PL201417B1 - Sposób uzyskiwania dojrzewania somatycznych zarodków drzew iglastych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania dojrzewania somatycznych zarodków drzew iglastych w hodowli tkankowej komórek zarodkowych prowadzonej w po zywce hodowlanej zawieraj a- cej anty-auksyn e, w wyniku czego otrzymuje si e niespodziewane przesuni ecie fizjologiczne z prolife- racji komórek do ich dojrzewania. Proliferacja jest tak zredukowana, ze ustaje tworzenie nowych nie- dojrza lych zarodków. Obni zenie stopnia proliferacji u latwia przej scie z etapu proliferacji do dojrzewa- nia, a tak ze cz estosc dojrzewania ulega zwi ekszeniu do znacznie wy zszego poziomu ni z spodziewa- ny. Niespodziewanie stwierdzono, ze jako sc zarodków somatycznych nie ulega obni zeniu, podczas gdy znacznemu zmniejszeniu ulega aktywno sc endogennego regulatora wzrostu ro slin, auksyny. Fak- tycznie, ogólna jako sc dojrza lych zarodków zebranych pod koniec dojrzewania jest wi eksza ni z w przypadku zarodków uzyskiwanych zgodnie ze znanym stanem techniki. PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201417 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 356259 ⁽¹³⁾ (22) Data zgłoszenia: 20.09.2000 ^{(51) Int.Cl.}

A01H 4/00 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: A01H 7/00 (2006.01)

20.09.2000, PCT/DK00/00522 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

29.03.2001, WO01/20972 PCT Gazette nr 13/01 (54) Sposób uzyskiwania dojrzewania somatycznych zarodków drzew iglastych (30)

Pierwszeństwo:

21.09.1999,EP,99203104.7

28.10.1999,US,60/161,938 (73) Uprawniony z patentu:

WOODY PLANT BIOTECH APS,Lundby,DK (43) Zgłoszenie ogłoszono:

28.06.2004 BUP 13/04 (72) Twórca(y) wynalazku:

Jens Iver Find,Roskilde,DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2009 WUP 04/09 (74)

Pełnomocnik:

Sławomira Łazewska, Łazewska & Łazewski ⁽⁵⁷⁾ Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania dojrzewania somatycznych zarodków drzew iglastych w hodowli tkankowej komórek zarodkowych prowadzonej w pożywce hodowlanej zawierającej anty-auksynę, w wyniku czego otrzymuje się niespodziewane przesunięcie fizjologiczne z proliferacji komórek do ich dojrzewania. Proliferacja jest tak zredukowana, że ustaje tworzenie nowych niedojrzałych zarodków. Obniżenie stopnia proliferacji ułatwia przejście z etapu proliferacji do dojrzewania, a także częstość dojrzewania ulega zwiększeniu do znacznie wyższego poziomu niż spodziewany. Niespodziewanie stwierdzono, że jakość zarodków somatycznych nie ulega obniżeniu, podczas gdy znacznemu zmniejszeniu ulega aktywność endogennego regulatora wzrostu roślin, auksyny. Faktycznie, ogólna jakość dojrzałych zarodków zebranych pod koniec dojrzewania jest większa niż w przypadku zarodków uzyskiwanych zgodnie ze znanym stanem techniki.

PL 201 417 B1

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu rozmnażania roślin iglastych technikami hodowli tkankowej, bardziej szczegółowo sposobu uzyskiwania dojrzewania somatycznych zarodków drzew iglastych z zastosowaniem embriogenezy somatycznej.

Stan techniki

Długie cykle pokoleniowe u większości roślin iglastych powodują, że hodowla z zastosowaniem krzyżowania i selekcji przebiega bardzo powoli, a ze względu na fakt, że drzewa iglaste stale ulegają kojarzeniu niekrewniaczemu, potomstwo, nawet wysoce wyselekcjonowanych osobników, różni się ogromnie. Natomiast zastosowanie rozmnażania wegetatywnego konkretnej rośliny umożliwia zachowanie zmienności w obrębie populacji, zarówno addycyjnych jak i nieaddycyjnych, prowadząc do uzyskania korzystnych genetycznie roślin potomnych. Dla części ważnych pod względem ekonomicznym drzew iglastych, opracowano sposoby rozmnażania wegetatywnego, głównie poprzez ukorzenione sadzonki, lecz dla przeważającej większości gatunków roślin iglastych, rozmnażanie generatywne jest jedynym lub jedynym odpowiednim pod względem ekonomicznym sposobem rozmnażania.

Nawet w przypadku roślin, dla których opracowano sposoby rozmnażania przez ukorzenione sadzonki, rezultat jest nie satysfakcjonujący, gdyż ilość możliwych do uzyskania roślin potomnych zmniejsza się wraz z wiekiem drzewa rodzicielskiego oraz dlatego, że występuje tendencja roślin do wzrostu plagiotropowego w przypadku sadzonek nie pobranych z pędów wierzchołkowych. Z tych powodów na całym świecie obserwuje się olbrzymie zainteresowanie opracowaniem korzystnych pod względem ekonomicznym, powtarzalnych sposobów rozmnażania wegetatywnego drzew iglastych.

Powrót do zastosowania transformacji genetycznej jako narzędzia w hodowli drzew iglastych, prowadzi również do konieczności opracowania skutecznych i powtarzalnych sposobów uzyskiwania roślin potomnych z transformowanej tkanki. Konieczne jest opracowanie takiego sposobu uzyskiwania roślin, aby mógł on być stosowany w praktycznie wszystkich liniach komórkowych, zapewniając powtarzalność podczas etapu proliferacji po etapie transformacji i zapobiegając niezamierzonej selekcji na tym etapie.

Uzyskanie rośliny, w przypadku drzew iglastych, w wyniku embriogenezy somatycznej obejmuje pewną liczbę następujących po sobie etapów. Po pierwsze hodowlę zarodkową rozpoczyna się tworząc eksplantat, którym może być zarodek, dojrzały lub niedojrzały, siewka, lub obecnie również oczka z dojrzałych drzew (WO 99/23874 AFOCEL). Etap ten jest prowadzony na dowolnej, odpowiedniej roślinnej pożywce hodowlanej zawierającej różne regulatory wzrostu roślin, dobrane do hodowanego gatunku. Zazwyczaj, zarówno auksyna jak i cytokinina są obecne w pożywce, lecz publikowano również prace, w których opisywano zakładanie hodowli z wykorzystaniem jedynie cytokininy (Norgaard i Krogstrup 1995, str. 344, tabela 1) lub nawet bez ż adnego regulatora wzrostu roś lin (US 5,565,355 New Zealand Forest Research Institute, Norgaard i Krogstrup 1995, str. 345).

Dalsze namnażanie prowadzi się, pasażując utworzone hodowle na pożywkę o takim samym składzie, co pożywka indukcyjna, lub na pożywkę z regulatorami wzrostu roślin o niższych stężeniach. Na tym etapie, proliferujący kalus embriogenny (masa komórek embriogennych) składa się z bardziej lub mniej zróżnicowanych niedojrzałych zarodków somatycznych, które morfologicznie odpowiadają etapowi występującemu w rozwijających się nasionach, we wczesnej fazie rozwoju. W optymalnych warunkach, podczas rozmnażania wegetatywnego zarodki somatyczne nie przechodzą żadnego dalszego rozwoju, a zatem w tym etapie nie są tworzone dojrzałe zarodki.

W celu uzyskania dojrzewania zarodków, hodowle muszą być przeniesione do roślinnej pożywki hodowlanej, która zazwyczaj nie zawiera auksyny i cytokinin, natomiast obecny jest kwas abscyzynowy (ABA). W pewnych przypadkach, stosuje się krótki (1-2 tygodni) etap przejściowy, podczas którego kalus embriogenny hoduje się na roślinnej pożywce hodowlanej pozbawionej regulatora wzrostu roślin i czasami zawierają cej aktywowany wę giel drzewny. Uważa się , ż e etap ten uł atwia nastę pują ce po nim dojrzewanie, ze względu na niższą zawartość w pożywce hodowlanej lub brak auksyny i cytokinin, oraz możliwe ich usuwanie przez aktywowany węgiel drzewny. W literaturze opisano dwukrotne zwiększenie częstości dojrzewania dzięki zastosowaniu tego etapu (WO93/11660).

Wykazano, że na częstość dojrzewania zarodków i/lub na jakość utworzonych dojrzałych zarodków wiele czynników ma działanie zasadniczo stymulujące. Najważniejszym czynnikiem jest występujący naturalnie regulator wzrostu roślin - kwas abscyzynowy. Obecnie na związku tym lub jego

PL 201 417 B1 analogach, lub pochodnych oparte są prawie wszystkie protokoły dojrzewania zarodków somatycznych drzew iglastych.

Innym ważnym czynnikiem w procesie dojrzewania jest osmolowość roślinnej pożywki hodowlanej (WO 93/11660 University of Saskatchewan). Wykazano, że zwiększanie wartości tego czynnika przez dodatek nieprzepuszczalnej substancji osmotycznie czynnej takiej jak PEG-4000 (Polietylenoglikol 4000) wyjątkowo poprawia jakość dojrzałych zarodków. Uważa się, że ta poprawa jest spowodowana zwiększonym poziomem triacyloglicerydów w dojrzałych zarodkach. Triacyloglicerydy są gromadzone w komórkach podczas dojrzewania zarodka zygotycznego i są wykorzystywane jako źródło energii w etapie kiełkowania. PEG4000 lub podobne związki są rutynowo dodawane do pożywki do dojrzewania.

W przypadku przeważającej większości gatunków drzew iglastych, jako jedyne ź ródło węglowodanów w etapie dojrzewania jest stosowana sacharoza. Jednakże opisano w literaturze, uzyskanie najlepszych wyników zwłaszcza przy zastosowaniu maltozy, jak przedstawiono dla Pinus spp (US 5187092 Institute of Paper Science and Technology) i Abies nordmanniana (Plant Science tom 124: 211-221, Norgaard).

Przedstawiono również w literaturze, że wprowadzenie auksyny do pożywki, w której następuje dojrzewanie, może stymulować zarówno liczbę utworzonych dojrzałych zarodków somatycznych, jak i ich jakość. W opisie patentowym US 5187092, należącym do Institut of Paper Science and Technology ujawniono zastosowanie przy dojrzewaniu zarodków somatycznych Pinus taeda i Pseudotsuga menziesii, 0,5-2,0 μΜ IBA + 10-40 μΜ ABA, a w pracy Robertsa i in. (1990) opisano zastosowanie 0,1-10 μM IBA + 40 μM ABA przy dojrzewaniu Picea glaca x engelmanii. Zatem, wykazano dla różnych gatunków z trzech różnych rodzajów, że wprowadzenie auksyny podczas dojrzewania poprawia wydajność tego procesu.

Jak wskazano w zgłoszeniu patentowym WO 96/37096 (Carter Holt Harvey LTD.) procent uzyskanych linii komórkowych, które są w stanie tworzyć dojrzałe zarodki wynosi zazwyczaj 1-10%. W zgłoszeniu patentowym WO 96/37096 wymieniono procentowość do 25%, otrzymaną dla wybranych linii komórek zarodkowych. Jeśli te sposoby będą stosowane do rozmnażania kalusa embriogennego i zostaną zastosowane do hodowli sadzonek w leśnictwie lub ogrodnictwie, bardzo ważne jest, aby w etapie rozmnażania nie była konieczna zasadniczo żadna lub nieznaczna selekcja. Jeśli nie jest możliwe będzie rozmnażanie wegetatywne cennych klonów, można je utracić.

W przypadku Picea abies możliwe było sklasyfikowanie linii komórkowych w dwóch grupach, w zależności od morfologii i zdolność linii komórkowych do wytwarzania dojrzałych zarodków somatycznych. Linie komórkowe zdolne do produkowania dojrzałych zarodków somatycznych są określane jako linie komórkowe typu A i z łatwością produkują dojrzałe zarodki w wyniku zastosowania znanych sposobów dojrzewania z udziałem kwasu abscyzynowego. Natomiast, około 50% wszystkich linii komórkowych klasyfikuje się jako linie komórkowe typu B, które nie produkują z łatwością dojrzałych zarodków somatycznych (von Arnold i in. 1995).

Realizacja sposobów znanych w stanie techniki związana jest z kolejnym problemem, polegającym na braku odtwarzalności wyników.

W przypadku wielu gatunków, występuje problem namnażania komórek podczas fazy dojrzewania. Gdy podczas dojrzewania nadal zachodzi proliferacja, to proces dojrzewania ulega zahamowaniu i w wielu przypadkach dojrzewające zarodki ulegają przerośnięciu przez dzielącą się tkankę. W przypadku gatunków należących do Picea, Pinus i Larix, proliferacja nie zachodzi w takim samym zakresie jak w przypadku gatunków należących do Abies, ale nadal może ten problem występować. Dojrzewające zarodki są pierwotnie tworzone na brzegu kalusa embriogennego, to jest na skraju lub na górze kalusa embriogennego. Zarodki utworzone na skraju hodowli komórkowej pozostają w kontakcie z pożywką, w której następuje dojrzewanie i zwykle uzyskują satysfakcjonującą jakość pod względem morfologicznym i gromadzenia zapasowych substancji pokarmowych. Zarodki tworzące się na górze komórek dzielących się są jedynie w pośrednim kontakcie z pożywką, w której następuje dojrzewanie, co więcej wpływają na te zarodki również związki (np. regulatory wzrostu) wydzielane lub wydostające się z komórek dzielących się. Często konsekwencją tego zjawiska jest opóźnione dojrzewanie, nadmiernie uwodnienie, nieprawidłowa morfologia (np. zazwyczaj źle utworzone lub brak liścieni) i obniżona akumulacja zapasowych substancji pokarmowych.

Na koniec, wiadomo, że zdolność ustalonych hodowli zarodkowych do przejścia etapu dojrzewania zmniejsza się wraz z ich wiekiem. W przypadku niektórych gatunków, szczególnie należących do rodzaju Pinus zdolność zanika bardzo szybko, to jest w zakresie miesięcy. Hodowle w przypadku

PL 201 417 B1 innych gatunków pochodzących z np. Picea, Larix i Abies są bardziej stabilne w dłuższych czasach, ale w większości przypadków, pewne zmniejszenie zdolności obserwowano, bądź jako zmniejszenie częstości dojrzewania, bądź jako konieczność zastosowania dłuższego okresu dojrzewania lub wyższego stężenia czynników stymulujących dojrzewanie takich jak kwas abscyzynowy.

Przedmiot wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania dojrzewania somatycznych zarodków drzew iglastych, który charakteryzuje się etapem, w którym prowadzi się hodowlę tkankową komórek zarodkowych w pożywce hodowlanej zawierającej anty-auksynę. Zgodne z wynalazkiem, korzystnie etap z anty-auksyną prowadzi się od 2 dni do 50 tygodni.

Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje dodatkowy etap, przed etapem z anty-auksyną, w którym prowadzi się hodowlę tkankową komórek zarodkowych w pożywce hodowlanej. Etap ten korzystnie prowadzi się od dwóch dni do 10 tygodni.

W innym korzystnym rozwią zaniu, sposób według wynalazku obejmuje również trzeci etap po etapie z anty-auksyną, w którym prowadzi się hodowlę tkankową komórek zarodkowych w poż ywce hodowlanej zasadniczo wolnej od anty-auksyny. Etap ten korzystnie prowadzi się od dwóch dni do 40 tygodni.

Korzystnie w sposobie według wynalazku w co najmniej jednym z etapów, stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą dodatkowo czynnik stymulujący dojrzewanie. Korzystniej we wszystkich etapach stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą dodatkowo co najmniej jeden czynnik stymulujący dojrzewanie.

Korzystnie stosuje się czynnik stymulujący dojrzewanie wybrany z grupy zawierającej: kwas abscyzynowy, azotan srebra, kwas jasmonowy, alkohol abscyzynowy, aldehyd acetylenowy, alkohol dihydroacetylenowy, kwas fazeinowy, kwas dihydrofazeinowy, kwas 6'-hydroksymetylo abscyzynowy, kwas beta-hydroksy abscyzynowy, kwas beta-metylo glutarylo abscyzynowy, kwas beta-hydroksybeta-metylo glutarylohydroksy abscyzynowy, kwas 4'-dezoksy abscyzynowy, ester kwasu abscyzynowego beta-D-glukozy, kwas 2-2 (2-p-chlorofenylo-trans-etylo) cyklopropano karboksylowy. Korzystniej jako czynnik stymulujący dojrzewanie stosuje się kwas abscyzynowy o stężeniu od 0,1 do 200 μΜ.

W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku stosuje się antyauksynę wybraną z grupy obejmującej: kwas izomasłowy a-(1-naftylometylo-sulfido)-, kwas a-(1-naftylometylosulfido)-propionowy, kwas a-(2-naftylometylo-sulfido)-izomasłowy, kwas a-(2-naftylometylosulfido)-propionowy, kwas δ-(naftylometylo-seleno)-η-walerianowy, kwas (-)-a-(2,4,5-trichlorofenoksy)-propionowy, kwas (-)-a-(2,4-dichlorofenoksy)-propionowy, kwas (-)-a-(2-naftoksy)-propionowy, kwas (+)-a-(1-naftoksy)-propionowy, kwas (3-fenylo-1,2,4-tiadiazolo-5-ylo) tiooctowy (PTAA), kwas β-naftaleno octowy (β-NAA), kwas γ-fenylomasłowy, kwas 1-(naftylometylo-sulfido)-propionowy, kwas 1-naftylometylo-selenooctowy, kwas 2-(naftylometylo-sulfido)-propionowy, kwas 2-(o-chlorofenoksy)-2-metylopropionowy, kwas 2,3,4,5,6-pentachlorofenoksyizomasłowy, kwas 2,3,5-trijodobenzoesowy (TIBA), kwas 2,3,5-trijodobenzoesowy, kwas 2,4,5-trichlorofenoksyizomasłowy, kwas 2,4,6-trichlorofenoksyoctowy (2,4,6-T), kwas 2,4,6-trichlorofenoksyizomasłowy, 2,4-dichloroanizol (2,4-DCA), kwas 2,4-dichlorofenoksyizomasłowy (2,4-DClP), kwas 2,4-dichlorofenylsulfonooctowy, kwas 2,4-dichlorofenylosulfotleno-octowy, kwas 2,6-dichlorofenoksyactic, kwas 2-chlorofenoksyizomasłowy, kwas 2-naftylometyloseleno-octowy, kwas 3-chlorofenoksyizomasłowy, kwas 3-indoloizomasłowy, kwas 3-nitro-4-flourobenzoilowy, kwas 4-chlorofenoksyizomasłowy, 5-metylotryptofan, 7-azaindol, kwas 9-hydroksyfluoreno-9-karboksylowy (HFCA), kwas ferulowy, flawonoidy, kwas indoloizomasłowy, kempferol, hydrazyd kwasu maleinowego, naftalam (kwas N-1-naftyloftalowy), kwas p-chlorofenoksyizomasłowy (PC1B), kwas p-kumarynowy, kwas fenoksyoctowy, kwas fenoksyizomasłowy, kwas fenylopropionowy, kwercytynę, kwas transcynamonowy.

Korzystnie w sposobie według wynalazku jako antyauksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 0,01 do 200 μM, korzystniej o stężeniu od 1 do 50 μM.

W korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku uzyskuje się zarodki drzewa iglastego z Pinaceae. Korzystnie uzyskuje się zarodki drzewa iglastego z rodzaju Pinus, Picea, Abies, Larix, lub Pseudotsuga. W korzystnym rozwiązaniu uzyskuje się zarodki Abies sp., zwłaszcza Abies nordmanniana albo Picea sp., zwłaszcza Picea abies lub Picea sitchensis.

W korzystnym sposobie według wynalazku uzyskuje się zarodki Abies sp. i jako antyauksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 1 do 100 μM.

W innym korzystnym sposobie według wynalazku uzyskuje się zarodki Picea sp. i jako anty-auksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 0,1 i 50 μM.

PL 201 417 B1

W sposobie według wynalazku korzystnie podczas przynajmniej części trzeciego etapu, po etapie z anty-auksyną, stosuje się w pożywce hodowlanej dodatkowo auksynę.

W innym korzystnym sposobie według wynalazku hoduje się następnie komórki zarodkowe w pożywce hodowlanej zawierającej źródła węgla ulegające metabolizmowi, korzystnie hoduje się komórki zarodkowe w pożywce hodowlanej zawierającej sacharozę, fruktozę albo glukozę. Korzystnie stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą źródła węgla ulegające metabolizmowi w ilości od 1 do 100 g/l. Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem sposobu według wynalazku dalszą hodowlę prowadzi się w okresie od 2 dni do 10 tygodni.

Dzięki wprowadzeniu anty-auksyny do pożywki hodowlanej podczas przynajmniej części procesu dojrzewania, uzyskuje się kilka niespodziewanych i korzystnych efektów.

Osiąga się ograniczenie proliferacji. Oznacza to, że ustaje tworzenie nowych niedojrzałych zarodków. Zaprzestanie namnażania komórek samo w sobie ułatwia przejście z proliferacji do dojrzewania, lecz uzyskana częstość dojrzewania jest znacznie większa niż, zakres jakiego można się było spodziewać na skutek obniżenia namnażania. Obecność anty-auksyny prowadzi do niespodziewanego przesunięcia fizjologii z namnażania komórek do dojrzewania zarodków.

Prawie wszystkie przebadane linie komórek zarodkowych, bez względu na gatunek od jakiego pochodziły, odpowiadają na zastosowanie sposobu według wynalazku, produkcją dojrzałych zarodków somatycznych, przez co uzyskuje się znacznie wyższy procent dojrzewania zarodków niż uzyskiwany w doś wiadczeniach opisanych w stanie techniki.

Niespodziewanie stwierdzono, że jakościowo uzyskane zarodki somatyczne nie są gorsze, jednakże aktywność auksyny, ważnego endogennego regulatora wzrostu roślin jest mniejsza. Faktem jest, że ostateczna jakość dojrzałych zarodków zebranych pod koniec procesu dojrzewania jest faktycznie lepsza niż opisywana w stanie techniki.

Inne składniki pożywki hodowlanej, takie jak składniki pokarmowe, witaminy, środki osmotycznie czynne, azot dostępny dla roślin, czynnik żelujący, źródła węgla i regulator wzrostu roślin, nie są objęte poziomem wynalazczym wynalazku. Biegły w dziedzinie będzie potrafił dobrać odpowiednią mieszankę podłoża pokarmowego z ogromnej liczby możliwości. Stan techniki obejmuje wiele przykładów odpowiednich połączeń składników pokarmowych i mikroelementów (patrz np. George, 1993) jak i odpowiednie źródła węgla ulegające metabolizmowi, takie jak na przykład sacharoza, maltoza, laktoza, fruktoza, glukoza, maltotrioza, skrobia, galaktoza itp. Oprócz wymienionych składników podłoża osoba biegła w stanie techniki potrafi odpowiednio dobrać dodatek witamin i różnych źródeł azotu dostępnego dla roślin, takich jak aminokwasy lub mieszaniny kompleksów substancji takich jak hydrolizat kazeiny lub inne hydrolizaty, które mogą być dodawane do pożywki hodowlanej. Ponadto może być korzystne substancje osmotycznie czynne, takie jak zatrzymywane przez błony komórkowe substancje osmotycznie czynne, na przykład glikole polietylenowe, dekstrany, celulozy, pektyny, galaktany, fikole, glikole polipropylenowe, agary, gumy, oligosacharydy, białka, aminokwasy, poliaminokwasy, lipoproteiny, nukleotydy, oligonukleotydy, lipopolisacharydy, lub przepuszczalne substancje osmotycznie czynne takie jak na przykład glikole polietylenowe, alkohole cukrowe, sorbitol, manitol i węglowodany. Pożywka hodowlana stosowana w różnych etapach dojrzewania może być podłożem płynnym, w którym komórki są hodowane lub komórki są hodowane w kontakcie z pożywką; albo może być podłożem stałym. W innym rozwiązaniu pożywka może być w postaci żelu lub zawierać jeden lub więcej znany czynnik żelujący taki jak na przykład żelrit, fitażel, agar, agaroza, skrobia lub tym podobne. Bez względu na zastosowaną pożywkę hodowlaną, komórki mogą być hodowane na filtrze lub podobnym nośniku, co ułatwia znacząco pasażowanie.

Na koniec, pożywka hodowlana stosowana podczas dojrzewania może zawierać dodatek regulatora wzrostu roślin takiego jak cytokininy, gibereliny, lub nawet auksyny.

W przypadku, w którym jeden z etapów wedł ug wynalazku jest stosunkowo krótki, np. krótszy niż 3 tygodnie, pożywka hodowlana może być bardzo podstawowa bez jednego lub wszystkich grup składników tradycyjnej pożywki. Jako pożywka hodowlana może również po prostu być stosowana woda lub woda żelowana, gdyż tkanka kalusa embriogennego może z łatwością przeżyć pewien okres bez składników pokarmowych i/lub węgla dostępnego metabolicznie.

Długość etapu zawierającego anty-auksynę zależy od gatunków i specyficznej linii komórkowej będącej w obszarze zainteresowań. Doświadczenia wykazały, że podczas gdy niektóre linie komórkowe powinny być hodowane w pożywce z anty-auksyną podczas całego okresu dojrzewania, inne linie komórkowe wymagają jedynie 2-4 tygodni lub nawet mniej, aby uzyskać działanie określone powyżej. Podobnie, wiek linii komórkowych ma wyraźny wpływ na całkowitą długość okresu dojrzewania,

PL 201 417 B1 młodsze linie komórkowe, na przykład młodsze niż jednoroczne zasadniczo dojrzewają znacznie szybciej niż starsze linie komórkowe, na przykład starsze niż pięcioletnie. Zatem, młodsze linie komórkowe mogą zwykle wymagać krótszego czasu działania anty-auksyny. Objawy zbyt długiego wystawienia na działanie anty-auksyny obejmują nieprawidłowy wygląd źle uformowanych zarodków, o nieregularnych lub całkowitym braku liś cieni. W takim przypadku należy skróć okres działania anty-auksyny.

Dla większości gatunków i linii komórkowych, wystawienie na działanie anty-auksyny od samego początku etapu dojrzewania powodowało zmniejszenie żywotności komórek kalusa embriogennego hodowanych na pożywce hodowlanej. Jest to częściowo spowodowane faktem, że komórki świeżo wysiane na szalki ulegają stresowi i konieczne jest uzyskanie stabilnej hodowli w pożywce hodowlanej, przed poddaniem działaniu anty-auksyny. Wskazane jest zatem zastosowanie dodatkowego etapu przed etapem z anty-auksyną.

Często wskazane jest wprowadzenie trzeciego etapu po etapie z anty-auksyną, w którym prowadzi się hodowlę tkanki komórek zarodkowych w pożywce hodowlanej zasadniczo bez anty-auksyny. Jak opisano powyżej, zbyt długie wystawienie na działanie anty-auksyny może mieć niepożądane efekty uboczne. W przypadku wystąpienia takich efektów hodowlę z dojrzewającymi zarodkami należy przenieść na pożywkę hodowlaną bez anty-auksyny, lecz zawierającą wszystkie inne konieczne do dalszego dojrzewania składniki.

Niespodziewanie, zmiana dodawanego do pożywki hodowlanej źródła węgla dostępnego dla metabolizmu rośliny, na przykład zastąpienie maltozy sacharozą w trzecim etapie bez anty-auksyny prowadziło do uzyskania korzystnego wpływu w etapie dojrzewania na wielkość dojrzałych zarodków, wygląd zarodków i skrócenie okresu dojrzewania.

W rozwiązaniu według wynalazku, pożywka hodowlana w co najmniej jednym z etapów również zawiera czynnik stymulujący dojrzewanie. Podczas gdy dojrzewanie zarodków jest możliwe bez zastosowania jakiegokolwiek czynnika stymulującego dojrzewanie, stwierdzono, że dodatek takiego czynnika do pożywki hodowlanej znacząco zwiększa częstość dojrzewania i jakość zarodków. W zależności od długości różnych faz, czynnik stymulujący dojrzewanie może być obecny podczas jednego, dwóch lub wszystkich trzech etapów. Wykazano, że jako czynnik stymulujący dojrzewanie, kwas abscyzynowy zwiększa dojrzewanie wyjątkowo skutecznie.

Rozwiązania według wynalazku obejmują wszystkie sposoby obniżenia wpływu auksyny podczas okresu dojrzewania. Można to uzyskać przez dodanie związków działających tak jak anty-auksyna, takich jak związki powodujące rozkład auksyny, związki hamujące wpływ auksyny, związki powodujące dezaktywację auksyny, związki hamujące syntezę auksyny, lub związki hamujące transport auksyny. Innym sposobem hamowania lub obniżania wpływu auksyny jest usunięcie pierwiastków lub związków, które są konieczne do syntezy auksyny takich jak na przykład bor lub cynk lub usunięcie związków biorących udział w biosyntezie prowadzącej do uzyskania auksyny, takich jak np. tryptofan.

Anty-auksyny według wynalazku obejmują wymienione powyżej związki oraz ich analogi i pochodne. Uzyskane dane doświadczalne wskazują, że jeśli drzewo iglaste należy do Abies sp i jest Abies nordmanniana to jako anty-auksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 1 do 100 μΜ. Uzyskany zakres stężeń jest konieczny, aby uzyskać odpowiednie działanie według wynalazku, zbyt niskie stężenia nie prowadzą do pożądanych wyników. W doświadczeniach wykazano również, że jeśli drzewo iglaste należy do Picea sp to jako anty-auksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 0,1 i 50 μΜ. Stężenie anty-auksyny powinno być stosunkowo niskie aby uzyskać wyniki według wynalazku. Zastosowanie zbyt wysokich stężeń w przypadku Picea sp. prowadzi do skutków bardziej lub mniej letalnych. Jedną z ważniejszych zalet sposobu według wynalazku jest to, że linie komórkowe, które normalnie nie przechodzą dojrzewania (takie jak Picea abies, tak zwane linie komórkowe typu B) będą faktycznie produkowały znaczące ilości zarodków w wyniku sposobu według niniejszego wynalazku.

W innym rozwiązaniu według wynalazku pożywka hodowlana stosowana podczas przynajmniej części trzeciego etapu po etapie z anty-auksyną zawiera również auksynę. Obserwowano w pewnych przypadkach, że wydłużanie się komórek zarodków dojrzewających może być częściowo zahamowane nawet po usunięciu z pożywki zawierającej anty-auksynę. W wyniku dodania auksyny do pożywki podczas etapu trzeciego w etapie dojrzewania, problem ten może być przezwyciężony i wydłużanie może zachodzić zgodnie z wymaganiami.

Stężenie auksyny w pożywce hodowlanej wynosi korzystnie od 0,001 do 100 μΜ. Auksyna korzystnie jest wybrana z grupy zawierającej kwas indolooctowy, kwas indolomasłowy, kwas naftalenooctowy, kwas 2,4-D,2-naftylooksyoctowy (NOA), kwas 4-chlorofeboksyoctowy (4-CPA), kwas 2-mePL 201 417 B1 tylo-4-chlorofenoksyoctowy (MCPA), kwas 2,4,5-trichlorofenoksyoctowy (2,4,5-T), kwas 3,6-dichloroanyżowy (dikamba), kwas 4-amino-3,5,5-trichloropikolinowy (pikloram), otonil, 2-chloro-3 (2,3dichloro-fenylo)-propionitryl (CDPPN).

Dokładny czas wystawienia na działanie auksyny podczas trzeciego etapu powinna być wyznaczona doświadczalnie i może zawierać się między 2 dniami a 40 tygodniami.

W wyniku zastosowania sposobu wedł ug wynalazku uzyskuje się dojrzał y somatyczny zarodek drzew iglastych. W wielu przypadkach, zgodnie ze stanem techniki, otrzymywanie takich zarodków w duż ych iloś ciach nie był o mo ż liwe. Co więcej, bardzo czę sto nie był o mo ż liwe otrzymywanie zarodków w sposób przewidywalny i powtarzalny.

Korzystnie zarodek uzyskany sposobem według wynalazku ma zawartość wody mniejszą niż 70% wyrażoną jako masę netto. Zgodnie ze stanem techniki uzyskanie dojrzałych somatycznych zarodków mających zawartość wody poniżej 70% było bardzo trudne, a czasem niemożliwe, szczególnie w przypadkach, w których stopień proliferacji podczas etapu dojrzewania był bardzo wysoki. Ze względu na fakt, że dzięki zastosowaniu sposobu według wynalazku, proliferacja jest pod kontrolą, uzyskuje się również wydłużenie okresu dojrzewania, co umożliwia zarodkom zgromadzenie większej ilości substancji zapasowych, takich jak triacyloglycerydy i białka zapasowe. Odpowiednie gromadzenie materiałów zapasowych ma olbrzymi wpływ na proces kiełkowania.

Zarodek uzyskany sposobem według wynalazku może być zarodkiem transgenicznym i a zatem może zawierać rekombinowane sekwencje DNA. Transformację prowadzi się w etapie przed etapem dojrzewania. Obecnie, jedynym sposobem produkcji transgenicznych zarodków drzew iglastych jest transformacja komórek różnymi znanymi sposobami, a następnie regeneracja roślin metodą somatycznej embriogenezy. Często otrzymanie dojrzałych zarodków somatycznych z transformowych komórek kalusa embriogennego nie było możliwe. Procedura transformacji, a następnie selekcji prowadzi do poddania komórek kalusa embriogennego stresowi, jak również zabiera bardzo dużo czasu. Dlatego zwykle podczas tego etapu linie komórkowe tracą swoją zdolność do produkowania zarodków somatycznych. Jest to szczególnie ważny problem w przypadku Pinus spp, gdy zdolność do produkcji dojrzałych zarodków somatycznych obniża się gwałtownie wraz z wiekiem.

Z zarodka otrzymanego zgodnie ze sposobem według wynalazku uzyskuje się dojrzałą roślinę iglastą. W przypadku wielu gatunków iglastych i wielu linii komórkowych na podstawie sposobów stosowanych w stanie techniki, nie było możliwe uzyskanie dorosłych roślin. Podczas gdy stosując sposób według obecnego wynalazku procent gatunków i linii komórkowych, z których mogą być otrzymane dojrzałe zarodki zwiększyła się znacząco. Ze względu na fakt, że zarodki według obecnego wynalazku są również wyższej jakości, kiełkowanie zarodków, ich hartowanie i stały wzrost kiełkujących roślin również się poprawił. Uzyskane z transgenicznego zarodka, rośliny również są transgeniczne i zawierają zrekombinowane sekwencje DNA.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek opisano bardziej szczegółowo na postawie przykładów i załączonego do przykładów rysunku, na którym:

Fig 1 przedstawia fotografie szybko rosnącej linii komórkowej Abies nordmanniana w etapie dojrzewania według wynalazku i według wcześniejszych sposobów.

Fig 2 przedstawia fotografie wolno rosnącej linii komórkowej Abies nordmanniana w etapie dojrzewania według wynalazku i według wcześniejszych sposobów.

Fig 3 graficzne przedstawia korzystne realizacje wynalazku etapu z anty-auksyną w sposobie według wynalazku.

Fig. 4 przedstawia zarodek uzyskany w korzystnych i niekorzystnych realizacjach wynalazku.

Fig. 5 przedstawia fotografie linii komórkowej Abies nordmanniana, w etapie dojrzewania według różnych realizacji wynalazku.

Fig. 6 przedstawia fotografie linii komórkowej Abies nordmanniana, w etapie dojrzewania według różnych realizacji wynalazku.

Fig. 7 graficznie przedstawia poziom endogennego kwasu indolooctowego (IAA) w trzech liniach komórkowych Abies nordmanniana.

Fig. 8 przedstawia fotografie kiełkowania i hartowania zarodków według wynalazku.

Fig. 9 przedstawia fotografie trzech dojrzałych zarodków somatycznych Abies nordmanniana;

lewy obrazek przedstawia typowy zarodek traktowany według B), środkowy obrazek przedstawia typowy zarodek traktowany według D), a prawy obrazek przedstawia typowy zarodek traktowany według C).

PL 201 417 B1

Rozwiązania według wynalazku badano w wielu różnych sytuacjach, dla różnych drzew iglastych i w różnych liniach komórkowych o zróżnicowanej charakterystyce, takich jak ostatnio utworzonych liniach komórkowych i starszych liniach komórkowych, powoli rosnących liniach komórkowych, szybko namnażających się liniach komórkowych, transgenicznych liniach komórkowych, liniach komórkowych, które produkują dojrzałe zarodki według znanych sposobów (takich jak linie komórkowe typu A), i liniach komórkowych które nie produkują dojrzałych zarodków według znanych sposobów (takich jak linie komórkowe typu B).

P r z y k ł a d I. Dojrzewanie w założonych liniach komórkowych Abies nordmanniana.

Materiały i metody:

Materiał roślinny

W obecnym badaniu stosowano trzy różne linie komórkowe z Abies nordmanniana. Badane linie komórkowe były hodowane stale przez kilka lat. Linia komórkowa G.3.8 została zainicjowana z niedojrzałego zarodka zygotycznego w 1989 w pożywce MS o połowiczym stężeniu (Murashige i Skoog, 1962) jak opisano wcześniej (Norgaard i Krogstrup, 1991). Linia komórkowa G.35.8 została zainicjowana z dojrzałego zarodka zygotycznego w pożywce SH w 1991 (Norgaard i Krogstrup, 1995), a linia komórkowa G.78.14 została zainicjowana w 1993 z niedojrzałego zarodka zygotycznego w zmodyfikowanej pożywce BLG o połowicznym stężeniu (Verhagen i Wann, 1989). Od roku 1996, wszystkie hodowle utrzymywano przez dwukrotne w ciągu tygodnia pasażowanie hodowli do świeżej zmodyfikowanej pożywki BLG o połowicznym stężeniu i wzroście w temp. 24 +/-1°C, w ciemności. Linie komórkowe G.3.8 i G.78.14 namnażały się szybko w pożywce zachowawczej, przy czasie podwajania masy krótszym niż 2 tygodnie. Linia komórkowa G.35.8 namnażała się stosunkowo powoli, przy czasie podwajania masy dłuższym niż 2 tygodnie.

Pożywki hodowlane stosowane do inicjacji i hodowli

Pożywka MS o połowicznym stężeniu (Murashige i Skoog, 1962) zawierała pożywkę MS o połowicznym stężeniu składników makro, mikro i FeEDTA. Witaminy w pożywce MS zmodyfikowano dodając 10 x tiaminę-HCl, 100 mg/l inozytol, 500 mg/l L-glutaminy i hydrolizatu kazeiny. Pożywkę SH (Schenck i Hildebrandt, 1972) zmodyfikowano przez wprowadzenie 500 mg/l L-glutaminy i hydrolizatu kazeiny. Pożywka BLG o połowicznym stężeniu (Verhagen i Wann, 1989) jest zmodyfikowaną pożywką MS o połowicznym stężeniu, bez NH4NO3 i o obniżonym stężeniu KNO3 do 50 mg/l. Dodano KCl do stężenia 372,5 mg/l, L-glutaminę do 750 mg/l i L-asparginę do 50 mg/l. Witaminy zmodyfikowano przez zastosowanie 10 x tiaminę-HCI, 100 mg/l inozytol. We wszystkich pożywkach stosowano 1,8 g/l fitażel (guma Gellana) jako czynnik żelujący i przed autoklawowaniem doprowadzono pH do wartości 5,7. Do etapu proliferacji, stosowano sacharozę w stężeniu 1% i BAP w stężeniu 5 μM. Nie stosowano auksyny w pożywce hodowlanej. Aminokwasy przygotowano w postaci roztworu wyjściowego sterylizowanego przez filtrowanie i dodano po autoklawowaniu i schłodzeniu pożywki do 50°C.

Dojrzewanie

Standardowa pożywka, w której prowadzi się dojrzewanie (kontrola) stanowi opisana powyżej zmodyfikowana pożywka BLG o połowicznym stężeniu. Pożywka nie zawiera sacharozy i BAP, lecz dodano 45 g/l maltozy (Merck 5911), 50 g/l PEG-4000 (Fluka) i 40 μM ABA (Sigma A1049). Wybór tych trzech składników pożywki hodowlanej zależy przede wszystkim od gatunku drzewa iglastego będącego przedmiotem hodowli. W przypadku Abies nordmanniana wiadomo, że najlepsze dojrzewanie uzyskuje się przez zastosowanie jako źródło węglowodanów maltozy, zamiast sacharozy. Podobnie wiadomo, że dodatek PEG-4000 poprawia dojrzewanie. Jednakże można uzyskać równie dobre wyniki w pożywkach o innych proporcjach tych składników, jak również w wyniku stosowania innych składników o równoważnym działaniu.

Podobnie wybrano pożywkę BLG o połowicznym stężeniu, ponieważ stwierdzono, że jest odpowiednia dla wielu drzew iglastych takich jak Abies spp, Picea spp i Pinus spp. Może być stosowana równoważna pożywka podstawowa, która również zapewni uzyskanie wyników, równoważnych wynikom otrzymanym w pożywce BLG, przy czym ważne jest, aby pożywka podstawowa była zrównoważona, odpowiednio do wymagań żądanych gatunków drzew iglastych.

W tym doświadczeniu, standardową pożywkę w której następuje dojrzewanie zmodyfikowano nie dodając PEG i wprowadzając jedną z następujących 3 substancji chemicznych, które jak się uważa, zazwyczaj wpływają na endogenne stężenie występującej w naturze auksyny IAA lub wpływają na normalne działanie auksyny w komórkach roślin: 1) PCIB (antagonista auksyny) o stężeniu 25 lub 117 μM, 2) TIBA (inhibitor transportu auksyny) o stężeniu 5 lub 50 μM, 3) floroglucynol: (inhibitor degradacji auksyny) (patrz George 1993, str. 429 od dołu do 430) o stężeniu 30 mM. Oprócz tych modyfikacji

PL 201 417 B1 standardowa pożywka w której następuje dojrzewanie została zmodyfikowana następująco: 4) obniżono stężenie boru (prekursor syntezy kwasu indolo octowego) do stęż. 10 μΜ, to jest 20% normalnego stężenia i na koniec 5) wprowadzono 25 μM PCIB w pożywce bez ABA.

Dojrzewanie hodowli prowadzono w ciemności przy temp. 24°C +/-1°C.

Anty-auksyny i środki do obniżenia działania endogennej auksyny zostały tak dobrane, aby reprezentować różne grupy działania lub różne stosowane związki. Zatem doświadczenie przedstawia wpływ bardzo różnych sposobów obniżenia stężenia auksyny lub obniżenia stężenia auksyny, jak i odpowiednie doświadczenia kontrolne oraz taką procedurę, która zgodnie z przewidywaniami spowoduje wzrost endogennego stężenia auksyny.

Szczepienie na szalkach

Dwa tygodnie po ostatnim pasażowaniu, 4 gramy komórek zarodkowych przeniesiono do 250 ml kolby (o niebieskich korkach) razem z mieszadłem magnetycznym. Dodano 100 ml płynnej pożywki do proliferacji i zawiesinę mieszano na mieszadle magnetycznym przez 5 minut z dużą szybkością, aby uzyskać homogenną zawiesinę komórek i grup komórek. Hodowlę następnie wstępnie hodowano na wytrząsarce (120 rpm) przez jeden tydzień przy 24 +/-1°C w ciemności. Po wstępnej hodowli, hodowlę mieszano ponownie mieszadłem magnetycznym z dużą szybkością przez 5 minut. Hodowlę przeniesiono do 100 ml cylindra miarowego i pozostawiono do powstania osadu przez 30 min. Supernatant usunięto i z pozostałej hodowli próbki o obj. 1 ml przeniesiono za pomocą odcinanej końcówki pipety na bibułę filtracyjną (Whatmann # 2) umieszczoną na 25 ml pożywki, gdzie następuje dojrzewanie w 10 cm szalkach Petriego (Nunc, Denmark). Filtry zawierające dogrzewające hodowle somatyczne przenoszono do świeżej pożywki co 2 tygodnie.

Hodowle umieszcza się w szalkach na pożywce w której następuje dojrzewanie, aby uzyskać jednorodne rozmieszczenie wysianych komórek na stałym podłożu (w tym przypadku na bibule filtracyjnej), co zapewni większą powtarzalność i zmniejszy zróżnicowanie w populacji. Dojrzewanie może również po prostu być zainicjowane przez przeniesienie grudek komórek kalusa embriogennego do pożywki, w której następuje dojrzewanie.

Kiełkowanie

Dobrze rozwinięte dojrzałe zarodki zebrano, aby poddać je działaniu zimna po około 20 tygodniach dojrzewania. Wyodrębnione dojrzałe zarodki przeniesiono na nylonowy filtr, który umieszczono na podkładce z pianki gumowej w wysokich szalkach Petriego. Zmoczona bibuła filtracyjna została umieszczona na dnie i na wieczku szalki Petriego. Szalkę Petriego zamknięto i uszczelniono dwoma okrążeniami taśmy polietylenowej, i owinięto folią aluminiową, a następnie umieszczono w temp. 5°C w ciemności przez 4 tygodnie i poddano działaniu niskich temperatur. Po poddaniu niskim temperaturom filtr nylonowy z dojrzałymi zarodkami przeniesiono do pożywki BGM-2 (Krogstrup i in., 1988). Pożywkę BGM-2 zawierającą 20 g/l sacharozy, 10 g/l aktywowanego węgla drzewnego (Merck 5411) poddano żelowaniu 3,5 g/l fitażelem (guma Gellana). Szalki Petriego umieszczono w pokoju hodowlanym w temp. 20°C przy 16 godzinnym fotoperiodzie. Po poddaniu kiełkowaniu przez jeden tydzień, sieć nylonową usunięto i zarodki umieszczano w bezpośrednim kontakcie z pożywką. Po dwóch tygodniach kiełkowania, zarodki z korzonkiem umieszczano pionowo z korzonkiem zanurzonym w pożywce. Później, kiełkujące zarodki przeniesiono do gleby i umieszczono w szklarni, w kontrolowanych warunkach.

Opisany sposób kiełkowania jest tylko jednym z wielu różnych sposobów, które mogą być stosowane do kiełkowania somatycznych zarodków drzew iglastych. Zatem, korzystne może być również wprowadzenie etapu suszenia pomiędzy dojrzewaniem zarodków a kiełkowaniem. Podczas tego etapu zarodek może być poddawany kontrolowanemu wysuszeniu w celu stymulowania dojrzewania, odpowiednio suszenie ma miejsce podczas ostatniej fazy dojrzewania nasion.

Zawartość wody

Zawartość wody w dojrzałych zarodkach somatycznych i zarodkach z nasion mierzono ważąc około 25 zarodków (świeża masa, FW), susząc zarodki w temp. 60°C przez dwa dni i ważąc zarodki ponownie (sucha masa, DW). Zawartość wody obliczano na podstawie świeżej masy:

(FW-DW)/FW.

Wyniki:

Figury 1 i 2 przedstawiają porównanie dojrzewania dwóch linii komórek zarodkowych z Abies nordmanniana. Linia komórkowa G.3.8 (fig. 1) jest jedną z hodowli, w której komórki na pożywce do proliferacji namnażają się szybko. Zgodnie ze stanem techniki, we wcześniejszych sposobach nie uzyskano z tej linii żadnych lub bardzo niewiele zarodków somatycznych. Linia komórkowa G.35.8 (fig. 2)

PL 201 417 B1 jest jedną z hodowli, której komórki na pożywce do proliferacji namnażają się stosunkowo powoli. Zgodnie ze stanem techniki, wytwarza ona kilka dojrzałych zarodków somatycznych. Zbadano cztery różne protokoły dojrzewania: A) Dojrzewanie prowadzono 20 tygodni w pożywce, w której następuje dojrzewanie, obejmującej 40 μΜ ABA i 5% PEG-4000 (kontrola). B) Dojrzewanie jak w A), lecz od tygodnia 4 do 8 hodowle prowadzono na pożywce do dojrzewania obejmującej 40 μM ABA i 25 μM PCIB. C) Dojrzewanie prowadzono 20 tygodni w pożywce, w której następuje dojrzewanie, obejmującej 40 μM ABA i 25 μM PCIB. D) Dojrzewanie prowadzono 20 tygodni na pożywce bez ABA lecz zawierającej 25 μM PCIB.

Fig. 3 przedstawia liczbę dobrze rozwiniętych dojrzałych zarodków somatycznych na jedną szalkę Petriego w liniach komórkowych G.3.8 i G.35.8 po 20 tygodniach dojrzewania według czterech różnych protokołów dojrzewania opisanych powyżej.

W przypadku badanych linii komórek zarodkowych Abies nordmanniana, w kontrolnej pożywce z ABA i PEG uzyskano jedynie kilka dojrzałych zarodków (fig. 1A, 2A i 3). W większości przypadków, w opisanych hodowlach nastąpiło zainicjowanie dojrzewania zarodków, lecz ze względu na namnażanie się komórek tkanki otaczającej, rozwijające się zarodki uległy przerośnięciu i nie rozwijały się dalej. Na pożywce zawierającej zarówno ABA jak i 25 μM PCIB, stopień proliferacji był zredukowany i podczas dojrzewania utworzyło się wiele zarodków (fig. 1 B, 2B i 3). Jednakże, liczba dobrze rozwiniętych dojrzałych zarodków zależała zarówno od stężenia jak i od czasu dostarczania PCIB (fig 3). Niektóre badane linie komórkowe w pożywce hodowlanej namnażały się bardzo szybko podczas gdy inne linie komórkowe namnażały się jedynie powoli. Te charakterystyki stwierdzono również gdy linie komórkowe hodowano w pożywce, w której następuje dojrzewanie, a szybkość proliferacji podczas dojrzewania była znacząco zależna od linii komórkowej. Stwierdzono, że optymalne podawanie PCIB podczas dojrzewania zależy częściowo od szybkości proliferacji danej linii komórkowej i dlatego ogólny protokół podawania PCIB dla wszystkich badanych linii komórkowych nie mógł być opracowany. Jako przykład, wyniki przedstawiono dla 'szybko' i 'wolno' proliferujących linii komórkowych.

Komórki linii komórkowej G.3.8 namnażały się szybko w pożywce zachowawczej i w pożywce w której następuje dojrzewanie, obejmującej ABA i PEG, i podczas dojrzewania w pożywce bez PCIB nie utworzyły się dobrze uformowane zarodki (fig. 1A i 3). Jeśli pożywka zawierała 25 μM PCIB od 4 do 8 tygodnia z 20 tygodniowego okresu dojrzewania, utworzyło się około 40 dobrze uformowanych zarodków i proliferacja uległa nieznacznemu zmniejszeniu (fig. 1B i 3). Jednakże, w wyniku wprowadzenia 25 μM PCIB podczas całego okresu dojrzewania uzyskano około 125 dobrze uformowanych zarodków/szalkę Petriego, a proliferacja uległa znacznemu zmniejszeniu (fig. 1 C i fig. 3).

Komórki linii komórkowej G.35.8 namnażały się powoli w pożywce zachowawczej jak również podczas dojrzewania w pożywce obejmującej ABA i PEG. Na pożywce kontrolnej rozwinęło się jedynie kilka dojrzałych zarodków (fig. 2A i 3), a wprowadzenie PCIB do pożywki, w której następuje dojrzewanie miało zdecydowanie korzystny wpływ na liczbę dobrze uformowanych zarodków w tej linii komórkowej. Jednakże, najlepsze wyniki stwierdzono, gdy pożywka w której następuje dojrzewanie zawierała PCIB, jedynie od 4 do 8 tygodnia w ciągu 20 tygodniowego okresu dojrzewania, uzyskując około 250 zarodków/szalkę Petriego (fig. 2B i 3). Przeciwnie niż w przypadku linii komórkowej G.3.8, wprowadzenie PCIB podczas całego okresu dojrzewania miało negatywny wpływ na liczbę dobrze uformowanych dojrzałych zarodków linii komórkowej G.35.8 (fig. 2C i 3) i uzyskano jedynie około 15 dobrze uformowanych zarodków/ szalkę Petriego.

Jeśli zastosowano pożywkę w której następuje dojrzewanie bez ABA, ale zawierającą 25 μM PCIB, w hodowlach uzyskano zainicjowanie dojrzewania stosunkowo dużej liczby zarodków, jednak we wszystkich badanych liniach komórkowych, na tej pożywce, rozwinęło się jedynie kilka, i to wyraźnie o nieprawidłowej budowie, przedwcześnie rozwiniętych kiełkujących zarodków (fig. 1D i 2D). Ponieważ nie zachodzi praktycznie żadne dojrzewanie w pożywce bez anty-auksyny i ABA, to anty-auksyny odgrywają ważną rolę w dojrzewaniu zarodków. Podobnie jak w innych przypadkach wprowadzenia PCIB, proliferacja została zmniejszona.

Figura 4 przedstawia morfologię dojrzałych zarodków somatycznych Abies nordmanniana i typowe nieprawidłowości powodowane przez nadmierne wystawienie na działanie PCIB podczas dojrzewania. A: dobrze rozwinięty zarodek o prostej osi od korzenia do końca pędu i około 5 liścieniach otaczających merystem wierzchołkowy. B: zarodek o jedynie dwóch liścieniach. Zarodek jest względnie symetryczny w osi pionowej, a merystem wierzchołkowy jest typowy, nieuszkodzony. C: zarodek o dwóch liścieniach. Zarodek jest wyraźnie asymetryczny, o dużym i małym liścieniu. Merystem wierzPL 201 417 B1 chołkowy jest nieprawidłowy; D: zarodek o tylko jednym liścieniu. Zarodek nie ma funkcjonującego merystemu wierzchołkowego.

Dobrze rozwinięty dojrzały somatyczny zarodek Abies nordmanniana, o prostej osi od korzenia do końca pędu i mający około 5 liścieni (fig. 4A). Jeśli linie komórkowe hodowane są w pożywce, w której nastę puje dojrzewanie obejmują cej PCIB stężenia optymalne in supra lub w niektórych liniach komórkowych przy zbyt długich okresach, rozwija się dużo anormalnych dojrzałych zarodków. Bardzo charakterystyczną nieprawidłowością było zmniejszenie liczby liścieni (fig. 4B-D). Jeśli powoli proliferujące linie komórkowe hodowano w pożywce zawierającej ABA i 25 μΜ PCIB przez dłuższy okres niż 4 tygodnie, rozwijały się zarodki o jedynie dwóch symetrycznych liścieniach (fig. 4B). Jeśli w badanych liniach komórkowych stosowano wyższe stężenia niż 25 μM PCIB, zarodki rozwijały się niesymetrycznie z jednym mniejszym i jednym większym liścieniem (fig. 4C) lub o tylko jednym liścieniu (fig. 4D). Merystem wierzchołkowy wydawał się nieuszkodzony u dojrzałych zarodków o dwóch symetrycznych liścieniach i te zarodki mogły kiełkować i dalej rozwijać się, podczas gdy dojrzałe zarodki z dwoma asymetrycznymi lub jedynie jednym liścieniem nie kiełkowały prawidłowo.

Fig. 5 przedstawia dojrzewanie linii komórkowej G.78.14., która proliferuje szybko i produkuje tylko kilka normalnych dojrzałych zarodków zgodnie ze sposobami stosowanymi w stanie techniki. Etap dojrzewania tych linii komórkowych prowadzono przez 20 tygodni w pożywce zawierającej 40 μM ABA i a) 25 μM PCIB, b) 0,4 mM floroglucynol, lub c) obniżone stężenie boru (20% normalnego stężenia). Kontrolę przedstawia fig. 1a lub 2a.

Pożywka o obniżonym stężeniu boru również miała korzystny wpływ na liczbę dojrzałych zarodków (fig. 5). W pożywce w której następuje dojrzewanie, o obniżonym stężeniu boru, obserwowano wyraźny wzrost liczby rozwijających się dojrzałych zarodków w niektórych badanych liniach komórkowych. Jednakże, w tych hodowlach proliferacja zachodziła nadal i przerastanie rozwijających się zarodków obniżało liczbę dobrze rozwiniętych zarodków. Ze względu na fakt, że badano jedynie jedno mniejsze stężenie boru, jest możliwe, że optymalizacja tego stężenia może prowadzić do korzystnych efektów.

Jeśli dojrzewanie zarodków przeprowadzano w pożywce obejmującej floroglucynol (0,4 mM) w badanych liniach komórkowych nie stwierdzono dobrze rozwiniętych zarodków, natomiast obserwowano zwiększenie proliferacji (fig. 5). Uważa się, że floroglucynol działa jako inhibitor degradacji auksyny, a dodatek floroglucynolu ma za zadanie spowodować wzrost endogennego stężenia auksyny.

Fig. 6 przedstawia dojrzewanie linii komórkowej G.78.14, etap prowadzony przez 20 tygodni w pożywce, w której następuje dojrzewanie, zawierającej 40 μM ABA i a) 2,5 mg/l TIBA (5 μM), lub b) 25 mg/l TIBA (50 gM).

Dla obu badanych stężeń inhibitorów transportu auksyny, TIBA, we wszystkich badanych liniach komórkowych stwierdzono znaczące obniżenie proliferacji w pożywce w której następuje dojrzewanie, lecz uzyskano jedynie kilka i to w większości nieprawidłowych, dojrzałych zarodków (fig. 6). Ze względu na fakt, że TIBA był badany jedynie w dwóch stężeniach (5 i 50 gM) nie można wykluczyć możliwości otrzymania korzystnego działania przy niższych stężeniach.

Fig. 7 przedstawia stężenie endogennego kwasu indolooctowego w trzech liniach komórkowych Abies nordmanniana. Stężenia zmierzono podczas proliferacji komórek hodowli. Pionowe kreski przedstawiają błąd standardowy.

Stwierdzono obecność endogenicznego IAA w proliferujących hodowlach we wszystkich 3 badanych linii komórkowych (fig. 7). Jak stwierdzono, w hodowlach stężenie IAA jest w zakresie od 6 do 9 mmol/mg suchej masy, ale nie stwierdzono żadnej znaczącej różnicy między szybko proliferującymi i wolniej proliferującymi liniami komórkowymi.

Zawartość wody w dojrzałych zarodkach zygotycznych Abies nordmanniana wynosiła około 30%. Zawartość wody w dojrzałych zarodkach somatycznych zależała od genotypu, lecz dla obu linii komórkowych zawartość wody w zarodkach somatycznych była wyższa niż zawartość wody w zarodkach zygotycznych. W przypadku zarodków somatycznych uzyskanych w pożywce w której następuje dojrzewanie z PCIB, zawartość wody wynosiła od 65 do 75%. Wartość ta jest niższa niż w odpowiadających im dojrzałych zarodkach somatycznych uzyskanych w pożywce, w której następuje dojrzewanie bez PCIB.

Fig. 8A przedstawia kiełkujące zarodki otrzymane według wynalazku. Zarodki poddawano działaniu niskich temperatur przez dwa tygodnie, po czym prowadzono dwa tygodnie kiełkowania w pożywce do kiełkowania. Fig. 8B przedstawia kiełkujące rośliny według wynalazku przeniesione do gleby w celu hartowania.

PL 201 417 B1

W kilku liniach komórkowych w pożywce w której następuje dojrzewanie z PCIB uzyskano dużą ilość dojrzałych zarodków. Kiełkowanie zarodków było zadawalające i blisko 100% zarodków rozwijało zarówno pęd jak i korzeń, a więcej niż 2000 roślin przeniesiono do gleby i do szklarni (fig. 8B). Uzyskane rośliny były zasadniczo uśpione, jak to ma miejsce w przypadku siewek tego samego gatunku. Rośliny przetrwały w glebie, lecz było bardzo trudno uzyskać dalszy wzrost z pączka. Problem prawdopodobnie dotyczył uśpienia i później możliwe było indukowanie dalszego wzrostu przez optymalizację protokołu kiełkowania. Wiadomo, że poddanie takich uśpionych roślin warunkom krótkiego dnia i niskich temperatur w okresie, który należy wyznaczyć doświadczalnie, indukuje przepływ płynów w pączku i w wyniku tego jego stały wzrost.

P r z y k ł a d II. Dojrzewanie w nowo utworzonych hodowlach zarodkowych Abies nordmanniana.

Około 50 linii komórkowych założono z dojrzałych nasion w ten sam sposób jak linia komórkowa G.78.14 (przykład 1). Hodowle założono i utrzymywano w zmodyfikowanej pożywce BLG o połowicznym stężeniu (patrz przykład I). Hodowle utrzymywano mniej niż 6 miesięcy, gdy poddawano je dojrzewaniu.

Protokół

Hodowle zakładano na szalkach jak opisano w przykładzie I. Hodowle poddawano dwóm różnym protokołom dojrzewania.

1) Dojrzewanie przez 8 tygodni w pożywce hodowlanej zawierającej 40 μM ABA i 5% PEG4000.

2) Dojrzewanie jak w 1) lecz od tygodnia 2 do 4 hodowle prowadzono w pożywce hodowlanej zawierającej 40 μM ABA i 25 μM PCIB.

Wyniki:

Wstępne doświadczenia wykazały, że poddanie tych nowo utworzonych linii komórkowych stałemu działaniu anty-auksyny było szkodliwe. Dlatego zastosowano jedynie jednorazowe traktowanie obejmujące krótki etap z anty-auksyną.

Przede wszystkim należy zauważyć, że nowo utworzone linie komórkowe wymagają zasadniczo krótszych czasów dojrzewania niż starsze linie komórkowe. Części linii komórkowych wytworzyła dużą ilość dobrze rozwiniętych dojrzałych zarodków somatycznych w porównaniu do próby kontrolnej (protokół 1). Pozostałe linie komórkowe nie wytworzyły żadnych zarodków somatycznych.

Jeśli wszystkie linie komórkowe poddawano opisanemu powyżej etapowi dwutygodniowego działania anty-auksyny, prawie wszystkie wytworzyły znaczą ilość dojrzałych zarodków somatycznych. Podsumowując, możliwe jest otrzymywanie dojrzałych zarodków somatycznych ze wszystkich badanych linii komórkowych.

P r z y k ł a d III. Dojrzewanie w hodowlach zarodkowych Picea abies.

Materiał roślinny

W obecnym doświadczeniu zastosowano trzy linie komórek zarodkowych, D.2.9, D.4.1, D.7.1, Picea abies, założonych z niedojrzałych nasion w 1989 i przechowywanych w postaci zamrożonej do 1998 jak opisali Norgaard i in. (1993). Hodowle utrzymywano na półstałej pożywce proliferacyjnej BMI-Sl (Krogstrup 1986) żelowanej żelrytem 1,8 g/l, przesiewając dwa razy w tygodniu. Przed przeniesieniem do pożywki, w której następuje dojrzewanie, 4 gramy komórek tkanki z każdej linii komórkowej odważono i przeniesiono do 50 ml płynnej pożywki proliferacyjnej w kolbie Erlenmeyera o pój. 250 ml. Kolba zawierała również sterylne mieszadło magnetyczne.

Procedura wstępna

Aby rozdrobnić hodowle mieszano je przez 5 minut mieszadłem magnetycznym. Następnie kolby wytrząsano przez 15 minut na wytrząsarce obrotowej przy 175 rpm. Pożywkę z zawiesiną agregatów komórkowych następnie przelano do cylindra miarowego o pój. 100 ml i pozostawiono do wytworzenia osadu przez 30 minut. Supernatant usunięto i równe ilości 1 ml komórek umieszczano na sterylnych krążkach papierowych Whatman #54 w szalkach z różnymi pożywkami do dojrzewania. Stosowano trzy powtórzenia szalek dla każdej kombinacji linii komórkowej i procedury.

Protokół dojrzewania

Badano pięć protokołów dojrzewania.

A: Dojrzewanie w pożywce BMG-1 (Krogstrup i in. 1988) zmodyfikowanej przez zwiększenie stężenia ABA do 40 μM.

B: Jak A, lecz od tygodnia 2 do 4 dojrzewanie prowadzono w pożywce hodowlanej zawierającej

2,5 μM PCIB i 40 μM ABA.

PL 201 417 B1

C: Jak A, lecz od tygodnia 2 do 4 dojrzewanie prowadzono w pożywce hodowlanej zawierającej

5,0 μΜ PCIB i 40 μΜ ABA.

D: Dojrzewanie prowadzono w pożywce zawierającej 2,5 μΜ PCIB i 40 μΜ ABA.

E: Dojrzewanie prowadzono w pożywce zawierającej 5,0 μΜ PCIB i 40 μΜ ABA.

Wyniki

W liniach komórkowych D.4.1 i D.7.1, które zazwyczaj są nazywane liniami komórkowymi typu A, otrzymano dojrzałe zarodki somatyczne bez przeprowadzenia etapu z anty-auksyną. Jednakże, przeprowadzenie etapu z anty-auksyną prowadziło do uzyskania większej ilości zarodków somatycznych niż bez tego etapu. Wpływ etapu z anty-auksyną polegał na obniżeniu proliferacji podczas dojrzewania.

Linia komórkowa D.2.9 nie produkowała tak wiele zarodków jak pozostałe dwie linie komórkowe. Jeśli nie stosowano w procesie dojrzewania etapu z anty-auksyną, hodowla stopniowo stawała się brązowa i traciła żywotność. Następnie otrzymywano dojrzałe zarodki. Jeśli hodowlę prowadzono z etapem z anty-auksyną, to również na początku stawała się brązowa, lecz później otrzymywano na brzegach hodowli nowe agregaty komórek z odpowiedniego, przezroczystego kalusa embriogennego. Z tej tkanki z powrotem otrzymano dużą liczbę dojrzałych zarodków somatycznych.

Zatem wydaje się, że wprowadzenie etapu z anty-auksyną ma wpływa na przekształcenie linii komórkowych, które nie są w stanie produkować dojrzałych zarodków somatycznych w linie komórkowe, które mogą produkować dojrzałe zarodki. Grudki nowo utworzonych tkanek z D.2.9 przenoszono z powrotem do proliferacyjnej pożywki i w ten sposób udało się otrzymanie dojrzałych zarodków z tej hodowli ponownie.

Jak wykazano powyżej realizacja sposobu według wynalazku umożliwia uzyskanie linii komórkowych o lepszej wydajności produkcji dojrzałych zarodków somatycznych. Efekt ten osiąga się dzięki poddaniu hodowli warunkom opisanym powyżej dla linii komórkowej D.2.9, jednak podobny wynik można uzyskać przez zastosowanie etapu z anty-auksyną w etapie proliferacji lub w etapie pomiędzy proliferacją a dojrzewaniem.

P r z y k ł a d IV. Dojrzewanie w hodowlach zarodkowych Picea sitchensis.

Materiał roślinny

W obecnym badaniu zastosowano dwie linie komórkowe Picea sitchensis, G. 1.12 i G. 1.13, założone z liścieni dojrzałych zarodków. Hodowle założono i poddano wstępnemu protokołowi w pożywce BMI-S1 jak opisano powyżej, lecz stosując 1000 mg/l hydrolizatu kazeiny i 10 μM 2,4-D.

Zastosowano protokół wstępny, pożywkę w której następuje dojrzewanie i etap z anty-auksyną jak opisano dla Picea abies.

Wyniki

W obu badanych liniach komórkowych otrzymano duże ilości dojrzałych zarodków somatycznych zarówno w procedurze z etapem z podaniem anty-auksyny jak i bez anty-auksyny. Jednakże, w wyniku poddania hodowli działaniu anty-auksyny proliferacja była wyraźnie mniejsza i poprawił się ogólny wygląd hodowli.

P r z y k ł a d V. Transformacja embriogennych hodowli komórkowych Abies nordmanniana, a następnie uzyskanie roślin.

Linie komórek zarodkowych Abies nordmanniana transformowano biolistcznie (z użyciem działa genowego) stosując sposób opisany przez Waltera i in. (1998) z pewnymi modyfikacjami. Po pierwsze, gatunkiem jest Abies nordmanniana zamiast Pinus radiata. Do proliferacji stosowano zmodyfikowaną pożywkę BLG o połowicznym stężeniu opisaną w przykładzie I, powyżej, podobnie jak podczas etapu selekcji po transformacji.

Przenoszonym plazmidem był plazmid pCW 122 zawierający gen reporterowy uidA pod kontrolą promotora CaMV 35S i gen kodujący marker selekcyjny npt II pod kontrolą promotora CaMV 35S.

Selekcję prowadzono w pożywce proliferacyjnej zawierającej 50 mg/l genetycyny. Ekspresję genu reporterowego uidA w transformowanej tkance embriogennej, w uzyskanych z niej dojrzałych zarodkach somatycznych otrzymanych według obecnego wynalazku i w uzyskanej z zarodków roślinie również otrzymanej według wynalazku wykrywano histochemicznie stosując barwienie GUS.

P r z y k ł a d VI. Dojrzewanie linii komórkowej Abies nordmannianas obejmujące etap z auksyną.

Stosowano trzy protokoły dojrzewania linii komórkowych:

A) Dojrzewanie w pożywce hodowlanej zawierającej 40 μΜ ABA i 5% PEG-4000 (kontrola).

B) Jak A) lecz pożywka hodowlana zawierająca 40 μΜ ABA i 25 μΜ PCIB była podawana od 2 do 4 tygodnia.

PL 201 417 B1

C) Jak B) ale pożywka hodowlana zawierająca 40 μM ABA i 5 μM IAA była podawana od czwartego tygodnia.

Zarodki otrzymane według protokołu C były dłuższe niż otrzymane według protokołu B. Ogólna jakość zarodków według protokołu C była również wyższa niż jakość zarodków według protokołu B.

P r z y k ł a d VII. Dojrzewanie linii komórkowych Abies nordmanniana obejmujące zmianę źródła węglowodanów przez zastąpienie maltozy sacharozą podczas ostatniego okresu (faza trzecia) etapu dojrzewania.

Z wyjątkiem składnika węglowodanowego, podstawowe pożywki w których zachodzi dojrzewanie miały skład taki jak opisano dla kontroli w przykładzie I. Jednakże wprowadzono PCIB, zgodnie z wcześniej określonym optymalnym stężeniem i przez optymalny okres wyznaczony doświadczalnie dla każdej z badanych linii komórkowych. Badano wpływ na dojrzewanie czterech różnych kombinacji węglowodanów:

A) Dojrzewanie w pożywce hodowlanej zawierającej jako źródło węglowodanów podczas całego procesu dojrzewania 45 g/l sacharozy,

B) Dojrzewanie w pożywce hodowlanej zawierającej jako źródło węglowodanów podczas całego procesu dojrzewania 45 g/l maltozy, typowy zarodek uzyskany według tej procedury przedstawiono na fig. 9, obraz po lewej stronie.

C) Dojrzewanie w pożywce hodowlanej zawierającej podczas pierwszej części etapu dojrzewania 45 g/l maltozy, zmienionej na pożywkę, w której zachodzi dojrzewanie, zawierającej 22,5 g/l sacharozy i w ostatnich dwóch tygodniach etapu dojrzewania zastąpionej pożywką zawierającą 22,5 g/l maltozy. Typowy zarodek uzyskany według tej procedury przedstawiono na fig. 9, obraz po prawej stronie.

D) Dojrzewanie w pożywce hodowlanej podczas pierwszej części okresu dojrzewania z 45 g/l maltozy, zmienionej na pożywkę, w której zachodzi dojrzewanie, zawierającej jako źródło węglowodanów 45 g/l sacharozy w ostatnich dwóch tygodniach okresu dojrzewania. Typowy zarodek uzyskany według tej procedury przedstawiono na fig. 9, obraz środkowy.

Wyniki

Jeśli jako źródło węglowodanów podczas całego okresu dojrzewania (test A) zastosowano sacharozę, nie otrzymano dobrze rozwiniętych dojrzałych zarodków. Wszystkie otrzymane dojrzałe zarodki wykazywały wyraźne nieprawidłowości. Jeśli jako jedyne źródło węglowodanów podczas całego okresu dojrzewania (test B) zastosowano maltozę otrzymano duże ilości zarodków (takie jak na fig. 1C i 2B). Dojrzałe zarodki były dobrze wykształcone, ale w większości linii komórkowych były stosunkowo mniejsze w porównaniu do dojrzałych zarodków zygotycznych.

Jeśli komórki przenoszono z pożywki, w której następuje dojrzewanie, zawierającej maltozę do pożywki, w której następuje dojrzewanie, zawierającej sacharozę podczas ostatnich dwóch tygodni dojrzewania (test C i D), uzyskiwano wyraźnie większe dojrzałe zarodki (fig. 9). Przeniesienie do pożywki zawierającej 45 g/l sacharozy (test D) prowadziło do rozwoju dojrzałych zarodków o wielkości podobnej do wielkości zarodków zygotyczych Abies nordmanniana. Średnia świeża masa dojrzałych zarodków uzyskanych według protokołu B) wynosiła około 50 mg, co można porównać do średniej świeżej masy dojrzałych zarodków uzyskanych według protokołu D), która wynosiła około 120 mg na zarodek. Zaobserwowano dodatkową korzyść z zastosowania protokołu D) w porównaniu do protokołu B), która polegała na skróceniu okresu dojrzewania do około czterech tygodni.

Obserwowany wpływ zmiany źródła węgla przez zastąpienie maltozy sacharozą podczas ostatniej części etapu dojrzewania był niespodziewany i zaskakujący, ponieważ wcześniejsze badania przedstawiały wyraźny negatywny wpływ sacharozy na dojrzewanie zarodków somatycznych Abies nordmanniana (Plant Science, tom 124: 211-221, Norgaard) i innych gatunków drzew iglastych (US 5187092 Institut of Paper Science and Technology).

Uważa się, że składniki metabolizowanych źródeł węgla, a bardziej szczegółowo źródła węglowodanów, zasadniczo będą wykazywały niespodziewany wpływ na dojrzewanie. Można zaproponować składniki takie jak laktoza, fruktoza, glukoza, maltotrioza, skrobia, galaktoza lub mieszaniny tych związków. Szczególnie podobne korzystne działanie na dojrzałe zarodki wykazywały fruktoza i glukoza, pojedynczo lub w mieszaninie. Pożywka hodowlana zawiera od 1 do 100 g/l fruktozy lub glukozy.

Lista odnośników:

von Arnold S, Egertsdotter U, Ekberg I, Gupta P, Mo H, Norgaard, J, 1995, „Somatic embryogenesis in Norway spruce (Picea abies). w: „Somatic embryogenesis in woody plants. tom 3 (wyd S Jain, P Gupta, R Newton), Kluwer Academic Publishers, str. 17-36.

PL 201 417 B1

Aitken-Christie J, Parkes BD, 1996, „Improved embryogenesis process for initiation and maturation. Zgłoszenie PCT, publikacja nr W096/37096.

Attree SM, Fowke LC, 1993, „Maturation, desiccation, and encapsulation of gymnosperm somatic embryos. Zgłoszenie PCT, publikacja nr W093/11660.

George EF, 1993, „Plant Propagation by Tissue Culture, Part 1, The Technology. Execetics Ltd, 2gie wydanie.

Krogstrup P, 1986, „Embryolike structures from cotyledons and ripe embryo of Norway spruce (Picea abies). Can. J. For. Res. tom. 16: 664-668.

Krogstrup P, Eriksen EN, Moller JD, Roulund H, 1988, „Somatic embryogenesis in Sitka spruce (Picea sitchensis (Bong.) Carr.). Plant Celi Rep. tom. 7: 594-597.

Murashige T, Skoog F, 1962, „A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant tom. 15: 473-497.

Norgaard JV, 1997, „Somatic embryo maturation and plant regeneration in Abies nordmanniana Lk. Plant Science tom 124: 211-221.

Norgaard JV, Krogstrup P, 1991, „Cytokinin induced somatic embryogenesis from immature embryos of Abies nordmanniana Lk. Plant Cell Rep tom 9: 509-513.

Norgaard JV, Duran V, Johnsen O, Krogstrup P, Baldursson S, von Arnold S, 1993, „Variations in cryotolerance of embryogenic Picea abies cell lines and the association to genetic, morphological and physiological factors. Can J For Res 23: 25602567.

Norgaard JV, Krogstrup P, 1995, „Somatic embryogenesis in Abies spp, Somatic embryogenesis in Woody Plants. Eds S Jain, P Gupta, R Newton, tom 3: 341-355.

Paques M, Bercetche J, 1999, „Procede de rajeunissement de gymnospermes par embryogenese somatique. Zgłoszenie PCT, publikacja nW099/23874.

Roberts DR, Flinn BS, Webb DT, Webster FB, Sutton BCS, 1990, „Abscisic acid and indole-3-butyric acid regulation of maturation and accumulation of storage proteins in somatic embrys of interior spruce. Physiol. Plant, tom 78: 355-360.

Schenck RU, Hildebrandt AC, 1972, „Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can. J. Bot. tom. 50: 199-204.

Smith DR, 1996, „Growth medium. opis patentowy US nr 5565355, z dnia 15.10.1996.

Uddin MR, 1993, „Somatic embryogenesis in gymnosperms. opis patentowy nr 5187092, z dnia 1 6.02.1993.

Verhagen SA, Wann SR, 1989, „Norway spruce somatic embryogenesis: High frequency initiation from light-cultured mature embryos. Plant Cell Tiss. Org. Cult. tom. 16: 103-111.

Walter C, Grace LJ, Wagner A, White DWR, Walden AR, Donaldson SS, Hinton H, Gardner RC, Smith DR, 1998, „Stable transformation and regeneration of transgenic plants of Pinus radiata D. Don. Plant Cell Reports 17: 460-468.

Claims (24)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób uzyskiwania dojrzewania somatycznych zarodków drzew iglastych, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym prowadzi się hodowlę tkankową komórek zarodkowych w pożywce hodowlanej zawierającej anty-auksynę.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap przed etapem z anty-auksyną, w którym prowadzi się hodowlę tkankową komórek zarodkowych w pożywce hodowlanej.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje również trzeci etap po etapie z anty-auksyną, w którym prowadzi się hodowlę tkankową komórek zarodkowych w pożywce hodowlanej zasadniczo wolnej od anty-auksyny.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap z anty-auksyną prowadzi się od 2 dni do 50 tygodni.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap przed etapem z anty-auksyną prowadzi się od dwóch dni do 10 tygodni.
6. 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że trzeci etap po etapie z anty-auksyną prowadzi się od dwóch dni do 40 tygodni.

   PL 201 417 B1
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą dodatkowo, w co najmniej jednym z etapów, czynnik stymulujący dojrzewanie.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą dodatkowo we wszystkich etapach co najmniej jeden czynnik stymulujący dojrzewanie.
9. 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się czynnik stymulujący dojrzewanie wybrany z grupy zawierającej: kwas abscyzynowy, azotan srebra, kwas jasmonowy, alkohol abscyzynowy, aldehyd acetylenowy, alkohol dihydroacetylenowy, kwas fazeinowy, kwas dihydrofazeinowy, kwas 6'-hydroksymetylo abscyzynowy, kwas beta-hydroksy abscyzynowy, kwas beta-metylo glutarylo abscyzynowy, kwas beta-hydroksy-beta-metylo glutarylohydroksy abscyzynowy, kwas 4'-dezoksy abscyzynowy, ester kwasu abscyzynowego beta-D-glukozy, kwas 2-2 (2-p-chlorofenylo-trans-etylo) cyklopropano karboksylowy.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako czynnik stymulujący dojrzewanie stosuje się kwas abscyzynowy o stężeniu od 0,1 do 200 μM.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się anty-auksynę wybraną z grupy obejmującej: kwas izomasłowy a-(1-naftylometylo-sulfido)-, kwas a-(1-naftylometylo-sulfido)-propionowy, kwas a-(2-naftylometylo-sulfido)-izomasłowy, kwas a-(2-naftylometylo-sulfido)-propionowy, kwas a-(naftylometylo-seleno)-n-walerianowy, kwas (-)-a-(2,4,5-trichlorofenoksy)-propionowy, kwas (-)-a-(2,4-dichlorofenoksy)-propionowy, kwas (-)-a-(2-naftoksy)-propionowy, kwas (+)-a-(1-naftoksy)propionowy, kwas (3-fenylo-1,2,4-tiadiazolo-5-ylo) tiooctowy (PTAA), kwas β-naftalenooctowy (P-NAA), kwas γ-fenylomasłowy, kwas 1-(naftylometylo-sulfido)-propionowy, kwas 1-naftylometyloseleno octowy, kwas 2-(naftylometylo-sulfido)-propionowy, kwas 2-(o-chlorofenoksy)-2-metylopropionowy, kwas

    2.3.4.5.6- pentachlorofenoksyizomasłowy, kwas 2,3,5-trijodobenzoesowy (TIBA), kwas 2,3,5-trijodobenzoesowy, kwas 2,4,5-trichlorofenoksyizomasłowy, kwas 2,4,6-trichlorofenoksyoctowy (2,4,6-T), kwas

    2.4.6- trichlorofenoksyizomasłowy, 2,4-dichloroanizol (2,4-DCA), kwas 2,4-dichlorofenoksyizomasłowy (2,4-DClP), kwas 2,4-dichlorofenylsulfonooctowy, kwas 2,4-dichlorofenylosulfotlenooctowy, kwas 2,6-dichlorofenoksyactic, kwas 2-chlorofenoksyizomasłowy, kwas 2-naftylometyloselenooctowy, kwas 3-chlorofenoksyizomasłowy, kwas 3-indoloizomasłowy, kwas 3-nitro-4-flourobenzoilowy, kwas 4-chlorofenoksyizomasłowy, 5-metylotryptofan, 7-azaindol, kwas 9-hydroksyfluoreno-9-karboksylowy (HFCA), kwas ferulowy, flawonoidy, kwas indoloizomasłowy, kempferol, hydrazyd kwasu maleinowego, naftalam (kwas N-1-naftyloftalowy), kwas p-chlorofenoksyizomaslowy (PC1B), kwas p-kumarynowy, kwas fenoksyoctowy, kwas fenoksyizomasłowy, kwas fenylopropionowy, kwercytynę, kwas transcynamonowy.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako anty-auksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 0,01 do 200 μM.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako anty-auksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 1 do 50 μM.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się zarodki drzewa iglastego z Pinaceae.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się zarodki drzewa iglastego z rodzaju Pinus, Picea, Abies, Larix, lub Pseudotsuga.
16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się zarodki Abies sp., zwłaszcza Abies nordmanniana.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się zarodki Picea sp., zwłaszcza Picea abies lub Picea sitchensis.
18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się zarodki Abies sp. i jako antyauksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 1 do 100 μM.
19. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się zarodki Picea sp. i jako antyauksynę stosuje się PCIB o stężeniu od 0,1 i 50 μM.
20. 20. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się w pożywce hodowlanej, podczas przynajmniej części trzeciego etapu, po etapie z anty-auksyną, dodatkowo auksynę.
21. 21. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że następnie hoduje się komórki zarodkowe w pożywce hodowlanej zawierającej źródła węgla ulegające metabolizmowi.
22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że następnie hoduje się komórki zarodkowe w pożywce hodowlanej zawierającej sacharozę, fruktozę albo glukozę.

    PL 201 417 B1
23. 23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą od 1 do 100 g/l źródeł węgla ulegających metabolizmowi.
24. 24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że dalszą hodowlę prowadzi się w okresie od 2 dni do 10 tygodni.