DE60033536T2

DE60033536T2 - Verfahren zum reifen von somatischen koniferenembryonen

Info

Publication number: DE60033536T2
Application number: DE60033536T
Authority: DE
Inventors: Jens Iver Private Bag 3020 FIND
Original assignee: Woody Plant Biotech ApS
Current assignee: Woody Plant Biotech ApS
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 2000-09-20
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-09-21
Also published as: HUP0202610A3; DK1217884T3; WO2001020972A1; EP1217884B1; CA2414842A1; AU778180B2; AU7404200A; HUP0202610A2; CZ20021004A3; PL201417B1; ATE354272T1; DE60033536D1; EP1217884A1; PL356259A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet von Verfahren für eine Pflanzenpropagierung durch Gewebekulturtechniken, insbesondere für eine Pflanzenpropagierung von Koniferenbäumen durch somatische Embryogenese.
Augrund der im Allgemeinen sehr langen Generationszyklen von Koniferen schreitet ein Züchten durch Kreuzen und Selektion sehr langsam voran und aufgrund der Tatsache, dass Konifere notorische Outbreeder sind, unterscheidet sich die Nachkommenschaft von sogar hochselektierten Individuen extrem. Durch clonale Propagierung ist es allerdings möglich, sowohl die Additive als auch die nicht-additive Variation in einer Population zu fangen, wodurch ein zusätzlicher genetischer Gewinn erhalten wird. Für eine Anzahl von wirtschaftlich bedeutsamen Koniferen wurden Verfahren für eine clonale Propagierung in erster Linie als Wurzelschnitte entwickelt, wobei allerdings für die große Mehrheit dieser Spezies eine sexuelle Propagierung über Samen das ausschließliche oder das ausschließliche kosteneffiziente Verfahren für eine Propagierung darstellt.
Sogar bei den Fällen, wo Verfahren für eine Propagierung über Schnitte entwickelt wurden, ist das Ergebnis häufig nicht zufrieden stellend, da ein Verwurzelungsprozentsatz mit dem Alter des Mutterbaums abnimmt und da eine Tendenz für ein plagiotropisches Wachstum der Schnitte besteht, welche nicht von dem apikalen Trieb genommen wurden. Aus diesen Gründen besteht ein dringendes weltweites Interesse in einer Entwicklung von kosteneffizienten Verfahren für eine reproduzierbare clonale Propagierung von Koniferen.
Das Aufkommen genetischer Transformationen als ein Werkzeug für ein Züchten von Bäumen benötigt ebenso die Entwicklung von effizienten und reproduzierbaren Verfahren für eine Regeneration von Pflanzen von transformiertem Gewebe. Es ist unabdinglich, dass die Regenerationsverfahren auf beinahe alle Zelllinien anwendbar sind, um irgendeine unbeabsichtigte Selektion während des Propagierungsschrittes folgend dem Transformationsschritt zu vermeiden.
In Kürze besteht eine Pflanzenregeneration mittels somatischer Embryogenese in Koniferen aus einer Anzahl von aufeinander folgenden Schritten. Zuerst wird eine embryogene Kultur von einem Explant initiiert, welches entweder ein Embryo, reif oder unreif, ein Setzling, oder jüngst ebenso Keime von erwachsenen Bäumen sein könnten (WO 99/23874 AFOCEL). Dieser Schritt wird an irgendeinem geeigneten Pflanzenkultivierungsmedium durchgeführt, welches eine Vielzahl von pflanzlichen Wachstumsregulatoren enthält, die weitestgehend von dem Genus der in Frage stehenden Spezies abhängig sind. Für gewöhnlich sind sowohl Auxin als auch Cytokinin eingefügt, aber es gibt ebenso Berichte auf eine Initiierung unter Verwendung von ausschließlich Cytokinin (Nørgaard & Krogstrup 1995, S. 344, Tabelle 1) oder sogar eine Initiierung ohne einen pflanzlichen Wachstumsregulator ( US 5,565,355 NEW ZEALAND FOREST RESEARCH INSTITUTE, Nørgaard & Krogstrup 1995, S. 345).
Für eine andauernde Proliferation werden die initiierten Kulturen entweder auf Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das Induktionsmedium subkultiviert oder sie werden auf einem Medium mit geringeren Konzentrationen von pflanzlichen Wachstumsregulatoren subkultiviert. In diesem Stadium bestehen die proliferierenden Zellmassen aus mehr oder weniger gut differenzierten unreifen somatischen Embryos, welche morphologisch einem Zustand entsprechen, der in dem sich entwickelten Samen in der frühen Phase einer Samenentwicklung gefunden wird. Unter optimalen Bedingungen erfahren die somatischen Embryos keine weitere Entwicklung während einer Proliferation und reife Embryos werden daher während dieser Phase nicht gebildet.
Um eine Embryoreifung zu erhalten, müssen die Kulturen auf ein pflanzliches Kultivierungsmedium transferiert werden, worin – für gewöhnlich – Auxin und Cytokinin weggelassen werden und Abscisinsäure (ABA) eingefügt ist. In einigen Fällen ist ein kurzer (1 bis 2 Wochen) Übergangsschritt eingeschlossen, während welchem die Zellmassen auf pflanzlichem Kultivierungsmedium kultiviert werden, welches keine pflanzlichen Wachstumsregulatoren und manchmal Aktivkohle enthält. Von dieser Phase wird angenommen, eine anschließende Reifung aufgrund des geringeren Gehalts oder der Abwesenheit von Auxin und Cytokinin in dem Kultivierungsmedium und deren möglichen Entfernung durch Aktivkohle zu erleichtern. Eine Verdopplung der anschließenden Reifungshäufigkeit wurde berichtet (WO 93/11660).
Von einer Anzahl von Faktoren wurde gezeigt, eine allgemeine stimulatorische Wirkung auf die Häufigkeit einer Embryoreifung und/oder auf die Qualität der gebildeten reifen Embryos aufzuweisen. Der wichtigste Faktor ist der natürlich auftretende pflanzliche Wachstumsregulator Abscisinsäure. Heutzutage ist diese Verbindung oder Analoge oder Derivate davon beinahe in allen Protokollen für eine Reifung von Koniferen somatischen Embryos mit eingefügt.
Ein andere wichtiger Faktor für den Reifungsvorgang besteht in der Osmolalität des pflanzlichen Kultivierungsmediums (WO 93/11660 UNIVERSITY OF SASKATCHEWAN). Deren Erhöhung durch Zugabe eines nicht durchdringenden Osmotikums, wie beispielsweise PEG-4000 (Polyethylenglycol-4000), wurde gezeigt, insbesondere die Qualität der reifen Embryos zu verbessern. Von der Verbesserung wird angenommen, durch ein erhöhtes Niveau Triacylglyceriden in den reifen Embryos verursacht zu werden. Triacylglyceride werden in den Zellen während einer Reifung von zygotischen Embryos abgelagert und als eine Energiequelle für die Keimung verwendet. PEG-4000 oder ähnliche Verbindungen werden herkömmlicher weise in Reifungsmedien eingefügt.
Bei der großen Mehrheit von Koniferen, wird Sucrose als die einzige Kohlenhydratquelle für den Reifungsschritt verwendet. Es gibt allerdings Berichte, dass insbesondere mit Maltose bessere Ergebnisse erzielt werden können. Dies wurde für Pinus spp ( US 5187092 INSTITUTE OF PAPER SCIENCE AND TECHNOLOGY) und für Abies nordmanniana berichtet (Plant Science, vol 124:211-221, NøRGAARD).
Es gibt ebenso Berichte, dass das Einfügen eines Auxins in das Reifungsmedium sowohl die Anzahl von gebildeten reifen somatischen Embryos als auch ihre Qualität stimulieren kann. US 5187092 INSTITUTE OF PAPER SCIENCE AND TECHNOLOGY offenbart die Verwendung von 0,5–2,0 μM IBA + 10–40 μM ABA für die Reifung von Pinus taeda und Pseudotsuga menziesii somatischen Embryos und Roberts et al (1990) offenbart die Verwendung von 0,1–10 μM IBA + 40 μM ABA für die Reifung von Picea glaucaxengelmanii. Es wurde daher für äußerst verschiedene Spezies von drei verschiedenen Genera gezeigt, dass die Zugabe eines Auxins während der Reifung das Verfahren bzw. den Vorgang verbessert.
Wie in WO 96/37096 (CARTER HOLT HARVEY LTD.) gezeigt, ist der Prozentsatz von initiierten Zelllinien, welche reife Embryos bilden können, für gewöhnlich 1–10% beträgt. WO 96/37096 erwähnt Prozentsätze von bis zu 25%, welche mit ausgewählten embryogenen Zelllinien erhalten werden. Falls dieses Verfahren für eine Massenpropagierung verwendet und mit einer Zucht in Wäldern oder Gartenbau kombiniert werden sollen, ist es von äußerster Wichtigkeit das im Wesentlichen keine oder eine äußerst begrenzte Selektion in dem Propagierungsschritt stattfindet. Wertvolle Clone können verloren gehen, falls es nicht möglich ist sie zu propagieren.
Bei Picea abies ist es möglich gewesen, Zelllinien in zwei Gruppen zu teilen, basierend auf ihrer Morphologie und der Befähigung der Zelllinien, reife somatische Embryos zu erzeugen. Zelllinien, welche reife somatische Embryos erzeugen können, werden A-Typ Zelllinien genannt und sie erzeugten bereits reife Embryos, falls die bekannten Reifungsverfahren mit Abscisinsäure unterzogen werden. Andererseits können ungefähr 50% aller Zelllinien als B-Typ Zelllinien gekennzeichnet werden, welche nicht bereits reife somatische Embryos erzeugen (von Arnold et al 1995).
Eine andere Schwierigkeit, welche mit dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik zusammenhängt, ist der Mangel an Reproduzierbarkeit.
Bei vielen Spezies ist eine Proliferation während der Reifungsphase eine Schwierigkeit. Falls eine Proliferation während der Reifung andauert wird der letztere Vorgang inhibiert und in vielen Fällen werden die reifenden Embryos durch proliferierendes Gewebe überwachsen. Bei den Spezies, welche zu Picea, Pinus und Larix gehören, setzt sich eine Proliferation nicht zu dem gleichen Ausmaß fort, wie in Spezies, welche zu Abies gehören, kann aber immer noch eine Schwierigkeit darstellen. Gereifte Embryos werden in erster Linie an der Kante der Zellmasse gebildet, d.h. sowohl an deren Peripherie als auch auf der Oberseite der Zellmasse. An der Peripherie gebildete Embryos stehen in Kontakt mit dem Reifungsmedium und erzielen für gewöhnlich eine ausreichende Qualität hinsichtlich Morphologie und Anhäufung von gelagerten Nährstoffen. Auf der Oberfläche einer proliferierenden Zellmasse gebildete Embryos stehen nur in indirektem Kontakt mit dem Reifungsmedium und werden ebenso durch Verbindungen betroffen (beispielsweise Wachstumsregulatoren), welche von den proliferierenden Zellen ausgeschieden werden oder austreten. Häufig besteht die Folge davon in einer verzögerten Reifung, Hyperhydrizität, unvollständiger Morphologien (beispielsweise gewöhnlich missgeformte oder fehlende Cotyledone) und eine erniedrigte Anhäufung von gelagerten Nährstoffen.
Schließlich ist es bekannt, dass die Befähigung von etablierten embryogenen Kulturen eine Reifung durchzumachen mit ihrem Alter abnimmt. Für einige Spezies, insbesondere den Mitgliedern von Pinus genus, erfolgt die Abnahme sehr schnell, d.h. innerhalb von Monaten.
Kulturen von mehreren anderen Genera, wie beispielsweise Picea, Pinus und Larix, sind besser für einen längeren Zeitraum stabil, allerdings wird in vielen Fällen eine gewisse Art einer Abnahme beobachtet, entweder als eine verringerte Reifungshäufigkeit oder als eine Notwendigkeit für längere Reifungszeiten oder höhere Konzentration von Reifungsagenzien, wie beispielsweise Absciscinsäure.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die Reifung von Koniferen somatischen Embryos bereitgestellt, umfassend einen Schritt, worin eine embryogene Zellmasse mit einem Kultivierungsmedium kultiviert wird, welches ein anti-Auxin umfasst.
Durch Einfügen eines anti-Auxins in das Kultivierungsmedium während zumindest einem Teil der Reifung, werden mehrere unerwartete und positive Wirkungen erzielt. Proliferation wird verringert. Dies bedeutet, dass die Bildung von neuen reifen Embryos aufhört. Eine Verringerung einer Proliferation an sich erleichtert den Übergang von Proliferation zu Reifung. Aber eine Reifungshäufigkeit ist zu einem weitaus größeren Maß als erwartet erhöht, lediglich aus der Verringerung einer Proliferation. Das anti-Auxin führt zu einer unerwarteten Verschiebung in einer Physiologie von einer Proliferation zu einer Reifung.
Beinahe alle getesteten embryogenen Zelllinien, unabhängig von der Spezies, reagieren auf die Reifungsbehandlung mit Erzeugung von reifen somatischen Embryos. Dadurch wird ein weitaus größerer Reifungsprozentsatz erhalten, als im Stand der Technik gezeigt.
Es wurde überraschenderweise entdeckt, dass die Qualität der somatischen Embryos nicht verringert ist, obgleich die Aktivität des wichtigen endogenen pflanzlichen Wachstumsregulators, Auxin, verringert ist. In der Tat ist die insgesamt Qualität der geernteten reifen Embryos am Ende der Reifung in der Tat besser als im Stand der Technik.
Die anderen Bestandteile des Kultivierungsmediums, wie beispielsweise Nährstoffe, Vitamine, Osmotika, organischer Stickstoff, Gellierungsagens, Kohlenstoffquellen und pflanzliche Wachstumsregulatoren sind nicht Bestandteil des erfinderischen Gedanken gemäß Anspruch 1. Die Wahl des Fachmanns stellt eine unendliche Anzahl von Möglichkeiten dar. Der Stand der Technik enthält viele Beispiele geeigneter Kombinationen von Makro-Nährstoffen und Mikro-Elementen (siehe beispielsweise George 1993), ebenso wie geeignete metabolisierbare Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Sucrose, Maltose, Lactose, Fructose, Glucose, Maltotriose, Stärke, Galactose usw. Zusätzlich zu diesen kann der Fachmann wählen Vitamine und verschiedene Quellen organischen Stickstoffs, wie beispielsweise Aminosäuren oder komplexe Mischungen davon, wie beispielsweise Casein Hydrolysat oder andere Hydrolysate, in das Kultivierungsmedium aufzunehmen. Darüber hinaus kann es von Vorteil sein, ein Osmotikum, wie beispielsweise ein nicht durchdringendes Osmotikum, wie beispielsweise Polyethylenglycole, Dextrane, Cellulosen, Pectine, Galactane, Ficolle, Polypropylen Glycole, Agar, Gummis, Oligosaccharide, Proteine, Aminosäuren, Polyaminosäuren, Lipoproteine, Nukleotide, Oligonukleotide, Lipopolysaccharide oder durchdringende Osmotika, wie beispielsweise Polyethylenglycole, Zuckeralkohole, Sorbitol, Mannitol und Carbohydrate, aufzunehmen. Das während dier vielen Schritte einer Reifung verwendete Kultivierungsmedium kann entweder flüssig sein, wobei die Zellen in dem Medium kultiviert werden oder in Kontakt mit dem Medium auf einer gewissen Art eines Festphasenträgers stehen. Alternativ dazu, kann das Medium mit einem oder mehreren der bekannten Gelierungsagenzien, wie beispielsweise Gelrit, Phytagel, Agar, Agarose, Stärke oder ähnlichen Agenzien, geliert sein. Unabhängig von dem Kultivierungsmedium können die Zellen auf Filtpapier oder ähnlichem Trägermitteln kultiviert werden, was eine Subkultivierung bedeutend erleichtert.
Schließlich kann das während einer Reifung verwendete Kultivierungsmedium zusätzliche pflanzliche Wachstumsregulatoren, wie beispielsweise Cytokinine, Gibberelline oder sogar Auxine umfassen.
In dem Fall, worin einer der erfindungsgemäßen Schritte vergleichsweise kurz ist, beispielsweise geringer als 3 Wochen, kann das Kultivierungsmedium sehr einfach sein, und eine oder alle der Gruppen herkömmlicher Mediumbestandteile ausschließen. Das Kultivierungsmedium kann ebenso einfach Wasser oder geliertes Wasser sein, da die embryogene Zellmasse eine Zeitspanne ohne Nährstoffe und/oder metabolisierbaren Kohlenstoff leicht überleben kann.
Die Länge des ein anti-Auxin umfassenden Schrittes ist vorzugsweise zwischen 2 Tagen und 50 Wochen, wobei die Länge von der in Frage stehenden Spezies und spezifischen Zelllinie abhängt. Versuche haben gezeigt, dass einige Zelllinien auf Medium mit anti-Auxin während der gesamten Reifungszeitspanne kultiviert werden sollten, andere Zelllinien ausschließlich 2 bis 4 Wochen oder sogar weniger benötigen, um die vorstehend erwähnten Wirkungen zu erzielen. Ähnlich dazu weist das Alter der Zelllinie eine erhebliche Wirkung auf die Gesamtlänge der Reifungszeitspanne auf, wobei die jüngeren Zelllinien, wie beispielsweise von weniger als einem Jahr Alter, im Allgemeinen viel schneller reifen als alte Zelllinien, wie beispielsweise von mehr als fünf Jahre Alter. Daher würden jüngere Zelllinien für gewöhnlich ebenso eine geringere Zeitspanne einer Aussetzung gegenüber anti-Auxin benötigen. Ein Zeichen einer zu langen Aussetzung gegenüber dem anti-Auxin ist das Auftreten von missgeformten Embryos mit unregelmäßigen oder fehlenden Cotyledonen. In diesem Fall, sollte der Zeitraum einer Aussetzung gegenüber anti-Auxin verkürzt werden.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiterhin einen zweiten Schritt vor dem anti-Auxin Schritt, worin die embryogene Zellmasse mit einem Kultivierungsmedium kultiviert wird. Für die Mehrzahl an Spezies und Zelllinien hat sich von einer Aussetzung gegenüber anti-Auxin gerade von dem Anfang einer Reifung gezeigt die Lebensfähigkeit der plattierten Zellen zu verringern. Dies beruht teilweise aufgrund der Tatsache, dass neu plattierte Zellen in einem gestressten Zustand vorliegen und das die Kultur benötigt auf dem Reifungsmedium vor einer Aussetzung gegenüber anti-Auxin "etabliert" zu sein. Die Länge des zweiten Schritts vor dem anti-Auxin Schritt ist vorteilhafter Weise zwischen 2 Tagen bis 10 Wochen.
Häufig ist es ähnlich dazu vorzuziehen, einen dritten Schritt nach dem anti-Auxin Schritt mit aufzunehmen, worin die embryogene Zellmasse in einem Kultivierungsmedium kultiviert wird, das in Wesentlichen frei von anti-Auxin ist. Wie vorstehend erwähnt, kann eine zu lange Aussetzung gegenüber anti-Auxin unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen, in welchen die Kultur mit reifenden Embryos in ein Kultivierungsmedium übertragen wurde, das kein anti-Auxin aufweist, aber alle anderen notwendigen Bestandteile für eine andauernde Reifung beinhaltet. Vorzugsweise dauert der dritte Schritt nach dem anti-Auxin Schritt 2 Tage bis zu 40 Wochen.
Unerwarteter Weise erzielte die Verschiebung der Zugabe einer metabolisierbaren Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise von Maltose nach Sucrose im Kultivierungsmedium in dem dritten Schritt unter Weglassung des anti-Auxins, eine überraschende positive Reifungswirkung auf die Größe der reifen Embryos, das Erscheinen der Embryos und Kürzung der Reifungszeitspanne.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Kultivierungs medium in zumindest einem der Schritte ebenso ein Reifungsagens. Wohingegen eine Embryoreifung ohne die Verwendung von irgendeinem Reifungsagens möglich ist, wurde es festgestellt, dass Zugabe von einem derartigen Agens zu dem Kultivierungsmedium die Reifungshäufigkeit und die Qualität der Embryos stark erhöht. In Abhängigkeit der Länge der verschiedenen Phasen, kann das Reifungsagens während einem, zwei oder allen drei Schritten vorliegen. Vorzugsweise liegt das Agens während allen drei Schritten vor.
Vorzugsweise ist das Reifungsagens ausgewählt aus der Gruppe welche umfasst Abscisinsäure, Silbernitrat, jasmonsäure, Abscisylalkohol, Acetylen Aldehyd, Dihydroacetylen Alkohol, Phaseinsäure, Dihydrophaseinsäure, 6'-Hydromethyl Abscisinsäure, Betahydroxy Abscisinsäure, Beta-methylglutaryl Abscisinsäure, Beta-Hydroxy-beta-methylglutarylhydroxy Abscisinsäure, 4'-Desoxy Abscisinsäure, Abscisinsäure Beta-D-Glucose Ester und 2-2(2-p-Chlorophenyl-trans-ethyl)xyclopropan Carboxylsäure. Von diesen Agenzien wurde gezeigt, eine Reifung zu fördern oder sind Analoge oder Derivate derartiger Agenzien.
Das Reifungsagens ist mehr bevorzugt Abscisinsäure, von welchem gezeigt wurde, eine Reifung besonders gut zu fördern. Die Konzentration von Abscisinsäure in dem Kultivierungsmedium liegt vorzugsweise zwischen 0,1 und 200 μM.
Der erfinderische Gedanke der vorliegenden Erfindung umfasst alle Verfahren für ein Verringern der Wirkung von Auxin während der Reifungszeitspanne. Dies kann durch Hinzufügen von Verbindungen mit einer anti-Auxin Funktion durchgeführt werden, wie beispielsweise von Verbindungen, welche einen Auxin-Abbau verursachen, Verbindungen, welche die Auxin-Wirkung inhibieren, Verbindungen, welche eine Auxin-Inaktivierung verursachen, Verbindungen, welche die Synthese von Auxin inhibieren, oder Verbindungen, welche einen Auxin-Transport inhibieren. Ein anderer Weg die Wirkung von Auxin zu inhibieren oder zu verringern besteht darin, Verbindungen wegzulassen, welche für eine Auxinsynthese notwendig sind, wie beispielsweise Bor oder Zink oder Weglassen von Verbindungen in dem Biosyntheseweg, der zu Auxin führt, wie beispielsweise Tryptophan.
Die anti-Auxine gemäß der Erfindung umfassen, sind aber nicht auf die nachstehenden Verbindung ebenso wie Analoge oder Derivate davon begrenzt: α-(1-Naphtylmethyl-sulfid)-isobuttersäure, α-(1-Naphtylmethyl-sulfid)-propionsäure, α-(2-Naphtylmethylsulfide)-isobuttersäure, α-(2-Naphtylmethylsulfide)-propionsäure, δ-(Naphtylmethyl selenid)-η-valeriansäure, (-)-α(2,4,5Trichlorphenoxy)-propionsäure, (-)-α-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure, (-)-α-(2-Naphthoxy)-propionsäure, (+)-α-(1-Naphthoxy)-propionsäure, (3-Phenyl-1,2,4thiadiazol-5-yl)-thioessigsäure (PTAA), β-Naphtalenessigsäure (β-NAA), γ-Phenylbuttersäure, 1-(Naphthylmethyl-sulfid)-propionsäure, 1-Naphthylmethylselenidessigsäure, 2-(Naphthylmethyl-sulfid)-propionsäure, 2-(o-Chlorphenoxy)-2-methylpropionsäure, 2,3,4,5,6-Pentachlorphenoxyisobuttersäure, 2,3,5-Triiodbenzoesäure (TIBA), 2,3,5-Triiodbenzoesäure, 2,4,5-Trichlorphenoxyisobuttersäure, 2,4,6-Trichlorphenoxyessigsäure (2,4,6-T), 2,4,6-Trichlorphenoxyisobuttersäure, 2,4-Dichloranisol (2,4-DCA), 2,4-Dichlorphenoxyisobuttersäure (2,4-DCIP), 2,4-Dichlorphenylsulfonessigsäure, 2,4-Dichlorphenylsulfoxidessigsäure, 2,6-Dichlorphenoxyessigäure, 2-Chlorphenoxyisobuttersäure, 2-Naphtylmethylselenidessigsäure, 3-Chlorphenoxyisobuttersäure, 3-Indolisobuttersäure, 3-Nitro-4-fluorbenzoesäure, 4-Chlorphenoxyisobuttersäure, 5-Methyltryptophan, 7-Aza-indol, 9-Hydroxyfluoren-9-carbonsäure (HFCA), Ferulasäure, Flavonoide, Indolisobuttersäure, Kämpferöl, Maleinsäurehydrazid, Naptalam (N-1-Naphtylphthalaminsäure), p-Chlorphenoxyisobuttersäure (PCIB), p-Coumarsäure, Phenoxyessigsäure, Phenoxyisobuttersäure, Phenylpropionsäure, Quercetin und Trans-Zimtsäure.
Ein besonders bevorzugtes anti-Auxin ist PCIB, welches vorzugsweise während des anti-Auxin Schritts in einer Konzentration zwischen 0,01 und 200 μM vorliegt. Besonders gute Ergebnisse werden mit einer Konzentration von PCIB zwischen 1 und 50 μM erhalten.
Der erfinderische Gedanke ist allgemein auf alle Koniferen anwendbar und insbesondere anwendbar auf Pflanzenspezies, welche ein Mitglied der Pinaceae sind. Innerhalb der Pinaceae werden besonders gute Ergebnisse gemäß der Erfindung mit den Genera Pinus, Picea, Abies, Larix und Pseudotsuga erhalten.
Gemäß besonders bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung ist die Konifere ein Abies sp wie beispielsweise Abies nordmanniana Lk. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Konifere eine Picea sp, wie beispielsweise eine Picea abies L. Karst. oder Picea sitchensis (Bong.) Carr.
Falls die Konifere ein Abies sp ist, wie beispielsweise Abies nordmanniana, ist vorzuziehen, dass das anti-Auxin PCIB einer Konzentration zwischen 1 und 100 μM ist. Versuchsdaten zeigen, dass dies den benötigten Konzentrationsbereich darstellt, um die Wirkungen gemäß dem erfinderischen Gedanken zu erhalten. Zu geringe Konzentrationen führen nicht zu den erwünschten Wirkungen.
Falls das Konifere ein Picea sp ist, ist es vorzuziehen dass das anti-Auxin PCIB einer Konzentration zwischen 0,5 und 50 μM ist. Versuche haben gezeigt, dass die Konzentration des anti-Auxins relativ gering sein sollte, um die Wirkungen gemäß dem erfinderischen Gedanken zu erhalten. Falls im Falle von Picea sp zu hohe Konzentrationen hinzugefügt werden, ist die Wirkung mehr oder weniger letal. Ein großer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass die Zelllinien, welche für gewöhnlich keine Reifung durchmachen (wie beispielsweise Picea abies, die so genannten B-Art Zelllinien), tatsächlich signifikante Mengen von Embryos gemäß der vorliegenden Erfindung herstellen werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Kultivierungsmedium, das während zumindest einem Teil des dritten Schritts nach dem Anti-Auxin Schritt verwendet wird, weiterhin ein Auxin. In einigen Fällen wurde beobachtet dass die Verlängerung bzw. Elongation der Zellen der reifenden Embryos sogar nach Entfernung von dem das anti-Auxin umfassenden Medium teilweise inhibiert werden kann. Durch Hinzufügen eines Auxins zu dem Medium während des dritten Schritts der Reifung kann diese Schwierigkeit gelöst werden und eine Verlängerung schreitet wie gewünscht voran.
Die Konzentration des Auxins in dem Kultivierungsmedium ist vorzugsweise zwischen 0,001 und 100 μM. Das Auxin ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, welche Indolessigsäure, Indolbuttersäure, Naphtalin Essigsäure, 2,4-D, 2-Naphtyloxy Essigsäure (NOA), 4-Chloropheboxy Essigsäure (4-CPA), 2-Methyl-4-Chlorophenoxy Essigsäure (MCPA), 2,4,5-Trichlorophenoxy Essigsäure (2,4,5-T), 3,6-Dichloranisin Säure (dicamba), 4-Amino-2,5,5-Trichlorpicolin Säure (picloram), Othonil und 2-Chloro-3(2,3-dichloro-phenyl)-Propionitril (CDPPN) umfasst.
Die genaue Länge einer Aussetzung gegenüber Auxin während dem dritten Schritt sollte in einem Versuch bestimmt werden und kann irgendeines zwischen 2 Tagen und 40 Wochen sein.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ist ein reifer Koniferen somatischer Embryo bereitgestellt, der durch irgendeines der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wird. In vielen Fällen ist es nicht möglich gewesen, derartige Embryos in großen Mengen gemäß dem Stand der Technik herzustellen. Es ist darüber hinaus nicht sehr häufig möglich gewesen, die Embryos auf eine vorhersehbare und reproduzierbare Art herzustellen.
Der Embryo gemäß der Erfindung weist vorzugsweise einen Wassergehalt von weniger als 70% auf, der basierend auf einem Nassgewicht ausgedrückt wird. Durch den Stand der Technik ist es nicht immer möglich gewesen, reife somatische Embryos mit einem Wassergehalt geringer als 70% zu erzeugen, insbesondere nicht in den Fällen, wo eine Proliferation während des Reifungsschritts weit fortgeschritten war. Da eine Proliferation gemäß der Erfindung kontrolliert werden kann, ist es ebenso möglich, den Reifungszeitraum zu verlängern, um den Embryos zu ermöglichen, größere Mengen an gelagertem Material, wie beispielsweise Triacylglyceride und gelagerte Proteine, anzuhäufen. Die Anhäufung von gelagertem Material weist eine förderliche Wirkung auf den anschließenden Keimungsvorgang auf.
Der Embryo gemäß der Erfindung kann transgen sein und dadurch rekombinante DNA-Sequenzen umfassen, wobei die Transformation in einem Schritt vor einer Reifung durchgeführt wird. Gegenwärtig besteht der ausschließliche Weg zur Herstellung von transgenen Koniferen Embryos durch Transformation von Zellen durch verschiedene bekannte Mittel und anschließend Regeneration von Pflanzen durch somatische Embryogenese. In vielen Fällen ist es nicht möglich gewesen, reife somatische Embryos aus transformierten embryogenen Zellmassen zu erzeugen. Transformation und der anschließende Selektionsvorgang setzen die embryogene Zellmassen Stress aus und benötigen ebenso eine sehr lange Zeit. Daher verlieren die Zelllinien häufig ihre Befähigung somatische Embryos während diesem Stadium zu erzeugen. Dies ist insbesondere eine Schwierigkeit mit Pinus spp, bei welchem die Befähigung zur Erzeugung reifer somatischer Embryos schnell mit dem Alter abnimmt.
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Koniferen Pflanze, die durch einen Embryo gemäß der Erfindung hergestellt wird. Für viele Koniferen Spezies und viele Zelllinien ist es nicht möglich gewesen, Pflanzen gemäß dem Stand der Technik zu regenerieren. Unter Verwendung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Prozentzahl von Spezies und Zelllinien, von welchem reife Embryos hergestellt werden können, signifikant erhöht. Da die erfindungsgemäßen Embryos ebenso von höherer Qualität sind, wurde ein Keimen der Embryos und Härten und andauerndes Wachstums der gekeimten Pflanzen ebenso verbessert.
Die Pflanzen der gemäß der Erfindung können ebenso transgen sein und rekombinante DNA-Sequenzen umfassen.
Die Erfindung wird nun detaillierter unter Verwendung einer Anzahl von Beispielen und den nachstehend aufgeführten Figuren beschrieben:
Figuren
1. Fotografie einer schnell wachsenden Abies nordmanniana Zelllinie, welche Reifung gemäß der Erfindung und gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik offenbart.
2. Fotografie einer langsam wachsenden Abies nordmanniana Zelllinie welche Reifung gemäß der Erfindung und gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik offenbart.
3. graphische Darstellung von bevorzugten Ausführungsformen der anti-Auxin Phase gemäß der Erfindung.
4. bevorzugte und nicht bevorzugte Ausführungsformen eines Embryos gemäß der Erfindung
5. Fotografien einer Abies nordmanniana Zelllinie, welche gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung gereift ist.
6. Fotografie einer Abies nordmanniana Zelllinie, welche gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung gereift ist.
7. Graphische Darstellung des endogenen Indol Essigsäure (IAA) Niveaus in drei Zelllinien von Abies nordmanniana.
8. Fotografie ein Keimen und Härten von Embryos gemäß der Erfindung.
9. Fotografie von drei reifen somatischen Embryos von Abies nordmanniana; das linke Bild zeigt einen gewöhnlichen Embryo von Behandlung B), das mittlere Bild zeigt einen gewöhnlichen Embryo von Behandlung D), und das rechte Bild zeigt einen gewöhnlichen Embryo von Behandlung C).
Der erfinderische Gedanke wurde in einer Anzahl von verschiedenen Situationen getestet, mit verschiedenen Koniferen und Zelllinien von verschiedenen Charakteristika, wie beispielsweise neu etablierte Zelllinien und ältere Zelllinien, langsam wachsende Zelllinien, schnell proliferierende Zelllinien, transgene Zelllinien, Zelllinien, welche reife Embryos gemäß bekannter Verfahren erzeugen können (wie beispielsweise A-Typ Zelllinien), und Zelllinien, welche keine reifen Embryos gemäß bekannter Verfahren erzeugen (wie beispielsweise B-Typ Zelllinien).
Beispiel 1. Reifung in etablierten Zelllinien von Abies nordmanniana
Material und Methoden:
Pflanzliches Material
Drei verschiedene Zelllinien von Abies nordmanniana wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Die getesteten Zelllinien wurden in kontinuierlicher Kultur über mehrere Jahre gehalten. Die Zelllinie G.3.8 wurde aus einem unreifen zygotischen Embryo 1989 auf MS Medium halber Stärke initiiert (Murashige and Skoog, 1962), wie vorstehend beschrieben (Nørgaard and Krogstrup, 1991), die Zelllinie G.35.8 wurde von einem reifen zygotischen Embryo auf SH Medium 1991 initiiert (Nørgaard and Krogstrup, 1995) und die Zelllinie G.78.14 wurde 1993 aus einem unreifen zygotischen Embryo auf modifiziertem BLG Medium halber Stärke initiiert (Verhalten and Wann, 1989). Von 1996 wurden alle Kulturen durch zwei wöchentliche Subkultivierung auf frischem modifiziertem BLG Medium halber Stärke gehalten und bei 24 +/– 1°C in der Dunkelheit wachsen gelassen. Zelllinien G.3.8 und G.78.14 proliferierten schnell auf Erhaltungsmedium mit einer Verdopplungszeit von etwas weniger als zwei Wochen. Die Zelllinien G.35.8 proliferierte relativ langsam mit einer Verdopplungszeit von etwas mehr als zwei Wochen.
Kultivierungsmedium für Initiierung und Erhaltung
Das MS Medium halber Stärke (Murashige and Skoog, 1962) enthielt halbstarkes MS Makro, Mikro und FeEDTA. Die MS Vitamine wurden durch 10 × Thiamin-HCL, 100 mg/l Inositol, 500 mg/L L-Glutamin und Casein Hydrolysat modifiziert. Das SH Medium (Schenk und Hildebrandt, 1972) wurde durch Einfügen von 500 mg/L l-Glutamin und Casein Hydrolysat modifiziert. Das BLG Medium halber Stärke (Verhalten und Wann, 1989) wurde aus MS Medium halber Stärke durch Weglassen von NH₄NO₃ und Verringern von KNO₃ auf 50 mg/L modifiziert. KCL wurde zu 372.5 mg/L, L-Glutamin zu 750 mg/L und L-Aspargin zu 50 mg/L hinzu gegeben. Vitamine wurden durch Verwendung von 10 × Thiamin-HCL und 100 mg/l Inositol modifiziert. Für alle Medien wurde 1,8 g/L Phytagel (Gellan Gummi) als Gelierungsagens verwendet und ein pH wurde auf 5,7 vor einem Autoklavieren eingestellt. Sucrose wurde in einer Konzentration von 1% und BAP in einer Konzentration von 5 μM für eine Proliferation verwendet. In dem Erhaltungsmedium wurde kein Auxin verwendet. Die Aminosäuren wurden als eine filtersterilisierte Lagerlösung hergestellt und nach Autoklavieren und Abkühlen des Mediums auf ungefähr 50°C hinzu gegeben.
Reifung
Das herkömmliche Reifungsmedium (die Kontrolle) sind von dem vorstehend erwähnten BLG Proliferationsmedium halber Stärke modifiziert. Das Medium umfasst keine Sucrose und BAP, wird allerdings mit 45 g/L Maltose (Merck 5911), 50 g/L PEG-4000 (Fulka), und 40 μM ABA (Sigma Al049) supplementiert. Die Wahl dieser drei Kulturmedium Bestandteile wird hauptsächlich durch die in Frage stehende Koniferenspezies bestimmt. Für Abies nordmanniana ist es bekannt, dass eine bessere Reifung durch Verwenden von Maltose anstelle von Sucrose als eine Carbohydratquelle erhalten wird. Ähnlich dazu ist es bekannt, dass Hinzufügen von PEG-4000 eine Reifung verbessert. Es kann noch möglich sein ebenso gute Ergebnisse mit anderen Kombinationen dieser Bestandteile zu erhalten und ebenso durch Verwenden anderer Bestandteile mit äquivalenten Wirkungen.
Ähnlich dazu, wurde das BLG Medium halber Stärke ausgewählt, da es für viele Koniferen einschließlich von Abbies spp, Picea spp und Pinus spp geeignet gefunden wurde. Ein äquivalentes Basalmedium kann verwendet werden, um Ergebnisse zu erzielen, die zu den Ergebnissen, die mit BLG Medium erhalten wurden, äquivalent sind, wobei das wichtige Thema ist, dass das Basalmedium ausgewogen sein sollte, um die Erfordernisse der in Frage stehenden Koniferenspezies zu erfüllen.
In diesem Versuch wurde das herkömmliche Reifungsmedium durch Ausschließen von PEG und durch Aufnehmen einer der 3 nachstehenden Chemikalien modifiziert, von den herkömmlicher weise erwartet wird, die endogene Konzentration des natürlich auftretenden Auxins IAA zu betreffen oder die herkömmliche Wirkung von Auxin in herkömmlichen Pflanzenzellen zu betreffen: 1) PCIB (Auxin-Antagonist) in einer Konzentration von 25 oder 117 μM, 2) TIBA (Auxin Transporterinhibitor) in einer Konzentration von 5 oder 50 μM, 3) Phlouroglucinol (Inhibitor eines Auxinabbaus) (siehe George 1993, Seite 429 unten bis 430) in einer Konzentration von 30 mM. Zusätzlich zu diesen Modifikationen wurde das herkömmliche Reifungsmedium modifiziert durch: 4) Verringern der Konzentration von Bor (Vorläufer einer Indol Essigsäuresynthese) auf 10 μM, d.h. 20% der gewöhnlichen Konzentration und schließlich durch 5) Aufnehmen von 25 μM PCIB in Medium mit keinem ABA.
Die Kulturen wurden in der Dunkelheit bei 24°C +/– 1°C reifen gelassen.
Die anti-Auxine und Mittel, um endogene Auxinwirkungen zu verringern, wurden für eine Darstellung verschiedener Gruppen von Behandlungen oder Verbindungen ausgewählt. Der Versuch stellt daher äußerst verschiedenen Wege einer Verringerung einer Auxinkon zentration oder einem Verringern von Auxinwirkungen, ebenso wie die benötigten Kontrollen und eine Behandlung dar, von welcher erwartet wird, eine endogenen Auxinkonzentration zu erhöhen.
Plattieren
Zwei Wochen nach der letzten Subkultivierung wurden 4 g embryogene Zellen in ein 250 ml Kolben bzw. Behälter (blauer Deckel) zusammen mit einem Magnetrührer transferiert. 100 ml flüssiges Proliferationsmedium wurden hinzu gegeben und die Suspension wurde für 5 Minuten bei hoher Geschewindigkeit auf einem Magnetrührer gerührt, um eine homogene Suspension von Zellen und Zellklumpen zu erhalten. Die Kultur wurde anschließend auf einem Drehschüttler (120 Upm) für 1 Woche bei 24 +/– 1°C in der Dunkelheit vor-kultiviert. Anschließend an die Vor-Kultivierung, wurde die Kultur wiederum auf einem Magnetrührer bei hoher Geschwindigkeit für 5 Minuten gerührt. Die Kultur wurde in einen 100 ml Messzylinder überführt und ermöglicht sich für 30 Min. abzusetzen. Der Überstand wurde verworfen und die verbleibenden Kulturaliquots von 1 mL wurden mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze auf Filterpapier (Whatman # 2) transferiert, das auf 25 mL Reifungsmedium in 10 cm Petrischalen (Nunc, Dänemark) platziert wurde. Die die reifenden somatischen Kulturen enthaltenen Filter wurden alle 2 Wochen auf frisches Medium transferiert.
Der Zweck eines Plattierens der Kulturen auf das Reifungsmedium besteht darin, eine gleichmäßige Verteilung der plattierten Zellen auf dem festen Träger zu erhalten (in diesem Falle Filterpapier), um eine Reproduzierbarkeit zu erhöhen und eine Variation zu verringern. Eine Reifung kann ebenso einfach durch Transferieren von Klumpen embryogener Zellmasse in das Reifungsmedium initiiert werden.
Keimen
Gut entwickelte reife Embryos wurden für eine Kältebehandlung nach ungefähr 20 Wochen Reifung gesammelt. Die isolierten reifen Embryos wurden auf einen Nylonfilter transferiert, der auf einer Schaumgummiunterlage in einer hohen Petrischale platziert war. Ein benetztes Filterpapier wurde in die Unterseite und den Deckel der Petrischale platziert. Die Petrischale wurde geschlossen, mit 2 Runden Polyethylenfilm abgedichtet, in Aluminiumfolie eingewickelt, und anschließend bei 5°C in der Dunkelheit für 4 Wochen für eine Kältebehandlung platziert. Nach einer Kältebehandlung, wurde der Nylonfilter mit den reifen Embryos auf BGM-2 Medium (Krogstrup et al, 1988) transferiert. Das BGM-2 Medium enthielt 20 g/l Sucrose, 10 g/L Aktivkohle (Merck 5411), und wurde mit 3,5 g/L Phytagel (Gellan Gummi) geliert. Die Petrischalen wurden in einem Wachstumskammer bei 20°C mit einer 16 Stündigen Lichtzeitspanne platziert. Nach 1 Woche Keimen wurde das Nylonnetz entfernt und die Embryos wurden in direkten Kontakt mit dem Medium platziert. Nach zwei Wochen Keimen wurden Embryos mit einer Wurzel vertikal platziert, wobei die Wurzel in das Medium eintauchte. Später wurden die keimenden Embryos auf Boden transferiert und in ein gesteuertes Gewächshaus platziert.
Das beschriebene Verfahren für ein Keimen ist gerade eines von vielen verschiedenen Verfahren, welche für ein Keimen von Koniferen somatischen Embryos verwendet werden kann. Es kann daher ebenso von Vorteil gefunden werden, einen Trocknungsschritt zwischen der Embryoreifung und Keimen einzufügen. Während dieses Schrittes kann der Embryo einer gesteuerten Trocknung unterzogen werden, um die Reifungstrockne zu simulieren, welche während der entsprechenden letzten Phase einer Samenreifung stattfindet.
Wassergehalt
Der Wassergehalt von reifen somatischen Embryos und Embryos von Samen wurde durch Wägen von ungefähr 25 Embryos (Frischgewicht, FW) bestimmt, Trocknen der Embryos bei 60°C für zwei Tage und erneutes Wägen der Embryos (Trockengewicht, DW). Der Wassergehalt ist die Bestimmung auf einer Frischgewichtsbasis: (FW-DW)/FW.
Ergebnisse:
Die 1 und 2 offenbaren Reifung von zwei embryogenen Zelllinien des Abies nordmanniana. Zelllinie G.3.8 (1) ist eine der Kulturen, welche schnell auf Proliferationsmedium proliferierten. Gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik erzeugt sie keine oder sehr wenige somatische Embryos. Zelllinie G.35.8 (2) ist eine der Kulturen, welche verhältnismäßig langsam in Proliferationsmedium proliferierten. Sie erzeugt wenige reife somatische Embryos gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik. Vier verschiedene Protokolle für eine Reifung wurden getestet: A) Reifung für 20 Wochen auf Reifungsmedium einschließlich 40 μM ABA und 5% PEG-4000 (Kontrollverfahren). B) Reifung wie für A), allerdings wurden von Woche 4 bis 8 die Kulturen auf Medium einschließlich von 40 μM ABA und 25 μM PCIB reifen gelassen. C) Reifung für 20 Wochen auf Reifungsmedium einschließlich von 40 μM ABA und 25 μM PCIB. D) Reifung für 20 Wochen auf Reifungsmedium ohne ABA, aber einschließlich 25 μM PCIB.
Die 3 zeigt die Anzahl von gut entwickelten reifen somatischen Embryos pro Petrischale bei den Zelllinien G.3.8 und G.35.8 nach 20 Wochen Reifung gemäß den vorstehend beschriebenen vier verschiedenen Reifungsprotokollen.
Für die getesteten embryogenen Zelllinien von Abies nordmanniana wurden ausschließlich wenige reife Embryos auf dem Kontrollmedium mit ABA und PEG gebildet (1A, 2A und 3). Bei den meisten Fällen wurde eine Reifung von Embryos in diesen Kulturen initiiert, allerdings wurde aufgrund einer Proliferation des Umgebungsgewebes die entwickelnden Embryos überwachsen und sie entwickelten sich nicht weiter. Auf Medium einschließlich von sowohl ABA als auch 25 μM PCIB war eine Proliferation verringert und eine hohe Anzahl von Embryos entwickelte sich während Reifung (1B, 2B und 3). Die Anzahl von gut entwickelten reifen Embryos war allerdings von sowohl der Konzentration als auch der Anwendungszeit von PCIB abhängig (3). Einige der getesteten Zelllinien proliferierten sehr schnell, wohingegen andere Zelllinien ausschließlich langsam auf dem Erhaltungsmedium proliferierten. Diese Charakteristika wurden ebenso gefunden, falls die Zelllinien auf Reifungsmedium wachsen gelassen wurden, und die Rate einer Proliferation während einer Reifung stark Zelllinien abhängig war. Die beste Anwendung von PCIB während einer Reifung wurde gefunden, teilweise durch die Rate einer Proliferation der Zelllinie bestimmt zu sein, und daher konnte ein allgemeines Protokoll für die Anwendung von PCIB nicht gefunden werden, welches alle getesteten Zelllinien abdeckt. Für eine Veranschaulichung werden die Ergebnisse für eine "schnell" und für eine "langsam" proliferierende Zelllinie gezeigt.
Zelllinie G.3.8 proliferierte schnell auf Erhaltungsmedium und auf Reifungsmedium einschließlich von ABA und PEG, wobei sich keine gut geformten reifen Embryos während einer Reifung auf Medium ohne PCIB entwickelten (1A und 3). Falls 25 μM PCIB in das Medium von Woche 4 bis 8 der 20 wöchigen Reifungszeitspanne aufgenommen wurde, entwickelten sich ungefähr 40 gut geformte Embryos und eine Proliferation war leicht verringert (1B und 3). Durch Aufnahme von 25 μM PCIB während der gesamten Reifungszeitspanne bildeten sich jedoch ungefähr 125 gut geformte Embryos pro Petrischale und eine Proliferation war stark verringert (1C und 3).
Die Zelllinie G.35.8 proliferierte langsam auf Erhaltungsmedium und ebenso während einer Reifung auf Medium einschließlich von ABA und PEG. Ausschließlich wenig reife Embryos entwickelten sich auf dem Kontrollmedium (2A und 3), wobei eine Aufnahme von PCIB auf das Reifungsmedium eine eindeutig positive Wirkung auf die Anzahl von gut geformten Embryos für diese Zelllinie aufwies. Die besten Ergebnisse wurden allerdings gefunden, falls PCIB in das Reifungsmedium von Woche 4 bis 8 der 20 wöchigen Reifungszeitspanne aufgenommen wurde, wobei sich ungefähr 250 Embryos pro Petrischale entwickelten (2B und 3). Im Gegensatz zu Zelllinie G.3.8, hatte eine Aufnahme von PCIB während der gesamten Reifungszeitspanne eine negative Wirkung auf die Anzahl von gut geformten reifen Embryos der Zelllinie G.35.8 (2C und 3), wobei sich ausschließlich ungefähr 15 gut geformte Embryos pro Petrischale entwickelten.
Falls ABA von einem Reifungsmedium einschließlich 25 μM PCIB ausgeschlossen wurde, fingen eine relativ hohe Anzahl von Embryos an, in den Kulturen zu reifen, wobei sich ausschließlich wenige und eindeutig abnormale und frühzeitig keimende Embryos auf diesem Medium für alle getesteten Zelllinien entwickelten (1C und 2D). Da praktisch keine Reifung auf Medium ohne sowohl anti-Auxin als auch ABA stattfindet, zeigt dies eindeutig, dass anti-Auxine als solche eine Rolle bei einer Embryoreifung spielen. Wie bei den anderen Fällen einer Aufnahme von PCIB, war eine Proliferation verringert.
Die 4 offenbart die Morphologie von reifen somatischen Embryos von Abies nordmanniana und gewöhnliche Abnormalitäten, welche durch übermäßige Aussetzung gegenüber PCIB während einer Reifung verursacht werden. A: gut entwickelter Embryo mit einer geraden Achse von einer Wurzel zu einem Trieb und ungefähr 5 Cotyledonen, welche das Triebmeristem umgeben. B: Embryo mit ausschließlich zwei Cotyledonen. Der Embryo ist um die vertikale Achse relativ symmetrisch und das Triebmeristem ist gewöhnlich intakt. C: Embryo mit zwei Cotyledonen. Der Embryo ist eindeutig asymmetrisch mit einem großen und einem kleine Cotyledon. Das Triebmeristem wird durch die Abnormalität beeinträchtigt. D: Embryo mit ausschließlich einem Cotyledon. Der Embryo weist kein funktionelles Triebmeristem auf.
Der gut entwickelte reife somatische Embryo von Abies nordmanniana wies eine gerade Achse von Wurzel zu Triebpol und ungefähr fünf Cotyledonen auf (4A). Falls die Zelllinien auf Reifungsmedium einschließlich von PCIB in oberhalb bestmöglichen Konzentrationen oder für einige Zelllinien für zu lange Zeiträume wachsen gelassen wurden, entwickelten sich hohe Anzahlen von abnormalen reifen Embryos. Eine äußerst charakteristische Abnormalität bestand in einer Verringerung der Anzahl von Cotyledonen (4B–D). Falls die langsam proliferierenden Zelllinien auf Medium, welches ABA und 25 μM PCIB enthielt, für längere Zeiträume als 4 Wochen wachsen gelassen wurden, entwickelten sich Embryos mit ausschließlich zwei symmetrischen Cotyledonen (4B). Falls höhere Konzentrationen als 25 μM PCIB für die getesteten Zelllinien verwendet wurden, entwickelten sich die Embryos asymmetrisch mit einem Haupt- und einem Neben-Cotyledon (4C) oder mit ausschließlich einem Cotyledon (4D). das Triebmeristem schien in reifen Embryos mit zwei symmetrischen Cotyledonen intakt zu sein, wobei diese Embryos keimen und sich weiter entwickeln konnten, wobei allerdings reife Embryos mit zwei asymmetrischen oder ausschließlich einem Cotyledon nicht richtig keimten.
Die 5 offenbart Reifung der Zelllinie G.78.14. Diese Zelllinie proliferiert schnell und erzeugt sehr wenige gewöhnliche reife Embryos gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik. Die Zelllinie wurde für 20 Wochen auf Medium reifen gelassen, welches 40 μM ABA und a) 25 μM PCIB, b) 0,4 mM Phloroglucinol oder c) eine verringerte Konzentration Bor (20% der herkömmlichen Konzentration) umfasste. Für eine Kontrolle siehe 1a oder 2b.
Ein Medium in einer geringeren Konzentration Bor wies ebenso eine positive Wirkung bei der Anzahl von reifen Embryos auf (5). Auf Reifungsmedium mit einer verringerten Konzentration Bor wurde eine eindeutige Zunahme bei der Anzahl von sich entwickelnden reifen Embryos bei einigen der getesteten Zelllinien beobachtet. Eine Proliferation setzte sich allerdings in diesen Kulturen fort und ein Überwachsen der sich entwickelten Embryos verringerte die Anzahl von gut entwickelten Embryos. Da verringertes Bor nur bei einer Konzentration getestet wurde, ist es möglich, dass positive Wirkungen durch Optimieren der Konzentration von Bor erhalten werden könnten.
Falls eine Embryoreifung auf Medium einschließlich von Phloroglucinol (0,4 mM) durchgeführt wurde, wurden keine gut entwickelten Embryos gefunden und eine Proliferation war in den getesteten Zelllinien erhöht (5). Von Phloroglucinol wird angenommen als ein Inhibitor eines Auxinabbaus zu wirken und von der Zugabe von Phloroglucinol wird daher angenommen, eine Zunahme einer endogenen Auxin Konzentration zu verursachen.
Die 6 offenbart Reifung der Zelllinie G.78.14 für 20 Wochen auf Reifungsmedium, welches 40 μM ABA und a) 2,5 mg/L TIBA (5 μM), oder b) 25 mg/L TIBA (50 μM) umfasste.
Für beide der getesteten Konzentrationen des Auxin Transportinhibitors TIBA wurde eine starke Verringerung der Proliferation auf dem Reifungsmedium für alle getesteten Zelllinien gefunden, wobei sich nur sehr wenige und überwiegend abnormale reife Embryos entwickelten (6). Da TIBA nur in zwei Konzentrationen (5 und 50 μM) getestet wurde, kann man die Möglichkeit nicht ausschließen, dass eine positive Wirkung mit einer geringeren Konzentration erhalten werden könnte.
7 offenbart die endogene Konzentration von Indol Essigsäure in drei Zelllinien der Abies nordmanniana. Die Konzentrationen wurden während Proliferation der Kulturen bestimmt. Die Balken stellen den Standardfehler dar.
Endogenes IAA wurde in proliferierenden Kulturen von allen drei getesteten Zelllinien gefunden (7). Die Konzentration von IAA wurde gefunden in einem Bereich von 6 bis 9 nmol/mg Trockengewicht in den Kulturen zu sein, wobei allerdings kein signifikanter Unterschied zwischen der "schnell proliferierenden" und der langsam proliferierenden Zelllinie gefunden wurde.
Der Wassergehalt von reifen zygotischen Embryos von Abies nordmanniana betrug ungefähr 30%. Der Wassergehalt von reifen somatischen Embryos war vom Genotyp abhängig, wobei allerdings für beide Zelllinien der Wassergehalt von somatischen Embryos höher als der Wassergehalt von zygotischen Embryos war. Für somatische Embryos von Reifungsmedium mit PCIB betrug der Wassergehalt zwischen 65 und 70%, was geringer ist als bei den entsprechenden reifen somatischen Embryos von Reifungsmedium ohne PCIB.
Die 8A offenbart keimende Embryos, welche gemäß der Erfindung hergestellt wurden. Die Embryos wurden einer Kältebehandlung für zwei Wochen unterzogen, gefolgt von zwei Wochen Keimen auf einem Keimungsmedium. Die 8B offenbart erfindungsgemäße gekeimte Pflanzen, welche auf Boden für ein Härten transferiert wurden.
Hohe Zahlen von reifen Embryos wurden von verschiedenen Zelllinien durch die Verwendung von PCIB in dem Reifungsmedium entwickelt. Eine Keimung der Embryos war gut und beinahe 100% der Embryos entwickelten sowohl Trieb als auch Wurzel, und mehr als 2000 der Pflanzen wurden auf Boden und in das Gewächshaus transferiert (8B). Regenerierte Pflanzen waren im Allgemeinen ruhend, wie es der Fall mit Setzlingen der gleichen Spezies ist. Die Pflanzen überlebten in dem Boden, es war allerdings sehr schwierig ein weiteres Wachstum von der Knospe zu erhalten. Die Schwierigkeit betraf wahrscheinlich Keimruhe, wobei es später möglich gewesen ist ein weiteres Wachstum durch Optimierung des Keimungsprotokolls zu induzieren. Es ist bekannt, das ein Unterziehen von derartig ruhenden Pflanzen zu Bedingungen von kurzen Tagen und geringer Temperatur für einen Zeitraum, welche experimentell bestimmt werden müssen, ein Überfluss an Knospen und dadurch andauerndes Wachstum induziert.
Beispiel 2, Reifung in neu etablierten Abies nordmanniana embryogenen Kulturen
Ungefähr 50 Zelllinien wurden von reifen Samen auf die gleiche Art wie die Zelllinie G.78.14 initiiert (Beispiel 1). Die Kulturen wurden auf modifiziertem BLG Medium halber Stärke initiiert und erhalten (siehe Beispiel 1). Die Kulturen waren weniger als 6 Monate alt, wenn sie einer Reifung unterzogen wurden.
Protokoll
Die Kulturen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben plattiert. Die Kulturen wurden zwei verschiedenen Reifungsprotokollen unterzogen.

1) Reifung für 8 Wochen auf Kulturmedium, welches 40 μM ABA und 5% PEG-4000 umfasst.
2) Reifung für wie in 1), allerdings waren von Woche 2 bis 4 die Kulturen auf Kultivierungsmedium, welches 40 μM ABA und 25 μM PCIB umfasst.

Ergebnisse:
Vorläufige Versuche hatten gezeigt, dass es schädlich war, diese neu etablierten Zelllinien andauerndem anti-Auxin zu unterziehen. Daher wurde ausschließlich eine Behandlung, welche einen kurzen anti-Auxin Schritt umfasst, einbezogen.
Zuerst sollte angemerkt werden, dass die neu etablierten Zelllinien wesentlich weniger Zeit für eine Reifung als die älteren Zelllinien benötigen. Ein Teil der Zelllinien erzeugte hohe Zahlen von gut entwickelten reifen somatischen Embryos gemäß der Kontrollbehandlung (Behandlung 1). Die verbleibenden Zelllinien taten das nicht.
Beinahe alle Zelllinien erzeugten hohe Zahlen von reifen somatischen Embryos gemäß der Erfindung, falls sie dem vorstehend beschriebenen, zwei wöchigen anti-Auxin Schritt unterzogen wurden. Daher bestand das Ergebnis darin, dass es möglich war, reife somatische Embryos von allen getesteten Zelllinien zu erzeugen.
Beispiel 3, Reifung in embryogenen Kulturen von Picea abies.
Pflanzliches Material
Drei embryogene Zelllinien, D.2.9, D.4.1, D.7.1, von Picea abies, die von unreifen Samen 1989 initiiert und bis 1998 wie durch Nørgaard et al (1993) beschrieben cryogelagen wurden, wurden für das vorliegende Experiment verwendet. Die Kulturen wurden durch 2 Wöchentliche Subkulturen auf halbfestem Proliferationsmedium BMI-S1 (Krogstrup 1986) erhalten, das mit 1,8 g/l Gelrit geliert wurde. Vor einer Übertragung auf Reifungsmedium wurden 4 g Zellmasse von jeder Zelllinie ausgewogen und in 50 ml Proliferationsmedium in einem 250 ml Erlenmeyerkolben transferiert. Der Kolben enthielt ebenso einen sterilen Magneten.
Vorbehandlung
Die Kulturen wurden für 5 Minuten unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt, um sie aufzulösen. Anschließend wurden die Kolben für 15 Minuten auf einem Drehschüttler bei 175 Upm geschüttelt. Das Medium mit suspendierten Zellaggregaten wurde anschließend in einen 100 ml Messzylinder gegossen und ermöglicht sich für 30 Minuten abzusetzen. Der Überstand wurde verworfen und Aliquots von 1 ml Zellen wurden auf sterile Whatman # 54 Papierscheiben plattiert, die auf die verschiedenen Reifungsmedien platziert sind. Drei Replikaplatten wurden für jede Kombination von Zelllinie und Behandlung vorgenommen.
Reifungsprotokoll
Fünf Reifungsprotokolle wurden getestet.

A: Reifung auf BMG-1 Medium (Krogstrup et al 1988), welches durch Erhöhen der ABA Konzentration auf 40 µM modifiziert ist.
B: Wie A, allerdings von Woche 2 bis Woche 4 Reifung auf Kulturmedium, welches 2,5 µM PCIB in 40 µM ABA umfasst.
C: Wie A, allerdings von Woche 2 bis Woche 4 Reifung auf Kulturmedium, welches 5,0 µM PCIB und 40 µM ABA umfasst.
D: Reifung auf Medium, welches 2,5 µM PCIB und 40 µM ABA umfasst.
E: Reifung auf Medium, welches 5,0 µM PCIB und 40 µM ABA umfasst.

Ergebnisse
Die Zelllinien D.4.1 und D.7.1, welche gewöhnlich so genannte A-Zelltyp Zelllinien darstellen, erzeugten reife somatische Embryos ohne irgendeine anti-Auxin Schritt. Sie erzeugten allerdings hohe Anzahlen von somatischen Embryos, falls ein anti-Auxin Schritt eingefügt wurde. Die Wirkung des anti-Auxins Schritt bestand darin, die Proliferation während einer Reifung zu verringern.
Die Zelllinie D.2.9 erzeugt nicht so viele Embryos wie die anderen beiden Zelllinien. Die Kultur wird schrittweise braun und verliert ihre Lebensfähigkeit, falls sie ohne einen anti-Auxin Schritt reifen gelassen wird. Reife Embryos werden anschließend erzeugt. Falls einem anti-Auxin Schritt unterzogen, wird die Kultur ebenso anfänglich braun, allerdings wird später feine, durchscheinende proliferierende embryogene Zellmasse an der Peripherie der Kultur erzeugt. Eine hohe Anzahl von reifen somatischen Embryos wird von dieser Zellmasse wiederum erzeugt.
Es scheint daher, dass die Aufnahme eines anti-Auxin Schritts die Wirkung einer Änderung von Zelllinien, die nicht in der Lage sind reife somatische Embryos zu erzeugen, in Zelllinien aufweist, die das bewerkstelligen können. Klumpen von neu gebildeten Zellmassen von D.2.9 wurden zurück in Proliferationsmedium transferiert und dadurch ist es möglich geworden, reife Embryos von dieser Kultur erneut zu erzeugen.
Es ist daher möglich, einen Aspekt des Verfahrens gemäß der Erfindung zu verwenden, um die Befähigung von Zelllinien zur Erzeugung reifer somatischer Embryos zu verbessern. Dies kann offenkundig durch Unterziehen der Kulturen den Bedingungen, die vorstehend für Zelllinie D.2.9 beschrieben wurden, bewerkstelligt werden, es kann allerdings ebenso durch Einfügen eines anti-Auxin Schritts in den Proliferationsschritt oder in einen Schritt zwischen Proliferation und Reifung bewerkstelligt werden.
Beispiel 4, Reifung in embryogenen Kulturen in Picea sitchensis
Pflanzliches Material
Zwei Zelllinien von Picea sitchensis, G.1.12, G.1.13, die von Cotyledonen von reifen Embryos initiiert wurden, wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Kulturen wurden initiiert und wie vorstehend auf BMI-S1 Medium vorbehandelt, allerdings mit 1000 mg/L Casein Hydrolysat und 10 µM 2,4-D.
Vorbehandlung, Reifungsmedium und anti-Auxin Schritt wie für Picea abies. Ergebnisse Beide der getesteten Zelllinien erzeugten hohe Anzahlen von reifen somatischen Embryos sowohl mit als auch ohne einen anti-Auxin Schritt. Eine Proliferation war allerdings eindeutig durch Unterziehen der Kulturen einem anti-Auxin Schritt verringert und das allgemeine Erscheinen der Kulturen war verbessert.
Beispiel 5, Transformation von embryogenen Abies nordmanniana Zellkulturen und anschließende Regeneration von Pflanzen.
Embryogene Zelllinien von Abies nordmanniana wurden unter Verwendung des Verfahrens, das durch Walter et al (1998) offenbart wird, mit wenigen Modifikationen biolistisch transformiert. Zuerst ist die Spezies Abies nordmanniana an Stelle von Pinus radiata. Das modifizierte BLG Medium halber Stärke, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurde für eine Proliferation und ebenso während dem Selektionsschritt nach einer Transformation verwendet.
Das transferierte Plasmid war das pCW 122 Plasmid, welches das Reportergen uidA unter der Kontrolle des CaMV 35S Promoters umfasst, und das npt II selektierbare Markergen, das durch den CaMV35S Promoter kontrolliert wird.
Eine Selektion wurde auf Proliferationsmedium durchgeführt, welches 50 mg/l Geneticin umfasst. Expression des uidA Reportergens wurde in transformierten embryogenen Gewebe, in abgeleiteten reifen somatischen Embryos, welche gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, und in regenerierten Pflanzen histochemisch nachgewiesen, die ähnlich dazu gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von GUS Färben erzeugt wurden.
Beispiel 6: Reifung von Abies nordmanniana Zelllinien, welche eine Auxinphase umfasst.
Drei Protokolle wurden für eine Reifung der Zelllinien verwendet:

A) Reifung auf Kulturmedium, welches 40 µM ABA und 5% PEG-4000 (Kontrolle) umfasst.
B) Wie A), allerdings umfasst das Kultivierungsmedium 40 µM ABA und 25 µM PCIB von Woche 2 bis Woche 4.
C) Wie B), wobei aber das Kultivierungsmedium 40 µM ABA und 5 µM IAA von Woche vier an umfasst.

Gemäß Protokoll C erzeugte Embryos waren länger als Embryos, die nach Protokoll B erzeugt wurden. Die insgesamte Qualität dieser Embryos war ebenso höher als die Qualität der Embryos nach Protokoll B.
Beispiel 7: Reifung von Abies nordmanniana Zelllinien, welche eine Verschiebung von Maltose nach Sucrose als Carbohydratquelle während dem letzten Zeitraum (die dritte Phase) des Reifungszeitraums umfasst.
Mit Ausnahme der Carbohydrate, setzte sich das Basisreifungsmedium wie für die in Beispiel 1 beschriebe Kontrolle zusammen. Allerdings wurde PCIB in einer zuvor bestimmten optimalen Konzentration und Zeitraum für jede der getesteten Zelllinien eingefügt. Vier Behandlungen mit verschiedenen Kombinationen von Carbohydraten wurden während einer Reifung getestet:

A) Reifung auf Kultivierungsmedium, welches 45 g/L Sucrose als Carbohydratquelle während des gesamten Reifungszeitraums umfasst.
B) Reifung auf Kultivierungsmedium, welches 45 g/L Maltose als Carbohydratquelle während des gesamten Reifungszeitraums umfasst. Ein gewöhnlicher Embryo von dieser Behandlung wird in der linken Abbildung von 9 offenbart.
C) Reifung auf Kultivierungsmedium mit 45 g/L Maltose während des ersten Teils des Reifungszeitraums, gefolgt von einer Verschiebung zu Reifungsmedium, welches 22,5 g/L Sucrose und 22,5 g/L Maltose während der letzten zwei Wochen während des Reifungszeitraums umfasst. Ein gewöhnlicher Embryo von dieser Behandlung wird in der rechten Abbildung von 9 offenbart.
D) Reifung auf Kultivierungsmedium mit 45 g/L Maltose während des ersten Teils des Reifungszeitraums, gefolgt von einer Verschiebung zu Reifungsmedium, welches 45 g/L Sucrose als Carbohydratquelle für die letzten zwei Wochen des Reifungszeitraums umfasst. Ein gewöhnlicher Embryo von der Behandlung wird in der mittleren Abbildung von 9 offenbart.

Ergebnisse
Keine gut entwickelten reifen Embryos wurden erzeugt, falls Sucrose als Carbohydratquelle während des gesamten Reifungszeitraums verwendet wurde (Behandlung A). Alle erzeugten reifen Embryos zeigten ausgeprägte Abnormalitäten. Eine hohe Anzahl von Embryos wurde erzeugt (wie in 1C und 2B), falls Maltose als die einzige Carbohydratquelle während des gesamten Reifungszeitraums verwendet wurde (Behandlung B). Die reifen Embryos wiesen eine gute Form auf, allerdings waren für die meisten Zelllinien die Embryos im Vergleich zu reifen zygotischen Embryos klein.
Falls die Zellen von Reifungsmedium mit Maltose in ein Sucrose umfassendes Reifungsmedium während den letzten zwei Wochen einer Reifung transferiert wurden (Behandlung C und D), wurde ein eindeutige Zunahme der Größe der reifen Embryos beobachtet (9). Eine Verschiebung zu einem Medium, welches 45 g/L Sucrose umfasst (Behandlung D), führte zu der Entwicklung von reifen Embryos mit einer Größe, die an die Größe von zygotischen Embryos von Abies nordmanniana gleicht. Das durchschnittliche Frischgewicht von reifen Embryos nach Behandlung B) betrug ungefähr 50 mg im Vergleich zu einem durchschnittlichen Frischgewicht von reifen Embryos nach Behandlung D) von ungefähr 120 mg pro Embryo. Ein zusätzlicher Effekt von Behandlung D) im Vergleich zu Behandlung B) bestand darin, dass der Reifungszeitraum auf ungefähr 4 Wochen verringert wurde.
Die beobachtete Wirkung einer Verschiebung von Maltose nach Sucrose während des letzten Teils des Reifungszeitraums war überraschend und unerwartet, da vorherige Untersuchungen eine eindeutig negative Wirkung von Sucrose während einer Reifung von somatischen Embryos von Abies nordmanniana (Plant Science, 124, 211–221, NØRGAARD) und für andere Koniferenspezies berichteten ( US 5187092 INSTITUTE OF PAPER SCIENCE AND TECHNOLOGY).
Es wird erwartet, dass Bestandteile der metabolisierbaren Kohlenstoffquellen und insbesondere Carbohydratquellen im Allgemeinen die unerwartete Reifungswirkung erzielen werden. Man könnte Bestandteile wie Lactose, Fructose, Glucose, Maltotriose, Stärke, Galactose oder Mischungen davon vorschlagen. Insbesondere Fructose und Glucose allein oder Mischungen davon zeigten ähnlich positive Wirkungen auf die reifen Embryos. Das Kultivierungsmedium wies einen Gehalt von zwischen 1 und 100 g/L Fructose oder Glucose auf.
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Claims

Verfahren zur Reifung von somatischen Koniferen-Embryos, welches einen Schritt umfasst, bei dem eine embryogene Zellmasse in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches ein Anti-Auxin enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiter einen zweiten Schritt vor dem Anti-Auxin Schritt aufweist, bei dem die embryogene Zellmasse in einem Kulturmedium gezüchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiter einen dritten Schritt nach dem Anti-Auxin Schritt umfasst, bei dem die embryogene Zellmasse mit einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches im Wesentlichen kein Anti-Auxin enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Anti-Auxin Schritt von 2 Tagen bis 50 Wochen dauert.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der zweite Schritt vor dem Anti-Auxin Schritt von 2 Tagen bis 10 Wochen dauert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der dritte Schritt nach dem Anti-Auxin Schritt von 2 Tagen bis 40 Wochen dauert.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Kulturmedium in mindestens einem der Schritte weiter ein Reifungsmittel aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Kulturmedium in allen Schritten weiter mindestens ein Reifungsmedium aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Reifungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Abscisinsäure, Silbernitrat, Jasmonsäure, Abscisylalkohol, Acetylenaldehyd, Dihydroacetylenalkohol, Phaseinsäure, Dihydrophaseinsäure, 6'-Hydroxymethylabscisinsäure, Beta-Hydroxyabscisinsäure, Beta-Methylglutarylabscisinsäure, Beta-Hydroxy-beta methylglutarylhydroxyabscisinsäure, 4'-Desoxyabscisinsäure, Abscisinsäure-beta-D-glucoseester, 2-2(2-p-Chlorophenyl-transethyl)cyclopropancarbonsäure.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Reifungsmittel Abscisinsäure in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 200 µM ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anti-Auxin ausgewählt ist aus der Gruppe von α-(1-Naphtylmethyl-sulfid)-isobuttersäure, α-(1-Naphtylmethyl-sulfid)-propionsäure, α-(2-Naphtylmethyl-sulfide)-isobuttersäure, α-(2-Naphtylmethylsulfide)-propionsäure, δ-(Naphtylmethyl-selenid)-η-valeriansäure, (-)-α(2,4,5Trichlorphenoxy)-propionsäure, (-)α(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure, (-)-α(2-Naphthoxy)-propionsäure, (+)-α-(1-Naphthoxy)-propionsäure, (3-Phenyl-1,2,4thiadiazol-5-yl)-thioessigsäure (PTAA), β-Naphtalenessigsäure (β-NAA), γ-Phenylbuttersäure, 1-(Naphthylmethyl-sulfid)-propionsäure, 1-Naphthylmethylselenidessigsäure, 2-(Naphthylmethyl-sulfid)-propionsäure, 2-(o-Chlorphenoxy)-2-methylpropionsäure, 2,3,4,5,6-Pentachlorphenoxyisobuttersäure, 2,3,5-Triiodbenzoessäure (TIBA), 2,3,5-Triiodbenzoesäure, 2,4,5-Trichlorphenoxyisobuttersäure, 2,4,6-Trichlorphenoxyessigsäure (2,4,6-T), 2,4,6-Trichlorphenoxyisobuttersäure, 2,4-Dichloroanisol (2,4-DCA), 2,4-Dichlorphenoxyisobuttersäure (2,4-DCIP), 2,4-Dichlorphenylsulfonessigsäure, 2,4-Dichlorphenylsulfoxidessigsäure, 2,6-Dichlorphenoxyessigäure, 2-Chlorphenoxyisobuttersäure, 2-Naphtylmethylselenidessigsäure, 3-Chlorphenoxyisobuttersäure, 3-Indolisobuttersäure, 3-Nitro-4-fluorbenzoesäure, 4-Chlorphenoxyisobuttersäure, 5-Methyltryptophan, 7-Aza-indol, 9-Hydroxyfluoren-9-carbonsäure (HFCA), Ferulasäure, Flavonoide, Indolisobuttersäure, Kämpferöl, Maleinsäurehydrazid, Naptalam (N-1-Naphtylphthalaminsäure), p-Chlorphenoxyisobuttersäure (PCIB), p-Coumarsäure, Phenoxyessigsäure, Phenoxyisobuttersäure, Phenylpropionsäure, Quercetin, Trans-Zimtsäure.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anti-Auxin PCIB in einer Konzentration von zwischen 0,01 und 200 μM ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anti-Auxin PCIB in einer Konzentration zwischen 1 und 50 μM ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konifere ein Mitglied der Kieferngewächse ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konifere ausgewählt ist aus der Gattung Pinus, Picea, Abies, Larix und Pseudotsuga.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konifere eine Abies sp, wie Abies nordmanniana ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konifere eine Picea sp, wie Picea Abies oder Picea Sitchensis ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konifere eine Abies sp und das Anti-Auxin PCIB in einer Konzentration zwischen 1 und 100 μM ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konifere eine Picea sp und das Anti-Auxin PCIB in einer Konzentration zwischen 0,1 und 50 μM ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das während mindestens einem Teil des dritten Schrittes nach dem Anti-Auxin Schritt verwendete Kulturmedium weiter ein Auxin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die embryogene Zellmasse weiter mit einem Kulturmedium gezüchtet wird, welche eine Kohlenhydratquelle enthält.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die embryogene Zellmasse weiter mit einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Saccharose, Fructose oder Glucose enthält.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Kulturmedium einen Gehalt an metabolisierbarer Kohlenstoffquelle von zwischen 1 und 100 g/l aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die weitere Züchtung für eine Zeitspanne von 2 Tagen bis 10 Wochen durchgeführt wird.