DE69818490T2

DE69818490T2 - Herstellung von zuckerrohr

Info

Publication number: DE69818490T2
Application number: DE69818490T
Authority: DE
Inventors: Layla Zakaria Didsbury Abdelrahman
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-02-21
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2018-02-21
Also published as: RU2226820C2; GB9703628D0; WO1998037173A2; ATE250665T1; AP1190A; JP4278183B2; CN1222611C; CN1252685A; ID24089A; AU724228B2; EP1007629A2; DE69818490D1; AU6220998A; BR9807452A; JP2001511652A; KR20000075570A; CA2282297A1; KR100505936B1; BR9807452B1; WO1998037173A3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Zuckerrohrpflanzen, und insbesondere auf Verfahren für das Produzieren solcher Pflanzen.
Zuckerrohr ist allgemein als eine extrem wichtige Anbaupflanze bekannt, da sie auch für die Herstellung von Lebensmitteln und Nebenprodukten wie zum Beispiel Molasse, Bagasse, Filterschlamm und Ethanol verwendet wird, von welchen alle sowohl in Entwicklungsländern wie auch in entwickelten Ländern von großer Bedeutung sind.
Im allgemeinen wird Zuckerrohr als mehrjährige Pflanze kultiviert. Die Pflanze wächst dabei ein Jahr lang, während dessen dieselbe als „Pflanzenrohr" bekannt ist. Das Pflanzenrohr wird zu diesem Zeitpunkt geschnitten und zu Zucker verarbeitet. Die Wurzel des Pflanzenrohres und ein kleines Stück des Rohrstengels verbleibt in der Erde, und dies wächst im darauffolgenden Jahr weiter, um den „ersten Ratoon" zu produzieren. Dieser wird dann geerntet, um Zucker zu produzieren, und der Rest der Pflanze wächst ein weiteres Jahr lang weiter, um den „zweiten Ratoon" zu produzieren. In manchen Ländern wird dieser Wachstumskreis bis zu einem „fünften Ratoon" wiederholt, bevor die Wurzel der Pflanze letztendlich aus der Erde entfernt wird.
Zuckerrohr wird durch den Wind bestäubt, und dies führt zu einer großen Unterschiedlichkeit der Pflanzen, welche aus Samen gezogen werden. Dies ist für Erzeugungsverfahren besonders nützlich, denn es produziert viele verschiedene Pflanzenvariationen, welche für die Auswahl neuer, nützlicher Klone verwendet werden können. Für die normale kommerzielle Propagierung liefert diese natürliche Reproduktionsmethode jedoch keine typenreinen Pflanzen. Als ein Resultat repräsentiert bis heute die vegetative Reproduktion die einzige praktische Methode für das Propagieren von Zuckerrohr. Die existierende Methode für das Propagieren von Zuckerrohr verwendet die Stengel reifer Zuckerrohrpflanzen. Diese Methode ist besonders verschwenderisch mit Bezug auf die allgemeine Produktivität der Zuckerrohrpflanzen, ist mit Bezug auf Arbeitskosten sehr kostspielig, und produziert ausserdem Probleme im Zusammenhang mit der Verbreitung von Viruskrankheiten wie zum Beispiel der Fiji-Krankheit, und bakteriellen Erkrankungen wie zum Beispiel Rotpilz und die hauptsächlich fungizide Krankheit 'Smut'. Solche Krankheitsprobleme bei der Zuckerrohrerstellung können extrem ernst sein, da sich dieselben mit Hilfe vieler verschiedener Vektoren ausbreiten und sich besonders schnell über eine gesamte Zuckerrohrplantage hinweg erstrecken können.
Leider ist eine solche vegetative Propagierung sehr kostspielig, denn die Pflanze muss 9–12 Monate lang wachsen, bevor der Stengel in Segmente von ungefähr 30 cm Länge zerschnitten werden kann. Das Hauptproblem ist dabei die Tatsache, dass die abgeschnittenen Enden des Zuckerrohrs einer möglichen Verunreinigung ausgesetzt sind, besonders in der Gegenwart des Nährstoffs Saccharose im Rohrsaft. Als ein Resultat ist es sehr einfach, Viren-, Bakterien- und Schimmelkrankheiten zu verbreiten, welche ernste Auswirkungen auf die Zuckerrohrerstellung haben können.
Aufgrund all dieser Probleme während der Herstellung neuer Zuckerrohrpflanzen wurden für Erzeugungs- und Propagierungsprogramme sowohl wie für das Vermeiden von Viren Gewebekulturmethoden entwickelt. Barredo R., Luzaman R., und Dequinto B. (1994) haben diesbezüglich zum Beispiel das Spindelblatt (das innerste Blatt des Stammes) der Sorte Phil 74-64 für die Herstellung von 13.5000 neuen Pflanzensämlingen verwendet. Sie haben jedoch festgestellt, dass es von Beginn der Laborarbeiten bis zur Herstellung der Pflanzensämlinge 8 Monate dauerte, bevor Pflanzensämlinge produziert werden konnten, die im Feld ausgepflanzt werden konnten. Barbra R. C., Zamora A. B., Linga C. K., und Thai Van N. (1975) haben eine Callusmethode verwendet, welche es ihnen ermöglichte, mit Hilfe eines 3 cm langen Stück eines Zuckerrohrtriebs 4.000 neue Pflanzensämlinge zu produzieren, wobei diese Methode jedoch den Nachteil aufwies, möglicherweise zu genetischen Variation führen zu können.
Aktuelle Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologie bieten neue Möglichkeiten für die Verbesserung der Pflanzenherstellung und -propagierung mit Hilfe von Pflanzengewebekulturtechniken. Ein Verfahren gemäß der Einleitung zu Anspruch 1 ist von Vasil I. K. bekannt („Advantages of embryogenic cell cultures of graninnae", IAEA-SM, Volumen 292, Nr. 41, 1986, Seiten 71–75).
Somatische Embryonen bestehen aus bipolaren Strukturen, welche sowohl Trieb- wie auch Wurzelmeristeme beinhalten. Diese können sowohl im Callus wie auch in einer Zellsuspensionskultur geformt werden, und führen direkt zu der Formierung reifer Pflanzen. Sie somatische Embryogenese bietet ein mögliches System für die Massenproduktion von Pflanzen. Um eine solche somatische Embryogenese jedoch für die Massenproduktion von Pflanzen praktisch zu gestalten, muss eine Reihe von Problemen überwunden werden, welche bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung weiter ein Hindernis während der Anwendung des Verfahrens für die Herstellung von Zuckerrohrpflanzen repräsentierten. Bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung konnten reife somatische Embryonen nur mit Hilfe des Callus in einem festen Medium gezogen werden. Zellen, welche im Callus gezogen werden, sind jedoch allgemein als genetisch unstabil bekannt, und solche im Callus gezogenen Embryonen neigen deshalb dazu, genetisch verschieden auszufallen. Ausserdem wachsen im Callus erzeugte Embryonen nicht synchron, und die Manupulierung ist deshalb sehr arbeitsintensiv. Solche Probleme gestalten die Callus-basierte somatische Embryogenese ungeeignet für die kommerzielle Massenproduktion und -propagierung. Im Gegensatz dazu weisen Zellsuspensionen in einer flüssigen Kultur eine größere genetische Stabilität auf, können durch das Modifizieren der Wachstumsbedingungen synchronisiert werden, und können einer automatisierten Manipulierung ausgesetzt werden. Bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung hatten alle Versuche, eine flüssige Kultur anzuwenden, jedoch lediglich unreife globulare Embryonen produziert.
Die vorliegende Erfindung soll nun einige der weiter oben aufgeführten Probleme lösen. Die vorliegende Erfindung adressiert diese Probleme und bietet wirkungsvolle und verläßliche Verfahren für das Produzieren von Zuckerrohrpflanzen, welche besonders für die Massenproduktion für kommerzielle Zwecke geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren für die Herstellung von somatischen Embryonen des Zuckenohrs aus Zuckerrohrexplantaten, welches die folgenden Schritte umfasst:

(1) Kultivieren unreifer Embryonen aus Explantaten.
(2) Kultivieren reifer somatischer Embryonen des Zuckerrohrs aus diesen unreifen Embryonen, wobei mindestens Schritt 2 in einer flüssigen Suspensionskultur auftritt.

Die vorliegende Erfindung bietet ein System, welches die somatische Embryogenese für die Herstellung von somatischen Embryonen für die Anwendung bei der Herstellung von Zuckerrohrpflanzen beinhaltet, mit welchem reife somatische Embryonen schneller und in größeren Mengen hergestellt werden können, und mit welchem die originellen Pflanzengencharakteristiken in den somatischen Embryonen erhalten werden.
Die somatischen Embryonen des Zuckerrohrs, welche mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können nachher der Keimung unterworfen werden, um Zuckerrohrpflanzen herzustellen, oder sie können in ein Einkapselungsmaterial eingekapselt werden, um „künstliche Samen" für die Direktzulieferung auf das Feld und die darauffolgende Keimung in Vitro herzustellen.
Die Herstellung von somatischen Embryonen des Zuckerrohrs mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet die somatische Embryogenese. Dieses Verfahren ist extrem wertvoll, denn es ist möglich, große Mengen von Embryonen mit Hilfe von kleinen Mengen des Kulturmediums auf eine beinahe synchronische Weise herzustellen. Eine hohe Multiplizierungsrate ist jedoch lediglich der erste von mehreren möglichen Vorteilen, welche die somatische Embryogenese für die darauffolgende Herstellung von Zuckerrohrpflanzen im Vergleich mit anderen Verfahren der vegetativen Propagierung von Zuckerrohrpflanzen bietet. So können zum Beispiel sowohl die Erzeugung von embryogenischem Gewebe während Schritt 1 wie auch die darauffolgende Entwicklung der Embryonen bis zu deren Reife während Schritt 2 in einem flüssigen Medium erzielt werden, was wiederum die Möglichkeit bietet, sehr große Mengen von Progagulen mit Hilfe von minimaler Handhabung zu manipulieren. Ausserdem besteht das Produkt der somatischen Embryogenese aus einem Embryo, welcher mit Hilfe eines sehr kleinen weiteren Arbeitsumfangs der Entwicklung zu einer regenerierten Zuckerrohrpflanze fähig ist. Der Vorteil der somatischen Embryogenese für die Herstellung von Zuckerrohrpflanzen im Vergleich mit Systemen für die vegetative Propagierung nach dem aktuellen Stand der Technik und mit der Mikropropagierung besteht daraus, dass sowohl Wurzel- wie auch Triebmeristeme in der gleichen Einheit gegenwärtig sind und es deshalb nicht notwendig ist, arbeitsintensive Übertragungsverfahern anzuwenden, so dass auch ein großer Teil der Betriebskosten eingespart werden kann.
Ausserdem resultiert diese Abwesenheit von wiederholten Übertragungsverfahren in einer vorteilhaften Reduzierung von Verunreinigungen, welche durch Kontakt verbreitet werden. Ein weiterer Vorteil ist derjenige, dass diese embryogenischen Systeme dazu fähig sind, getrennte individuelle Embryonen herzustellen, welche weder mit einer Mutterpflanze noch mit anderen Embryonen zusammenhängen. Diese embryogenischen Kulturen produzieren deshalb Propagule, welche nicht nur komplett sind, sondern auch diskret. Die Kombination dieser zwei Eigenschaften gestaltet somatische Embryonen ideal für die direkte Zulieferung an das Gewächshaus oder das Feld, zum Beispiel als Komponente eines künstlichen Samens oder als ein flüssiges Bohrsystem.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet ein vorteilhaftes Multiplikationswerkzeug in Vitro, welches die neue Möglichkeit bietet, schnell große Mengen von Embryonen des Zuckerrohrs in einem flüssigen Medium zu erzeugen. Dies ermöglicht eine sehr viel umfangreichere und schnellere Propagierung von Zuckerrohrpflanzen, als es zurzeit mit Hilfe anderer Techniken wie zum Beispiel der Mikropropagierung, welche unter hohen Arbeitskosten leidet, möglich ist.
Zuckerrohrpflanzen, welche mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung regeneriert wurden, welche die somatische Embryogenese beinhaltet, werden vorzugsweise mit Hilfe von charakterstischen organisierten Meristemzellen oder meristematischen Zellen von Zuckerrohrpflanzen erzeugt. Diese Zellen sind von Natur aus genetisch stabil und neigen nicht zu Mutationsveränderungen. Es ist vielmehr bewiesen, dass während der Entwicklung von somatischen Embryonen eine starke Auswahl zugunsten von genetisch normalen Zellen auftritt. Folgedessen werden Zuckerrohrpflanzen, welche mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, echte Klone erzeugen, was für eine verläßliche und wirkungsvolle Massenproduktion von Zuckerrohrpflanzen wichtig ist.
Embryogenische Suspensionskulturen bieten aufgrund der Abwesenheit einer wiederholten Handhabung des Pflanzengewebes die Möglichkeit, das Verfahren einfach zu erweitern, sowohl wie die Möglichkeit der relativ einfachen Automatisierung des Verfahrens besonders für die Massenproduktion. Die Entwicklung des Verfahrens zu einem praktischen Herstellungssystem fordert im Idealfall die Herstellung einzelner Embryonen, so dass sich alle Embryonen auf der gleichen Entwicklungsstufe befinden, und so dass eine letztendlich hohe Umformungsrate in Pflanzensämlinge entsteht. Der Vorteil des Anwendung von Embryonen als Propagule besteht daraus, dass es möglich ist, dieselben für eine Direktzulieferung an das Feld einzukapseln.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet weiter eine vorteilhafte Möglichkeit, mit welcher die Zuckerrohrpflanzen mit Hilfe von Zellen regeneriert werden können, welche aus manipulierten Kulturen ausgewählt wurden. Demnach bietet das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine wirkungsvolle Methode für die Anwendung mit neuartigen genetischen Manipulierungstechniken für die Zuckerrohrpflanzenverbesserung, wie zum Beispiel die somatische Hybridisierung und die genetische Transformation.
Das für Schritt 1 des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendete Explantat kann während einer beliebigen Stufe der Entwicklung aus einem Teil der Zuckerrohrmutterpflanze gewonnen werden. Die Quelle des Explantates kann zum Beispiel einem Blatt, der Wurzel, einem jungen Trieb, Knospen, Infloreszenz, oder aus jungen Knoten der Zuckerrohrpflanze gewonnen werden, und/oder das Explantat kann aus reifen Embryonen bestehen, welche durch die Stressbelastung eines Blattes, eines jungen Triebs, einer Wurzel, einer Interfloreszenz, oder eines jungen Knotens der Zuckerrohrpflanze erzeugt wurden. Eine solche Stressbelastung kann durch das Behandeln des Pflanzenteils mit 95% Ethanol für eine Zeitspanne (vorzugsweise 1–5 Stunden) und/oder das Kühlen des Pflanzenteils auf eine Temperatur von ungefähr 5– 15°C für eine Zeitspanne von ungefähr 1–3 Monaten erzeugt werden. Wurzelbasierte oder reife Embryonen werden jedoch als Explantatmaterial bevorzugt.
Ein Wurzelexplantat ist vorteilhafterweise während des Formens von unreifen Embryonen besonders produktiv, und dies beruht wahrscheinlich auf der Tatsache, dass die Wurzel (besonders die Spitze) hauptsächlich aus meristematischem Gewebe besteht. Ausserdem unterliegt ein Wurzelexplantat vorteilhafterweise weit weniger den Auswirkungen des bekannten Problems des „Bräunens" von Kulturmedien und Zellen bei Pflanzengewebekulturtechniken. Dieser „Bräunungseffekt" wird durch die Oxidierung von phenolischen Verbindungen und deren Umwandlung in quinone Oxidierungsprodukte produziert. Phenolische Derivative werden oft von Explantaten ausgegeben. Da ein solches Bräunen der unreifen Embryonenkultur im Wesentlichen nicht auftritt, wenn dieselbe mit Hilfe von Wurzelexplantaten erzeugt wurde, besteht vorteilhafterweise keine Notwendigkeit, das Kulturmedium auszuwechseln, und wurzelbasierte Kulturen neigen deshalb dazu, über einen bestimmten Zeitraum hinweg mehr Biomasse zu erzeugen.
Ein weiterer Vorteil der Anwendung von wurzelbasierten Explantaten anstelle von Blatt- oder Triebexplantaten besteht daraus, dass auf diese Weise eine feine, hoch dispersierte, unreife Embryonenkultur erzeugt wird. Ausserdem kann ein solches Wurzelexplantat dazu angewendet werden, Embryonen in einer flüssigen Suspensionskultur direkt, d. h. ohne das Formieren von Zwischencallus, und ohne das Auswechseln des Kulturmediums alle 2 bis 5 Tage, zu erzeugen. Diese Eigenschaft ist für die industrielle Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung als eine Methode für das Propagieren von Zuckerrohr mit Hilfe der somatischen Embryogenese besonders wichtig. Die Kultur des Wurzelexplantates überträgt zusammen mit einem Explantat, welches nicht aus der Wurzel erzeugt wurde, die gleichen Vorteile auf die gemischte Kultur wie die weiter oben schon beschriebenen Vorteile für die alleinstehende Wurzelexplantatkultur. Wenn so zum Beispiel normalerweise ein „Bräunen" der Wurzelexplantatkultur auftreten würde, wird ein solches Bräunen in einer gemischten Trieb- und Wurzelexplantatkultur minimiert.
Ausserdem sind Wurzelexplantate jederzeit erhältlich, da Wurzeln durch das Einlegen von Triebmaterial mit mindestens einem Knoten in distilliertes Wasser einfach produziert werden können. Nach einer gewissen Zeit wird ein Wurzelnetz wachsen, aus welchem Explantatmaterial gewonnen werden kann. Dies ist bei einer industriellen Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung besonders nützlich.
Die Vorteile der Anwendung eines Blattexplantates schliessen dessen einfache Erhältlichkeit und die Tatsache ein, dass es normalerweise in einem nicht verunreinigten Zustand vorhanden ist.
Wenn Blattexplantate angewendet werden, sollte das Blattexplantat vorzugsweise aus einem Bereich stammen, welcher in der Nähe des Wachstumspunktes der Pflanze liegt, da die Häufigkeit des Bräunens des Kulturmediums mit steigendem Abstand von demselben Wachstumspunkt steigt.
Ausserdem sollte das Alter der Spendenpflanze, von welcher das Blattexplantat gewonnen wird, vorzugsweise zwischen ungefähr 3–12 Monaten liegen, und am besten ungefähr 9 Monate betragen, da ein Bräunen des Kulturmediums dann im Wesentlichen nicht auftreten wird, da beinahe alle Blattsegmente einer 9 Monate alten Pflanze hoch embryogenisch sind.
Die oben erwähnten Vorteile der Anwendung eines Wurzelexplantates, entweder allein oder in Kombination mit anderen Explantatquellen, und insbesondere für das Vermeiden der Häufigkeit des oft auftretenden Problems des „Bräunens" bei Pflanzenkulturtechniken, sind für alle Arten von Pflanzenkulturen von Vorteil (wie zum Beispiel für Bäume, Dattelpalmen, Kartoffeln), und die Anwendung eines Zuckerrohrwurzelexplantates ist deshalb keineswegs auf die Kultur des Zuckerrohrs beschränkt.
Das Verfahren des Kultivierens unreifer Embryonen aus Explantaten (Schritt 1 der vorliegenden Erfindung) umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte:

(a) das Kultivieren von Explantatmaterial in einem Kulturmedium für das Herstellen von somatischen Zellen;
(b) das Auswählen und das Multiplizieren von somatischen Zellen, welche mit Hilfe des Explantatmaterials erzeugt wurden;
(c) das Kultivieren der somatischen Zellen für eine Zeitspanne in einem Kulturmedium, und das Herstellen unreifer Embryonen des Zuckerrohrs aus denselben somatischen Zellen.

Die unreifen Embryonen können als embryonischer Callus gestartet und in einem festen Medium oder als eine embryonische Zellsuspensionskultur in einem flüssigen Medium, oder in einer Kombination von festen und flüssigen Medien, welche vorzugsweise ein „doppellagiges Medium" repräsentieren, herangezogen werden.
Es kann für das Verfahren der vorliegenden Erfindung von relativ verdünnten Medien bis zu den weitaus konzentrierteren Formulierungen von Evans u. a., Gamborg u. a., Schenk und Hildebrandt (SH-Medium), und Murashige und Skoog (MS-Medium) eine weite Reihe von festen und/oder flüssigen Kulturmedien angewendet werden. Vorzugsweise werden jedoch feste oder flüssige MS-Medien für das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet, da diese sich für die Formierung unreifer Embryonen als embryogenische Callus-/Suspensionskultur und für das Erzeugen einer somatischen Embryogenese derselben als besonders vorteilhaft erwiesen haben, was möglicherweise auf der Tatsache beruht, dass in dem MS-Medium größere Mengen von Ammoniakstickstoff vorhanden sind. Verschiedene Medien können für die verschiedenen Schritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wie erforderlich angewendet werden.
Vorzugsweise sollten jedoch Pflanzenwachstumsregulatoren wie zum Beispiel Auxine (d. h. 2,4-Dichlorophenoxyascorbinsäure (2,4-D), Naphtalenascorbinsäure (NAA), Indol 3-Ascorbinsäure (IAA), Cyotikine, Gibberelline, Abscissinsäure, Anti-Auxine, Kinetine, Zeatine und/oder Aktivkohle entweder allein oder in Kombination mit in der Medienformulierung angewendet werden. 2,4-D Auxin ist dabei der effektivste Regulator für das Erzeugen unreifer Embryonen (Callusformierung und/oder Suspensionskultur), die Entwicklung von Explantaten, und die Entwicklung von somatischen Embryonen aus unreifen Embryonen mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Es sind dabei eine weite Reihe von Konzentrationen von 2,4-D geeignet, wie zum Beispiel 0,5–10 mg/l, obwohl eine relativ hohe Konzentration wie zum Beispiel ungefähr 3–5 mg/l bevorzugt angewendet wird. Im Gegensatz dazu üben Cyotikine einen hemmenden Effekt auf den Wuchs unreifer Embryonen des Zuckerrohrs aus. Vorzugsweise sollte das Kulturmedium weiter ABA zusammen mit 2,4-D beinhalten, welche in einer Konzentration von 0.1–20 mg, und vorzugsweise in einer Konzentration von ungefähr 1 mg/l vorhanden sein sollten. ABA hemmt vorteilhaft den Wuchs von nicht embryonischen Zellen, so dass der Prozentanteil der embryonischen Zellen in der Kultur optimiert werden kann.
Als Kohlen- und Energiequelle repräsentierten Kohlenhydrate einen wichtigen und unentbehrlichen Bestandteil eines Gewebekulturmediums. Es wird dabei für das Verfahren der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Saccharose als der wichtigste Kohlenhydratbestandteil des Mediums der Kultur für das Zuckerrohr angewendet. Viele andere Monosaccharide, wie zum Beispiel Glucose und Fructose, Disaccharide wie zum Beispiel Lactose, und andere Zucker wie zum Beispiel Melibose, können auch zur Wachstumsförderung und der Embryogenese für das Kulturverfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Die Anwendung von Saccharose ist jedoch für das Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaft, da dieselbe das Bräunen der Kultur nicht fördert. Die angewendete Saccharosekonzentration liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von 10–60 g/l. Am häufigsten wird dabei eine Saccharosekonzentration von ungefähr 30 g/l bevorzugt. Bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung war es normal, für die Kultur von Zuckerrohr Kokosnusswasser als einen Bestandteil dem Kulturmedium hinzuzufügen. Kokosnusswasser ist jedoch für das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu dessen Vorteil kein erforderlicher Bestandteil, was die Kosten reduziert.
Die Herstellung eines embryogenischen Callus und/oder einer embryogenischen Suspensionskultur kann durch die Stressbelastung des Explantatmaterials und/oder des Gewebes, aus welchem das Explantatmaterial vor dem Hinzufügen desselben Explantatmaterials zu dem Medium (Schritt a) gewonnen wird, besonders effektiv stimuliert werden.
Dies kann zum Beispiel durch eine Stressbehandlung erreicht werden, welche das Kühlen des Explantates auf eine Temperatur von ungefähr 5°C–15°C für eine Zeitspanne von ungefähr 1–3 Monaten beinhaltet. Die Explantate werden dabei vorzugsweise ungefähr 2 Monate lang auf ungefähr 10°C gekühlt. Andere geeignete Stressbehandlungen für das Stimulieren der Embryonenproduktion schliessen das Einweichen des Explantats in ungefähr 95% Ethanol für ungefähr 1–5 Stunden ein. Die letztere Ethanolmethode wird dabei bevorzugt, da diese Methode jederzeit für die Behandlung der Zuckerrohrexplantate bereitsteht und ausserdem Verunreinigungen entfernt, während sie die Zellen gleichzeitig lebensfähig erhält, d. h. sie können embryonisches Material formen. Die bevorzugteste Zeitspanne für das Einweichen der Explantate in Ethanol beträgt ungefähr 4 Stunden.
Die freien abgeschnittenen Enden des von der Zuckerrohrmutterpflanze gewonnenen Gewebes werden vor der Ethanolbehandlung vorzugsweise mit einem Wachs, wie zum Beispiel Kerzenwachs, überzogen, um die Absorption des Ethanols durch das durch die Schnitte freigelegte Gewebe zu reduzieren. Nach dem Einweichen des Gewebes in Ethanol wird dasselbe Gewebe vorzugsweise in sterilisiertes trockenes Seidenpapier oder ähnliches eingewickelt, um überflüssiges Ethanol zu absorbieren. Das Explantatmaterial kann dann ausgewählt und von dem Spendergewebe (d. h. Blatt, Trieb, Wurzel) aussortiert und dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Das Explantat wird dann für eine Zeit kultiviert, um die Formierung von somatischen Zellen einzuleiten. Die Entwicklung der somatischen Zellen wird vorzugsweise vorteilhaft mit Hilfe eines Kulturmediums eingeleitet, welches ABA beinhaltet. ABA hemmt den Wuchs anderer Zellentypen, und optimiert auf diese Weise den Prozentanteil der erwünschten somatischen Zellen. Somatische Zellen werden weiter mit Hilfe eines Verfahrens ausgewählt, welches Zellen gemäß ihrer Größe und Form voneinander trennt. Somatische Zuckerrohrzellen verfügen normalerweise über eine gerundete Form und einen Durchmesser von ungefähr 40–65 μm, und am häufigsten zwischen 46–63 μm. Im Gegensatz dazu sind nicht embryogenische Zuckerrohrzellen normalerweise länglich und weniger als ungefähr 46 μm lang. Eine herkömmliche Methode für die Auswahl von hauptsächlich ausschließlich somatischen Zellen ist das Sieben der Kultur durch ein erstes Sieb mit einer Maschengröße von 100–50um, wodurch im Wesentlichen somatische und nicht-embryonische Zellen durch das Sieb hindurchgeführt werden (und wobei größere Partikel wie zum Beispiel Aggregate herausgefiltert werden), und das darauffolgende Sieben der einmal gesiebten Kultur mit einem zweiten Sieb mit einer Maschengröße von 50–38 μm, wobei im Wesentlichen nicht-embryogenische Zellen durch das Sieb hindurchgeführt werden, während somatische Zellen herausgefiltert werden. Die optimale Auswahl somatischer Zellen tritt dann auf, wenn das erste Sieb über eine Maschengröße von ungefähr 63 μm, und das zweite Sieb über eine Maschengröße von ungefähr 45 μm verfügt.
Die ausgewählten somatischen Zellen werden dann vorzugsweise erneut in dem oben erwähnten 2,4-D-haltigen Medium suspendiert, welches vorzugsweise wie weiter oben schon beschrieben für Multiplizierungszwecke ausserdem ABA beinhaltet.
Die somatischen Zellen werden dann für eine Zeit kultiviert, um unreife Embryonen zu formen, Schritt (c). Im allgemeinen beträgt diese Zeitspanne zwischen 10 und 40 Tagen, was jedoch zum Beispiel von der Natur des Explantates, dem angewendeten Kulturmedium, und der Konzentration und dem/den Typen) der angewendeten Wachstumsregulatoren abhängen wird. Im allgemeinen wird der Prozentanteil der somatischen Zellen, welcher unreife Embryonen formt, mit der Konzentration von 2,4-D steigen.
Unreife Embryonen können mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sowohl in dunklen wie auch in hellen Umgebungen, oder mit einer Kombination von sowohl dunklen wie hellen Umgebungen hergestellt werden. Die Kultur wird dabei vorzugshalber photoperiodischen Zyklen von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit ausgesetzt, da dieser Zyklus die größte Anzahl von Embryonen produziert.
Das Kultivieren von unreifen Embryonen aus somatischen Zellen, welche mit Hilfe von Explantaten erzeugt wurden, kann das Heranziehen von Sub-Kulturen aus der anfänglichen Kultur einschliessen. Vorzugsweise wird dabei die anfängliche Kultur mindestens drei Monate lang in dem anfänglichen Medium herangezogen, bevor die Sub-Kultur in ein frisches Medium überführt wird. Dies hat sich für das herstellen einer optimalen Anzahl von embryogenischen Kulturen als vorteilhaft erwiesen.
Wenn eine anfängliche Kultur eines Explantates das Erzeugen eines embryogenischen Callus von Explantaten in einem festen Medium einschließt, wird Schritt 1 des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ausserdem das Sub-Kultivieren des embryogenischen Callus aus dem Explantat in einem flüssigen Medium einschliessen, um embryogenische Zellsuspensionskulturen zu etablieren und aufrecht zu erhalten. Bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung präsentierte eine solche Sub-Kultivierung zahlreiche Probleme, welche sowohl ein weit verbreitetes Bräunen des Callus, wenn dieser in ein flüssiges Medium übertragen wird, wie auch die Produktion einer großen Anzahl von Wurzeln anstelle von Embryonen in der flüssigen Kultur, und eine Aggregierung der Calluszellen anstelle einer Formierung von feinen Suspensionskulturen usw. einschliessen.
Bisher konnte das Bräunen des flüssigen Kulturmediums nur durch das wiederholte Auswechseln des Kulturmediums alle 3–5 Tage verhindert werden. Ein solches Auswechseln ist zeitraubend und verschwendet kostspieliges Medium. Das Auswechseln des Mediums kann ausserdem die Möglichkeit einer Kulturverunreinigung und den Verlust wichtiger Chemikalien herbeiführen, welche von den Zellen produziert werden. Das Auswechseln des Mediums zur Verhinderung von Bräunungsproblemen ist deshalb keine praktische Option für die Massenpropagierung von Zuckerrohr mit Hilfe der somatischen Embryogenese. Die vorliegende Erfindung hat sich als eine unterschiedliche Lösung für dieses Problem erwiesen, wobei dieselbe kein wiederholtes Sub-Kultivieren fordert, um ein Bräunen zu verhindern.
Bei der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein embryonischer Callus entweder allein oder in Kombination mit anderen Typen von Explantat aus einem Wurzelexplantat geformt, um auf diese Weise die flüssige Suspensionskultur zu formen. Ein Wurzelcallus dispersiert besonders schnell und produziert eine feine Suspension mit minimalem Zellaggregat. Ein Wurzelcallus produziert ausserdem im Wesentlichen keine Medium- oder Zellbräunung, und Suspensionskulturen aus Wurzelcallus müssen deshalb nicht subkultiviert werden, um das Problem des Medium- und/oder Zellbräunens zu verhindern. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet ein Zuckerrohrwurzelexplantat für die Kultur, denn dies ist wichtig für alle Arten von Pflanzenkultur, wie zum Beispiel Dattelpalmen, welche bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung unter solchen „Bräunungsproblemen" gelitten haben.
Zumindest in einem Fall von aus Blattexplantat erzeugten Kulturen assistieren Ascorbinsäure und Zitronensäure bei der Verhinderung des Bräunens von Zellen und Kulturmedium. Ascorbinsäure wird dementsprechend vorzugsweise als ein Bestandteil des festen Mediums und des flüssigen embryogenischen Suspensionsmediums hinzugefügt, welcher den Callus erzeugt. Verschiedene Konzentrationen von Ascorbinsäure/Zitronensäure sind zu verschiedenen Zeiten des Kulturprozesses der vorliegenden Erfindung erforderlich. Während der Erzeugungsstufe des Callus aus einem Blattexplantat wird vorzugsweise ungefähr 1– 2 mg/l Ascorbinsäure zu dem festen Medium hinzugefügt, um ein Bräunen des Explantats zu verhindern. Für die Erzeugung der Suspensionskultur aus dem Callus wird vorzugsweise 50 mg/l bis 200 mg/l Ascorbinsäure, und noch vorzugsweiser 100 mg/l Ascorbinsäure zusammen mit vorzugsweise 250 mg/l Zitronensäure zu dem Medium hinzugefügt. Nach dem anfänglichen Schritt der Suspensionskultur sollte in dem Aufrechterhaltungsmedium vorzugsweise eine Konzentration von 2 mg/l bis 20 mg/l, und noch bevorzugter ungefähr 10 mg/l Ascorbinsäure vorhanden sein, um ein Bräunen zu verhindern.
Andere Anti-Oxidiermittel wie zum Beispiel Aktivkohle können auch einen Teil des anfänglichen festen Mediums repräsentieren, bevor der Callus in ein flüssiges Medium übertragen wird, um die Suspensionskultur zu erzeugen.
Andererseits können sowohl Wurzelexplantate wie auch wurzelfreie Explantate zusammen kultiviert werden, da die Gegenwart des Wurzelexplantates/Callus das Auftreten einer Medium- und Zellbräunung im Wesentlichen hemmt.
Ein wichtiger Punkt, welcher die Formierung von Suspensionskulturen und deren darauffolgendes Wachstum beeinflusst, ist die Dichte des Callusinnokulums. Je höher die Dichte des Innokulums ist, desto höher wird auch Frequenz der Zellaggregation sein. Um eine fein dispersierte Suspensionskultur zu erhalten, sollte die Innokulumdichte deshalb vorzugsweise zwischen 1 und 10 g/l des Mediums betragen. Die am meisten bevorzugte Dichte beträgt ungefähr 5 g/l.
Die Photoperiode für die optimale Vermehrung der Suspensionskultur besteht vorzugsweise aus Zyklen von ungefähr 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit.
Die Kohlenhydratquelle innerhalb des flüssigen Kulturmediums besteht vorzugsweise aus Saccharose. Sie kann natürlich auch aus anderen Arten von Kohlenhydraten wie zum Beispiel den oben beschriebenen Mono- und Disacchariden bestehen. Für eine optimale Embryoherstellung wird jedoch eine Saccharose- und/oder Glucosekonzentration von 20 bis 60 g/l bevorzugt, wobei ungefähr 30 g/l am meisten bevorzugt wird.
Abscissinsäure (ABA) wird vorzugsweise in das flüssige Medium mit eingeschlossen. Eine Konzentration von zwischen 0.1 und 20 mg/l wird bevorzugt, und ungefähr 1 mg/l wird besonders bevorzugt, da dies den Wuchs von nicht embryogenischen Zellen unterdrückt und gleichzeitig den Wuchs von embryonischen Zellen und die Produktion einer im Wesentlichen reinen embryonischen Kultur fördert. Dies ist besonders vorteilhaft für eine wirkungsvolle, langzeitige Aufrechterhaltung der embryogenischen Kultur, denn es macht die arbeitsintensive Entfernung der nicht embryogenischen Zellen unnötig, welche während einer jeden Sub-Kultivierung geformt werden, und stellt eine wirkungsvolle Langzeitneugenerierung sicher. Diese Anwendung von ABA in Kulturmedien für das Hemmen des Wuchses von nicht embryogenischen Zellen könnte sich auch für das Kultivieren anderer Pflanzentypen als wichtig erweisen.
Für die kommerzielle Massenpropagierung von Embryonen des Zuckerrohrs, wo der aus dem Explantat gewonnene Callus anfänglich in einem festen Medium herangezogen wird, wird es bevorzugt, denselben zur Weiterentwicklung in eine flüssige Kultur zu übertragen. Wenn der aus dem Explantat gewonnene Callus anfänglich in einem festen Medium herangezogen wird, und auch seine Weiterentwicklung in einem festen Medium fortgesetzt wird, werden sich die Embryonen nicht synchron entwickeln und müssen individuell gehandhabt werden, obwohl sie sich letztendlich auch als Zuckerrohrpflanzensämlinge etablieren werden. Für eine kommerzielle Massenpropagierung von Zuckerrohr wird es deshalb bevorzugt, dass der aus dem Explantat gewonnene Callus zur Weiterentwicklung von dem festen Medium in eine flüssige Suspensionskultur übertragen wird. Es ist jedoch wichtig hervorzuheben, dass es andererseits auch möglich ist, unreife globulare Embryonen aus Wurzelexplantaten direkt in einer flüssigen Suspensionskultur zu erzeugen, wobei eine anfängliche Erzeugung in einem festen Medium, wie es zum Beispiel zumindest für Trieb- und Blattexplantatkulturen erforderlich ist, unnötig ist.
Schritt 2 des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst deshalb vorzugsweise das Ausreifen der unreifen globularen Embryonen in einer flüssigphasigen Suspensionskultur, so dass die Embryonen durch das Einleiten der somatischen Embryogenese vollständig entwickelt werden können. Bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung haben Probleme die erfolgreiche Herstellung von reifen Embryonen des Zuckerrohrs in flüssigen Kulturen verhindert.
Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren, mit welchem diese Wurzel-, Trieb- und Blattexplantate erfolgreich als die anfängliche Pflanzengewebequelle erzeugt werden können. Es werden dabei vorzugsweise Wurzelexplantate angewendet. Aus Wurzeln gewonnene Kulturen produzieren dabei während Schritt 2 vorteilhafterweise ein schleimiges Material, welches die Suspension viskos gestaltet. Dieses schleimige Material verfügt über wichtige Eigenschaften, welche das Bräunen weitgehend verhindern. Die gesteigerte Viskosität des Kulturmediums steigert ausserdem den Grad der Embryogenese. Die Produktion des schleimigen Materials könnte auch mit Hilfe von Zuckerrohrwurzeln eingeleitet werden, wenn dieselben Wurzeln bei einer relativ hohen Temperatur (wie zum Beispiel 35°C) unter sterilen Bedingungen in Wasser eingetaucht würden. Das schleimige Material könnte dann gesammelt und zu einer beliebigen Pflanzen-/Gewebekultur hinzugefügt werden, wenn dieselbe unter „Bräunen" leidet. Das Anwenden dieses Materials könnte das Hinzufügen von teuren Antioxodiermitteln zu Kulturmedien ersetzen, welche normalerweise erforderlich sind, um ein „Bräunen" zu verhindern.
Wie weiter oben schon beschrieben können unreife Embryonen des Zuckerrohrs in einem Medium mit 2,4-D wirkungsvoll aus Explantaten erzeugt werden. Es wird dabei für Schritt 2 bevorzugt, dass die unreifen Embryonen danach in ein flüssiges Medium ohne 2,4-D Auxin übertragen werden, um deren Weiterentwicklung zu reifen Embryonen zu fördern. Es werden jedoch nur aus Wurzeln gewonnene Suspensionskulturen in dem flüssigen, 2,4-D-freien Medium hauptsächlich ohne Bräunen reife Embryonen entwickeln. Wenn zum Beispiel aus Blättern und Trieben gewonnene Suspensionskulturen in ein 2,4-D-freies Medium übertragen werden, wird ein gewisses Bräunen auftreten, welches das Ausreifen der Embryonen reduziert. Dementsprechend wird es unter solchen Umständen bevorzugt, zu diesem Zeitpunkt Aktivkohle oder andere geeignete Anti-Oxidiermittel zu dem Medium hinzuzufügen, um auf diese Weise das Bräunen des Mediums und der Zellen zu kontrollieren und die Entwicklung reifer Embryonen zu fördern. Das Hinzufügen der Aktivkohle/des Anti-Oxidiermittels ist für aus Wurzeln gewonnene Kulturen nicht unbedingt notwendig, kann jedoch unter bestimmten Umständen erfolgen, zum Beispiel wenn die Wurzelkultur älter als ungefähr zwei Monate ist, da die Wurzelkultur nach diesem Zeitpunkt normalerweise unter dem Problem des „Bräunens" zu leiden beginnt. Wenn Aktivkohle jedoch hinzugefügt werden soll, sollte dieselbe vorzugsweise in einer Konzentration von ungefähr 3 g/l hinzugefügt werden.
Die Kultur sollte sich dann vorzugsweise über eine gewisse Zeitspanne hinweg entwickeln können, und vorzugsweise über zwischen 50 und 60 Tage. Während dieser Ausreifungsperiode sollte das Medium vorzugsweise oft ausgewechselt werden, wie zum Beispiel wöchentlich. Die somatische Embryogenese der unreifen globularen Embryonen zu bipolaren, und dann zu reifen somatischen Torpedo-Embryonen tritt nach ungefähr 30–40 Tagen auf und wird zum Beispiel von dem Zustand der Kultur abhängen.
Wenn somatische Embryogenese für die Massenproduktion von Zuckerrohrpflanzen angewendet werden soll, sollten die reifen Embryonen, welche an das Feld ausgeliefert werden (vorzugsweise in der Form von künstlichen Samen) einen gleichmäßigen Pflanzenwuchs produzieren, um landwirtschaftliche Verfahren wie zum Beispiel das Jäten von Unkraut, die Irrigierung, und das Ernten zu ermöglichen. Im Fall des Zuckerrohrs müssen Pflanzen eine bestimmte Reife erreichen, um die Zuckerproduktion maximieren zu können. Die Zuckerernte ist nach dem Erblühen dramatisch reduziert. Es ist deshalb kritisch, dass alle reifen Embryonen sich vor der Keimung auf der gleichen Entwicklungsstufe befinden, so dass die Pflanzen zur gleichen Zeit reifen.
Um eine asynchrone Reifung der unreifen Embryonen zu vermeiden, umfasst Schritt 2 vorzugsweise ein Verfahren für das Behandeln der Embryonen, mit welchem eine solche asynchrone Entwicklung verhindert werden kann. Geeignete Behandlungen schliessen das Aufbewahren der Suspensionskultur in Kaltschränken ein. Optimale Bedingungen sind zum Beispiel Aufbewahrungstemperaturen von 5°C (+/–1°C) für ungefähr 10 Tage. Eine weitere einfache Behandlung, welche vorteilhaft und einfach in Vitro angewendet werden kann, ohne eine Verunreinigung zu riskieren, ist die Hitzebehandlung, welche zum Beispiel bei 50°C für 45–60 Minuten stattfindet. Nach dieser Behandlung verlieren nicht-embryogene sowohl wie embryogene Zellen ihre Lebensfähigkeit, während Embryonen unbeeinflusst bleiben.
Nach dieser Hitzebehandlung, oder als eine Alternative, sollte die Suspensionskultur wie weiter oben im Zusammenhang mit dem ersten Schritt der vorliegenden Erfindung beschrieben vorzugsweise gesiebt werden, um eine Kultur auszuwählen, welche einen größeren Prozentanteil von somatischen Embryonen beinhaltet. Im Idealfall sollte die Suspension mit Hilfe eines Siebs mit einer Maschengröße von 63 μm gesiebt, und dann auf einem zweiten Sieb mit einer Maschengröße von 45 μm gesammelt werden.
Im Idealfall sollte die Kultur nach dem Sieben weiter gerührt werden, wodurch im Wesentlichen alle verbleibenden nicht-embryogenischen Zellen entfernt werden. Wenn die Kultur in einem Bioreaktor gerührt wird, kann dieses Rühren bequemerweise durch das Betreiben des Rührelementes mit ungefähr 500 upm für ungefähr 1 Stunde durchgeführt werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird dabei erkennen, dass die oben erwähnten Verfahren für das Optimieren einer synchronen Entwicklung von Embryonen in einer Kultur auch für andere Arten von Pflanzenkulturen, bei welchen eine asynchrone Entwicklung normalerweise auftritt, vorteilhaft angewendet werden können. Beispiele schliessen Kulturen von Embryonen für die Herstellung von Bäumen, Dattelpalmen, und Kartoffeln ein.
Die Herstellung von somatischen Embryonen des Zuckerrohrs mit Hilfe von Bioreaktoren ist für die Massenpropagierung von Zuckerrohrpflanzen aus Gewebe- und Zellenkulturen besonders wünschenswert. Das Anwenden eines solchen Bioreaktors ermöglicht das Kontrollieren der Kulturbedingungen, das Automatisieren des Verfahrens, das Herstellen großer Mengen von Suspensionskulturen, und gestaltet das Sub-Kultivieren von Suspensionskulturen unnötig.
Bioreaktoren verfügen im Vergleich mit Schüttelkolben bei der somatischen Embryogenese über zahlreiche Vorteile. Abgesehen von ihrem großen Fassungsvermögen bieten Bioreaktoren aufgrund des Mischens, welches entweder durch mechanisches Rühren oder durch Anreicherung des Mediums mit Sauerstoff erfolgt, eine homogene Kultur. Mit der Anwendung von Bioreaktoren ist es möglich, den pH-Wert, die Konzentration von aufgelöstem Sauerstoff, und andere Umweltbedingungen zu überwachen.
Einer der wichtigsten Punkte ist dabei die Konzentration des aufgelösten Sauerstoffs in dem Medium, welche mit Hilfe der Anreicherung desselben mit Sauerstoff und des Rührens in dem Bioreaktor kontrolliert wird. Andere wichtige Punkte schliessen die Verteilung und die Dichte von Zellen innerhalb des Mediums ein.
Für das Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen sich viele Arten von Bioreaktor, wie zum Beispiel Luftauftrieb-Bioreaktoren und mechanisch gerührte Bioreaktoren. In einem Luftauftrieb-Bioreaktor wird Luft dazu angewendet, sowohl die Anreicherung mit Sauerstoff wie auch das Mischen der Kultur durchzuführen. Mit dem mechanisch gerührten Bioreaktor ist es möglich, die Sauerstoffanreicherung des Mediums unabhängig von der Mischstufe zu kontrollieren. Dieser letztere Bioreaktortyp wird aus dem Grund bevorzugt, dass es mit demselben möglich ist, die Rotiergeschwindigkeit des mechanischen Rührers unabhängig zu variieren. Keine der nicht embryogenischen Zellen werden bei Rotorgeschwindigkeiten von mehr als 500 upm überleben, so dass eine Variierung der Rotorgeschwindigkeit eine wertvolle Methode für das Verbessern der Synchronität einer embryogenischen Kultur repräsentiert.
Der Prozentanteil der somatischen Embryogenese in dem gerührten Tank des Bioreaktors ist im allgemeinen höher als derjenige in einem Luftauftrieb-Bioreaktor. Der gerührte Tank liefert eine gute Mischung auf allen Ebenen, während die Luftdurchflußrate in dem Luftauftrieb-Bioreaktor mit steigendem Wuchs ununterbrochen gesteigert werden muss, da viele der Zellen sich am Boden absetzen, wenn die Luftdurchflußrate zu niedrig ist. Eine hohe Luftdurchflußrate bedeutet ausserdem eine beachtliche Verdunstung und das Formen einer Schaumdecke, welche wiederum zu einem Festsetzen vieler Zellen an den Wänden des Bioreaktors führen.
Eine weitere bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung bietet ein Verfahren für das Kultivieren von reifen somatischen Embryonen des Zuckerrohrs aus unreifen Embryonen mit Hilfe der folgenden Schritte:

(1) dem Vorbereiten einer flüssigen Suspensionskultur unreifer Embryonen aus einem Explantat;
(2) dem Kultivieren der Suspension in einem Bioreaktor, und dem Formen von somatischen Embryonen.

Das Kultivieren des Schrittes 1 und des Schrittes 2 findet vorzugsweise in einem Bioreaktor statt. Schritt 1 könnte jedoch andererseits zum Beispiel auch in einem Schüttelkolben stattfinden, und die in einem Bioreaktor gemäß Schritt 2 angewendete unreife Embryonenkultur kann als ein Innokulum für das Kultivieren verwendet werden.
Schritt 1 umfasst vorzugsweise das direkte Kultivieren eines embryonischen Wurzelcallus aus einem Wurzelexplantat in einem Medium mit 2,4-D ABA. Im Idealfall wird die Konzentration des 2,4-D in einem Bereich von 0.1 bis 5 mg/l, und vorzugsweise 3 mg/l liegen, und die Konzentration des ABA wird im Idealfall zwischen 0.1 und 20 mg/l betragen, und vorzugsweise 1 mg/l. Vor dem Durchführen des Schrittes 2 sollte das Verfahren vorzugsweise das Sieben der Kultur mit Hilfe eines Siebes umfassen, um auf die weiter oben schon eingehender beschriebene Weise eine feine Suspension zu formen. Die Maschengröße des Siebs sollte vorzugsweise 63 μm betragen, und die Suspension sollte auf einem Sieb mit einer Maschengröße von 45 μm gesammelt werden, welches sicherstellen wird, dass die feine Suspension im Wesentlichen hauptsächlich somatische Zellen beinhaltet. Danach umfasst das Verfahren vorzugsweise einen weiteren Schritt des erneuten Suspendierens der Kultur des Schrittes 1 in einem frischen Medium vor dem Durchführen des Schrittes 2. Dieser weitere Schritt umfasst vorzugsweise das Sub-Kultivieren in einem frischen Medium mit 2,4-D und ABA, am besten für 1 Monat, um auf diese Weise eine besonders embryonische Kultur zu formen. Die Dichte der Innokulation für die erneute Suspension in einem Bioreaktor beträgt vorzugsweise 5 g/l. Möglicherweise noch verbleibende embryogenische Zellen werden vorzugsweise durch das Rühren der Kultur bei 500 upm für 1 Stunde entfernt. Dies kann am bequemsten in einen Bioreaktor mit einem gerührten Tank durchgeführt werden, in welchem die Rotorgeschwindigkeit des Rührers entsprechend eingestellt werden kann.
Schritt 2 umfasst vorzugsweise das Kultivieren der Suspension in einem 2,4-D-freien Medium, welches ABA beinhaltet, vorzugsweise in einem gerührten Bioreaktor. Das Medium in dem Bioreaktor wird vorzugsweise regelmäßig ausgewechselt, bis ein Ausreifen auftritt. Dies tritt im allgemeinen nach ungefähr 50 Tagen auf. Das Medium wird vorzugsweise zum Beispiel alle 10 Tage ausgewechselt.
Die mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung (in einem Bioreaktor oder anderswo) hergestellten reifen Embryonen können danach eingekapselt werden, um „künstliche Samen" zu formen.
Die Herstellung von Zuckerrohrpfänzlingen umfasst das Ausreifen von somatischen Embryonen zu Pflanzensämlingen durch das Keimen der Embryonen. Diese Schritt umfasst vorzugsweise das Kultivieren von einzelnen somatischen Embryonen in einem flüssigen Medium. Dieses Kultivieren findet vorzugsweise auf einem Polyethylenschaum statt. Polyethylenschaum stützt die Sämlinge auf eine vorteilhafte Weise und ermöglicht ein einfaches und direktes Übertragen der Sämlinge auf das Feld. Die somatischen Embryone befinden sich zu diesem Zeitpunkt vorzugsweise in einer späten Torpedostufe. Die Embryonen werden vorzugsweise in einem flüssigen, 2,4-D-freien Medium kultiviert. Das Medium kann vorteilhafterweise ABA in einer Konzentration von 0.05–1 mg/l beinhalten, und vorzugsweise 0.1 mg/l. Die aus den mit ABA behandelten Embryonen hergestellten Sämlinge haben sich als lebensfähiger bewiesen und überleben unter Gewächshausbedingungen weitaus besser.
Die mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellten somatischen Embryonen können eingekapselt werden, um vor dem Keimen künstliche Samen zu formen.
Eine weitere bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung bietet ein Verfahren für das Einkapseln eines somatischen Embryos, welches den Schritt des Hinzufügens von mindestens einem Mittel zu demselben somatischen Embryo umfasst. Das Verfahren eignet sich für das Einkapseln vieler pflanzlicher somatischer Embryonen wie zum Beispiel Zuckerrohr, alle Baumtypen, Kartoffeln, Dattelpalmen usw., für das Formen von sogenannten „künstlichen Samen", welche einfach handzuhaben, zu lagern, und zu transportieren sind, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Das Einkapselungsmittel umfasst vorzugsweise mindestens eine Getreidemehl-/Wasserpaste. Eine solche Paste als Einkapselungsmittel ist besonders vorteilhaft, da sie Nährstoffe für den eingekapselten Embryo liefert, das Anreichern desselben mit Sauerstoff ermöglicht, und eine Kruste formt, welche den Embryo feucht hält und ein einfaches Keimen des Embryos ermöglicht, und dennoch preiswert ist. Sorghummehl ist ein besonders bevorzugtes Mittel, da es besonders preiswert ist. Das angewendete Mehl kann entweder fermentiert oder nicht fermentiert werden. Fermentiertes Mehr wird jedoch bevorzugt, da die mit Hilfe desselben hergestellten Kapseln im Wesentlichen gegen ein Einreissen sehr widerstandsfähig sind. Die Mehl-/Wassermischung besteht vorzugsweise aus 5–30 g Mehl pro 100 ml Wasser, wobei eine Mischung von 10 g Mehl auf 100 ml Wasser am meisten bevorzugt wird.
Das Verfahren des Einkapselns umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte:

(1) das Herstellen einer Mehl-/Wasserpaste;
(2) das Zusetzen somatischer Embryonen zu der Paste;
(3) das Einsetzen einzelner in Paste eingekapselter Embryonen in Wasser, um eine Kapsel um jeden Embryo zu formen;
(4) das Trocknen der Kapsel.

Das Verfahren des Formens der Mehl-/Wasserpaste umfasst vorzugsweise das Vermischen des Mehls mit dem Wasser, das Wärmen der Mischung, um eine Paste zu formen, das Verarbeiten der Mischung in einer Autoklave, und das Kühlen der Paste.
Vor dem Trocknen kann die Kapsel in ein mikrobizides Mittel wie zum Beispiel ein Fungizid und/oder ein Bakterizid eingetaucht werden.
Vor oder nach Schritt (4) des Verfahrens für das Einkapseln des Embryos kann das Verfahren weiter die folgenden Schritte umfassen:

(a) das Hinzufügen von Natriumalginatlösung zu den Kapseln;
(b) das anschließende Einsetzen der Kapsel in Calciumchloridlösung. Diese zusätzlichen Schritte produzieren Perlen von Calciumalginat, in welche einzelne Embryonen in einer Mehlpaste eingekapselt sind.

Im Idealfall beträgt die Konzentration der für den oben erwähnten Schritt angewendete Natriumalginatlösung ungefähr 3%, wobei dieselbe während Schritt 2 vorzugsweise zu einer 75 mM-Lösung Calciumchlorid hinzugefügt wird. Die Calciumalginatperlen, welche einen einzigen Embryo beinhalten, können entweder in einem flüssigen oder einem festen Medium wie zum Beispiel einem 2,4-D-freien Medium, oder direkt in Erde keimen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet daher einen künstlichen Samen, welcher einen Pflanzenembryo enthält, welcher in ein mehlbasiertes Material eingekapselt ist. Der in Mehl eingekapselte Embryo wird vorzugsweise in eine Calciumalginatperle eingekapselt. Der künstliche Samen wird vorzugsweise mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens hergestellt.
Solche künstliche Samen, welche somatische Embryonen beinhalten, liefern im Vergleich mit sexuellen Samen viele Vorteile. Diese schliessen zum Beispiel eine höhere Keimungsrate ein, als sie für sexuelle Samen typisch ist. Die künstlichen Samen sind ausserdem genetisch stabil und im Gegensatz zu den chromosomen Variationen und der schlechten Lebensfähigkeit sexueller Samen besonders lebensfähig. Solche künstlichen Samen liefern ausserdem zahlreiche Vorteile gegenüber der vegetativen Propagierung von Zuckerrohr, welche besonders mit Bezug auf den Verbrauch von Zuckerrohr, den Arbeitsaufwand, und den Transport kostspielig ist und ein hohes Verunreinigungsrisiko aufweist. Das Verfahren für das Herstellen von somatischen Embryonen und die anschließende Einkapselung und das Formen künstlicher Samen der vorliegenden Erfindung bietet eine besonders wirkungsvolle Methode der Zuckerrohrherstellung, denn es bietet eine verunreinigungsfreie, arbeitsarme, zeitsparende Methode für die Massenproduktion lebensfähiger und genetisch identischer künstlicher Samen mit Hilfe eines einzigen Zuckerrohrexplantates. Die auf diese Weise hergestellten künstlichen Samen können unter mininalem Kostenaufwand eingelagert und ausgepflanzt werden.
Die mit Hilfe der vegetativen Propagierung einer Mutterpflanze hergestellten Pflanzen sind sich in ihrer Morphologie, ihrem Zuckergehalt, ihrer Biochemie usw. genau wie diejenigen, welche mit Hilfe der somatischen Embryogenese der vorliegenden Erfindung erzeugten Pflanzen sehr ähnlich, und die mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellten Pflanzen sind wiederum der Originalmutterpflanze in einer weiten Reihe von Charakteristiken sehr ähnlich. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet deshalb eine konunerziell wichtige und realisierbare neue Methode für die Massenproduktion von Zuckerrohr.
Die vorliegende Erfindung soll nun unter Bezugnahme auf die nicht einschränkenden folgenden Beispiele näher beschrieben werden.
Beispiele
Vorbereitung der Blattexplantate
Zuckerrohrsetzlinge der Sorte Co527 (Kenana Sugar Company) wurden zunächst 2 Tage lang in ein Wasserbad von 52°C eingetaucht, um mögliche Verunreinigungen freizulegen und die Wurzel- und Triebbildung zu fördern.
Die Setzlinge wurden anschließend bei 25°C und einer 16-stündigen Photoperiode auf Levington Multipurpose Compost (Fisons) in einem Gewächshaus von November bis April herangezogen, wobei dieselben von Mai bis Oktober natürliches Tageslicht erhielten.
Die wachsenden Pflanzen wurden einmal wöchentlich mit Flüssigdünger (Tomorite Rey TM, Fisons) gedüngt.
Es wurden dann nach drei Monaten Blattexplantate in der Form von 5 mm-Segmenten von äusseren und inneren Blättern entnommen.
Die Blattexplantate wurden durch Einweichen in 95% Ethanol 20 Minuten lang sterilisert.
Vorbereitung der Trieb- und Wurzelexplantate
Sämlinge wurden in Vitro von einer Calluskultur gewonnen, welche mit Hilfe eines Blattexplantates (Sorte Co527) erzeugt wurde. Es wurde aus diesen Sämlingen dann eine Mutterpflanze ausgewählt, welche auf einem Triebmultiplizierungsmedium propagiert wurde. Wurzel- und Triebexplantate wurden dann von drei Monate alten mikropropagierten Pflanzen entnommen. Das Wurzel- und Triebexplantat wurde anschließend von regenerierten Pflanzen ohne Sterilisierung auf axenische Kulturen übertragen.
Vorbereitung eines kultivierten MS-Mediums (Murashige and Skoog. 1962)
Das Grundmedium wurde aus fertigen Lösungen vorbereitet und dann mit verschiedenen Kombinationen von Pflanzenwachstumsregulatoren, Vitaminen und Zuckern vervollständigt, wonach fertige Lösungen derselben getrennt weiter verarbeitet und bei –20°C in dunklen Flaschen aufbewahrt wurden. Myo-Inosiltol, Verfestigungsmittel (Agar), und Kohlenhydrate wurden während der Vorbereitung dann zu dem Medium hinzugefügt. Das Medium wurde dann mit einer doppelten Menge von distilliertem Wasser aufgefüllt. Hitzestabile Pflanzenwachstumsregulatoren sowohl wie andere Zusammensetzungen wurden dann vor der Verarbeitung in der Autoklave hinzugefügt, während hitzelabile Zusammensetzungen wie zum Beispiel Zeatin und ABA kurz vor dem Ausgiessen auf die sterilen Platten zu dem lauwarmen Medium hinzugefügt wurden. Alle Medien wurden dann mit Hilfe von 1M MaOH oder 1M HCl vor der Verarbeitung in der Autoklave auf einen pH-Wert von 5.8 eingestellt. In dem Fall des festen Mediums wurde vor dem Einstellen des pH-Wertes 0.9% (Massenanteil) Agar (Sigma, UK) hinzugefügt.
Das Murashige and Skoog (1962) Medium mit 30 g/l Saccharose und 3 mg/l 2,4-D wurde dann für das Heranziehen und das Aufrechterhalten der Calluskulturen und der Suspensionskulturen in Schüttelkolben und Bioreaktoren angewendet; es wird hier als MS 1 bezeichnet. Für die Embryogenese wurde das Murashige and Skoog Medium mit 30 g/l Saccharose angewendet, welches hier als MS2 bezeichnet wird. Die Medien wurden wie erforderlich abgeändert.
Aseptische Proben wurden dann regelmäßig entnommen und auf MYGP-Agar (Malz- und Hefeextrakt, Glucose und Pepton), PDA (Kartoffeldextroseagar), und NA (Nährstoffagar) -Platten aufgetragen, welche alle von Oxoid, Basingstoke, Hants, geliefert wurden. Diese Pflanzen wurden dann 1 Woche lang bei 25°C ausgereift, bevor dieselben auf mikrobialen Bewuchs überprüft wurden.
Initiierung der Calluskulturen
Calluskulturen wurden durch das Kultivieren von Explantaten in 90 × 15 mm sterilen Petri-Schalen aus Plastik (Sterilin Ltd., UK) initiiert, welche das mit 0.9% Agar verfestigte MS 1 enthielten. Die Petri-Schalen wurden dann mit Parafilm (American National Can Co.) versiegelt, um den Feuchtigkeitsverlust durch Verdunstung zu reduzieren. Nach mehreren Wochen des Ausreifens, d. h. wenn der Callus ausreichend gewachsen war, wurde derselbe mit einer sterilen Zange entfernt und auf frische Agarplatten positioniert. Diese wurden dann einen weiteren Monat lang ausgereift. Das restliche Originalexplantat einschließlich aller dunkelbraunen oder verunreinigten Gewebe wurde entsorgt.
Herstellung der Suspensionskulturen
Die Suspensionskulturen wurden anfänglich durch das Einfüllen von 0.5–1.0 g (Frischgewicht) von Callusmaterial in sterile 250 ml Erlenmeyer-Schüttelkolben (Corning, Stone, Staffs.) hergestellt, welche schon 50 ml MS1 enthielten. Nach dem erneuten Versiegeln mit einer doppelten Schicht von sterilisierten Aluminiumfolienquadraten von ungefähr 12 × 12 cm Größe wurden die Kolben auf Rotierschüttelapparate gestellt und mit 100 upm geschüttelt. Im Laufe mehrerer Wochen förderte diese sanfte Schüttelbewegung das Heraustrennen kleinerer Bruchteile von Zellen und einzelner Zellen aus dem Gesamtaggregat. Die Kulturen wurde dann subkultiviert, wobei das Übertragen der kleineren Klümpchen und das Entsorgen des Restaggregates besonders vorsichtig durchgeführt wurde. Aliquoten von 10–15 ml des feineren Zellaggregates wurden dann jede Woche in 50 ml eines frischen Mediums in 250 ml Schüttelkolben übertragen.
Direkte Initüerung von Wurzelkulturen für die begrenzte Herstellung
Wurzeln wurden entweder von reifen Pflanzen oder von mikropropagierten Pflanzen geerntet und direkt in ein flüssiges Medium eingelegt, welches 0.5–10 mg/l 2,4-D (vorzugsweise 3 mg/l) und 0.1–10 mg/l ABA (vorzugsweise 1 mg/l) enthielt. Auf diese Weise wurde eine feine Suspensionskultur geformt.
Herstellung reifer Embryonen mit Hilfe der somatischen Embryogenese
Für die Embryogenese wurden Kulturen in ein MS-Medium übertragen, welches frei von 2,4-D war. Das Ausreifen der Embryonen trat in demselben MS-Medium ohne Wachstumsregulator auf.
Initüerung von Wurzelsuspensionen für die industrielle Anwendung (als Innokulum für große Bioreaktoren)
Eine gut herangezogene Mutterpflanze mit einem Alter von neun Monaten war hier die Quelle des Pflanzenmaterials. Die Pflanze wurde 10 cm über dem Erdboden angeschnitten, und ein Setzling mit zwei Knoten (ungefähr 20 cm lang) wurde entnommen, wobei die Schnittenden mit Hilfe von geschmolzenem Paraffinwachs versiegelt wurden. Der Setzling wurde dann in 20% Natriumhypochlorid 20 Minuten lang sterilisiert und mehrere Male mit distilliertem Wasser gewaschen, wonach die gewachsten Enden entfernt wurden. Die Knospen wurden vorsichtig entfernt, um das Wachstum von Trieben innerhalb des Bioreaktors zu hemmen. Die Pflanze wurde dann in einen 3-Liter-Bioreaktor in die Nähe der Wand desselben positioniert, und mit Hilfe eines mit einem nicht giftigen Klebstoff befestigten runden Silikonrohres an derselben Wand festgehalten.
Der Bioreaktor wurde dann mit distilliertem Wasser gefüllt, und die Temperatur wurde mit Hilfe eines Wasserbades auf 35°C kontrolliert, ohne den Rührer zu betätigen. Daraufhin wuchs ein massives Wurzelnetz. Als die Wurzeln ungefähr 1 Zoll lang waren, wurde das distillierte Wasser aus dem Bioreaktor abgesaugt, und derselbe wurde mit dem MS 1 Medium gefüllt. Die Temperatur wurde anschließend auf 27°C reduziert. Der Bioreaktor wurde nun mit 100 upm gerührt. Nach 1 Monat war eine feine, bräunungsfreie Suspension für die Anwendung als ein Innokulum vorhanden.
Die feine Suspension wurde mit Hilfe eines Siebs mit einer Maschengröße von 63 μm gesiebt und auf einem Sieb mit einer Maschengröße von 45 μm gesammelt.
Herstellung von somatischen Embryonen für die kommerzielle Anwendung in einem 5-Liter-Bioreaktor
25 g Zellen wurden dem oben erwähnten Innokulum entnommen und für das Innokulieren eines 5-Liter-Bioreaktors mit einem Rührtank und einem MS2 Medium angewendet. Der Rührer wurde mit 500 upm betrieben, so dass möglicherweise noch vorhandene nicht-embryogenische Zellen entfernt werden konnten. Dieses Verfahren resultierte in einem besonders synchronisierten Wuchs. Am Ende des Verfahrens bestanden bei einer Dichte von ungefähr 1 Million Embryonen pro Liter 93% der Embryonen aus Torpedo-Embryonen.
Herstellung von eingekapselten somatischen Embryonen
Sorghummehl (10g) wurde mit Wasser (100ml) vermischt, und der pH-Wert wurde auf 5.8 eingestellt. Die Mischung wurden dann bei ununterbrochenem Rühren auf den Siedepunkt gebracht, um eine dicke Paste zu formen (diese verfestigte sich sofort, wenn ein Tropfen in Wasser eingegeben wurde). Zu diesem Zeitpunkt wurde die Paste bei 15 psi und 121°C 20 Minuten lang in einer Autoklave verarbeitet. Die Paste wurde dann auf 40°C abgekühlt. Für das Einkapseln wurden aus dem Ausreifungsmedium nach 3 Wochen reife Embryonen gewählt, welche dann einzeln in die Paste gelegt wurden. Mit Hilfe einer Pipette wurde dann eine gerundete Kapsel, welche ein Embryo beinhaltete, in kaltes Wasser gelegt. Zu diesem Zeitpunkt konnte die Kapsel dann in Fungizid und Bakteriozid getaucht werden. Die Kapseln wurden anschließend getrocknet.
Natriumalginat (Sigma) wurde dann in einer Konzentration von 3.0% (Massenanteil) zu dem MS2 hinzugefügt. Das Medium wurde dann nach Einstellen des pH-Wertes auf 5.8 in einer Autoklave verarbeitet. In Mehl eingekapselte Embryonen wurden zunächst einzeln in eine sterile Natriumalginatlösung eingetaucht, und dann in 75 mM Natriumchloridlösung gelegt, welche sich in einem Becher auf einem magnetischen Rührer befand. Die resultierenden Perlen, von welchen eine jede einen einzigen somatischen Embryo beinhaltete, wurden durch das Dekantieren der Natriumchloridlösung wiedergewonnen und mit flüssigem MS Medium gewaschen.
Keimen der Embryonen für die Herstellung von Sämlingen
Nach dem Keimen in dem MS Medium (fest oder flüssig) wurden die Sämlinge zunächst in Perlit, und dann in Levington Kompost übertragen (nach 3 Wochen), und in einem Gewächshaus bei 15–32°C und 87% relativer Luftfeuchtigkeit herangezogen. Es wurden mit Hilfe von Quecksilberdampflampen lange Tage vorgetäuscht (16 Stunden Tageslicht). Nach 3 Wochen wurden die Sämlinge dann in Kompost übertragen.
Lebensfähigkeitstest
Die Lebensfähigkeit der Zellen und Embryonen in der Kultur wurde mit Hilfe der Fluoreszindiacetat-Prüfung (FDA) (Widholm, 1972) ausgewertet. Eine Lösung von FDA in Aceton (5 mg/ml) wurde in Wasser verdünnt, um eine endgültige Konzentration von 0.01 % vor der Anwendung zu erhalten. Gleiche Volumen dieser Lösung und der Zellsuspension wurden dann gemischt und mindestens 3 Minuten bei Zimmertemperatur belassen. Ein Tropfen der Mischung wurde dann mit einer Pipette auf einen Glasobjektträger aufgetragen, mit einem Deckglas abgedeckt, und unter einem Olympus BH2 UV-Mikroskop mit einem BH-RFL-W Fluoreszenzlichtreflektor überprüft, welcher mit einer 100 Watt Quecksilberdampflampe, einem EY.455 Erregerfilter, einem B(DM.500+ 0.515) Dichromspiegel, und einem 530 nm Sperrfilter ausgestattet war. Nach einigen Minuten der Entwicklung des fluoreszenten Lichtes wurde die Anzahl von gelbgrünen fluoreszenten Zellen (lebensfähig) und die Gesamtanzahl von Zellen einschließlich der nicht-fluoreszenten (nicht lebensfähigen) Zellen in 10 willkürlich ausgesuchten Feldern gezählt.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird hier sofort erkennen, dass die vorliegende Erfindung ein zeit- und arbeitssparendes, und dennoch verläßliches Verfahren bietet, welches sich für die Massenproduktion von reifen Embryonen des Zuckerrohrs eignet. Das Verfahren ist besonders vorteilhaft für die Herstellung in einem Bioreaktor, wo dasselbe Verfahren vollständig automatisiert werden kann.
Es sollte dabei weiter beachtet werden, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die weiter oben beschriebenen Beispiele beschränkt ist, und dass diese Beispiele lediglich zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen sollen.

Claims

Verfahren umfassend die Herstellung von somatischen Embryonen des Zuckerrohrs aus Zuckerrohrexplantaten, des Weiteren enthaltend die Schritte
Kultivieren unreifer Embryonen aus Explantaten,
Kultivieren reifer somatischer Embryonen des Zuckerrohrs aus diesen unreifen Embryonen, und dadurch gekennzeichnet, dass zumindest Schritt 2 in einer flüssigen Suspensionskultur durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl das Wachstum des embryogenen Gewebes in Schritt 1 als auch die nachfolgende Entwicklung der Embryonen zur Reife im flüssigen Medium stattfinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zuckerrohrpflanzen von charakteristisch aufgebauten Meristemen oder von meristematischen Zellen von Zuckerohrpflanzen abgeleitet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das explantierte Material Wurzel-abgeleitete oder reife Embryonen enthält.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das explantierte Material reife Embryonen enthält, welche mittels Stressbelastung des Pflanzenmaterials des Zuckerrohrs gewonnen werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Stressbelastung durch Kühlen des Pflanzenmaterials erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenmaterial für ein bis drei Monate auf eine Temperatur von 5 bis 15°C gekühlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stressbelastung durch eine Behandlung mit Alkohol erzielt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur Kultivierung unreifer Embryonen aus Explantaten (Schritt 1) die Schritte umfasst: a) Kultivieren explantierten Materials in Kulturmedium um somatische Zellen zu produzieren, b) Auswählen und Vermehren somatischer Zellen, welche aus dem explantierten Material gewonnen werden, c) Kultivieren der somatischen Zellen als Kulturmedium für einen Zeitraum um unreife Zuckerrohrembryos aus den somatischen Zellen hervorzurufen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 his 9, dadurch gekennzeichnet, dass die unreifen Embryonen als embryogener Callus auf festem Medium oder als eine embryogene Zellsuspensionskultur in flüssigem Medium oder in einer Kombination aus sowohl festem als auch flüssigem Medium initiert und erhalten werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Pflanzenwachstumsregulatoren wie Auxine, Cytokinine, Gibberelline, Abscissinsäure, Anti-Auxine, Kinetin, Zeatin und/oder Aktivkohle entweder einzeln oder in Kombination in der Zusammensetzung des Mediums enthalten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Medium enthaltend Saccharose als hauptsächlichen Kohlenhydratbestandteil durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der verwendeten Saccharose im Bereich von 10 bis 60 g/l liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das explantierte Material von Rohrzuckerpflanzengewebe gewonnen wird ist, bei welchem die freien abgeschnittenen Enden mit Wachs überzogen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswahl von im Wesentlichen nur somatischen Zellen dadurch erreicht wird, dass mindestens eines der Folgenden angewendet wird: Sieben des Kulturmaterials, Hitzebehandlung oder Rühren.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei ein erstes Sieb mit einer Maschengröße von 100 bis 50 um und anschließend ein zweites Sieb mit einer Maschengröße von 50 bis 38 um verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass Hell- und Dunkel-Zyklen während der Produktion der unreifen Embryonen eingesetzt werden.
Verfahren nach einem, der Ansprüche 1 oder 2 sowie 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivieren unreifer Embryonen Wachstum von Sub-Kulturen aus der Erstkultur umfasst, wobei frisches Kulturmedium für die Sub-Kultur eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Erstkultur des Explantats das Initiieren von embryogenem Callus aus Explantaten auf festem Medium umfasst, welches gefolgt wird vom Sub-Kultivieren von embryogenem Callus aus dem Explantat in flüssigem Medium, um eine embryogene Zellsuspensionskultur einzurichten und zu erhalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verwendung von aus Pflanzenexplantaten gewonnenen Kulturen das feste Medium zur Callusinitiierung und das flüssige embryogene Suspensionsmedium Ascorbinsäure als Bestandteil enthalt.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Initüerung der Suspensionskultar aus Callas ungefähr 50 mg/l bis 200 mg/l Ascorbinsäure eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass zur Initüerung der Suspensionskultar Ascorbinsäure and Zitronensäure eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass Abscisinsäure in einem flüssigen Kulturmedium enthalten ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur reifer somatischer Embryonen des Zuckerrohrs aus unreifen Embryonen die Schritte aufweist: Herstellung flüssiger Suspensionskultar unreifer Embryonen aus Explantaten Kultivieren der Suspension in einem Bioreaktor zur Gewinnung von somatischen Embryonen.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl Schritt 1 als auch 15 Schritt 2 in einem Bioreaktor stattfinden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die produzierten reifen Embryonen vor ihrer Keimung eingekapselt werden.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Einkapselungsmittel eine Getreidemehl/Wasser-Paste enthält.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Mehl Sorghummehl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt 2 verwendeten aus Wurzel gewonnenen Kulturen ein schleimiges Material produzieren, dessen Produktion durch Eintauchen der Wurzeln in Wasser bei einer Temperatur von ungefahr 35°C unter sterilen Bedingungen eingeleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass für Schritt 2 aus Wurzel gewonnene unreife Embryonen anschließend in ein flüssiges Medium überführt werden, das weitgehend frei von 2,4-D Auxin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass für Schritt 2 die aus Blatt and Stengel gewonnene und in ein 2,4-D Auxin-freies Medium überführte Suspensionskultur Aktivkohle oder ein anderes Antioxidant im Medium enthält.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkapselung die folgenden Schritte umfasst: Herstellung einer Mehl/Wasser-Paste, Zusetzen somatischer Embryonen zu der Paste, Einsetzen einzelner in Paste eingekapselter Embryonen in Wasser, um eine Kapsel um den Embryo (die Embryonen) zu bilden, Trocknen der Kapsel.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Trocknen nach Schritt 4 die Kapsel in ein mikrobizides Mittel wie ein Fungizid and/oder ein Bakterizid eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Trocknen gemäss Schritt 4 das Einkapseln der Embryonen weiter folgende Schritte umfasst: a) Hinzufügen von Natriumalginatlösung zu den Kapseln, b) anschließendes Einsetzen der Kapsel in Calciumchloridlösung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass Zuckerrohrpflänzchen hergestellt werden durch Reifung von somatischen Embryonen zu Pflanzensämlingen aufgrund von Keimung von Embryonen, wobei einzelne somatische Embryonen in flüssigem Medium auf Polyethylenschaum kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass sich die somatischen Embryonen in einer späten Torpedostufe und in einem 2,4-D Auxin-freiem flüssigen Medium befinden, und dass dieses Flüssigmedium Abscinsinsäure (ABA) enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf Pflanzenmaterial angewendet werden, welches von anderen pflanzlichen Quellen als Zuckerrohr, die Bäume, Dattelpalmen und Kartoffeln umfassen, abgeleitet wird.