder Flasche wurde die Schüttel-Suspensionskultur (180 UpM) zur Vermehrung der Pflanzen einen Monat bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) durchgeführt. Am Ende des Monats wurden die vermehrten Pflanzen jeder Flasche erneut in 10 Gruppen aufgeteilt und jede Gruppe noch einmal in eine neue, ein neues Kulturmedium enthaltende Flasche überführt und einen weiteren Monat unter den gleichen Kulturbedingungen gezüchtet, und der gesamte Arbeitsgang wurde 20 Mal wiederholt. Während dieses sich wiederholenden Kreislaufs erhöhte sich die Zahl der Pflanzen in jeder Flasche allmählich zu einer durchschnittlichen Enddichte von 700 Pflanzen pro Flasche. Die Inhalte von 3 Flaschen wurden anschließend in einen 8 l-Fermenter verpflanzt, der 6 l neues flüssiges Medium bei einer Tiefe von etwa 23 cm enthielt, wobei das flüssige Medium, abgesehen von einer auf 9% (Gew./Vol.) erhöhten Saccharose-Konzentration, im wesentlichen die gleiche Zusammensetzung wie zuvor aufwies. Die Züchtung wurde einen weiteren Monat bei 25ºC bei einer Belüftungsrate von 0,1 vvm unter den Bedingungen einer kontinuierlichen Beleuchtung (2500 Lux) fortgesetzt bis die Pflanzen eine durchschnittliche hänge von 23 cm erreicht hatten. Die Belüftungsrate wurde anschließend auf 2 vvm erhöht und die Züchtung einen weiteren Monat fortgesetzt. Während dieses Zeitabschnitts verdampfte das flüssige Medium allmählich, so daß die vermehrten Pflanzen fortschreitend in die Luftphase oberhalb des Kulturmediums hineinreichten. Am Ende eines Monats verblieben 1,2 l flüssiges Kulturmedium mit einer Tiefe von 5 cm. In dieser Phase befanden sich 80% des gezüchteten, jedoch nicht-verdorbenen Pflanzenmaterials in der Luftphase. In diesem Stadium wurden die Pflanzen aus dem Vermehrungsgefäß entfernt und untersucht. Die basalen Teile von fast allen Pflanzen waren dicker geworden und hatten Corme gebildet, wobei etwa 2900 Corme in jedem Fermenter gebildet wurden. Das Gesamtgewicht der erzeugten Corme betrug 0,8 kg bei einem durchschnittlichen Gewicht der Corme von 0,3 g. 370 Corme mit einem Gewicht von mehr als 1 g wurden erhalten. Im Gegensatz dazu wurden mit einer gesonderten Charge an vermehrten Pflanzen die letzten Stadien der Züchtung ohne Veränderung der Belüftungsrate, die auf 0,1 vvm gehalten wurde, wiederholt. Nach zwei Monaten verblieben 4,7 l Kulturmedium mit einer Tiefe von 18 cm. Unter diesen Umständen wurden nur 430 "taro"-Corme pro Fermenter erhalten, Corm-Gesamtgewicht: 130 g, Durchschnittsgewicht jedes Corms: 0,3 g. Nur 65 1 g oder mehr wiegende Corme wurden erhalten.

Beispiel 4

"Konjak"-Corme wurden in Wasser-absorbierendes, mit 500 ppm BA imprägniertes Papier und auch noch in ein Blatt aus Vinyl eingewickelt, um einen Feuchtigkeitsverlust durch Verdunstung zu verhindern. Nachdem die Corme 7 Tage bei 25ºC gestanden hatten, entwickelte jedes Corm etwa 100 axilläre Knospen bis zu einer Größe von 3 mm bis 10 mm. Von diesen Knospen wurden die Vegetationspunkte keimfrei unter einem Stereomikroskop präpariert und unter keimfreien Bedingungen gesammelt. Die präparierten Vegetationspunkte wurden anschließend in 10 ml Murashige-Skoog-Medium überführt, das die in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung aufwies, allerdings noch mit 4 PU in einer Konzentration von 1 mg/l versetzt war, wobei das Medium in einem Teströhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Länge von 125 mm enthalten war. Die Pflanzen wurden anschließend 5 Monate bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) gezüchtet. Nach Ablauf dieses Zeitraums wurden die aus jedem Röhrchen erhaltenen Pflanzen keimfrei in 10 Gruppen aufgeteilt und jede Gruppe zur Fortsetzung der Züchtung in neues flüssiges Medium verpflanzt, wobei der gesamte Subkultur-Zyclus 5 Mal wiederholt wurde. Nach der Subkultur wurden die Inhalte der 20 Teströhrchen in einen 8 l- Fermenter verpflanzt, der 6 l eines flüssigen Kulturmediums enthielt mit der gleichen zuvor beschriebenen, allerdings Agar-freien und eine auf 9% (Gew./Vol.) erhöhte Saccharose- Konzentration enthaltenden Zusammensetzung. Die Kulturflüssigkeit war in diesem Stadium 23 cm tief. Es wurde 60 Tage bei 25ºC bei einer Belüftungsrate von 0,2 vvm unter den Bedingungen einer kontinuierlichen Beleuchtung (2500 Lux) gezüchtet, bis die Pflanzen eine durchschnittliche Länge von 18 cm erreicht hatten.
Die Belüftungsrate wurde in diesem Stadium auf 1,5 vvm erhöht und die Züchtung einen weiteren Monat fortgesetzt, in dessen Verlauf das flüssige Medium allmählich verdampfte, so daß sich die vermehrten Pflanzen fortschreitend oberhalb des Flüssigkeitsspiegels und in der Luftphase befanden. Am Ende eines Monats verblieben 1,7 l flüssiges Kulturmedium mit einer Tiefe von 6 cm. In diesem Stadium befanden sich etwa 60% des gezüchteten, jedoch nicht-verdorbenen Pflanzenmaterials in der Luftphase. Von diesem Material wurden etwa 1800 "konjak"-Corme aus jedem Fermenter erhalten, Gesamtgewicht: 1,2 kg mit einem Durchschnittsgewicht der Corme von 0,7 g. Die Zahl der Corme, die 1 g oder mehr wogen, betrug dabei 270.
Im Gegensatz dazu wurden bei der Wiederholung der letzten Stadien des Züchtungsverfahrens über einen Zeitraum von zwei Monaten ohne Veränderung der Belüftungsrate nur 47 "konjak"-Corme pro Fermenter produziert.

Beispiel 5

Vegetationspunkte der Knospen des gefleckten Aronstabs wurden keimfrei unter einem Stereomikroskop präpariert, in 10 ml Murashige-Skoog-Medium überführt, das die in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung aufwies und sich in einem 125 mm Teströhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm befand, und 3 Monate bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) gezüchtet. Die Pflanzen wurden fortlaufend in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise subkultiviert. Nach dem Stadium der Subkultur wurde das vermehrte Pflanzenmaterial von 3 Flaschen in einen 8 l-Fermenter überführt, der 6 l eines flüssigen Kulturmediums enthielt mit der in Tabelle 1 dargestellten, allerdings Agar-freien und eine auf 9% (Gew./Vol.) erhöhte Saccharose- Konzentration aufweisenden Zusammensetzung, wobei das Medium 23 cm tief war. Die Züchtung erfolgte 40 Tage bei 25ºC bei einer Belüftungsrate von 0,1 vvm unter den Bedingungen einer kontinuierlichen Beleuchtung (2500 Lux), bis die Pflanzen eine durchschnittliche Länge von 20 cm erreicht hatten. Die Züchtung wurde anschließend bei einer erhöhten Belüftungsrate von 1,5 vvm einen weiteren Monat fortgesetzt. Im Verlaufe dieses einen Monats verdampfte das flüssige Medium allmählich, so daß sich das vermehrte Pflanzenmaterial fortschreitend oberhalb des flüssigen Mediums und in der Luftphase befand. Am Ende eines Monats blieb ein Rückstand an Kulturmedium von 2,0 l mit einer Tiefe von 8 cm, wobei sich etwa 80% des Pflanzenmaterials in der Luftphase befanden und nicht verdorben waren. 3600 Corme des gefleckten Aronstabes wurden pro Fermenter erhalten, Gesamtgewicht: 1,8 kg mit einem Durchschnittsgewicht der Corme von 0,5 g. Die Zahl der Corme, die 1 g oder mehr wogen, betrug dabei 280.
Bei der Wiederholung der letzten Stadien des Züchtungsverfahrens ohne Veränderung der Belüftungsrate über einen Zeitraum von zwei Monaten wurden nur 430 Corme des gefleckten Aronstabes pro Fermenter produziert, Gesamtgewicht pro Fermenter 180 g, Durchschnittsgewicht 0,3 g. Es wurden kaum Corme erhalten, die 1 g oder mehr wogen.

Beispiel 6

Die Vegetationspunkte der Knospen der Stiele des "Chinese yam" wurden keimfrei unter einem Stereomikroskop präpariert und in ein 125 mm Teströhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm überführt, das 10 ml Murashige-Skoog-Medium enthielt, das die in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung aufwies)allerdings noch mit 0,1 mg/l Naphthalinsäure und 0,1 mg/l BA versetzt war. Es wurde 5 Monate bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) gezüchtet. Die Pflanzen wurden anschließend in eine 300 ml-Flasche verpflanzt, die 100 ml neues flüssiges Medium der gleichen zuvor beschriebenen, allerdings Agar-freien Zusammensetzung enthielt. Die Schüttel-Suspensionskultur (180 UpM) wurde anschließend 2 Monate bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) durchgeführt. Die so erhaltenen 120 Pflanzen wurden in 10 Gruppen von jeweils 12 Pflanzen aufgeteilt, von denen jede Gruppe anschließend jeweils in eine 300 ml-Flasche verpflanzt wurde, die jeweils 100 ml neues flüssiges Medium enthielt, das die gleiche vorstehend beschriebene Zusammensetzung aufwies. Die Schüttel- Suspensionskultur (180 UpM) wurde zur Vermehrung der Pflanzen für jede Flasche zwei Monate bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) durchgeführt, wobei die Aufteilung und der Prozeß der Subkultur insgesamt 3 Mal wiederholt wurden. Nach der fortlaufenden Subkultur wurden die vermehrten Pflanzen aus 3 Flaschen in einen 8 l- Fermenter überführt, der 6 l neues flüssiges Medium bei einer Tiefe von 23 cm enthielt. Die Zusammensetzung des Mediums entsprach der in Tabelle 1 dargestellten, wobei allerdings kein Agar enthalten und die Saccharose-Konzentration auf 9% (Gew./Vol.) erhöht war. Die Züchtung wurde zwei Monate bei 25ºC bei einer Belüftungsrate von 0,1 vvm unter den Bedingungen einer kontinuierlichen Beleuchtung (2500 Lux) durchgeführt bis die Pflanzen eine durchschnittliche Länge von 24 cm erreicht hatten. Die Züchtung wurde zwei weitere Monate, allerdings mit einer auf 2 vvm erhöhten Belüftungsrate, fortgesetzt. Während dieses Zeitabschnitts verdampfte das flüssige Medium allmählich, so daß die vermehrten Pflanzen fortschreitend in die Luftphase oberhalb des flüssigen Mediums hineinreichten. Im Verlauf von zwei Monaten erniedrigte sich das flüssige Kulturmedium auf 0,7 l mit einer Tiefe von 3 cm, wobei sich 85% der gesamten Pflanzen in der Luftphase befanden und nicht verdorben waren. 1900 knollenförmige Wurzeln von "Chinese yam" wurden pro Fermenter erhalten, Gesamtgewicht pro Fermenter 0,4 kg, durchschnittliches Knollengewicht 0,2 g.
Die letzten Stadien des Züchtungsverfahrens wurden unter Verwendung einer anderen Pflanzen-Charge aus der Subkultur jedoch ohne Steigerung der Belüftungsrate über einen Zeitraum von vier Monaten wiederholt. Unter diesen Umständen blieb ein Rückstand von 4,7 l an flüssigem Medium, das 18 cm tief war. Die Ausbeute erniedrigte sich auf 800 knollenförmige Wurzeln pro Fermenter, Gesamtgewicht 140 g, und ein Durchschnittsgewicht von 0,18 g.

Beispiel 7

Die Vegetationspunkte der Knospen der Rhizome von Scopolia japonica wurden keimfrei unter einem Stereomikroskop bis zu einer Größe von 3 mm präpariert und in ein 125 mm Teströhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm überführt, das 10 ml Murashige-Skoog-Medium enthielt, das die in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung aufwies. Es wurde 2 Monate bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) gezüchtet. Die Pflanzen wurden anschließend in ein zweites, gleich großes Teströhrchen verpflanzt, das 10 ml des gleichen, allerdings mit BA bis zu einer Konzentration von 1 mg/l versetzten Morashige-Skoog-Mediums enthielt.
Die Züchtung wurde 40 Tage bei 25ºC unter kontinuierlichen Beleuchtungsbedingungen (2500 Lux) durchgeführt. In diesem Stadium wurden die Pflanzen keimfrei in 10 Gruppen aufgeteilt, die anschließend jeweils in neues Medium verpflanzt wurden, das die gleiche vorstehend beschriebene Zusammensetzung aufwies, und zur weiteren Vermehrung der Pflanzen in einer ähnlichen Weise subkultiviert. 20 der so vermehrten Pflanzen wurden anschließend in einen 8 l- Fermenter verpflanzt, der 6 l neues flüssiges Medium mit einer Tiefe von etwa 23 cm enthielt. Das flüssige Kulturmedium wies die in Tabelle 1 dargestellte Zusammensetzung auf, die allerdings Agar-frei war, mit 1 mg/l&sub1; BA versetzt war und eine auf 9% (Gew./Vol.) erhöhte Saccharose-Konzentration enthielt.
Die Züchtung wurde zwei Monate bei 25ºC bei einer Belüftungsrate von 0,1 vvm unter Bedingungen einer kontinuierlichen Beleuchtung (2500 Lux) durchgeführt bis die Pflanzen eine durchschnittliche Länge von 20 cm erreicht hatten. In diesem Stadium wurde die Belüftungsrate auf 1 vvm erhöht und die Züchtung ohne Veränderung der anderen Bedingungen weitere eineinhalb Monate fortgesetzt. Während dieses Zeitabschnitts verdampfte das flüssige Medium allmählich, so daß am Ende des Züchtungsverfahrens der Rückstand an flüssigem Medium 2 l betrug und eine Tiefe von 8 cm aufwies, wobei etwa 50% der gesamten Pflanzen in die Luftphase hineinreichten und nicht verdorben waren. In diesem Stadium wurden die Pflanzen entfernt und die auf den unteren Teilen der Pflanzen gebildeten Rhizome mit einer Ausbeute von 670 Rhizomen pro Fermenter gewonnen.
Wenn dagegen die letzten Stadien des Züchtungsverfahrens 3,5 Monate lang ohne Veränderung der Belüftungsrate durchgeführt werden, erniedrigt sich die Rhizom-Ausbeute auf 420 pro Fermenter.

Claims

1. Verfahren zur Vermehrung in großem Maßstab von Knollen bildenden Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe Kartoffeln, Colocasia esculenta ("taro"), Amdophophallus konjak ("konjak"), geflecktem Aronstab, Scopolia japonica und Diosconea ("Chinese yam") durch Gewebekultur umfassend:

A) keimfreies Züchten des Pflanzengewebes der ausgewählten Species in einem Kulturmedium bis zu einer anfänglichen Pflanzengröße, die 10 cm nicht überschreitet, wobei das Gewebe zumindest einen Vegetationspunkt enthält,

B) keimfreies Aufteilen des gezüchteten, nach Schritt A) erhaltenen Pflanzenmaterials und Überführen des aufgeteilten Materials in ein neues flüssiges Kulturmedium, das eine geeignete Kohlenstoffquelle mit einer Konzentration von 60 g/l oder weniger enthält,

C) Weiterzüchten des aufgeteilten Pflanzenmaterials in dem neuen Kulturmedium bei einer Beleuchtungsstärke von 200 bis 10 000 Lux zum Erhalt eines vermehrten Pflanzenmaterials mit einer durchschnittlichen Pflanzengröße im Bereich von 15 bis 30 cm,

D) Zugeben von neuer Kulturflüssigkeit im Falle, daß 90% des gezüchteten, nach Schritt C) erhaltenen Pflanzenmaterials in das Kulturmedium nicht eintauchen, bis 90% des gezüchteten Pflanzenmaterials eingetaucht sind,

E) Steigern der Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem flüssigen Kulturmedium auf 60 bis 150 g/l und Weiterzüchten, allerdings bei einer Beleuchtung von 200 Lux oder weniger,

F) fortschreitendes Reduzieren des Volumens der Kulturflüssigkeit während Schritt E) bis sich 50 bis 98% des vermehrten Pflanzenmaterials über dem Spiegel des Kulturmediums und sich im wesentlichen in der Luftphase über der Kulturflüssigkeit befinden, wobei ein vermehrtes Pflanzenmaterial hergestellt wird, umfassend die Knollen, Corme, Rhizome oder ein anderes knollenförmiges Wurzelgewebe der fraglichen Pflanze,

G) Gewinnen der besagten Knollen, Corme, Rhizome oder des anderen knollenförmigen Wurzelgewebes aus der Pflanzenkultur am Ende von Schritt F).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Schritt C) das aufgeteilte Pflanzenmaterial bei einer Konzentration von 5 bis 50 Pflanzenstücken pro Liter Kulturmedium gezüchtet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kohlenstoffquelle Glucose oder Saccharose ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Schritt C) die fortgesetzte Vermehrung der Pflanzenstücke bei einer Glucose- oder Saccharosekonzentration im Bereich von 25 bis 35 g/l, einer Temperatur im Bereich von 10 bis 35ºC, einer Beleuchtungsstärke im Bereich von 200 bis 10 000 Lux, einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 8 und einer Belüftungsrate von 0,01 bis 0,5 vvm durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei Schritt E) die Glucose- oder Saccharosekonzentration auf 80 bis 100 g/l erhöht wird und die fortgesetzte Vermehrung bei einer Temperatur im. Bereich von 10 bis 35ºC, einer Beleuchtungsstärke von 200 Lux oder weniger und einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 8 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtung bei Schritt E) null ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei Schritt F) das Volumen der Kulturflüssigkeit durch Steigerung der Belüftungsrate auf 0,8 bis 2,2 vvm erniedrigt wird, um dadurch die Verdunstungsrate der Kulturflüssigkeit zu erhöhen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei Schritt F) das Volumen der Kulturflüssigkeit durch regelmäßiges Dekantieren der Kulturflüssigkeit erniedrigt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der Kulturflüssigkeit in 3 bis 10 Schritten erniedrigt wird, wobei bei jedem Schritt 10 bis 20% des verbliebenen Volumens der Kulturflüssigkeit dekantiert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das verwendete Pflanzengewebe von einer Kartoffelpflanze stammt und das gewonnene Produkt aus Schritt G) Kartoffelknollen umfaßt.