DE10154301A1

DE10154301A1 - Verfahren zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides)

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Publication number: DE10154301A1
Application number: DE2001154301
Authority: DE
Original assignee: PRIVATINSTITUT fur INNOVATIVE
Current assignee: PRIVATINSTITUT fur INNOVATIVE
Priority date: 2001-11-05
Filing date: 2001-11-05
Publication date: 2003-05-15

Abstract

Es wird ein Verfahren beschrieben, welches die in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) zum Inhalt hat. Teile von ausgewachsenen Sanddornpflanzen werden in beschriebener Weise sterilisiert und auf festem Nährmedium mit spezifischer Zusammensetzung unter definierten Bedingungen kultiviert und zur Kallusbildung angeregt. Unter Veränderung der Zusammensetzung des Nährmediums wird der Kallus in Suspension überführt, vermehrt und anschließend auf festem Nährmedium wieder regeneriert. Der regenerierte Kallus wird durch Veränderung von Wachstumsbedingungen und Zusammensetzung des Nährmediums zur Schösslingsbildung angeregt. Die Besonderheiten des Verfahrens liegen in der Berücksichtigung der Empfindlichkeit des Sanddorns (Hippophae rhamnoides ssp.) gegenüber oxidativen und anderen Abbauprozessen, der spezifischen Zusammensetzung der Nährmedien, der Kultivierungsbedingungen sowie des zeitlichen Ablaufes des Verfahrens.

Description

Der Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.), welcher zu den Ölweidengewächsen (Elaeagnazeen) gehört, ist eine Pflanze, die sowohl im europäischen als auch im asiatischen Raum vorkommt und aufgrund seiner Anspruchslosigkeit an Boden, Klima und Nährstoffversorgung auch in extremen Lagen, z. B. auf kargem Sandboden, im Hochgebirge etc. wächst.
Aufgrund seines hohen Gehaltes an Vitaminen, Ölen mit ungesättigten Fettsäuren und sonstiger gesundheitsfördernder Inhaltsstoffe in den Früchten und Samen wird der Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) traditionell schon seit dem Altertum als Arzneimittel genutzt und erzielt heute eine zunehmende wirtschaftliche Bedeutung für Pharmazie, Kosmetik- und Lebensmittelindustrie.
Schwierige Erntebedingungen und eine aufgrund des spezifischen Fruchtbildungszyklus nur alle zwei Jahre mögliche Beerenernte steigern den Bedarf an Anbaufläche für den Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) und damit verbunden den Bedarf an Sanddornjungpflanzen. Für diesen sich abzeichnenden Trend eines plötzlich erhöhten Bedarfes an Sanddornjungpflanzen ist in herkömmlichen Anzuchtbetrieben (Baumschulen etc.) nicht ausreichend Zuchtmaterial an bestimmten Sorten vorhanden. Eine in Vitro Vermehrung schafft gegenüber der vegetativen Vermehrung den Vorteil, dass aus einer einzigen Stammpflanze mit den gewünschten optimalen Merkmalen (Wachstum, Ertrag, Beschaffenheit der Beeren etc.) sehr viele Jungpflanzen mit den gleichen Eigenschaften in kürzester Zeit herangezogen werden können.
Diese bei vielen Kulturpflanzen bereits erfolgreich industriell angewandte Methode bereitet beim Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) bisher aufgrund verschiedener physiologischer und ökologischer Besonderheiten Probleme. Deshalb wurde er bisher noch nicht in dieser Weise vermehrt. Zu diesen Besonderheiten zählen z. B. die Symbiose mit einem Strahlenpilz, welcher ähnlich wie bei den Leguminosen den Luftstickstoff zu binden vermag, sowie eine sehr hohe Empfindlichkeit verletzter Gewebeteile gegenüber Sauerstoff, was zu einer schwierigen Handhabung bei der Kalluserzeugung durch sehr schnelles Absterben der Zellen führt. Der Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) ist unter Freilandbedingungen eine anspruchslose Pflanze, hat aber sehr spezifische Ansprüche an die Zusammensetzung der Nährmedien und den Beleuchtungsmodus bei der in Vitro Vermehrung. Erschwerend kommt für die notwendigen sterilen Arbeitsbedingungen hinzu, dass der Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) durch seine schuppige Oberfläche eine große Zahl von Keimen und Sporen aufweist, welche sich nur mit speziellen Sterilisationsmethoden entfernen lassen, da die Pflanze wiederum empfindlich gegenüber den meisten der üblicherweise in der Pflanzenzellkultivierung eingesetzten Desinfektionsmittel ist. Die Behandlung dieser Probleme (Sauerstoffempfindlichkeit, Ansprüche an Nährmedium und Wachstumsbedingungen, Sterilisation) sind der besondere Gegenstand des beschriebenen Verfahrens zur Sanddornvermehrung.

1. Gewinnung der Explantate

Geeignete Pflanzenteile werden von der ausgewachsenen Pflanze abgeschnitten und die Schnittflächen versiegelt. Diese Teile werden mit geeigneten Desinfektionsmitteln, darunter Natriumhypochlorid in optimaler Konzentration behandelt. Die Einwirkzeit richtet sich nach der Keimbelastung. Nach der Durchführung verschiedener steriler Spülschritte werden die Pflanzenteile von anhaftender Flüssigkeit befreit. Die anschließende Herstellung der Schnitte (Explantate) erfolgt unter sterilen Bedingungen unter Beachtung der Empfindlichkeit von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) gegen Sauerstoff- Einwirkung. Es werden nur zur Kallusbildung geeignete, meristemhaltige Schnitte verwendet.

2. Herstellung des Nährmediums für die Kallusbildung

Das Nährmedium, welches zur Kallusbildung mit Agar verfestigt wird, wird mit Reinstwasser (Aqua bidest.) hergestellt und enthält in definierten Mengen Makronährstoffe, Mikronährstoffe, Spurenelemente, Vitamine, Saccharose sowie Wuchsstoffe. Das Nährmedium wird dampfsterilisiert, hitzeempfindliche Komponenten werden sterilfiltriert. Das Nährmedium wird in Petrischalen gegossen und nach dem Erstarren des Agar kühl und dunkel bis zum Gebrauch aufbewahrt.

3. Kultivierung der Explantate zur Kallusbildung

Die Explantate werden in geeigneter Weise auf den Agar aufgebracht und die Kulturgefäße steril verschlossen. Die Kultivierung erfolgt bei optimaler Temperatur, Beleuchtung und Atmosphäre bis zum Erscheinen des Kallus.

4. Subkultivierung und Vermehrung des Kallus

Bei der Subkultivierung des Kallus ist der richtige Zeitpunkt von entscheidender Bedeutung. Ebenso die Bedingungen beim Abtrennen, Umsetzen und der Weiterkultivierung, welche die Sauerstoff-Empfindlichkeit des Pflanzengewebes von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) berücksichtigen. Das Nährmedium, auf welchem subkultiviert wird, wird zur Optimierung des Kalluswachstums und zur Vorbereitung für die Suspensionskultur mit veränderter Zusammensetzung hergestellt. Dies bezieht sich hauptsächlich auf die Pflanzenwuchsstoffe. Die Passage wird so oft wiederholt, bis der Kallus die optimale Konsistenz erreicht.

5. Suspensionskultur zur Einzelzellvermehrung

Zur Einzelzellvermehrung wird ein flüssiges Nährmedium (ohne Zusatz von Agar) verwendet, welches sich im Wesentlichen nur durch veränderte Pflanzenwuchsstoffe und Wuchstoffkonzentrationen vom Kallusbildungsmedium unterscheidet. Die Kulturgefäße werden so gewählt, dass das Medium ausreichend bewegt werden kann, durch schütteln, rühren o. ä.. Der vorbereitete Kallus wird unter Beachtung der Sauerstoffempfindlichkeit in das Flüssigmedium überführt, steril verschlossen und unter optimalen Bedingungen (definierte Temperatur-, Licht- und Atmosphärenverhältnisse) kultiviert. Zur ausreichenden Versorgung der Zellen mit Nährstoffen wird das Medium laufend erneuert, bis die optimale Zelldichte erreicht ist.

6. Kallusregeneration aus Einzelzellen

Mit Agar versetztes Medium, welches sich vom Medium zur Kallusbildung (siehe Pkt. 2) in der Wuchsstoffzusammensetzung unterscheidet, wird in Petrischalen gegossen. Die Zellsuspension wird auf dem Medium gleichmäßig aufgebracht und unter optimalen Bedingungen (Temperatur, Licht, Atmosphäre) kultiviert. Der sich aus den Einzelzellen regenerierende Kallus wird bei Erreichen eines bestimmten Entwicklungszustandes subkultiviert, wobei die besondere Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff zu beachten ist.

7. Anregung der Schösslingsbildung und Kultivierung bis zum Jungpflanzenstadium

Mit Agar versetztes Medium, welches sich vom Medium zur Kallusregeneration in der Wuchsstoffzusammensetzung mit dem Ziel der Anregung der Schösslingsbildung unterscheidet, wird in geeignete Kulturgefäße gebracht und die regenerierten Kallusteile darauf umgesetzt, wobei die besondere Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff zu beachten ist. Die Kultivierung erfolgt unter für diese Phase optimalen Bedingungen (Licht, Temperatur, Atmosphäre). In verschiedenen Schritten der Regeneration von Sprossen, Blättern und Wurzeln differenzieren sich die Schösslinge aus dem Kallus. Diese Schösslinge werden in geeignete Kulturgefäße auf angepasstes Nährmedium vereinzelt bzw. umgesetzt und bis zum Jungpflanzenstadium weiterkultiviert.

Claims

1. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn, dadurch gekennzeichnet, dass geeignete Pflanzenteile von der ausgewachsenen Pflanze abgeschnitten, versiegelt und mit geeigneten Desinfektionsmitteln, darunter Natriumhypochlorid in geeigneter Konzentration und mit geeigneter Einwirkdauer behandelt werden.

2. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kalluswachstum aus den nach Anspruch 1 gewonnenen Explantaten auf Nährmedien mit optimaler Zusammensetzung und spezifischen Konzentrationen an Phytohormonen angeregt wird.

3. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Behandlung des Kallus die besondere Empfindlichkeit gegen oxidative und andere Abbauprozesse berücksichtigt wird.

4. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddom (Hippophae rhamnoides ssp.) nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kallus zur Zellvermehrung in Flüssigkultur in ein Nährmedium mit optimaler Zusammensetzung und spezifischen Konzentrationen an Phytohormonen überführt wird.

5. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Kallus aus der Suspension auf einem geeignetem Medium regeneriert wird unter optimaler Zusammensetzung und spezifischer Konzentration der Phytohormone.

6. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalluskultivierung unter definierten Wachstumsbedingungen und unter den den jeweiligen Stadium angepassten Beleuchtungsverhältnissen erfolgt.

7. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung der Schösslingsbildung mit geeignetem Medium mit optimaler Zusammensetzung und spezifischen Konzentrationen an Phytohormonen erfolgt.

8. Methode zur in Vitro Vermehrung von Sanddorn (Hippophae rhamnoides ssp.) nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen in Anspruch 1 bis 7 genannten Arbeitsschritte jeweils zu definierten optimalen Zeitpunkten nach Kultivierungsbeginn erfolgen.