ES2876291T3 - Procedimiento para hace crecer embriones somáticos de coníferas como árboles - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos completamente maduros del género Abies que comprende: a) Someter embriones somáticos totalmente maduros a 2°C-7°C durante 8-16 semanas b) Seleccionar las pequeñas plántulas obtenidas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una fuente de carbohidratos accesible para la planta en una concentración donde pueda ser absorbidos por las plantas y utilizados como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración; a intensidades de luz LED de 70 - 300 μmol/m2s durante al menos 3 semanas c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para hacer crecer embriones somáticos de coniferas como árboles

Campo de la invención

La presente invención se enmarca dentro del campo de la producción de árboles o madera donde los árboles son proporcionados por embriogénesis somática (ES). Los árboles son coníferas del género Abies. La invención se refiere a un procedimiento para tratar y cultivar embriones somáticos en condiciones que inducen y estimulan el crecimiento de las raíces, que inducen y estimulan la formación de brotes y aumentan la tasa de supervivencia de los embriones y plántulas en comparación con intentos anteriores de producir árboles de Abies a partir de embriogénesis somática. Posteriormente, las plántulas se pueden convertir en árboles y debido a la similitud genética obtenida mediante el uso de embriones somáticos en comparación con los árboles obtenidos por polinización cruzada aleatoria, los árboles de Abies derivados de la embriogénesis somática son de apariencia y calidad muy homogéneas, lo que se prefiere en la producción de árboles como los árboles de Navidad, reduciendo así la tasa de desperdicio.

Antecedentes

El mercado comercial europeo de árboles de Navidad asciende anualmente a unos 70 millones de árboles, 35 millones de ellos son abetos de Nordmann (Abies nordmanniana). Dinamarca es el principal país exportador que suministra una cuota de mercado de 10 millones de abetos de Nordmann. El abeto de Nordmanns ha pasado de ser un producto de nicho cosechado en plantaciones forestales a ser un cultivo agrícola producido principalmente en tierras de cultivo. El mercado se está volviendo cada vez más competitivo debido al hecho de una producción creciente, en el mejor de los casos un consumo estable, y una transición del mercado de lotes minoristas más pequeños a la venta de grandes cantidades de árboles en supermercados. Además, se está produciendo un cambio estructural que conduce a menos productores, pero más grandes, y también se impone una competencia muy fuerte al tratar con compradores altamente profesionales y una producción aún dispersa de muchos productores.

Tradicionalmente, las fuentes de semillas utilizadas en la industria del árbol de Navidad se originan en puestos en el área de distribución natural del abeto de Nordmann y, por lo tanto, despliegan un material genético muy amplio y variable. Esto contrasta fuertemente con el hecho de que el producto final de un árbol de Navidad se caracteriza como un 'ideotipo' o un conjunto de 'ideotipos' dependiendo de mercados específicos, pero generalmente se caracteriza por un crecimiento en altura uniforme, ramificación simétrica y densa, ángulo de ramas ligeramente erguido y agujas de color verde oscuro orientadas en una estructura redondeada tridimensional simétrica sobre las ramitas. Además, un conjunto de caracteres adaptativos son importantes para la producción: supervivencia y adaptación a las condiciones de crecimiento y al clima locales, es decir, enrojecimiento tardío (para evitar las heladas tardías de primavera), resistencia a las bajas temperaturas invernales, etc. para evitar daños a las yemas que causen que estas mueran, afectando la simetría. Debido a que la apariencia visual del árbol de Navidad es de tanta importancia, los factores dañinos como los insectos, especialmente los adelgidos (chupando las agujas provocan el amarillamiento) y los hongos reciben mucha atención, y si es posible, se evitan mediante la aplicación de pesticidas. El color verde oscuro del árbol está fuertemente relacionado con el contenido de nutrientes de las agujas y, por lo tanto, con la práctica de fertilización y las condiciones de crecimiento locales específicas.

Sobre la base de amplias fuentes de semillas naturales, la proporción de individuos adecuados es demasiado limitada para obtener ingresos económicos positivos, cuando simplemente se cultivan de forma natural. Por lo tanto, las operaciones de corte y poda de árboles que requieren mucha mano de obra, la regulación del crecimiento de la longitud de la guía normalmente se aplican junto con la fertilización, el control de malezas y la aplicación de pesticidas. Por lo tanto, la clonación es muy relevante, ya que ofrece la oportunidad de uniformar el material genético utilizado para la producción de árboles de Navidad y potencialmente 'retener' la combinación deseada de rasgos, que se ven en una pequeña proporción de los árboles, y necesarios para árboles de Navidad de alta calidad y rasgos adaptables que aseguran una producción de bajo riesgo y potencialmente también reducen los problemas de plagas y el uso de pesticidas, y altos ingresos económicos. Aunque no se pueden lograr combinaciones óptimas de rasgos en el material clonado, el simple hecho de que se espera que los clones por ES sean más uniformes en crecimiento y fenología será beneficioso para operaciones de campo como el control de longitud de guía (donde para algunas sustancias químicas una longitud de guía de 10-18 cm está dirigida al primer tratamiento), pero también a la poda lateral, donde los brotes recién emergidos de las ramas laterales se rompen a una longitud de 2 cm, y el momento es crucial para asegurar la formación óptima de las yemas en la ramita cortada y, por lo tanto, la mejor apariencia visual y crecimiento de aspecto natural al año siguiente.

La embriogénesis somática en combinación con la criopreservación y las pruebas de campo para identificar a los mejores individuos es potencialmente una herramienta muy eficaz.

Reducir el tiempo y los recursos dedicados a la formación de plantas mediante el uso de la embriogénesis somática en lugar de cultivar semillas producidas naturalmente se ha aplicado durante mucho tiempo en diferentes especies de plantas. Sin embargo, no ha sido fácil en árboles y, especialmente en coníferas, ha resultado difícil proporcionar tasas de supervivencia suficientes tanto de los embriones somáticos como de las plántulas obtenidas de la embriogénesis somática. Además, las razones de las bajas tasas de supervivencia parecen variar entre los diferentes géneros y, en cierta medida, también entre familias.

Nawrot-Chorabik (2016) describió un procedimiento que comprende tanto el desarrollo de embriones somáticos de abeto de Nordmann como su maduración. Según este trabajo, la formación de raíces se indujo mediante crecimiento en un medio por SH que contenía, entre otros, IBA, microelementos, sacarosa y fitagel. Para inducir la formación de brotes, la germinación se llevó a cabo en luz LED blanca difusa a una humedad elevada al 70 % en un medio que contenía sacarosa.

Pullman y col. (2016) revelaron un procedimiento para mejorar Abies fraseri para la producción de árboles de Navidad. Los embriones maduros se expusieron a un período de almacenamiento en frío de 1-2 meses a 4°C, mediante el cual se logró un crecimiento de las raíces significativamente mejor.

US2009/0280566 divulgó un procedimiento para aumentar la germinación y la frecuencia de embriones somáticos viables de pinos como especies de Pinus producidas in vitro. El procedimiento contiene tres etapas y comprende un período de tratamiento con frío a 0-10°C durante al menos una semana.

US 5.731.204 describe un procedimiento de producción de pinos a partir de embriones somáticos en árboles de Pinus e híbridos de Pinus. Básicamente, el procedimiento consiste en tres etapas: a) una etapa donde los embriones somáticos se cultivan en un medio que contiene PEG, b) un período de almacenamiento en frío de 2-12 semanas a 0-10°C, c) un período de crecimiento adicional en un medio de crecimiento que contiene sacarosa. Se concluye que es esencial que ABA y PEG estén presentes en el medio en el período de crecimiento previo al período de almacenamiento en frío, y que el período de almacenamiento en frío es decisivo para superar los efectos inhibidores del PEG sobre la germinación.

Kartarzyna Nawrot-Chorabik (2012) describió factores que se cree que aumentan la formación de raíces. Además, se recomendó que los pequeños embriones somáticos enraizados se transfieran a crecimiento bajo luz LED blanca que es aproximadamente 10 veces más baja en intensidad que en condiciones naturales.

Malabadi y Nataraja (2007) aplicaron un pretratamiento con frío a 4°C para inducir el desarrollo de tejido embriogénico. En cuanto a la intensidad de la luz se menciona que las plántulas se colocaron en la sala de crecimiento bajo un fotoperiodo de 16 h (50 pmol m-2 s-1). Haggman y col. (1999) aplicaron un tratamiento en frío de 14 días - 2 meses a 5°C en relación con el tratamiento de los conos, es decir, antes de que los embriones cigóticos inmaduros se utilizaran para iniciar cultivos embriogénicos. En cuanto a la intensidad de la luz durante el desarrollo de los embriones somáticos, las masas de células embriogénicas se cultivaron en la oscuridad a 25 ± 2°C, y durante la germinación se cultivaron bajo un fotoperíodo de 16/8 h luz/oscuridad (67-74 pE m-2 s-1) a 24°C.

Por lo tanto, hasta ahora, ha faltado un procedimiento completamente satisfactorio para proporcionar un número suficiente de plántulas aptas derivadas de la embriogénesis somática en árboles de coníferas del género Abies. Por lo tanto, la mayor parte de la producción de árboles de Navidad en la actualidad se basa en semillas que han sido recolectadas de polinizaciones incontroladas derivadas de árboles de aproximadamente 35 años, que es la edad donde la mayoría de las especies del género Abies inician la producción de semillas. Los árboles resultantes muestran grandes diferencias en crecimiento y apariencia y aproximadamente el 30 % de los árboles no son aptos para la producción de árboles de Navidad. Esto solo se hará evidente después de 8 a 10 años de crecimiento. Además, las plagas y los herbívoros reducen aún más la producción. Por lo tanto, la producción vegetativa de árboles selectos de élite es beneficiosa porque todos los árboles tendrán el potencial genético para la apariencia deseada y, opcionalmente, un crecimiento mejorado.

Hasta ahora ha resultado difícil obtener embriones somáticos de la especie dentro del género Abies que desarrollen tanto raíces como brotes lo suficiente como para que sobrevivan las pequeñas plántulas. El presente procedimiento proporciona una solución a este problema en el sentido de que estimula la formación de raíces al hacer crecer los embriones somáticos maduros a bajas temperaturas durante un período de tiempo seguido de crecimiento en luz LED y en un sustrato que no comprende una cantidad significativa de una fuente de carbohidratos accesible a la planta que estimula la formación de brotes.

Resumen de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos completamente maduros mediante la estimulación del desarrollo y crecimiento de raíces y brotes en embriones somáticos de coníferas con el objetivo de acortar el tiempo y la inversión necesarios para la propagación vegetativa de un gran número de coníferas de un genotipo preferido.

El procedimiento ha demostrado ser especialmente beneficioso en el desarrollo de embriones somáticos de coníferas del género Abies, particularmente Abies nordmanniana (abeto de Nordmann). Además, se espera que se obtenga un desarrollo beneficioso similar en otras especies de Abies, especies que sean adecuadas para la producción de árboles de Navidad y para la vegetación cortada, particularmente en Abies bornmülleriana.

Los embriones somáticos completamente maduros que sirven como material de partida para crecer según el procedimiento de la presente invención se pueden generar a partir de una variedad de tejidos de origen sexual como mega gametofitos inmaduros y embriones cigóticos extirpados o de tejidos de origen asexual como ápices de brotes vegetativos de árboles viejos. Los embriones somáticos de Abies completamente maduros obtenidos a partir de cualquier procedimiento conocido en la técnica pueden usarse para un desarrollo y crecimiento adicional mediante el procedimiento según la presente invención.

El procedimiento de la presente invención comprende las siguientes etapas:

a) Someter embriones somáticos de coníferas a 2-7°C durante 8-16 semanas

b) Recoger las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz de 70 - 300 pmol/m2s; mediante el uso de luz LED durante al menos 3 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

Las pequeñas plántulas obtenidas en la etapa (b) generalmente se cultivan en estas condiciones durante 4-8 semanas, pero se pueden cultivar en las condiciones de la etapa (b) durante al menos 3 meses. Además de inducir la formación de raíces y brotes, se mejora en consecuencia la tasa de supervivencia de los embriones somáticos. Además, estas condiciones de crecimiento hacen que los embriones obtenidos después de la etapa (b) sean adecuados para un mayor crecimiento en condiciones que impidan la inactividad cuando la planta se transfiera al suelo.

Después de que los embriones somáticos hayan crecido según la etapa a) y la etapa b) del procedimiento de la presente invención, los embriones se pueden cultivar más en la etapa c) en cualquier condición adecuada, por ejemplo, como plantas en cepellones cultivadas en invernadero, vivero o al aire libre durante un período de tiempo, como 1-2 años, hasta que las plantas hayan obtenido un tamaño adecuado para crecer al aire libre, como en un campo o bosque, hasta la etapa deseada para la tala o el corte. La etapa c) incluye cualquier condición de crecimiento adecuada para hacer crecer los embriones obtenidos en la etapa b) en plantas de un tamaño deseado.

Para muchas especies de coníferas y muchas líneas celulares no ha sido posible regenerar plantas mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Usando el procedimiento según la presente invención, el número de especies y líneas celulares a partir de las cuales se pueden desarrollar embriones somáticos maduros en embriones ha aumentado significativamente. Dado que los embriones obtenidos mediante el presente procedimiento son de mayor calidad, también se ha mejorado el crecimiento continuo de los embriones en plantas.

Descripción detallada de la invención

El procedimiento de la presente invención estimula y mejora el crecimiento de raíces y brotes en embriones somáticos de coníferas completamente maduros acortando así el tiempo y la inversión necesarios para la propagación vegetativa de un gran número de coníferas de un genotipo preferido.

El procedimiento es adecuado para el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos completamente maduros de coníferas del género Abies, incluyendo Abies alba, Abies amabilis, Abies balsamea, Abies beshanzuensis, Abies bifolia, Abies borisii-regis, Abies bornmü/leriana, Abies bracteata, Abies cephalonica, Abies chensiensis, Abies cilicica, Abies concolor, Abies delavayi, Abies densa, Abies duragensis, Abies equi-trojani, Abies fabri, Abies fargesii, Abies fanjingshanensis, Abies firma, Abies flincki, Abies forrestii, Abies fraseri, Abies guatemalensis, Abies hickelii, Abies holophylla, Abies homolepis, Abies kawakamii, Abies koreana, Abies lasiocarpa, Abies lowiana, Abies magnifica, Abies mariesii, Abies nebrodensis, Abies nephrolepis, Abies nordmanniana, Abies numidica, Abies pardei, Abies pindrow, Abies pinsapo, Abies procera (Abies nobilis), Abies recurvata, Abies religiosa, Abies sachalinensis, Abies sibirica, Abies spectabilis, Abies squamata, Abies veitchii, Abies vejarii, Abies yuanbaoshanensis, Abies ziyuanensis, y cualquier híbrido obtenido de hibridación entre especies entre cualquiera de las especies del género Abies.

Los miembros del género Abies no siempre se clasifican de la misma manera, por ejemplo, A. bornmülleriana según algunos se clasifica como una subespecie más que como una especie independiente (Farjon y Rushfort, 1989, Liu 1971). El procedimiento según la presente invención será adecuado para cualquier especie o subespecie del género Abies. Además, los miembros del género Abies a menudo se hibridan entre las especies y/o subespecies. La hibridación entre especies es particularmente común entre las especies europeas del género Abies. El procedimiento según la presente invención también será adecuado para cultivar híbridos dentro de miembros de la especie Abies. En un aspecto, el procedimiento es adecuado para el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos completamente maduros de las especies europeas del género Abies incluyendo: Abies alba, Abies nebrodensis, Abies borisii-regis, Abies cephalonica, Abies nordmanniana, Abies bornmülleriana, Abies pinsapo, Abies numidica, Abies cilicica, e híbridos obtenidos por hibridación interespecies entre las especies europeas del género Abies.

El procedimiento ha demostrado ser particularmente beneficioso para el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos completamente maduros de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) y Abies bornmülleriana.

Los embriones somáticos completamente maduros para crecer según el procedimiento de la presente invención se pueden generar a partir de una variedad de tejidos de origen sexual como mega gametofitos inmaduros y embriones cigóticos extirpados o de tejidos de origen asexual como ápices de brotes vegetativos de árboles viejos. Los embriones somáticos de Abies completamente maduros obtenidos a partir de cualquier procedimiento conocido en la técnica pueden usarse para un desarrollo y crecimiento adicional mediante el procedimiento según la presente invención. En una realización preferida de la invención, los embriones somáticos se derivan de embriones cigóticos extirpados. Los embriones somáticos de la especie Abies pueden obtenerse, por ejemplo, como se describe en US 6,897.065 y son adecuados para desarrollarse en plántulas según el procedimiento de la presente invención.

La regeneración de las plantas a través de la embriogénesis somática en las coníferas generalmente consiste en varias etapas consecutivas. Primero, se inicia un cultivo embriogénico a partir de un explante, que puede ser un embrión, maduro o inmaduro, una plántula, yemas o ápices de brotes vegetativos de árboles adultos. Esta etapa se lleva a cabo en cualquier medio de cultivo de plantas adecuado que contenga varios reguladores del crecimiento de las plantas, dependiendo en gran medida del género de la especie en cuestión. Normalmente, se incluyen tanto auxina como citoquinina.

Para una proliferación continua, los cultivos iniciados se subcultivan en un medio con la misma composición que el medio de inducción o se subcultivan en un medio con concentraciones más bajas de reguladores del crecimiento de las plantas. En esta etapa, las masas celulares en proliferación consisten en embriones somáticos inmaduros más o menos bien diferenciados, que corresponden morfológicamente a una etapa que se encuentra en la semilla en desarrollo en la fase temprana del desarrollo de la semilla. En condiciones óptimas, los embriones somáticos no experimentan ningún desarrollo adicional durante la proliferación y, por lo tanto, los embriones maduros no se forman durante esta fase.

Para obtener la maduración del embrión, los cultivos deben transferirse a un medio de cultivo de plantas, donde, típicamente, se omiten las auxinas y las citoquininas y se incluye el ácido abscísico (ABA). En algunos casos, se incluye una etapa de transición corta (1 - 3 semanas), durante la cual las masas de células se cultivan en un medio de cultivo de plantas desprovisto de reguladores del crecimiento de las plantas y opcionalmente incluyendo carbón activado. Se cree que esta fase facilita la maduración posterior, debido al menor contenido o ausencia de auxina y citoquinina en el medio de cultivo y su posible eliminación por carbón activado.

Se ha demostrado que varios factores tienen un efecto estimulante general sobre la frecuencia de maduración del embrión. y/o sobre la calidad de los embriones maduros formados. El factor más importante es el ácido abscísico, regulador natural del crecimiento de las plantas. Este compuesto o análogos o derivados del mismo se incluyen en casi todos los protocolos para la maduración de embriones somáticos de coníferas.

Otro factor de importancia para el procedimiento de maduración es la osmolalidad del medio de cultivo vegetal. Se ha demostrado que aumentar esto mediante la adición de un osmótico no penetrante como PEG-4000 (Polietilenglicol-4000) mejora especialmente la calidad de los embriones maduros. Se sospecha que la mejoría se debe a un aumento del nivel de triacilglicéridos en los embriones maduros. Los triacilglicéridos se depositan en las células durante la maduración de los embriones cigóticos y se utilizan como fuente de energía para la germinación. PEG-4000 o compuestos similares se incorporan de forma rutinaria en los medios de maduración.

En la gran mayoría de las coníferas, la sacarosa se utiliza como única fuente de carbohidratos para la etapa de maduración. Sin embargo, hay informes de que, en especial, la maltosa puede dar resultados superiores. Esto se ha informado para Pinus spp (Patente de Estados Unidos N.° 5.187.092) y para Abies nordmanniana (Norgaard, 1997). La inclusión de una auxina en el medio de maduración puede estimular tanto el número de embriones somáticos maduros formados como su calidad.

Se sabe que la capacidad de los cultivos embriogénicos establecidos para madurar disminuye con la edad. Para algunas especies, especialmente los miembros del género Pinus, la disminución es muy rápida, es decir, en unos meses. Los cultivos de varios otros géneros como Picea, Larix y Abies son más estables a largo plazo, pero en la mayoría de los casos, se observa algún tipo de disminución, ya sea como una frecuencia de maduración reducida o como un requisito para períodos de maduración más largos o una mayor concentración de agentes de maduración. como el ácido abscísico.

El desarrollo de embriones somáticos a partir de coníferas se describe, por ejemplo, en von Arnold y Clapham 2008. En la Figura 1 se muestra un dibujo general de las diferentes etapas del desarrollo temprano de embriones somáticos en coníferas, que es un dibujo del desarrollo de la picea de Noruega (Picea abies) de von Arnold y col. 2016.

Los embriones somáticos que se van a desarrollar en plantas según el procedimiento de la presente invención deben ser embriones cotiledonarios completamente maduros. Dichos embriones tienen en general 4-5 mm de largo, mostrando pequeños cotiledones, típicamente 2-5 o más, y una radícula (primordios de la raíz), y tienen un diámetro en el centro del tallo de 1 mm. Esta etapa corresponde al tipo 7 como se muestra en el dibujo de la Figura 1 y en la Figura 2. Así, los embriones somáticos de esta etapa son adecuados para someterse a las condiciones de crecimiento de la etapa (a) del procedimiento de la invención como se describe más adelante.

El procedimiento de la presente invención comprende las siguientes etapas:

a) Someter embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros a 2°C - 7°C durante 8-16 semanas b) Recoger las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz de 70 - 300 pmol/m2s; mediante el uso de luz LED durante al menos 3 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

El crecimiento de los embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros en las condiciones establecidas en la etapa a) inducirá y promoverá el desarrollo de la raíz.

En la etapa a) anterior, la temperatura puede ser de 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C o 7°C. La temperatura también puede variar ligeramente, por ejemplo, de 3°C a 7°C durante el tratamiento. La temperatura preferida es un intervalo de temperatura de 2°C a 5°C tal como 2°C, 3°C o tal como la temperatura más preferida de 4°C.

Es bien conocido en la técnica que, en la práctica, la temperatura exacta establecida en una determinada instalación de crecimiento, como una cámara de crecimiento, una cabina de crecimiento o una sala de crecimiento, puede variar ligeramente dependiendo de la instalación de crecimiento específica. Además, la incertidumbre de las mediciones de temperatura depende de los medios específicos aplicados para medir la temperatura. Por tanto, las temperaturas mencionadas como aplicables en la etapa a) del presente procedimiento pueden en la práctica desviarse ligeramente hasta ± 0,5°C o incluso hasta ± 1°C, dependiendo de la instalación de crecimiento específica y los medios de medición de temperatura.

En la etapa a) anterior, la duración de algunos embriones completamente maduros a temperaturas de 2 a 7°C depende de la tasa de desarrollo de cada embrión individual y de la especie de Abies específica. Este período de tratamiento generalmente varía de 8 a 16 semanas, para la mayoría de los embriones el período de tratamiento será de 12 a 14 semanas, preferiblemente de 8 a 12 semanas, como de 9 a 11 semanas.

En la etapa a) anterior, los embriones completamente maduros se cultivan preferiblemente en la oscuridad durante todo el período. Las plantas pueden cultivarse en placas de Petri que comprenden aproximadamente 40 embriones cotiledonarios completamente maduros por placa. El medio de crecimiento podría ser cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Un ejemplo de un sustrato adecuado es el sustrato 51.21 como se describe en los ejemplos 3 y 9.

Después de 8 semanas, los embriones completamente somáticos cultivados bajo las condiciones de la etapa (a) en el procedimiento mencionado anteriormente deben ser revisados para el desarrollo de raíces. Los embriones somáticos son ahora pequeñas plántulas y se deben seleccionar las adecuadas para el crecimiento en las condiciones de la etapa (b). Como se mencionó anteriormente, el momento apropiado para mover las pequeñas plántulas a la etapa (b) depende de la especie, líneas de clones/células y también en la plántula individual.

Los embriones somáticos/pequeñas plántulas deben revisarse durante un período de hasta 14 o incluso 16 semanas para seleccionar y recolectar todas las pequeñas plántulas adecuadas para un mayor crecimiento. La mayoría de los embriones somáticos se habrán convertido en pequeñas plántulas que tienen la etapa de desarrollo adecuada para transferirlas a la etapa (b) después de 8 a 12 semanas, como de 9 a 11 semanas. Sin embargo, no todos los embriones somáticos completamente maduros que han sido sometidos a 2 - 7°C durante 8 a 16 semanas según la etapa (a) habrán desarrollado una raíz después de la etapa (a) a pesar del tratamiento beneficioso, pero el número de embriones somáticos/pequeñas plántulas que han sobrevivido y desarrollado una raíz serán más altos en comparación con los embriones somáticos completamente maduros que no han crecido en las condiciones establecidas en la etapa (a). Las pequeñas plántulas de la etapa (a) que se seleccionan después de 8 a 16 semanas como aptas para el crecimiento en las condiciones establecidas en la etapa (b) deben haber desarrollado una raíz y cotiledones que ahora miden entre 1 y 5 mm de largo y el el hipocótilo debe tener unos 5-15 mm de largo. En la Figura 3 se muestran ejemplos de plántulas de esta etapa.

En la etapa (b), las pequeñas plántulas seleccionadas de la etapa (a) que tienen la etapa de desarrollo aplicable se cultivan en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para las plantas; a intensidades de luz de 70 - 300 pmol/m2s mediante el uso de luz LED para inducir y promover la formación de brotes.

Las condiciones de crecimiento establecidas en las etapas a) y b) mejoran la tasa de supervivencia de los embriones somáticos completamente maduros que pueden convertirse en embriones viables. Por tanto, el número de embriones que se pueden obtener a partir de embriones somáticos completamente maduros mejora enormemente cuando los embriones somáticos y posteriormente las pequeñas plántulas se cultivan en las condiciones establecidas en las etapas a) y b).

En la etapa (b), el sustrato sin azúcar podría ser cualquier sustrato adecuado conocido en la técnica que no comprenda una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para las plantas. Las fuentes de carbohidratos como el azúcar, en particular la sacarosa, la glucosa, la fructosa, la galactosa, la maltosa, la lactosa o el almidón, suelen estar presentes o añadidas a los sustratos y medios para el crecimiento de cultivos de tejidos, embriones y plantas. La fuente de carbohidrato se añade al sustrato para ser absorbida por la planta y utilizada por la planta para el crecimiento y como fuente de energía para, por ejemplo, la fotosíntesis o la respiración. El sustrato o medio usado en la etapa b) no debe comprender tal fuente de carbohidratos dedicada al crecimiento y fuente de energía de las plantas. Por tanto, se puede utilizar cualquier sustrato adecuado conocido en la técnica donde el sustrato se prepara en una versión donde se omite la adición de una o más de una fuente o fuentes de carbohidratos accesibles para las plantas normalmente presentes en el sustrato. Un ejemplo de un sustrato adecuado es el sustrato 47.07 como se describe en los Ejemplos 4 y 10.

Las pequeñas plántulas de la etapa (b) deben cultivarse bajo la luz de una fuente LED. Cualquier fuente de LED capaz de proporcionar intensidades de luz de 50 a 400 pmol/m2s serían aplicables. En relación con el presente procedimiento, las intensidades de luz de 70 - 300 pmol/m2s deben estar presentes/ser medidas cerca de los cotiledones de las pequeñas plántulas. Si las pequeñas plántulas se cultivan en cajas con tapa, se deben ajustar las intensidades de luz para remediar cualquier pérdida de luz debido a la presencia de la tapa. Las intensidades de luz aplicadas en la etapa (b) podrían ser de 70 pmol/m2s, 100 pmol/m2s, 150 pmol/m2s, 200 pmol/m2s, 250 pmol/m2so 300 pmol/m2s. La intensidad de luz más beneficiosa puede variar entre diferentes especies del género Abies, pero las intensidades de luz más adecuadas se seleccionan generalmente dentro del intervalo de 100 pmol/m2s - 300 pmol/m2s, preferiblemente dentro del intervalo de 150 pmol/m2s - 250 pmol/m2s como 175 pmol/m2s - 225 pmol/m2s.

En la etapa (b) las pequeñas plántulas se cultivan opcionalmente en períodos de 16 h de luz/8 h de oscuridad, 18h de liz/6h de oscuridad, 20h de luz/4h de oscuridad, 22h de luz/2h de oscuridad o en un período de luz de 24 horas. Lo más preferido es un período de luz de 24 horas.

En la etapa (b), las pequeñas plántulas se pueden cultivar a cualquier temperatura adecuada, por ejemplo, de 10°C a 25°C, la mayoría de las pequeñas plántulas se beneficiarían de crecer a temperaturas de 12°C a 18°C, por ejemplo, a 15°C.

En la etapa (b), las pequeñas plántulas se pueden cultivar opcionalmente en cajas de plástico transparente o en otros medios adecuados. Preferiblemente, las condiciones de crecimiento se mantienen estériles. Se ha descubierto que cuando las pequeñas plántulas se cultivan en cajas de plástico con tapa, es beneficioso que la caja no sea completamente hermética. Por ejemplo, se puede quitar parte de la tapa o la tapa puede comprender uno o más orificios que permiten que el aire entre y salga de la caja. La humedad relativa óptima del aire puede variar, pero para la mayoría de las pequeñas plántulas se ha demostrado que es adecuada una humedad relativa del aire de alrededor del 90 %. Aquí se encontró que cuando se cultivan las pequeñas plántulas en cajas de plástico con tapa, se mantiene abierta parte del área de la tapa o se tiene un filtro que permite el movimiento de aire hacia adentro y hacia afuera, correspondiente a aproximadamente 10 - 30 % del área de la tapa aumentó significativamente la tasa de supervivencia de las pequeñas plántulas. El movimiento del aire también podría asegurarse por otros medios que no sean a través de un orificio o filtro en la tapa, por ejemplo, asegurando el movimiento del aire a través de los lados o el fondo de la caja, y ajustándose al tamaño de la caja aplicada.

La duración de la etapa (b) es de al menos tres semanas hasta que las plántulas han alcanzado una etapa (la etapa de embrión) en la que han desarrollado nuevos cotiledones, que también se han vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie 'normal' de una aguja de conífera completamente desarrollada. La altura total de la plántula/embrión por encima de la raíz varía y depende de la especie de Abies, pero en la mayoría de las especies será de 8 a 22 mm. La longitud de la raíz también es variable, pero en la mayoría de las especies de Abies estará en el intervalo de 1 a 30 mm. El período mínimo requerido para la mayoría de las plantas es de 4 a 8 semanas. A continuación, las pequeñas plántulas se han convertido en embriones con nuevos coltiledones, que también se han vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie "normal" de una aguja de conífera completamente desarrollada. La altura total de los embriones por encima de la raíz es generalmente de 8 a 22 mm. La longitud de la raíz es variable entre los embriones y las especies, pero normalmente está en el intervalo de 1 a 30 mm. En la Figura 4 se muestran ejemplos de plantas de esta etapa. La mayoría de las pequeñas plántulas habrán alcanzado esta etapa de crecimiento en 4 a 8 semanas; la mayoría habrá alcanzado esta etapa después de 6 semanas.

Una vez que los embriones hayan terminado de crecer en las condiciones establecidas en la etapa (b), estarán listos para su posterior desarrollo y crecimiento en plantas en la etapa c). Los embriones en la etapa c) se pueden hacer crecer como plantas bajo cualquier condición adecuada conocida en la técnica. Los embriones pueden transferirse inicialmente a cepellones individuales y transferirse a viveros comerciales y posteriormente replantarse cuando corresponda hasta que las plantas hayan alcanzado un tamaño adecuado para la tala o el corte de vegetación, por ejemplo, cuando las plantas hayan alcanzado un tamaño adecuado para un árbol de Navidad.

Con el fin de reducir el tiempo, la energía y otros recursos necesarios para que las plantas se conviertan en árboles enteros, las plantas obtenidas con el procedimiento descrito anteriormente, es decir, las plantas que han finalizado con éxito la etapa (a) y la etapa (b) pueden cultivarse posteriormente. en la etapa (c) en condiciones que impidan que las plantas entren en el período de inactividad habitual de interrupción de la temporada de crecimiento. Los embriones obtenidos en la etapa (b) mediante el presente procedimiento han demostrado ser particularmente receptivas para crecer en condiciones que evitan la latencia.

En una realización de la presente invención, el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros del género Abies comprende:

a) Someter los embriones somáticos completamente maduros a 3 - 7°C durante 8 - 14 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 150 - 250 pmol/m2s; durante 4 - 8 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

En una realización más preferida de la presente invención, el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros del género Abies comprende:

a) Someter los embriones somáticos completamente maduros a 3 - 5°C durante 12 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 175 - 225 pmol/m2s; durante 4 - 8 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

En otra realización preferida de la presente invención, el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros del género Abies comprende:

a) Someter embriones somáticos completamente maduros a 2°C - 5°C durante 9 a 11 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 175 - 225 pmol/m2s; durante 6 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

En otra realización preferida de la presente invención, el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros del género Abies comprende:

a) Someter los embriones somáticos completamente maduros a 4°C durante 12 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 200 pmol/m2s; durante 4 - 8 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

En una realización preferida de la invención, los embriones somáticos de coniferas completamente maduros del género Abies se seleccionan de entre las siguientes especies de Abies: Abies alba, Abies amabilis, Abies balsamea, Abies beshanzuensis, Abies bifolia, Abies borisii-regis, Abies bornmülleriana, Abies bracteata, Abies cephalonica, Abies chensiensis, Abies cilicica, Abies concolor, Abies delavayi, Abies densa, Abies duragensis, Abies equi-trojani, Abies fabri, Abies fargesii, Abies fanjingshanensis, Abies firma, Abies flinckii, Abies forrestii, Abies fraseri, Abies guatemalensis, Abies hickelii, Abies holophylla, Abies homolepis, Abies kawakamii, Abies koreana, Abies lasiocarpa, Abies lowiana, Abies magnifica, Abies mariesii, Abies nebrodensis, Abies nephrolepis, Abies nordmanniana, Abies numidica, Abies pardei, Abies pindrow, Abies pinsapo, Abies procera (Abies nobilis), Abies recurvata, Abies religiosa, Abies sachalinensis, Abies sibirica, Abies spectabilis, Abies squamata, Abies veitchii, Abies vejarii, Abies yuanbaoshanensis, Abies ziyuanensis, , cualquier híbrido obtenido de hibridación entre especies entre cualquiera de las especies del género Abies.

En una realización preferida de la invención adicional, los embriones somáticos de coniferas completamente maduros del género Abies se seleccionan de entre Abies alba, Abies nebrodensis, Abies borisii-regis, Abies cephalonica, Abies nordmanniana, Abies bornmülleriana, Abies pinsapo, Abies numidica, Abies cilicica, y cualesquiera híbridos obtenidos de la hibridación entre especies entre cualquiera de las especies europeas del género Abies.

En realizaciones particularmente preferidas, los embriones somáticos completamente maduros son de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) o de Abies bornmülleriana y cualquier híbrido obtenido por hibridación entre especies entre estas especies o entre estas especies y cualquier otra especie del género Abies.

En una realización, los embriones somáticos completamente maduros tales como los embriones somáticos de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) o de Abies bornmülleriana se derivan de embriones cigóticos extirpados. En una realización más preferida de la invención, los embriones somáticos completamente maduros tales como los embriones somáticos de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) o de Abies bornmülleriana se derivan de embriones cigóticos extirpados obtenidos por el procedimiento descrito en US 6.897.065.

En una realización de la invención, los embriones somáticos tales como los embriones somáticos de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) o de Abies bornmülleriana se derivan de embriones cigóticos extirpados y cuando se cultivan en plantas, el procedimiento comprende:

a) Someter los embriones somáticos completamente maduros a 3 - 7°C durante 8 - 14 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 100 - 300 pmol/m2s; durante al menos tres semanas c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

En una realización más preferida de la invención, los embriones somáticos tales como los embriones somáticos de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) o de Abies bornmülleriana se derivan de embriones cigóticos extirpados y se han hecho crecer como plantas, mediante:

a) Sometiendo los embriones somáticos completamente maduros a 3°C - 5°C durante 12 semanas

b) Seleccionando las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 150 - 250 pmol/m2s; durante 4 - 8 semanas c) Seleccionando los embriones obtenidos en la etapa b) que han desarrollado nuevos cotiledones y haciéndolos crecer como plantas

En un aspecto de la realización preferida de la invención, los embriones somáticos tales como los embriones somáticos de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) o de Abies bornmülleriana se derivan de embriones cigóticos extirpados y se han hecho crecer como plantas, mediante:

a) Someter embriones somáticos completamente maduros a 2°C - 5°C durante 9 a 11 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 175 - 225 pmol/m2s; durante 6 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

En una más una realización preferida de la presente invención, los embriones somáticos tales como los embriones somáticos de Abies nordmanniana (abeto de Nordmann) o de Abies bornmülleriana se derivan de embriones cigóticos extirpados y se han hecho crecer como plantas, mediante:

a) Someter los embriones somáticos completamente maduros a 4°C durante 12 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para la planta; a intensidades de luz LED de 175 - 225 pmol/m2s; durante 4 - 8 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

Cuando se usa en esta invención, "cultivo de células somáticas" significa un cultivo de células formado in vitro a partir de células vegetativas (somáticas) por división mitótica de células. Los cultivos de células somáticas se pueden generar a partir de tejido derivado sexualmente (tejido cigótico) o de tejido asexual/vegetativo. Ejemplos de tejidos adecuados incluyen: megagametofitos inmaduros, embriones cigóticos extirpados, ápices de brotes vegetativos. Cuando se usa en esta invención, "embrión somático" significa un embrión formado in vitro a partir de células vegetativas (somáticas) por división mitótica de células. Los embriones somáticos en etapa temprana son morfológicamente similares a embriones cigóticos inmaduros. Embriones somáticos se pueden generar a partir de tejido derivado sexualmente (tejido cigótico) o de tejido asexual/vegetativo. Ejemplos de tejidos adecuados incluyen: megagametofitos inmaduros, embriones cigóticos extirpados, ápices de brotes vegetativos.

Cuando se usa en esta invención, "embriogénesis somática" es el procedimiento de iniciación y desarrollo de embriones in vitro a partir de células y tejidos somáticos.

Cuando se usa en esta invención, "embrión somático completamente maduro" significa un embrión somático que mide aproximadamente 4-5 mm de largo, muestra pequeños cotiledones, típicamente 2-5 o más, y un primordio de raíz, y tiene un diámetro en el centro del tallo de aproximadamente 1 mm. Esta etapa corresponde al tipo 7 como se muestra en el dibujo de la Figura 1 y en la Figura 2.

Cuando se usa en esta invención, "clon" significa un grupo de líneas celulares, ES o plantas genéticamente idénticas obtenidas del mismo tejido cigótico o del mismo tejido vegetativo.

Cuando se usa en esta invención, "embrión cigótico" significa un embrión derivado de la fusión sexual de células gaméticas o de un embrión de semilla. En las coníferas, el embrión cigótico se sitúa en el centro de la semilla rodeado por el megagametofito (que sirve como medio nutricional durante la germinación), que es el gametofito femenino. Cuando se usa en esta invención, una "pequeña plántula" significa un embrión cotiledonario completamente maduro que ha desarrollado además una raíz a partir de la radícula, que tiene cotiledones de 1 a 5 mm de largo y un hipocótilo de aproximadamente 5 a 15 mm de largo.

Cuando se usa en esta invención, "embrión" significa una pequeña plántula que se ha convertido en un embrión que ha desarrollado más cotiledones que la pequeña plántula, y los cotiledones se han vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie "normal" de una aguja de conífera completamente desarrollada. El tamaño real puede depender de la especie, pero en la mayoría de las especies la altura total del embrión por encima de la raíz es de 8 a 22 mm. La longitud de la raíz es variable pero generalmente en el intervalo de 1 a 30 mm.

Cuando se usa en esta invención, un "embrión bien desarrollado" o "un buen embrión" significa un embrión (como se describió anteriormente) que ha crecido más durante 6-8 semanas, que tiene al menos una roseta de agujas en su mayoría verdes.

Cuando se usa en esta invención, los embriones somáticos que han "desarrollado una raíz" significa que el embrión somático completamente maduro ha desarrollado una raíz claramente visible a partir de la radícula.

Cuando se usa en esta invención, "radícula" significa tejido que se ha desarrollado a partir de los primordios de la raíz de un embrión somático completamente maduro. La radícula es la etapa de desarrollo inicial de la raíz, que se desarrolla en el extremo inferior del hipocótilo.

Cuando se usa en esta invención, "hipocótilo" significa la parte del tallo debajo de los cotiledones en un embrión de planta, que eventualmente lleva las raíces.

Cuando se usa en esta invención, "cotiledones" significa las primeras hojas del embrión somático que forman las primeras hojas fotosintéticas. "Nuevos cotiledones" significa cotiledones adicionales que se han desarrollado después de los cotiledones presentes en el embrión somático completamente maduro. En relación con el procedimiento de la presente invención, "nuevos" cotiledones "son todos y cada uno de los cotiledones desarrollados mientras los embriones cotiledonarios completamente maduros se someten a la etapa (a), es decir, 2-7 °C durante 8 - 16 semanas. Cuando se usa en esta invención, "raíz" significa tejido que se ha desarrollado a partir de la radícula.

Cuando se usa en esta invención, "brote" se refiere a 1) la parte aérea del embrión que se ha desarrollado a partir de la pequeña plántula. En relación al procedimiento de la presente invención, este significado de "brote" se refiere a la parte aérea de la planta que se desarrolla mientras las pequeñas plántulas son sometidas a la etapa (b), es decir, mientras crecen las pequeñas plántulas en un sustrato que no comprenden una concentración significativa de una fuente de carbohidratos accesible para las plantas; a intensidades de luz de 70 - 330 pmol/m2s mediante el uso de luz LED durante al menos tres semanas. Alternativamente, el término "brote" se refiere a 2) cualquier nuevo crecimiento de las partes aéreas de un embrión, una planta pequeña o de una planta. Estas partes incluyen el tallo, las ramas jóvenes, las hojas y las yemas. En relación con el procedimiento de la presente invención, este significado del término "brote" es cualquier desarrollo y crecimiento de las partes aéreas del embrión, planta pequeña o planta mientras crece en la etapa (c), es decir, en cualquier condición adecuada conocida en la técnica, incluida la etapa de cepellones y el crecimiento en viveros comerciales, las etapas en las que las plantas se replantan opcionalmente y se cultivan al aire libre, como en un campo o en un bosque, hasta que las plantas hayan alcanzado un tamaño adecuado para la tala o el corte de vegetación, por ejemplo, cuando las plantas han alcanzado un tamaño adecuado para un árbol de Navidad. Cuando se usa en esta invención, "yema" significa un brote rudimentario condensado. La yema es un cuerpo compacto que tiene un eje con un punto de crecimiento delicado, nudos y entrenudos no expandidos muy cortos y hojas jóvenes muy apiñadas.

Cuando se usa en esta invención, "fuente de carbohidratos accesible para plantas" significa cualquier fuente de carbohidratos, como un monosacárido, disacárido, oligosacárido o polisacárido, incluidos azúcares como sacarosa, glucosa, fructosa, galactosa, maltosa, lactosa o almidón que se pueda absorber. por la planta y utilizado por la planta para el crecimiento como fuente de carbono y energía para, por ejemplo, la fotosíntesis o la respiración. "Una concentración significativa" de una fuente de carbohidratos accesible para plantas significa que se ha agregado una fuente de carbohidratos al medio con el propósito de agregar una fuente de carbohidratos a una concentración donde las plantas puedan absorberlos y usarlos como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración.

Cuando se usa en esta invención, sustrato "sin azúcar" significa cualquier sustrato o medio que no comprende una concentración significativa de un carbohidrato accesible para las plantas.

Cuando se usan en esta invención, "sustrato" y "medio" se usan indistintamente.

Cuando se usa en esta invención, "intensidades de luz" se refiere a la intensidad de luz medida como un flujo de fotones fotosintéticos (en la banda de onda 400-700nm) en pE/m2s (micro Einstein por metro cuadrado y segundo) o en pmol/m2s (micro moles por metro cuadrado y segundo). Estas unidades de flujo de fotones fotosintéticos se corresponden entre sí y pueden usarse indistintamente. Las intensidades de luz se pueden medir con cualquier equipo estándar para medir PAR (radiación fotosintéticamente activa), como un medidor de luz Li-Cor Li250a y un censor cuántico Licor.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: Un dibujo de las diferentes etapas del desarrollo temprano de embriones somáticos en la picea de Noruega de von Arnold y col. 2016. Las etapas de desarrollo de la picea de Noruega son similares a las etapas de desarrollo en otras coniferas y se utiliza a menudo como un "sistema modelo".

Figura 2: Embriones cotiledonarios completamente maduros de Abies nordmannianapor ES. Estos tienen en general 4-5 mm de largo, mostrando pequeños cotiledones, típicamente 2-5 o más, y una radícula (primordios de la raíz), y tienen un diámetro en el centro del tallo de 1 mm.

Figura 3: Pequeñas plántulas de Abies nordmanniana por ES después de crecer en condiciones de inducción de raíces de 3 a 7°C durante 8 a 14 semanas. Los embriones cotiledonarios/pequeñas plántulas han desarrollado una raíz, los cotiledones miden 1-5 mm de largo y el hipocótilo mide aproximadamente 5-15 mm de largo.

Figura 4: Embriones de Abies nordmanniana por ES después de crecer en condiciones de inducción de raíces de 3 -7°C durante 8 - 14 semanas y posteriormente en condiciones de inducción de brotes en un sustrato sin azúcar a intensidades de luz de 175 - 225 pmol/m2s mediante el uso de luz LED a 15°C durante 4 a 6 semanas. Los embriones están listos para ser trasplantados en pequeños cepellones de turba.

Figura 5: Embriones bien desarrollados de Abies nordmanniana por ES en pequeñas macetas de cepellón de 025 mm después de haber crecido en condiciones de inducción de raíces de 3 - 7°C durante 8 - 14 semanas y posteriormente en condiciones de inducción de brotes en un sustrato sin azúcar a intensidades de luz de 175 - 225 pmol/m2s mediante el uso de luz LED a 15°C durante 4 a 6 semanas seguido de crecimiento durante 6 a 8 semanas a 25°C en períodos de 24 horas de luz LED blanca de 100 a 400 pmol/m2s.

Figura 6: Pequeñas plantas de Abies nordmanniana por ES que crecen en un vivero. Las plantas se han cultivado en condiciones de inducción de raíces de 3 a 7°C durante 8 a 14 semanas y, posteriormente, en condiciones de inducción de brotes en un sustrato sin azúcar a intensidades de luz de 175 a 225 pmol/m2s mediante el uso de luz LED a 15°C durante 4 a 6 semanas seguido de crecimiento durante 6 a 8 semanas a 25°C en períodos de 24 horas de luz LED blanca de 100 a 400 pmol/m2s, seguidos de 1-2 años de cultivo en invernadero. Las plantas todavía necesitan una temporada de crecimiento más antes de ser plantadas afuera, por ejemplo, en un campo para la producción de árboles de Navidad.

Figura 7: Diagrama que muestra el impacto de la temperatura (eje x) en el porcentaje de plantas (eje y) que se han desarrollado de una parte superior (brote) y un desarrollo continuo de las raíces, respectivamente. Las plantas son Abies nordmanniana por ES después de crecer en condiciones de inducción de raíces de 3 - 7°C durante 8 - 14 semanas y posteriormente en condiciones de inducción de brotes en un sustrato sin azúcar a intensidades de luz de 175 - 225 pmol/m2s mediante el uso de luz LED a temperaturas de 10°C, 12,1°C, 14,3°C, 16,4°C, 18,6°C, 20,7°C, 22,9°C o 25°C, respectivamente, durante 4 a 6 semanas.

Figura 8: Diagrama que muestra el porcentaje de embriones enraizados de 3459 embriones de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana que se han cultivado a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C en la oscuridad durante 8 a 11 semanas.

Figura 9: Gráfico que muestra el porcentaje de embriones bien desarrollados de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana que se han cultivado a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C en la oscuridad durante 8 a 11 semanas seguido de crecimiento en luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 y 400 pmol/m2s durante 8 semanas a 15°en períodos de luz de 24 h seguidos de un crecimiento adicional durante 8 semanas a 25°C en luz LED blanca de 175­ 195 pmol/m2s en períodos de luz de 24 h en función del porcentaje de embriones enraizados obtenidos después del crecimiento a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C en la oscuridad durante 8 a 11 semanas.

Figura 10: Gráfico que muestra el porcentaje de embriones enraizados de clones seleccionados de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana que se han cultivado a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C en la oscuridad durante 8 a 11 semanas.

Figura 11: Gráfico que muestra el porcentaje de embriones enraizados de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana en función de la temperatura de enraizamiento aplicada (2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C en la oscuridad durante 8 a 11 semanas) para obtener las pequeñas plántulas; y el porcentaje de buenos embriones de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana obtenidos en función de la temperatura aplicada (2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C en la oscuridad durante 8 a 11 semanas) para obtener las pequeñas plántulas que posteriormente habían crecido en luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 pmol/m2s durante 8 semanas a 15°en períodos de luz de 24 h seguidos de un crecimiento adicional durante 8 semanas a 25°C en luz LED blanca de 175-195 pmol/m2s en periodos de luz de 24 h.

Figura 12: Gráfico que muestra el porcentaje de embriones enraizados que tienen una longitud de raíz superior a 5 mm en función del número de semanas sometidas a crecimiento en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, respectivamente.

Figura 13: Gráfico tridimensional que muestra el porcentaje de embriones enraizados acumulados en función de la temperatura de enraizamiento y en función del número de semanas de crecimiento hasta enraizamiento, cuando se desarrollan embriones completamente maduros de Abies nordmanniana y Abies bornmümlleriana en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, respectivamente, durante 8, 9, 10 u 11 semanas.

Figura 14: Gráfico que muestra el porcentaje acumulado de enraizamiento embrionario para clones seleccionados de Abies nordmanniana y Abies bornmulleriana en función del número de semanas sometidas a crecimiento en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C durante 8, 9, 10 u 11 semanas, respectivamente.

Figura 15: Diagrama que muestra el porcentaje de embriones enraizados en función del puntaje inicial de calidad embrionaria para el número total de embriones enraizados obtenidos después del crecimiento en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C durante 8, 9, 10 u 11 semanas y para los embriones buenos obtenidos después del crecimiento en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C durante 8, 9, 10 u 11 semanas y posteriormente cultivado en luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 pmol/m2s durante 8 semanas a 15°en períodos de luz de 24 h seguidos de un crecimiento adicional durante 8 semanas a 25°C en luz LED blanca de 175-195 pmol/m2s en periodos de luz de 24 h.

Figura 16: Gráfico que muestra el porcentaje de embriones enraizados sometidos a crecimiento en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C durante 8 a 11 semanas para clones de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana en función del puntaje de calidad embrionaria inicial.

Figura 17: Gráfico que muestra el porcentaje de enraizamiento de embriones de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana de diferentes puntajes de calidad embrionaria en función de la temperatura de enraizamiento aplicada al crecer los embriones maduros en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, respectivamente, durante 8 a 11 semanas.

Figura 18: Gráfico que muestra el número de cotiledones en embriones de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana en función de la intensidad de luz LED pmol/m2s después de crecer con luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 pmol/m2s, respectivamente, durante 8 semanas a 15°C en períodos de luz de 24 h después del crecimiento inicial en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, durante 8 a 11 semanas.

Figura 19: Gráfico que muestra la longitud en mm de cotiledones en embriones de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana en función de la intensidad de luz LED pmol/m2s después de crecer con luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 pmol/m2s, respectivamente, durante 8 semanas a 15°C en períodos de luz de 24 h después del crecimiento inicial en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, durante 8 a 11 semanas.

Figura 20: Gráfico que muestra el porcentaje de embriones muertos de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana en función de la intensidad de luz LED pmol/m2s después de crecer con luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 pmol/m2s, respectivamente, durante 8 semanas a 15° en períodos de luz de 24 h seguidos de 8 semanas de crecimiento en cepellones a 25°C con una intensidad de luz promedio de 175-195 pmol/m2s en períodos de luz de 24 h; después del crecimiento inicial de los embriones completamente maduros en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, durante 8 a 11 semanas.

Figura 21: Gráfico que muestra el porcentaje de embriones buenos de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana en función de la intensidad de luz LED pmol/m2s después de crecer con luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 |jmol/m2s, respectivamente, para 8 semanas a 15° en períodos de luz de 24 h seguidas de 8 semanas de crecimiento en cepellones a 25°C en luz LED blanca con una intensidad de luz promedio de 175-195 jmol/m2s en períodos de luz de 24 h; después del crecimiento inicial de los embriones completamente maduros en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, durante 8 a 11 semanas.

Figura 22: Gráfico tridimensional que muestra el porcentaje de embriones buenos exitosos obtenidos del total de embriones completamente maduros de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana obtenidos del crecimiento de los embriones completamente maduros en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C , 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, respectivamente, durante 8 a 11 semanas seguido de crecimiento con luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 jmol/m2s, respectivamente, durante 8 semanas a 15°en períodos de luz de 24 h y crecimiento adicional durante 8 semanas a 25°C en luz LED blanca de 175-195 jmol/m2s en períodos de luz de 24 h .; en función de la temperatura de enraizamiento y la intensidad de la luz LED jmol/m2s.

Figura 23: Gráfico tridimensional que muestra el porcentaje de embriones buenos exitosos obtenidos del total de embriones completamente maduros de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana obtenidos del crecimiento de los embriones completamente maduros en la oscuridad a 2°C, 4°C, 5°C , 8°C, 10°C, 15°C o 20°C, respectivamente, durante 8 a 11 semanas seguido de crecimiento con luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 400 jmol/m2s, respectivamente, durante 8 semanas a 15°en períodos de luz de 24 h y crecimiento adicional durante 8 semanas a 25°C en luz LED blanca de 175-195 jmol/m2s en períodos de luz de 24 h como una función de la temperatura de enraizamiento y el puntaje inicial de la calidad embrionaria.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de embriones somáticos de Abies nordmanniana

Se recolectaron conos de Abies nordmanniana de Ambrolauri, República de Georgia, y se limpiaron y enjuagaron con agua y se desinfectaron con fungicida y etanol. A continuación, los conos fueron almacenados a 5°C durante 60 días. Las semillas se aislaron del cono rompiendo el cono en pedazos y recolectando las semillas. Las semillas se colocaron en una solución de peróxido de hidrógeno al 35 % diluida 1:10 durante 3-5 minutos mientras se agitaba. A continuación, las semillas se retiraron a una solución suave Presept® (1 comprimido, 0,5 g, que comprendía trocloseno sódico en 1 litro de agua y dos gotas de detergente (Tween)) durante 24 horas mientras se aseguraba el acceso de oxígeno a la solución mediante agitación. Las semillas se enjuagaron en etanol al 70 % durante 3 minutos. Esto también separará las semillas vitales de las semillas muertas; las semillas vitales se hundirán mientras que las semillas muertas fluyen. Solo se recolectaron las semillas vitales para su posterior procesamiento. Las semillas vitales se retiraron a una solución de Precept (1 comprimido en 0,5 L de agua esterilizada y 3-4 gotas de detergente (Tween)) y se colocaron en un agitador durante 10 minutos. A continuación, las semillas se enjuagaron 3 veces en agua estéril en condiciones estériles. Si las semillas se han almacenado durante mucho tiempo o si parecen sucias, se pueden sumergir brevemente en etanol al 96 % y flamear.

Las semillas limpias se abrieron y se extrajo el embrión de la semilla. Cada embrión se colocó en una placa de Petri que comprendía medio de crecimiento 29.4 para iniciar el cultivo de células somáticas. El embrión y el cultivo de inicio se mantuvieron y se cultivaron en la oscuridad a 20°C durante 8-12 semanas hasta que hubo suficiente cultivo disponible. A continuación, los cultivos se hicieron crecer a 20°C en la oscuridad durante 10 a 16 semanas más y se volvieron a colocar en medio fresco cada dos semanas.

Medio 29,4:1 litro

R iliz r r rin r m i 2 4

Las muestras del cultivo de células somáticas se pueden preparar opcionalmente para la crioconservación o se pueden usar directamente para el desarrollo y la maduración del embrión.

Si las muestras fueron criopreservadas, se colocaron aproximadamente 2 gramos de tejido de un genotipo específico en una botella estéril y se agregaron 20 g de medio 29.4 y 1 ml de Sorbitol. Los cultivos se colocaron en un agitador proporcionando agitación constante para una aireación adecuada durante 24 horas a 20°C y se añadió 1 ml de sorbitol. Después de 48 horas, las muestras se colocaron a 0°C durante al menos 30 min. A continuación, se añadió 1 ml de DMSO a cada botella. La solución se dividió en 12 tubos y se congeló lentamente de 0,5°C a -35°C antes de ser transferida a un criodepósito a menos 180°C.

Cuando fue aplicable, los cultivos de células somáticas se descongelaron y se inició el desarrollo de embriones somáticos.

Las muestras se descongelaron en agua a 40°C, se desinfectaron en etanol y se vertieron sobre papel de filtro en una placa de Petri con medio 29.4. Después de 1 hora, los papeles de filtro con cultivos se trasladaron a una nueva placa de Petri con medio 29.4, y nuevamente después de 18 horas, los papeles de filtro con cultivos se colocaron en una nueva placa de Petri que contenía un medio de crecimiento, como el medio 29.4.

Los cultivos se cultivan a 20°C y se comprobó la viabilidad de los cultivos cada 2a semana. Después de 6 semanas, se seleccionan cultivos viables para el desarrollo y maduración del embrión. Cada 2a semana, los cultivos se trasladaron a medio fresco 29.4. Después de otras 6-8 semanas, los cultivos estaban listos.

Ejemplo 2: Desarrollo y maduración embrionaria de Abies Nordmanniana

Se seleccionaron cultivos de células somáticas de dos genotipos diferentes de Abies Nordmanniana obtenidos del ejemplo 1 para el desarrollo y maduración del embrión.

Para cada muestra de cultivo de células somáticas, se añadieron 4 g de cultivo a 100 g de medio 29,4 y se mezclaron durante 25 segundos. A continuación, se dejaron las muestras durante 30 minutos y se eliminó el líquido sobrante hasta 30 ml. Se pipeteó un ml de la mezcla sobre papel de filtro en una placa de Petri que comprendía 15 ml de medio 49,53.

Medio 49,53:1 litro

ajustarse a pH 5,7

Recetas utilizadas ara ro orcionar medio 49,53

Los cultivos se cultivaron a 20°C en la oscuridad durante 3 semanas. Los papeles de filtro que contenían cultivos adecuados se trasladaron a un medio 29,75 desarrollado a 20 °C en la oscuridad durante 3 semanas.

Medio 29,75:1 litro

R iliz r r ri n r m i 2 7

El papel de filtro que contenía los cultivos adecuados se movió a continuación a un medio 49.53 durante 6 semanas para completar la maduración de los embriones. Posteriormente, el papel de filtro que contenía los embriones adecuados se retiró a medio 8,95 para engorde y se cultivó a 20°C en la oscuridad durante dos semanas con el fin de completar la maduración de los embriones.

Medio 8,95:1 litro

R iliz r r rin r m i :

Los embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros así obtenidos (como se muestra en la Figura 1, número 7) estaban ahora listos para crecer en condiciones que estimulan la formación de raíces.

Los embriones somáticos completamente maduros seleccionados para crecer en condiciones de inducción de raíces se caracterizaron por tener en general 4-5 mm de largo; teniendo típicamente 2-5 o más cotiledones pequeños; y una radícula (primordios de raíz); y un diámetro en el centro del tallo de aproximadamente 1 mm. En la Figura 2 se muestran ejemplos de embriones completamente maduros.

Ejemplo 3: Enraizamiento de embriones somáticos completamente maduros de Abies nordmanniana 300 embriones cotiledonarios completamente maduros (correspondientes a la etapa 7 como se muestra en la Figura 1 y en la Figura 2) de cada uno de los dos genotipos de Abies nordmanniana obtenidos del Ejemplo 2 se colocaron horizontalmente en medio de enraizamiento 51.21 en placas de Petri que comprendían 20-40 embriones por placa. Se cultivaron 60-80 embriones de cada genotipo durante 12-14 semanas en la oscuridad a una de las siguientes temperaturas, respectivamente: 2°C, 4°C, 3-7°C, 9°C y 10°C.

Medio 51,21:1 litro

Recetas utilizadas ara ro orcionar el medio 51,21:

Después de 8, 9, 10, 11, 12 y 16 semanas, se comprobó la formación de raíces en los embriones y se seleccionaron los embriones con una raíz bien desarrollada para un mayor crecimiento en las condiciones de inducción de brotes descritas en el Ejemplo 4.

Resultados:

Solo una pequeña parte de los embriones de ambos genotipos que se cultivaron a 2°C o 9°C desarrollaron una raíz después de 8 a 16 semanas.

Muy pocos de los embriones de ambos genotipos que se cultivaron a 10°C desarrollaron una raíz después de 8 a 16 semanas.

La mayoría de los embriones de ambos genotipos que se cultivaron a 4°C o a 3-7°C habían desarrollado una raíz después de 12 semanas, un número menor ya después de 8 semanas y un número menor solo después de 16 semanas.

En la Figura 3 se muestran ejemplos de pequeñas plántulas adecuadas que se eligieron para un mayor crecimiento en condiciones de inducción de brotes. Estas pequeñas plántulas se caracterizaron porque el embrión cotiledonario había desarrollado una raíz, los cotiledones tenían 1-5 mm de largo y el hipocótilo estaba con unos 5-15 mm de largo.

Ejemplo 4: Desarrollo de brotes en embriones somáticos enraizados de Abies nordmanniana

De cada uno de los dos genotipos de Abies nordmanniana, se seleccionaron de 30 a 40 pequeñas plántulas que habían desarrollado una raíz cuando se cultivaron en cada una de las condiciones de inducción de raíces descritas en el Ejemplo 3 para crecer en condiciones de inducción de brotes. La mayoría de las pequeñas plántulas seleccionadas se habían cultivado a 3-7°C durante 12-14 semanas como se describe en el Ejemplo 3, ya que esta era la temperatura a la que la mayoría de los embriones somáticos desarrollaron con éxito una raíz.

Como se menciona en el Ejemplo 3, las pequeñas plántulas incluidas en este experimento se caracterizaron por tener una raíz, los cotiledones tenían 1-5 mm de largo y el hipocótilo tenía aproximadamente 5-15 mm de largo.

Las pequeñas plántulas se trasladaron a cajas de plástico (Eco2box, ovaladas, Duchefa Bichemie) de 125 mm de largo x 65 mm de ancho x 80 mm de alto con tapa. La tapa estaba parcialmente abierta para el movimiento del aire. El % de humedad relativa se mantuvo por encima de 90.

Cada caja contenía 100 ml del medio sin azúcar 47.07.

Medio 47,07:1 litro

Recetas utilizadas ara ro orcionar medio 47,07:

Cada caja contenía aproximadamente de 20 a 30 pequeñas plántulas del mismo genotipo, que habían sido cultivadas bajo las mismas condiciones de inducción de raíces.

Las pequeñas plántulas se cultivaron durante 4 a 8 semanas a 15° en períodos de 24 h de luz LED blanca de 70 a 400 pmol/m2s.

Las intensidades de luz se midieron en la parte superior de cada caja lo más cerca posible de los cotiledones y, a partir de entonces, se tomó en cuenta el efecto reductor de luz de la tapa. Las intensidades de luz variaron de aproximadamente 100 a 400 pmol/m2s dependiendo de la distancia a la fuente de luz más cercana.

Resultados:

La mayoría de las pequeñas plántulas de ambos genotipos se habían convertido en embriones con nuevos cotiledones, que también se habían vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie "normal" de una aguja de conífera completamente desarrollada; después de 6 semanas. La altura total de estos embriones por encima de la raíz era generalmente de 8 a 22 mm y la raíz generalmente tenía una longitud en el intervalo de 1 a 30 mm. Ejemplos de tales embriones se muestran en la Figura 4.

Una cantidad menor de plantas de ambos genotipos había desarrollado las mismas características después de solo 4 a 5 semanas, y una cantidad menor de plantas de ambos genotipos había desarrollado las mismas después de 7 a 8 semanas.

La mayoría de las plantas de ambos genotipos que habían desarrollado nuevos cotiledones, que también se habían vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie 'normal' de una aguja de conífera completamente desarrollada después de 4 a 8 semanas, eran plántulas que habían sido sometidas a un crecimiento de 3 a 7° C en la etapa anterior de inducción de raíces

Ejemplo 5: Desarrollo de pequeñas plantas de Abies nordmanniana

Todos los embriones bien desarrollados con nuevos cotiledones obtenidos del Ejemplo 4 se transfirieron a macetas C7 Jiffy de cepellón de 025 mm de bosque pequeño para un crecimiento continuo y se cultivaron durante 6 a 8 semanas a 25°C en períodos de 24 horas de luz LED blanca de 100 a 400 pmol/m2s. El % de humedad relativa se redujo lentamente a 70 °C.

Casi todas las plantas sobrevivieron y posteriormente fueron seleccionadas para continuar con la producción de viveros.

En la Figura 5 se muestran ejemplos de embriones que crecen en plantas pequeñas en esta etapa.

Ejemplo 6: Producción en vivero de pequeñas plantas de Abies nordmanniana

Las plantas obtenidas del Ejemplo 5 se colocaron en macetas más grandes y se cultivaron en un invernadero durante 1-2 años hasta que se alcanzó un tamaño adecuado para crecer al aire libre (por ejemplo, en un campo para la producción de árboles de Navidad).

En la Figura 6 se muestran ejemplos de embriones comerciales de Abies nordmanniana obtenidos a partir de las condiciones descritas en el Ejemplo 5 y los Ejemplos anteriores. Las plantas de la Figura 6 todavía necesitan una temporada más antes de plantarlas.

Ejemplo 7: Preparación de embriones somáticos de Abies bornmülleriana

Se recolectaron conos de Abies bornmülleriana del huerto semillero danés FP.267 Kongs0re, al norte de Holb^k. Se seleccionaron árboles de semillas en un puesto de árboles de Navidad danés que se originó en el área cercana a Bolu Kokez en Turquía. Los conos se limpiaron y enjuagaron con agua y se desinfectaron con fungicida y etanol. A continuación, los conos fueron almacenados a 5°C durante 60 días.

Las semillas se aislaron del cono rompiendo el cono en pedazos y recolectando las semillas. Las semillas se colocaron en una solución de peróxido de hidrógeno al 35 % diluida 1:10 durante 3-5 minutos mientras se agitaba. A continuación, las semillas se retiraron a una solución suave de Presept® (1 comprimido que comprendía trocloseno sódico en 1 litro de agua y dos gotas de detergente (Tween)) durante 24 horas mientras se aseguraba el acceso de oxígeno a la solución mediante agitación. A continuación, las semillas se envolvieron brevemente en gasa para secarlas y posteriormente se enjuagaron en etanol al 70 % durante 3 minutos. Esto también separará las semillas vitales de las semillas muertas; las semillas vitales se hundirán mientras que las semillas muertas fluyen. Solo se recolectaron las semillas vitales para su posterior procesamiento. Las semillas vitales se retiraron a una solución de Precept (1 comprimido en 0,5 L de agua esterilizada y 3-4 gotas de detergente (Tween)) y se colocaron en un agitador durante 10 minutos. A continuación, las semillas se enjuagaron 3 veces en agua estéril en condiciones estériles. Si las semillas se han almacenado durante mucho tiempo o si parecen sucias, se pueden sumergir brevemente en etanol al 96 % y flamear.

Las semillas limpias se abrieron y se extrajo el embrión de la semilla. Cada embrión se colocó en una placa de Petri que comprendía medio de crecimiento 29.4 para iniciar el cultivo de células somáticas. Los cultivos se hicieron crecer a 20°C en la oscuridad durante 10 a 16 semanas.

Medio 29,4:1 litro

Recetas utilizadas ara ro orcionar medio 29,4:

Las muestras del cultivo de células somáticas se pueden preparar opcionalmente para crioconservación o se pueden usar directamente para el desarrollo y la maduración del embrión.

Si las muestras fueron criopreservadas, se colocaron aproximadamente 2 gramos de tejido de un genotipo específico en una botella estéril y se agregaron 20 g de medio 29,4 y 1 ml de Sorbitol. Los cultivos se colocaron en un agitador proporcionando agitación constante para una aireación adecuada durante 24 horas a 20°C y se añadió 1 ml de sorbitol. Después de 48 horas, las muestras se colocaron a 0°C durante al menos 30 min. A continuación, se añadió 1 ml de DMSO a cada botella. La solución se dividió en 12 tubos y se congeló lentamente de 0,5°C a -35°C antes de ser transferida a un criodepósito a menos 180°C.

Cuando fue aplicable, los cultivos de células somáticas se descongelaron y se inició el desarrollo de embriones somáticos.

Las muestras se descongelaron en agua a 40°C, se desinfectaron en etanol y se vertieron sobre papel de filtro en una placa de Petri. Después de 1 hora, los cultivos se retiraron a un papel de filtro limpio, y nuevamente después de 18 horas, los cultivos se colocaron en una nueva placa de Petri que comprendía un medio de crecimiento, como el medio 29.4.

Los cultivos se cultivan a 20°C y se comprobó la viabilidad de los cultivos cada 2a semana. Después de 6 semanas, se seleccionan cultivos viables para el desarrollo y maduración del embrión. Cada 2 semanas, los cultivos se trasladaron a medio fresco 29.4. Después de otras 6-8 semanas, los cultivos estaban listos.

Ejemplo 8: Desarrollo y maduración de embriones de Abies bornmülleriana

Se seleccionaron cultivos de células somáticas de dos genotipos diferentes de Abies bornmulleriana obtenidos del ejemplo 7 para el desarrollo y maduración del embrión.

Para cada muestra de cultivo de células somáticas, se añadieron 4 g de cultivo a 100 g de medio 29,4 y se mezclaron durante 25 segundos A continuación, se dejaron las muestras durante 30 minutos y se eliminó el líquido sobrante hasta 30 ml. Se pipeteó un ml de la mezcla sobre papel de filtro en una placa de Petri que comprendía 15 ml de medio 49,53.

Medio 49,53:1 litro

Recetas utilizadas ara ro orcionar medio 49,53

Los cultivos se cultivaron a 20°C en la oscuridad durante 3 semanas. Los papeles de filtro que contenían cultivos adecuados se trasladaron a un medio 29,75 desarrollado a 20 °C en la oscuridad durante 3 semanas.

Medio 29,75:1 litro

Recetas utilizadas ara ro orcionar medio 29,75

Filter paper holding suitable cultures were then moved to médium 49,53 for 6 weeks for completing maturation of the embryos. Posteriormente, el papel de filtro que contenía los embriones adecuados se retiró a medio 8,95 para engorde y se cultivó a 20°C en la oscuridad durante dos semanas con el fin de completar la maduración de los embriones.

Medio 8,95:1 litro

R iliz r r rin r m i :

Los embriones somáticos cotiledonarios completamente maduros así obtenidos (como se muestra en la Figura 1, número 7) estaban ahora listos para crecer en condiciones que estimulan la formación de raíces.

Los embriones somáticos completamente maduros seleccionados para crecer en condiciones de inducción de raíces se caracterizaron por tener en general 4-5 mm de largo; teniendo típicamente 2-5 o más cotiledones pequeños; y una radícula (primordios de raíz); y un diámetro en el centro del tallo de aproximadamente 1 mm

Ejemplo 9: Enraizamiento de embriones somáticos completamente maduros de Abies bornmülleriana Aproximadamente 300 embriones cotiledonarios completamente maduros (correspondientes a la etapa 7 como se muestra en la Figura 1) de cada uno de los dos genotipos de Abies bornmulleriana obtenidos del Ejemplo 8 se colocan horizontalmente en medio de enraizamiento 51.21 en placas Petri que comprenden 30-40 embriones por placa. Se cultivan 60-80 embriones de cada genotipo durante 12-14 semanas en la oscuridad a una de las siguientes temperaturas, respectivamente: 2°C, 4°C, 3-7°C, 9°C y 10°C

Después de 8, 9, 10, 11, 12 y 16 semanas, se comprueba la formación de raíces en los embriones y se seleccionan los embriones con una raíz bien desarrollada para un mayor crecimiento en las condiciones de inducción de brotes descritas en el Ejemplo 10.

Medio 51,21:1 litro

R iliz r r ri n r l m i 121:

Resultados:

Solo una pequeña parte de los embriones de ambos genotipos que se cultivaron a 2°C o 9°C desarrollaron una raíz después de 8 a 16 semanas.

Muy pocos de los embriones de ambos genotipos que se cultivaron a 10°C desarrollaron una raíz después de 8 a 16 semanas.

La mayoría de los embriones de ambos genotipos que se cultivaron a 4°C o a 3-7°C habían desarrollado una raíz después de 12 semanas, un número menor ya después de 8 semanas y un número menor solo después de 16 semanas.

Estas pequeñas plántulas así obtenidas que son adecuadas para un mayor crecimiento en las condiciones de inducción de brotes se caracterizan porque el embrión cotiledonario ha desarrollado una radícula (raíz), los cotiledones tienen 1-5 mm de largo y son verdes, y el hipocótilo es de aproximadamente 10-20. mm de largo.

Ejemplo 10: Desarrollo de brotes de pequeñas plántulas de Abies bornmülleriana

De cada uno de los dos genotipos de Abies bornmulleriana se seleccionan de 30 a 40 pequeñas plántulas que habrán desarrollado una raíz cuando crezcan en cada una de las condiciones de inducción de raíces descritas en el Ejemplo 3 para crecer en condiciones de inducción de brotes. La mayoría de las plántulas seleccionadas serán plantas que han crecido en un período frío de 3-7°C como se describe en el Ejemplo 9, ya que esta será la temperatura a la que la mayoría de los embriones somáticos desarrollan con éxito una raíz.

Como se menciona en el Ejemplo 3, las pequeñas plántulas incluidas en este experimento se caracterizaron por tener una raíz, los cotiledones tenían 1-5 mm de largo eran verdes y el hipocótilo tenía aproximadamente 5-15 mm de largo. Las pequeñas plántulas se trasladaron a cajas de plástico (Eco2box, ovaladas, Duchefa Bichemie) de 125 mm de largo x 65 mm de ancho x 80 mm de alto con tapa. La tapa estaba parcialmente abierta para el movimiento del aire. El % de humedad relativa se mantuvo por encima de 90.

Cada caja contenía 100 ml del medio sin azúcar 47.07.

Medio 47,07:1 litro

R iliz r r r i n r m i 47 7:

Cada caja contenía aproximadamente de 24 a 30 pequeñas plántulas del mismo genotipo que habían sido cultivadas bajo las mismas condiciones de inducción de raíces.

Las pequeñas plántulas se cultivaron durante 4 a 8 semanas a 15° en períodos de 24 h de luz LED blanca de 70 a 400 pmol/m2s.

Las intensidades de luz se miden dentro de cada caja lo más cerca posible de los cotiledones. Las intensidades de luz variaron de aproximadamente 100 a 400 pmol/m2s dependiendo de la distancia a la fuente de luz más cercana.

Resultados:

La mayoría de las pequeñas plántulas de ambos genotipos se habían convertido en embriones con nuevos cotiledones, que también se habían vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie "normal" de una aguja de conífera completamente desarrollada después de 6 semanas. La altura total de estos embriones por encima de la raíz era generalmente de 8 a 22 mm y la raíz generalmente tenía una longitud en el intervalo de 1 a 30 mm.

Una cantidad menor de embriones de ambos genotipos había desarrollado las mismas características después de solo 4 a 5 semanas, y una cantidad menor de plantas de ambos genotipos había desarrollado las mismas después de 7 a 8 semanas.

La mayoría de los embriones de ambos genotipos que habían desarrollado nuevos cotiledones, que también se habían vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie 'normal' de una aguja de conífera completamente desarrollada después de 4 a 8 semanas, eran plántulas que habían sido sometidas a un crecimiento a 3 a 7°C en la etapa anterior de inducción de raíces

Ejemplo 11: Desarrollo de pequeñas plantas de Abies bornmülleriana

Todos los embriones bien desarrollados con nuevos cotiledones obtenidos del Ejemplo 10 se transfirieron a macetas C7 Jiffy de cepellón de 025 mm de bosque pequeño para un crecimiento continuo y se cultivaron durante 6 a 8 semanas a 25°C en períodos de 24 horas de luz LED blanca de 100 a 400 pmol/m2s. El % de humedad relativa se redujo lentamente a 70..

Casi todas las plantas habrán sobrevivido y posteriormente serán seleccionadas para continuar con la producción de viveros.

Ejemplo 12: Comparación de la etapa de desarrollo de embriones somáticos o pequeñas plántulas que crecen sin condiciones que induzcan raíces

Se cultivan varios embriones somáticos maduros de dos genotipos diferentes de Abies nordmanniana obtenidos del Ejemplo 2 y dos genotipos diferentes de Abies bornmülleriana obtenidos del Ejemplo 8 en las condiciones de inducción de brotes descritas en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 10, respectivamente, es decir, sin crecimiento previo en las condiciones de inducción de raíces descritas en el Ejemplo 3 y en el Ejemplo 11, respectivamente.

Para los 4 genotipos, la tasa de supervivencia de las plántulas será significativamente menor en comparación con los genotipos del mismo tipo, que se cultivarán en las condiciones de inducción de raíces descritas en el Ejemplo 3 y en el Ejemplo 9, respectivamente, y bajo las condiciones de inducción de brotes. condiciones descritas en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 10, respectivamente.

Ejemplo 13: Comparación de la etapa de desarrollo de pequeñas plántulas cultivadas sin condiciones inductoras de brotes

Varias pequeñas plántulas enraizadas de dos genotipos diferentes de Abies nordmanniana y de Abies bornmülleriana, respectivamente, obtenidas del Ejemplo 3 y del Ejemplo 9, respectivamente, se cultivarán en pequeñas plántulas en las condiciones descritas en el Ejemplo 5 y en el Ejemplo 11, respectivamente, es decir, sin crecimiento previo en las condiciones de inducción de brotes descritas en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 10, respectivamente.

Para los 4 genotipos, la tasa de supervivencia de las plántulas será significativamente menor en comparación con los genotipos del mismo tipo, que se cultivarán en las condiciones de inducción de raíces descritas en el Ejemplo 3 y en el Ejemplo 9, respectivamente, y bajo las condiciones de inducción de brotes condiciones descritas en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 10, respectivamente.

Ejemplo 14: Características que influyen en la tasa de supervivencia

Se probó el impacto de cultivar pequeñas plántulas en cajas herméticas frente a cultivarlas en cajas donde se había quitado parte de la tapa para determinar si esto tenía alguna influencia en el desarrollo y la tasa de supervivencia de las pequeñas plántulas. Además, se probaron diferentes medios.

La prueba se realizó en 240 embriones enraizados/pequeñas plántulas de Abies nordmanniana de dos genotipos diferentes que se habían proporcionado, desarrollado y cultivado posteriormente como se describe en los Ejemplos 1 a 3, respectivamente, donde las condiciones descritas en el Ejemplo 3 se seleccionaron para un crecimiento de 3 -7°C durante 12 semanas.

Las pequeñas plántulas habían desarrollado así una raíz, cotiledones de 1-5 mm de largo y verdes, y un hipocótilo de unos 5-15 mm. En esta etapa de desarrollo, las pequeñas plántulas se separaron en dos grupos de 120 plantas - un grupo para crecer en cajas herméticas y el otro grupo para crecer en cajas donde se aseguró el acceso continuo al aire quitando aproximadamente el 20 % de la tapa.

Cada grupo de 120 embriones enraizados se dividió en cuatro grupos de 30 plantas cada uno y se cultivaron en una caja que contenía uno de los siguientes cuatro medios:

47.037: Doble resistencia del medio 47.07 como se describe en los Ejemplos 4 y 10, respectivamente

47.06: Doble resistencia del medio 47.07 como se describe en los Ejemplos 4 y 10, respectivamente con la adición de 3 tipos de auxinas y Cu

47.07: Este medio se describe en los Ejemplos 4 y 10, respectivamente.

47.08: Medio 47.07 como se describe en los Ejemplos 4 y 10, respectivamente con la adición de 3 tipos de auxinas y Cu

A continuación, las plantas se cultivaron en la misma cámara durante 6 semanas a 15° en períodos de 24 h de luz LED blanca de 100 a 400 pmol/m2s.

Después de las 6 semanas, se determinó la tasa de supervivencia y, en las plántulas sobrevivientes, se determinó el porcentaje de plántulas que habían desarrollado una copa verde, una yema y una raíz blanca. En algunas de las plántulas supervivientes, la raíz se había vuelto negra. Una raíz negra indica que las plántulas tendrán menos posibilidades de sobrevivir cuando se transfieran a un cepellón o al suelo.

Resultados:

Como es evidente en la siguiente tabla, sobrevivió un porcentaje significativamente mayor de pequeñas plántulas que se cultivaron en cajas donde parte de la tapa estaba abierta al aire en comparación con las pequeñas plántulas que se cultivaron en cajas herméticas con el mismo medio. . Sin embargo, el acceso al aire no pareció influir en los porcentajes de plántulas supervivientes que tienen la parte superior verde, la yema o la raíz blanca.

Por tanto, se puede concluir que es beneficioso para las tasas de supervivencia que las plantas cultivadas en condiciones de crecimiento inductoras de brotes según el procedimiento de la presente invención se cultiven en circunstancias en las que se asegura el acceso al aire.

También es evidente a partir de los resultados que el medio donde se cultivan los embriones enraizados influye en gran medida tanto en el porcentaje de pequeñas plántulas que sobreviven como en el porcentaje de plántulas que tienen una parte superior verde, una yema y una raíz blanca.

Por lo tanto, encontrar el medio óptimo para una especie específica puede requerir algunas pruebas de optimización de rutina.

Ejemplo 15: Impacto de la temperatura en la etapa de inducción de brotes

Se obtuvieron 8 cajas donde la tapa estaba parcialmente abierta comprendiendo aproximadamente 30 pequeñas plántulas de Abies nordmanniana de diferentes genotipos a partir de un procedimiento que comprende las etapas descritas en los Ejemplos 1, 2 y 3, donde el período de tratamiento en frío en la etapa de inducción de raíces fue de 3-7°C durante 12 semanas se cultivaron a diferentes temperaturas con el fin de encontrar la temperatura más beneficiosa para inducir la formación de brotes superiores y, al mismo tiempo, estimular un mayor desarrollo de las raíces.

Las cajas se colocaron a una de las siguientes 8 temperaturas durante 4 semanas en períodos de luz de 24 h de LED a intensidades de luz de 100 a 300 pmol/m2s y posteriormente, se evaluaron los porcentajes de las pequeñas plántulas que se habían convertido en embriones con brotes y enraizamiento adicional.

Los resultados se muestran en la si uiente tabla en la Fi ura 7:

Es evidente a partir de estos resultados que a temperaturas que oscilan entre 10°C y aproximadamente 16°C, el porcentaje de plántulas que desarrollan un brote superior es menor que a temperaturas que oscilan entre aproximadamente 16°C y 25°C.

Además, es evidente que a temperaturas que oscilan entre 10°C y aproximadamente 16°C, el porcentaje de plántulas que desarrollan nuevas raíces blancas es mayor que a temperaturas que oscilan entre aproximadamente 16°C y 25°C. Por lo tanto, si se debe priorizar tanto el enraizamiento como el desarrollo de un brote superior, la temperatura más adecuada es aproximadamente de 14 a 17°C.

Ejemplo 16: Producción de árboles de Navidad de Abies nordmanniana

Un total de 327 árboles de 9 clones de pequeños embriones de Abies nordmanniana obtenidos mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 6 (es decir, como resultado del desarrollo según los Ejemplos 1,2, 3, 4, 5, donde la etapa de inducción de raíces comprendía el crecimiento de los embriones somáticos a 3 - 7°C durante 8 a 12 semanas y en la etapa de inducción de brotes a intensidades de luz de 150 - 350 pmol/m2s) se plantaron en suelo de bosque en Dinamarca en áreas que ya se utilizaban para la producción de árboles de Navidad. La apariencia y el tamaño de los árboles se registraron con regularidad. Luego de 8 años de crecimiento en campo, se concluyó que la mayoría de los árboles habían sobrevivido y se comparó la apariencia de los árboles entre los genotipos identificando así los genotipos más aptos para la producción de árboles de Navidad. Además, se concluyó que los árboles del mismo genotipo eran casi idénticos en forma y tamaño.

Ejemplo 17: Enraizamiento de embriones somáticos completamente maduros de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana

En total 3459 embriones cotiledonarios completamente maduros (correspondientes a la etapa 7 como se muestra en la Figura 1 y en la Figura 2) de las dos especies Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana, respectivamente 5 y 2 genotipos, se colocaron horizontalmente en el medio de enraizamiento 51.21 (la misma receta que se muestra en el Ejemplo 3) en placas de Petri que comprenden 20 embriones por placa. Se cultivaron 40-100 embriones de cada genotipo durante 8-11 semanas en la oscuridad a una de las siguientes temperaturas, respectivamente: 2°C, 4°C, 5°C, 8°C, 10°C, 15°C y 20°C.

Número de embriones empleados en el experimento por especie y genotipo:

Después de 8, 9, 10 y 11 semanas, los embriones (que ahora se habían desarrollado en pequeñas plántulas) se revisaron para la formación de raíces y se seleccionaron los embriones con una raíz bien desarrollada (más larga de 5 mm, como los que se muestran en la Figura 3). (cuando el embrión individual cumple por primera vez con los criterios y se anotó la semana de transferencia) para un mayor crecimiento en las condiciones de inducción de brotes descritas en el Ejemplo 19.

Sujeto a las condiciones de inducción de brotes descritas en el Ejemplo 19, los 'embriones buenos' obtenidos (como los que se muestran en la Figura 4) se registraron después de finalizar la etapa b) y siguieron creciendo durante 8 semanas adicionales (etapa c) en embriones bien desarrollados de aceptable calidad (que tenga al menos una roseta de agujas en su mayoría verdes, como las que se muestran en la Figura 5).

Resultados:

Como se muestra en la Figura 8, se encontró que lo óptimo para el enraizamiento estaba entre 2-4°C y el enraizamiento estaba disminuyendo con el aumento de la temperatura. Se observaron fuertes diferencias significativas en el enraizamiento entre temperaturas. La relación entre el enraizamiento y la temperatura fue casi lineal (R2=0,94) y el enraizamiento cae 7,6 por ciento-unidades para un aumento en la temperatura de enraizamiento de un grado Celsius. La diferencia en el porcentaje de enraizamiento entre el tratamiento de temperatura 2°C y 4°C no fue significativa. El enraizamiento inicial tiene un fuerte impacto (una correlación significativa de 0,96) en el número final de embriones buenos después de finalizar la etapa b) (datos no mostrados) y el crecimiento adicional en la etapa c) durante 8 semanas adicionales en embriones bien desarrollados de calidad aceptable (habiendo al menos una roseta de agujas en su mayoría verdes), Figura 9.

Se observó un efecto significativo del genotipo sobre el enraizamiento. Los genotipos probados fueron en general variables (interacción significativa clon por temperatura) y mostraron patrones de enraizamiento desviados en función de la temperatura de enraizamiento: algunos más sensibles a la temperatura que otros, aunque la mayoría de los clones mostraron el patrón promedio de enraizamiento decreciente por aumento de temperatura, Figura 10.

Las dos especies probadas Abies nordmanniana y Abies bornmulleriana mostraron la misma respuesta general a la temperatura en los embriones enraizantes, así como buenos embriones después de finalizar la etapa b) y el crecimiento de los pequeños embriones en la etapa c) durante 8 semanas adicionales en embriones bien desarrollados de calidad aceptable. como se muestra en la Figura 11. Ambas especies declinaron fuertemente con el aumento de temperatura y mostraron un estado óptimo a 2-5°C.

El porcentaje de embriones enraizados aumentó en general de la semana 8 a la 11, mientras que casi no se observaron nuevos enraizamientos en la semana 12 y posteriores. Las temperaturas más bajas de 2°C, 4°C y 5°C también tuvieron el aumento más constante en los individuos enraizados y alcanzaron el nivel más alto de enraizamiento acumulado después de 11 semanas, como se muestra en las Figuras 12 y 13.

El número de semanas necesarias para lograr el enraizamiento dependía también del genotipo; se necesitaron al menos 9 semanas para que algunos de los clones probados alcanzaran el máximo, mientras que otros se beneficiaron de 11 semanas, Figura 14. Casi no se observó un nuevo enraizamiento en la semana 12 o después.

En la Figura 3 se muestran ejemplos de pequeñas plántulas adecuadas que se eligieron para un mayor crecimiento en condiciones de inducción de brotes. Estas pequeñas plántulas se caracterizaron porque el embrión cotiledonario había desarrollado una raíz, los cotiledones tenían entre 1 y 5 mm de largo y el hipocótilo tenía entre 5 y 15 mm de largo.

Ejemplo 18. Enraizamiento de embriones somáticos completamente maduros de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana - efecto de la calidad inicial del embrión.

Los 3459 embriones cotiledonarios completamente maduros usados en el Ejemplo 17 se evaluaron individualmente antes de cualquier tratamiento usando un puntaje embrionario inicial que asigna un puntaje de calidad de 4 a 9. Los embriones que habían obtenido puntajes de 1 a 3 no se incluyeron en los 3459 embriones seleccionados para crecimiento.

Puntaje inicial de la calidad del embrión en el momento de iniciar el enraizamiento:

Descripción del puntaje

Embriones deformados

1 Embriones muy deformados, embriones acumulados, cotiledones crecen desde el centro del hipocótilo, cotiledones deformados

2 Solo hipocótilo largo, ya sea recto, doblado o en forma de camarón

3 Parece un embrión, pero para muchos cotiledones, hipocótilo hinchado, hipocótilo pequeño y doblado Ligeramente hinchado, mínimo 2 cotiledones

4 hipocótilo menor o igual a 1,99 mm

5 hipocótilo 2,0-3,99 mm

6 hipocótilos más largos o iguales a 4,0 mm

Hipocótilo mínimo delgado, 2 cotiledones

7 hipocótilo menor o igual a 3,99 mm

8 hipocótilo 4,0-5,99 mm

9 hipocótilo myor o igual a 6.0 mm

Después de 8, 9, 10 y 11 semanas de crecimiento en las condiciones descritas en el Ejemplo 17, se comprobó la formación de raíces de los embriones y se seleccionaron los embriones con una raíz bien desarrollada (más larga que 5 mm) (se notó cuándo el embrión individual cumplió por primera vez con los criterios y la semana de transferencia) para un mayor crecimiento en las condiciones de inducción de brotes descritas en el Ejemplo 19.

Se registraron 'buenos embriones' (como los que se muestran en la Figura 4) después de finalizar la etapa b) y el crecimiento de los pequeños embriones en la etapa c) durante 8 semanas adicionales en embriones bien desarrollados de calidad aceptable (con al menos una roseta de agujas de color verde en su mayoría)

Resultados:

El porcentaje de embriones enraizados y el porcentaje de embriones buenos aumentaron significativamente de embriones que tenían un puntaje inicial de calidad del embrión de 4 a 9, respectivamente, un intervalo de enraizamiento del 24 al 82 por ciento y para los embriones buenos del 3 al 24 por ciento, Figura 15.

Los clones mostraron algunos patrones de desviación menores en el enraizamiento en función del puntaje inicial del embrión (clon de interacción significativa por puntaje inicial del embrión), aunque en su mayoría todos mostraron el patrón promedio de aumento de enraizamiento debido al aumento de la calidad inicial del embrión, Figura 16.

Porcentaje de embriones de enraizamiento - agrupados en grupos según los puntajes iniciales de los embriones (puntajes de 4 a 9, respectivamente) tuvieron un rendimiento muy similar en todas las temperaturas a pesar de la interacción significativa (efecto de escala) entre el puntaje de enraizamiento inicial y la temperatura de enraizamiento, Figura 17.

Ejemplo 19: Desarrollo de brotes en embriones somáticos enraizados de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana bajo tratamiento con luz

De los cinco genotipos de Abies nordmanniana y dos de Abies bornmülleriana, 1455 pequeñas plántulas (de una etapa de desarrollo similar a las que se muestran en la Figura 3), provenientes de todos los grupos de puntaje embrionario inicial, que habían desarrollado una raíz cuando crecieron debajo de cada una de las raíces inductoras. Las condiciones descritas en el Ejemplo 17 se seleccionaron para crecer en condiciones de inducción de brotes. La mayoría de las pequeñas plántulas seleccionadas (86 por ciento) se habían cultivado a 2-6°C durante 8-11 semanas como se describe en el Ejemplo 17, ya que esta era la temperatura a la que la mayoría de los embriones somáticos desarrollaron con éxito una raíz. Este grupo (2-6°C) representa solo el 61 por ciento de los embriones obtenidos del Ejemplo 17.

Como se menciona en el Ejemplo 17, las pequeñas plántulas incluidas en este experimento se caracterizaron por tener una raíz, los cotiledones tenían 1-5 mm de largo y el hipocótilo tenía aproximadamente 5-15 mm de largo. Las pequeñas plántulas se trasladaron a cajas de plástico (Eco2box, ovaladas, Duchefa Bichemie) de 125 mm de largo x 65 mm de ancho x 80 mm de alto con tapa. La tapa estaba parcialmente abierta para el movimiento del aire. El % de humedad relativa se mantuvo por encima de 90.

Cada caja contenía 100 ml del medio sin azúcar 47.07 (la misma receta que se muestra en el Ejemplo 3).

Como se mencionó en el Ejemplo 17, las pequeñas plántulas incluidas en este experimento se caracterizaron por tener una raíz. La aleatorización de esta etapa del experimento se aproximó transfiriendo embriones enraizados de un clon dado y una placa de Petri dada (tratamiento) en cajas separadas. Este procedimiento se repitió durante las semanas 8 a 11.

En cada semana, 8-11, las cajas se asignaron al azar a siete condiciones de luz: de luz LED blanca de 50, 100, 150, 200, 250, 300 y 400 pmol/m2s y se mantuvieron en esa condición de luz durante 8 semanas a 15°en períodos de luz de 24 h

Las intensidades de luz se midieron en la parte superior de cada caja lo más cerca posible de los cotiledones y, a partir de entonces, se tomó en cuenta el efecto reductor de luz de la tapa. Las intensidades de luz variaron de aproximadamente 50 a 400 pmol/m2s dependiendo de la distancia a la fuente de luz más cercana.

Resultados:

La mayoría de las pequeñas plántulas de ambas especies se habían convertido en embriones con nuevos cotiledones, que también se habían vuelto de un verde más oscuro mostrando una superficie "normal" de una aguja de conífera completamente desarrollada; después de 8 semanas. Ejemplos de tales embriones se muestran en la Figura 4. El número de cotiledones desarrollados después de 8 semanas varió significativamente entre las intensidades de luz, de 4,0 a 5,4, Figura 18 Parece que se alcanza un máximo en 200 pmol/m2s, y no se registró ninguna ganancia significativa adicional en el número de cotiledones aumentando aún más la intensidad de la luz. El número de cotiledones en 50 pmol/m2s fue significativamente diferente de las otras intensidades de luz.

La longitud del cotiledón más largo en cada una de las pequeñas plántulas se midió después de 8 semanas y varió en intensidades de luz de 7,8 mm a 8,6 mm La longitud del cotiledón más largo parece tener un máximo alrededor de una intensidad de luz de 100 a 200 pmol/m2s, Figura 19. La longitud de los cotiledones más largos a una intensidad de 100 pmol/m2sy 200 pmol/m2s fue significativamente diferente de la intensidad más baja de 50 pmol/m2s, así como la intensidad más alta de 400 pmol/m2s.

Ejemplo 20: Desarrollo de embriones de Abies nordmanniana y Abies bornmülleriana cultivados en cepellones durante 8 semanas.

Se seleccionaron 1455 embriones (de una etapa de desarrollo como se muestra en la Figura 4) que habían crecido en las condiciones de inducción de raíces descritas en el Ejemplo 17 y posteriormente en las condiciones de inducción de brotes como se describe en el Ejemplo 19 y se transfirieron a cepellones Jiffy7 Los cepellones se añadieron y se regaron antes de la transferencia de los embriones usando una solución de fertilizante NPK a una conductividad de 1,5 mS cm-1 y se ajustaron a un pH de 4,5 usando HCI. Los cepellones que contenían los pequeños embriones se colocaron en bandejas de plástico de 8 por 13 cepellones y se cubrieron con una tapa transparente. Las bandejas se colocaron bajo luz LED con una intensidad de luz promedio de 175-195 pmol/m2s. La temperatura ambiente era de 25 °C. Las bandejas se mantuvieron con una tapa durante seis semanas, en la semana siete se subió ligeramente la tapa y finalmente se retiró en la semana ocho. El contenido de agua en los cepellones se redujo lentamente en un 14 por ciento del contenido de agua inicial durante las 8 semanas. Se añadió agua tres días a la semana.

Se registraron 'buenos embriones' después de finalizar la etapa b) y se siguió cultivando los embriones en la etapa c) durante 8 semanas adicionales hasta obtener embriones bien desarrollados de calidad aceptable (es decir, tener al menos una roseta de agujas en su mayoría verdes.

Resultados:

Aunque se cultivó en condiciones uniformes durante ocho semanas en cepellones estandarizados, hubo un efecto fuerte y significativo sobre la mortalidad debido al tratamiento previo con luz como se describe en el Ejemplo 19. La mortalidad fue más severa para las plantas que se habían cultivado con la intensidad de luz más baja, 50 pmol/m2s, que fue significativamente diferente de todos los demás tratamientos y la mortalidad fue más baja a una intensidad de luz de 200 pmol/m2s, Figura 20.

También para el porcentaje de buenos embriones, hubo un efecto fuerte y significativo del tratamiento con luz anterior. Aumentando la intensidad de la luz de 50 pmol/m2s a 200 pmol/m2s aumentó el porcentaje de embriones buenos del 13 al 30 por ciento, Figura 21. La intensidad de la luz de 50 pmol/m2s fue significativamente diferente de todos los demás tratamientos. No se observó ningún aumento en el porcentaje de embriones buenos para intensidades de luz superiores a 200 pmol/m2s.

Combinando las figuras observadas para las plántulas buenas deseadas y la mortalidad realizada, hay un valor óptimo para el número de plántulas buenas obtenidas cuando se cultivan las pequeñas plántulas en la etapa b) de 100 a 200 pmol/m2s, con un valor óptimo más cercano a 200 pmol/m2s.

El porcentaje de embriones buenos exitosos obtenidos del total de embriones que comenzó a aumentar con la disminución de la temperatura y mostró un máximo en el intervalo de 2°C a 4°C en la etapa (a) (las condiciones de inducción de raíces) y posteriormente el crecimiento de los embriones a Intensidad de luz LED de al menos 200 pmol/m2s en la etapa (b) (las condiciones de inducción de brotes), como se ve en la superficie de respuesta que se muestra en la Figura 22.

El porcentaje de embriones buenos exitosos obtenidos del total de embriones iniciados estuvo además fuertemente influenciado por la temperatura aplicada en (a) - la temperatura de enraizamiento y por la calidad inicial del embrión. En general, el número máximo de embriones buenos exitosos obtenidos después del crecimiento, primero en las condiciones de inducción de raíces y luego en las condiciones de inducción de brotes, se logró cultivando los embriones cotiledonarios completamente maduros a una temperatura de 4°C y utilizando embriones que tienen la mejor calidad inicial del embrión (puntaje 9) como se ve en la superficie de respuesta que se muestra en la Figura 23.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para el desarrollo de plantas a partir de embriones somáticos completamente maduros del género Abies que comprende:

a) Someter embriones somáticos totalmente maduros a 2°C-7°C durante 8-16 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas obtenidas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una fuente de carbohidratos accesible para la planta en una concentración donde pueda ser absorbidos por las plantas y utilizados como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración; a intensidades de luz LED de 70 - 300 pmol/m2s durante al menos 3 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha temperatura en la etapa a) es 3°C - 5°C

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, donde dicha temperatura en la etapa a) es de 4°C

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde los embriones completamente maduros de la etapa a) se someten a dicha temperatura durante 9 a 11 semanas

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde los embriones completamente maduros de la etapa a) se someten a dicha temperatura durante 12 semanas

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dichas intensidades de luz LED aplicadas en la etapa b) son 150 - 250 pmol/m2s

7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde dichas intensidades de luz LED en la etapa b) son 175 - 225 pmol/m2s

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dichas plántulas en la etapa b) se cultivan en un sustrato que no comprende una fuente de carbohidratos accesible para las plantas a una concentración donde las plantas pueden absorberlos y usarlos como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración; a dichas intensidades de luz LED durante 4 a 8 semanas

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde dichas plántulas en la etapa b) se cultivan en un sustrato que no comprende una fuente de carbohidratos accesible para las plantas a una concentración donde las plantas pueden absorberlos y usarlos como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración; a dichas intensidades de luz LED durante 6 semanas

10. Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende:

a) Someter embriones somáticos completamente maduros a 2°C - 5°C durante 9-11 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas obtenidas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una fuente de carbohidratos accesible para la planta en una concentración donde puedan ser absorbidos por las plantas y utilizados como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración; a intensidades de luz LED de 175 - 225 pmol/m2s durante al menos 6 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

11. Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende:

a) Someter embriones somáticos totalmente maduros a 3°C - 7°C durante 12 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas obtenidas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una fuente de carbohidratos accesible para la planta en una concentración donde puedan ser absorbidos por las plantas y utilizados como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración; a intensidades de luz LED de 175 - 225 pmol/m2s durante al menos 6 semanas

c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, que comprende:

a) Someter embriones somáticos totalmente maduros a 4°C durante 12 semanas

b) Seleccionar las pequeñas plántulas obtenidas de la etapa (a) que han desarrollado una raíz y hacer crecer dichas pequeñas plántulas en un sustrato que no comprende una fuente de carbohidratos accesible para la planta en una concentración donde puedan ser absorbidos por las plantas y utilizados como fuente de carbono o energía para el crecimiento, la fotosíntesis o la respiración; a intensidades de luz LED de 200 pmol/m2s durante 6 semanas c) Seleccionar los embriones obtenidos en la etapa b) y convertirlos en plantas

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dichas pequeñas plántulas de la etapa (b) se cultivan en cajas transparentes que permiten la aireación de dichas pequeñas plántulas

14. Procedimiento según la reivindicación 13, donde dicha caja transparente comprende una tapa que tiene un orificio del 10-30 % del área total de la tapa

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde dichos embriones somáticos del género Abies se seleccionan de entre: Abies alba, Abies amabilis, Abies balsamea, Abies beshanzuensis, Abies bifolia, Abies borisii-regis, Abies bornmülleriana, Abies bracteata, Abies cephalonica, Abies chensiensis, Abies cilicica, Abies concolor, Abies delavayi, Abies densa, Abies duragensis, Abies fabri, Abies fargesii, Abies fanjingshanensis, Abies firma, Abies flinckii, Abies forrestii, Abies fraseri, Abies guatemalensis, Abies hickelii, Abies holophylla, Abies homolepis, Abies kawakamii, Abies koreana, Abies lasiocarpa, Abies iowiana, Abies magnifica, Abies mariesii, Abies nebrodensis, Abies nephrolepis, Abies nordmanniana, Abies numidica, Abies pardei, Abies pindrow, Abies pinsapo, Abies procera (Abies nobilis), Abies recurvata, Abies religiosa, Abies sachalinensis, Abies sibirica, Abies spectabilis, Abies squamata, Abies veitchii, Abies vejarii, Abies yuanbaoshanensis, Abies ziyuanensis y cualquier híbrido obtenido de hibridación entre especies entre cualquiera de las especies del género Abies