CZ20021004A3 - Metoda pro dozrávání somatických embryí jehličnanů - Google Patents
Metoda pro dozrávání somatických embryí jehličnanů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021004A3 CZ20021004A3 CZ20021004A CZ20021004A CZ20021004A3 CZ 20021004 A3 CZ20021004 A3 CZ 20021004A3 CZ 20021004 A CZ20021004 A CZ 20021004A CZ 20021004 A CZ20021004 A CZ 20021004A CZ 20021004 A3 CZ20021004 A3 CZ 20021004A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- acid
- auxin
- maturation
- embryos
- nutrient medium
- Prior art date
Links
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 title claims abstract description 124
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 72
- 230000005070 ripening Effects 0.000 title claims description 43
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 124
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims abstract description 96
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims abstract description 41
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 51
- TXCGAZHTZHNUAI-UHFFFAOYSA-N clofibric acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 TXCGAZHTZHNUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 claims description 42
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 42
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 claims description 31
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 29
- 241000379221 Abies nordmanniana Species 0.000 claims description 28
- 241000218657 Picea Species 0.000 claims description 23
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 22
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 17
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 17
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 17
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 12
- 241000218642 Abies Species 0.000 claims description 11
- ZMZGFLUUZLELNE-UHFFFAOYSA-N 2,3,5-triiodobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(I)=CC(I)=C1I ZMZGFLUUZLELNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000008124 Picea excelsa Nutrition 0.000 claims description 10
- -1 beta-methylglutaryl abscisic acid Chemical compound 0.000 claims description 10
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000218602 Pinus <genus> Species 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000005205 Pinus Nutrition 0.000 claims description 7
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- SMYMJHWAQXWPDB-UHFFFAOYSA-N (2,4,5-trichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl SMYMJHWAQXWPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MVXVYAKCVDQRLW-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrrolo[2,3-b]pyridine Chemical compound C1=CN=C2NC=CC2=C1 MVXVYAKCVDQRLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZEQSWIRBIUYYFA-UHFFFAOYSA-N 2-(2-chlorophenoxy)-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=CC=C1Cl ZEQSWIRBIUYYFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RZCJYMOBWVJQGV-UHFFFAOYSA-N 2-naphthyloxyacetic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(OCC(=O)O)=CC=C21 RZCJYMOBWVJQGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GXAMYUGOODKVRM-UHFFFAOYSA-N Flurecol Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)(O)C3=CC=CC=C3C2=C1 GXAMYUGOODKVRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000218652 Larix Species 0.000 claims description 4
- 239000005574 MCPA Substances 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- WHKUVVPPKQRRBV-UHFFFAOYSA-N Trasan Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O WHKUVVPPKQRRBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 claims description 4
- IYRMWMYZSQPJKC-UHFFFAOYSA-N kaempferol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 IYRMWMYZSQPJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims description 3
- 241000218595 Picea sitchensis Species 0.000 claims description 3
- 241000218641 Pinaceae Species 0.000 claims description 3
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 claims description 3
- IWHNWHGZYZTRJT-NXECVXFDSA-N (2z,4e)-5-[(1s)-1-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohex-2-en-1-yl]-3-methylpenta-2,4-dienoic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CCCC1(C)C IWHNWHGZYZTRJT-NXECVXFDSA-N 0.000 claims description 2
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M (E)-Ferulic acid Natural products COC1=CC(\C=C\C([O-])=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M 0.000 claims description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003559 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims description 2
- KEZQJKFYPXBCAV-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichloro-1-(2,4-dichlorophenyl)sulfinylbenzene Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1S(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1Cl KEZQJKFYPXBCAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KQCMTOWTPBNWDB-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichloroaniline Chemical compound NC1=CC=C(Cl)C=C1Cl KQCMTOWTPBNWDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VIMHPDKXVNPSTD-UHFFFAOYSA-N 2,5-dichloro-4-methoxybenzoic acid Chemical compound COC1=CC(Cl)=C(C(O)=O)C=C1Cl VIMHPDKXVNPSTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DVCPZLUILSFNDO-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl DVCPZLUILSFNDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PZBIVIXQLIVFHJ-UHFFFAOYSA-N 2-(3-chlorophenoxy)-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=CC(Cl)=C1 PZBIVIXQLIVFHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ILPUOPPYSQEBNJ-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-phenoxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=CC=C1 ILPUOPPYSQEBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JDZNIWUNOASRIK-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-indol-3-yl)-2-methylpropanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(C)C(O)=O)=CNC2=C1 JDZNIWUNOASRIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DWZPZQUZHRPNLS-UHFFFAOYSA-N 4,6-diamino-2-iodopyridine-3-carbonitrile Chemical compound NC1=CC(N)=C(C#N)C(I)=N1 DWZPZQUZHRPNLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 4-Hydroxycinnamate Natural products OC1=CC=C(\C=C\C([O-])=O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 0.000 claims description 2
- HUNCSWANZMJLPM-UHFFFAOYSA-N 5-methyltryptophan Chemical compound CC1=CC=C2NC=C(CC(N)C(O)=O)C2=C1 HUNCSWANZMJLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N Acetovanillone Natural products COC1=CC(C(C)=O)=CC=C1O DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UBSCDKPKWHYZNX-UHFFFAOYSA-N Demethoxycapillarisin Natural products C1=CC(O)=CC=C1OC1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 UBSCDKPKWHYZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 claims description 2
- ZGHRCSAIMSBFLK-UNDGGMAZSA-N Nigellic acid Natural products O=C(O)/C=C(/C=C/[C@@]1(O)C(CO)=CC(=O)CC1(C)C)\C ZGHRCSAIMSBFLK-UNDGGMAZSA-N 0.000 claims description 2
- YNCRBFODOPHHAO-YUELXQCFSA-N Phaseic acid Natural products CC(=CC(=O)O)C=C[C@@H]1[C@@]2(C)CO[C@@]1(C)CC(=O)C2 YNCRBFODOPHHAO-YUELXQCFSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005595 Picloram Substances 0.000 claims description 2
- 229920001167 Poly(triaryl amine) Polymers 0.000 claims description 2
- 241000218683 Pseudotsuga Species 0.000 claims description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N Valeric acid Natural products CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 2
- YMGUBTXCNDTFJI-UHFFFAOYSA-N cyclopropanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CC1 YMGUBTXCNDTFJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XIVFQYWMMJWUCD-VSTJRZLJSA-N dihydrophaseic acid Chemical compound C1[C@H](O)C[C@@]2(C)OC[C@]1(C)[C@@]2(O)/C=C/C(/C)=C\C(O)=O XIVFQYWMMJWUCD-VSTJRZLJSA-N 0.000 claims description 2
- XIVFQYWMMJWUCD-UHFFFAOYSA-N dihydrophaseic acid Natural products C1C(O)CC2(C)OCC1(C)C2(O)C=CC(C)=CC(O)=O XIVFQYWMMJWUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N ferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 claims description 2
- 235000001785 ferulic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940114124 ferulic acid Drugs 0.000 claims description 2
- KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N ferulic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 claims description 2
- ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N jasmonic acid Natural products CCC=CCC1C(CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000008777 kaempferol Nutrition 0.000 claims description 2
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JXTHEWSKYLZVJC-UHFFFAOYSA-N naptalam Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC2=CC=CC=C12 JXTHEWSKYLZVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IZGYIFFQBZWOLJ-UHFFFAOYSA-N neophaseic acid Natural products C1C(=O)CC2(C)OCC1(C)C2(O)C=CC(C)=CC(O)=O IZGYIFFQBZWOLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IZGYIFFQBZWOLJ-CKAACLRMSA-N phaseic acid Chemical compound C1C(=O)C[C@@]2(C)OC[C@]1(C)[C@@]2(O)C=CC(/C)=C\C(O)=O IZGYIFFQBZWOLJ-CKAACLRMSA-N 0.000 claims description 2
- NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N picloram Chemical compound NC1=C(Cl)C(Cl)=NC(C(O)=O)=C1Cl NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N pyrazine-2,5-dicarboxylic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C1=CN=C(C(O)=O)C=N1 KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 claims description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N trans-isoferulic acid Natural products COC1=CC=C(C=CC(O)=O)C=C1O QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 claims description 2
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 claims 1
- DKICYCNWKRHPFR-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfanylnaphthalene Chemical compound C1=CC=C2C(SC)=CC=CC2=C1 DKICYCNWKRHPFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- DZRRTVYFYXFKCY-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-(2,3,4,5,6-pentachlorophenoxy)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl DZRRTVYFYXFKCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- GOLXRNDWAUTYKT-UHFFFAOYSA-N 3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCC(=O)O)=CNC2=C1 GOLXRNDWAUTYKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OLXGURCIOIELAX-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-indol-2-yl)-2-methylpropanoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(CC(C)C(O)=O)=CC2=C1 OLXGURCIOIELAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241001115954 Turtur Species 0.000 claims 1
- HBBVFDNZOWNNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-hydroxy-beta-methylglutarylhydroxyabscisic acid Natural products CC(=CC(=O)O)C=CC1(O)C(=CC(=O)CC1(C)COC(=O)CC(C)(O)CC(=O)O)C HBBVFDNZOWNNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N trans-cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N 0.000 claims 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 abstract description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 121
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 21
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 14
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 11
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 11
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 11
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 7
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 7
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 7
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 7
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 5
- QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N phloroglucinol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(O)=C1 QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 4
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 4
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- KZDCLQBOHGBWOI-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6-trichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl KZDCLQBOHGBWOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 125000004516 1,2,4-thiadiazol-5-yl group Chemical group S1N=CN=C1* 0.000 description 1
- CICQUFBZCADHHX-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichloro-1-methoxybenzene Chemical compound COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl CICQUFBZCADHHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBEXNQDCALHLNS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-(2,3-dichlorophenyl)propanenitrile Chemical compound N#CC(Cl)CC1=CC=CC(Cl)=C1Cl OBEXNQDCALHLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DAEXZCKEPFUXCE-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-(2,4,6-trichlorophenoxy)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)OC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl DAEXZCKEPFUXCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTAVXDDWEGVLRN-UHFFFAOYSA-N 2-naphthalen-1-yloxypropanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(OC(C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 KTAVXDDWEGVLRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- JPYHHZQJCSQRJY-UHFFFAOYSA-N Phloroglucinol Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O JPYHHZQJCSQRJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008577 Pinus radiata Nutrition 0.000 description 1
- 241000218621 Pinus radiata Species 0.000 description 1
- 235000008566 Pinus taeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000218679 Pinus taeda Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 240000001416 Pseudotsuga menziesii Species 0.000 description 1
- 235000008572 Pseudotsuga menziesii Nutrition 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 229920001821 foam rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003050 macronutrient Effects 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229960001553 phloroglucinol Drugs 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000011232 storage material Substances 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/002—Culture media for tissue culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se vztahuje k oblasti metod pro rozmnožování rostlin technikami tkáňových kultur (tissue culture techniques), zejména k rozmnožování jehličnanových stromů somatickou embryogenezí (somatic embryigenesis).
Dosavadní stav techniky
Vzhledem k obecně dlouhému generačnímu cyklu u jehličnanů, šlechtění křížením a výběrem postupuje velmi pomalu a vzhledem k faktu, že u jehličnanů dochází obecně ke vzdálenému křížení (...notorious outbreéders) , je potomstvo dokonce vysoce vybíraných jedinců vysocé^variabilní. Díky rozmnožování klonováním (clonalipropagation) je ale možné zachytit jak doplňkové (additive), tak riědbplňkové (non-aditive) variace uvnitř populace, kterými se získá dodatečný genetický zisk. Pro řadu ekonomicky významných jehličnanů se vyvinuly metody rozmnožování klonováním, hlavně jako zakořeněné řízky, ale pro obrovské množství těchto druhů je sexuální rozmnožování semeny jedinou, nebo jedinou ekonomicky efektivní metodou, rozmnožování. _.·
Dokonce v těch případech, kdy se vyvinuly metody množení řízky, není výsledek vždy uspokojivý, protože procento zakořenění se snižuje se stářím mateřského stromu a protože je zde tendence pro plagiotropní růst řízků, které se neodebraly z apikálního výhonku. Tyto důvody jsou příčinou pro ohromnou celosvětovou snahu o vyvinutí ekonomicky výhodných metod pro reprodukovatelné rozmnožování jehličnanů klonováním.
Nástup genetických transformací jako prostředku pro šlechtění stromů si také vynutilo vývoj účinných a reprodukovatelných metod pro regeneraci rostlin z transformovaných pletiv. Je naprosto nutné, aby regenerační metody byly aplikovatelné na téměř všechny buněčné linie, aby se zabránilo jakékoliv nechtěné selekci během rozmnožovacího kroku, následujícím po transformačním kroku.
Zkrátka rostlinná regenerace somatickou embryogenezí u jehličnanů se skládá z řady návazných kroků. Za prvé se iniciuje embryogenní kultura z výchozí rostliny (ex-plant), jenž může být buď • · · ·
embryem, vyzrálým nebo nevyzrálým, semenáček, nebo v poslední době také poupata z dospělých stromů (WO 99/23874 AFOCEL). Tento krok se provede na jakémkoliv vhodném rostlinném živném médiu obsahujícím různé rostlinné hormonové regulátory do značné míry závislé na druhu rodu o který se jedná. Typicky se použije jak auxin, tak cytokinin, ale jsou také zprávy o iniciaci pouze cytokininem (N?rgaard & Krogstrup. 1995, s 344, Tabulka 1)., nebo dokonce iniciace bez jakýchkoliv regulátorů typu rostlinných hormonů (US 5 565 355 NEW 2EALAND FOREST RESEARCH INSTITUTE, N?rgaard & Krogstrup 1995, strana 345) .
Pro pokračující proliferaci jsou iniciované kultury buď dále pěstované (subcultured) na médiu o stejném složení, jako má indukční médium, nebo jsou dále pěstované na médiu s nižší koncentrací rostlinných růstových regulátorů. V tomto stádiu se proliferujicí buněčné hmoty skládají z více.či méně diferenciovaných nezralých somatických embryí, které morfologicky odpovídají fázi nacházející se ve vyvíjejících se semenech v časné fázi vývoje semen. Za optimálních podmínek nedochází u spmatických embryí k žádnému dalšímu vývoji během proliferace a nedochází tedy v této fázi ke tvorbě zralých embryí.
Aby se dosáhlo dozrání embryí, kultury se musí přenést na rostlinné živné médium, do kterého se typicky nepřidá auxin a cytokinin a přidá se kyselina abscisová (ΑΒΑ). V některých případech se zahrne krátké období přechodu (1—2 týdny) , během kterého se buněčné hmoty kultivují na rostlinném živném médiu postrádajícím rostlinné.růstové regulátory a někdy obsahující aktivované živočišné uhlí. Věří se, že tato fáze usnadní následující dozrávání díky nižšímu obsahu nebo nepřítomnosti auxinu a cytokiniu v kultivačním médiu a jejich možnému odstranění aktivovaným živočišným uhlím. Popsané je zdvojnásobení následující frekvence dozrávání (WO 93/11660).
Ukázalo se, že řada faktorů má obecný stimulační účinek na frekvenci dozrávání embrya a/nebo kvalitu vytvořených zralých embryí. Nejdůležitějším faktorem je přirozeně se vyskytující rostlinný růstový regulátor kyselina abscisová. Tato sloučenina nebo její analoga či deriváty jsou dnes zahrnuté téměř ve všech protokolech pro dozrávání somatických embryí jehličnanů.
Jiným důležitým faktorem pro proces dozrávání je osmolalita rostlinného živného média (WO 93/11660 UNIVERSITY OF SASKATCHEWAN).
• · · · • ·
Ukázalo se, že jejím zvýšením přidáním nepronikajícího (non-permeating) osmotika, jako například PEG-4000 (Polyetylenglykol 4000), se zlepšuje hlavně kvalita zralých embryí. Předpokládá se, že zlepšení je způsobené zvýšením hladiny triacylglyceridů v dospělých embryích. Triacylglyceridy jsou ukládané v buňkách během dospívání zygotických embryí a jsou použité jako zdroj energie při klíčení. PEG-4000 nebo podobné sloučeniny se rutinně přidávají do médií určených k dozrávání.
U velké většiny jehličnanů se přidává sacharóza jako výhradní zdroj sacharidů (carbohydrate) pro krok dozrávání. Jsou ale zprávy, že zejména malťóza může poskytnout lepší výsledky. Bylo to popsané,u poddruhu Pinus (Pinus ssp) (US 5187092 INSTITUT OF PAPER SCIENCE AND TECHNOLOGY) a pro Abies nordmanniana (Plant Science vol 124:
211-221, N7RGAARD).
Jsou také zprávy, že zahrnutí auxinu do dozrávacícho média může stimulovat jak počet formovaných zralých somatických embryí, tak jejich kvalitu. US 5187092 INSTITUTE7OF PAPER SCIENCE AND TECHNOLOGY uvádí použití 0,5-2,0 μΜ IBA + 10-40 μΜ ΑΒΑ pro dozrávání somatických embryí Pinus taeda a Pseudotsuga menziesii a Roberts et al. (1990) uvádí použití 0,1-10 μΜ IBA + 40 μΜ ΑΒΑ pro dozrávání Picea glaucaxengelmanii. Takže bylo ukázáno u velmi odlišných druhů ze tří různých rodů, že zahrnutí auxinu během dozrávání zlepšuje proces.
Jak se uvedlo v WO 96/37096 (CARTER HOLT HARVEY LTD.) procento iniciovaných buněčných linií, které jsou schopné tvořit zralá embrya, je typicky 1-10%. WO 96/37096 se zmiňuje o až 25%, získaných s vybranými embryogenními buněčnými liniemi. Jestliže se pro hromadné množení mají použít tyto metody a mají se kombinovat se šlechtěním v lesnictví nebo zahradnictví, je maximálně důležité, že nedochází k žádné nebo jenom velmi malé selekci v kroku množení. Hodnotné klony se můžou ztratit, když je není možné množit.
U Picea abies bylo možné rozdělit buněčné linie do dvou skupin, založených na jejich morfologii a schopnosti buněčných linií vytvořit zralá somatická embrya. Buněčné linie schopné produkovat zralá somatická embrya se nazývají buněčné linie A-typu a snadno produkují dospělá embrya, když se podrobí známým postupům s využitím kyseliny abscisové vyvolávajícím dozrávání. Na druhé straně zhruba 50% buněčných linií se může charakterizovat jako buněčné linie » ···
B-typu, které neposkytují snadno zralá somatická embrya (von Arnold et al. 1995).
Jiný problém spojený s metodami zmíněnými dříve je nedostatek reprodukovatelnosti.
U mnoha druhů je problémem proliferace během fáze dozrávání. Když proliferace pokračuje během dozrávání, je proces dozrávání inhibován a v mnoha případech jsou dozrávající embrya přerůstána proliferujícím pletivem. U druhů náležícím k Picea, Pinus a Larix nepokračuje proliferace do stejného stupně jako u druhů náležících k Abies, ale přesto může představvovat problém. Dozrávající embrya se primárně formují na okraji buněčné hmoty, tj. buď na její periferii nebo na vrcholu buněčné hmoty. Embrya vytvořená na okraji jsou v kontaktu s dozrávacím médiem a normálně dosáhnou dostatečné kvality co se týče morfologie a akumulace skladových živin. Embrya vytvářená na vrcholu proliferující masy buněk jsoupouze v nepřímém kontaktu s dozrávacím médiem a jsou také ovlivněna, sloučeninami (např.. rostlinnými regulátory)' vylučovanými nebo unikajícími z proliferujících buněk. Častým důsledkem je potom zpožděné dozrávání, hyperhydricita (hyperhydricity), neúplná morfologie (např. typicky znetvořené nebo chybějící dělohy) a snížená akumulace skladových živin.
Nakonec je známé, že schopnost zavedených embryogenních kultur prodělat dozrávání se s jejich věkem snižuje. Pro některé druhy, zejména členy rodu Pinus je tento pokles velmi rychlý, tj. dochází k němu během měsíců. Kultury z některých jir.ých rodů, jako Picea, . Larix a Abies jsou stabilní po delší dobu, ale ve většině případů je možné pozorovat určitý druh poklesu, <buď jako snížení frekvence dozrávání, nebo jako požadavek na delší dozrávací období či vyšší koncentraci látek pro dozrávání, jako kyseliny abscisové.
Podstata vynálezu
Prvním hlediskem vynálezu je poskytnutí metody pro dozrávání somatických embryí jehličnanů, zahrnující krok, kdy je embryogenní buněčná hmota pěstovaná na živném médiu s anti-auxinem.
Zahrnutím anti-auxinu do živného média během alespoň části dozrávání se získaly některé neočekávané a pozitivní účinky.
Redukovala se proliferace. To znamená, že se zastavila tvorba • · · · nových nevyspělých embryí. Samotné snížení proliferace usnadní přechod od proliferace k dozrávání. Ale frekvence dozrávání se zvýší více než se by čekalo jako důsledek omezení proliferace. Anti-auxin způsobí neočekávaný posun ve fyziologii od proliferace k dozrávání.
Téměř všechny testované embryogenní buněčné linie, nezávisle na druhu, reagují na dozrávací ošetření produkcí zralých somatických embryí. Tím se dosáhne mnohem většího procenta dozrávání než bylo dosud obvyklé.
Překvapivě se zjistilo, že kvalita somatických embryí není snížená, i když aktivita důležitého endogenního rostlinného růstového regulátoru, :auxinu, snížena je. Vlastně celková kvalita získaných zralých embryí na konci dozrávání je ve skutečnosti ve srovnání s dosavadním stavem zvýšená.
Další složky živného média, jako živiny, vitamíny, osmotika, organický dusík, - želatinační činidlo, (gelling agent), zdroje uhlíku a rostlinné růstové regulátory nejsou částí myšlenky vynálezu podle nároku 1. Výběr odborníka poskytuje nekonečné množství možností. Stávající znalosti obsahují četné příklady vhodných kombinací makro-živin a'mikro-prvků (viz např. George 1993) a také vhodných metabolizovatelných zdrojů uhlíku, jako například sacharózy, maltózy, laktózy, fruktózy, glukózy, maltoriózy, škrobu, galaktózy atd. Odborník se kromě toho může rozhodnout přidat do živného média vitamíny a různé zdroje organického dusíku, jako aminokyseliny, nebo jejich komplexní směsi, jako je kaseinový hydrolyzát nebo jiné hydrolyzáty. Kromě-toho může být výhodné zahrnout- osmotikum, například nepronikající (non-permeating) osmotikum, jako polyetylén glykoly, dextrany, celulózy, pektiny, galaktany, fikoly, polypropylen glykoly, agary, necelulózové polysacharidy (gums), oligosacharidy, proteiny, aminokyseliny, polyamino kyseliny, lipoproteiny, nukleotidy, oligonukleotidy, liposacharidy, nebo pronikající (permeating) osmotika, jako například polyetylén glykoly, alkoholové cukry, sorbitol, manitol a sacharidy. Živné médium použité v různých krocích dozrávání může být buď tekuté, kdy jsou buňky pěstované v médiu, nebo jsou v kontaktu s médiem na nějakém druhu tuhého povrchu. Nebo může být médium ve formě gelu při použití jedné nebo více gelujících látek, jako například gelrit (gelrite), phytagel, agar, agaróza, škrob nebo podobné látky. Nezávisle na živném médiu můžou být buňky pěstované na filtračním papíru nebo podobném podpůrném prostředku, který značně usnadňuje
subkultivaci.
Nakonec může živné médium použité při dozrávání obsahovat další rostlinné růstové regulátory, jako cytokininy, gibereliny, nebo dokonce auxiny.
V případě, kde je jeden z kroků vynálezu relativně krátký, např. kratší než 3 týdny, může být živné médium velmi jednoduché, bez jedné skupiny nebo všech skupin složek tradičních médií. Živné médium také může být jednoduše jenom voda nebo vodový gel, protože embryogenní buněčná hmota může snadno přežít určitou dobu bez živin a/nebo metabolizovatelného uhlíku.
Délka kroku s antiauxinem je přednostně mezi 2 dny a 50 týdny, přičemž záleží na druhu a konkrétní linii, o kterou se jedná. Experimenty ukázaly, že .zatímco některé buněčné linie by měly být. pěstované na médiu s anti-auxinem po celé.období dozrávání, jiné buněčné linie vyžadují pro vyvolání výše zmíněného efektu pouze 2-4 týdny, nebo dokonce méně. Podobně má zřetelný účinek stáří buněčné linie na celkovou délku období dozrávání, kdy mladší buněčné linie (jako například mladší než jeden rok) obecně dozrávají mnohem rychleji, než staré buněčné linie (starší než pět let). Takže mladší buněčné linie normálně také vyžadují kratší období vystavení anti-auxinu. Znakem příliš dlouhého vystavení anti-auxinu je objevení znetvořených embryí s nepravidelnými nebo chybějícími dělohami. V takovém případě by mělo být období vystavení anti-auxinu zkrácené.
Metoda přednostně, dále zahrnuje druhý krok před- krokem s anti-auxinem, kde je embryogenní buněčná hmota pěstovaná s živným médiem. Pro většinu druhů a buněčných linií,, vystavení anti-auxinu hned na začátku dozrávání mělo za následek snížení životnosti očkovaných (plateb) buněk. To je částečně dané skutečností, že nově naočkované buňky jsou ve stavu stresu a kultura se musí na dozrávacím médiu před aplikací anti-auxinu „ujmout („establish). Délka druhého kroku před krokem s anti-auxinem je výhodná mezi dvěma dny a 10 týdny.
Často je také žádoucí třetí krok po anti-auxinovém kroku, kde je embryogenní buněčná hmota pěstovaná s živným médiem v podstatě bez anti-auxinu. Jak je řečeno výše, příliš dlouhé působení anti-auxinu může mít nežádoucí vedlejší účinky; v takovém případě se kultura s dozrávajícími embryi přenesla do živného média postrádajícího anti-auxin, ale s ostatními nezbytnými složkami pro pokračující dozrávání. Třetí krok po kroku s anti-auxinem trvá přednostně od dvou dnů do 40 týdnů.
Změna přidaného metabolízovatelného zdroje uhlíku v živném médiu, například z maltózy na sacharózu ve třetím kroku bez anti-auxinu, má překvapivě pozitivní účinek na dozrávání, co se týče velikosti zralých embryí, vzhledu embryí a zkrácení období dozrávání.
V preferovaném případě vynálezu živné médium alespoň jednoho kroku také obsahuje látku pro dozrávání. Zatímco je dozrávání možné bez použití jakékoliv dozrávacího činidla, zjistilo se, že přidání takovéto látky do živného média značně zvyšuje frekvenci dozrávání a kvalitu embryí. V závislosti na délce různých fází může být činidlo pro dozrávání přítomné během jednoho, dvou nebo všech tří kroků. Přednostně je toto činidlo přítomné během všech tří kroků.
Činidlo pro dozrávání je vybrané ze skupiny-zahrnující (angl. termíny) «abscisic acid, silver nitráte, jasmonic acid, abscisyl alcohol, acetylenic aldehyde, dihydro-acetylenic alcohol, phaseic acid, dihydrophaseic acid, 6'-hydroxymethyl abscisic acid, beta-hydroxy abscisic acid, beta-methylglutaryl abscisic acid, beta-hydroxy-beta-methylgfutarylhydroxy abscisic acid, 4’-desoxy abscisic acid, abscisic acid, beta-D-glucose ester,
2-2(2-p-chlorophenyl-trans-ethyl)cyclopropane carboxylie acid». U těchto činidel se zjistilo, že podporují dozrávání,, nebo jsou analogy či deriváty takovýchto činidel.
Nejlépe když je.činidlem pro dozrávání kyselina abscisová, která vykazuje zvláště dobrou podporu dozráváním Koncentrace kyseliny abscisové v médiu, je,přednostně v rozsahu mezi 0,1 a 200 μΜ.
Nová myšlenka předkládaného vynálezu zahrnuje všechny metody pro omezení účinku auxinu během období dozrávání. Toho se může dosáhnout přidáním sloučenin s anti-auxinovým účinkem, například sloučenin způsobujících degradaci auxinu, sloučenin inhibujících auxinový' účinek, sloučenin způsobujících inaktívací auxinu, sloučenin inhibujících syntézu auxinu, nebo sloučenin inhibujících transport auxinu. Jiná možnost, jak inhibovat syntézu nebo účinek auxinu, je vynechání sloučenin, které jsou nezbytné pro syntézu auxinu, jako například bóru nebo zinku, nebo sloučenin vedoucích v biosyntetických drahách k auxinu, jako je tryptofan.
Anti-auxiny jsou podle vynálezu například následující sloučeniny a «4·· ···· jejich analoga a deriváty: (angl. termíny) «?-(1-naphtylmethylsulfide)-isobutyric acid, ?-(1-naphtylmethyl-sulfide)propionic acid, ?-(2-naphtylmethyl-sulfide)-isobutyric acid, ?-(2-naphtylmethyl-sulfide)-propionic acid, ?-(naphtylmethyl-selenide)-?-valeric acid, (-)-?-(2,4,5-trichlorophenoxy)-propionic acid, (-)-?-(2,4-dichlorophenoxy)-propionic acid, (-)-?-(2-naphthoxy)-propionic acid, (+)(1-naphthoxy)-propionic acid, (3-phenyl, 1,2,4-thiadiazol-5-yl)thioacetic acid (PTAA), ?-naphtalene acetic acid (?-NAA), ?-phenylbutyric acid, 1-(n aphthylmethyl-sulfide)-propionic acid,
1- naphthylmethyl-selenidacetic acid,
2- (naphthylmethyl-sufide)-propionic acid,
2- (o-chlorophenoxy) -2-methylpropionic acid, . At.·--.... .
2,3,4,5,β-pentachlorophenoxyisobutyric acid, 2,3,5-trř-iodobenzoic acid (TIBA), 2,3,5-triiodobenzoic acid,
2,4,5-trichiorophenoxyisobutyric acid, 2,4,6-tríchlorophenoxyacetic acid (2,4,6-T), 2,4,6-ttichlorophenóxyisobutyric acid,
2.4- dichloroanisole (2,4-DCA), 2,4-dichlorophenoxyisobutyric acid (2,4-DCIP), 2,4-dichlorophenylsulfoneacetic acid,
2.4- dichlorophenylsulfoxideacetic acid, 2,6-dichlorophenoxyactic acid, 2-chlorophenoxyisobutyric acid, 2-naphtylmethýl-selenidacetic acid, 3-chlorophenoxyisobutyric acid, 3-indoleisobutyric acid,
3- nitro-4-flourobenzoid acid, 4-chlorophenoxyisobutyric acid, 5-methyltryptophan, 7-aza-indol, 9-hydroxyfluorene-9-carboxylic acid (HFCA) , ferulic acid, flavonoids=, indole-isobutyric. acid, kaempferol, maieic hydrazide, naptalam (N-l-naphtylphthalamic acid), p-Chlorophenoxyisobutyric acid (PCIB), p-coumaric acid, phenox yacetic acid, phenoxyisobutyric acid, phenylpropionic acid, quercitin, trans-cinnamic acid».Zvláště preferovaným anti-auxinem je PCIB, který je přednostně přítomný během anti-auxinového kroku v koncentracích mezi 0,01 a 200 μΜ. Zvláště' dobré výsledky se získávají s koncentrací PCIB mezi 1 a 5 0 μΜ.
Nová myšlenka je obecně aplikovatelná na všechny jehličnany a zejména na rostlinné druhy, které jsou členy Pinaceae. Uvnitř Pinaceae se zvláště skvělé výsledky s vynálezem dosahují u rodu Pinus, Picea, Abies, Larix a Pseudotsuga.
·«««
• ·· ·
Ve zvláště preferovaném případě vynálezu je jehličnan z druhu Abies, jako například Abies nordmanniana Lk. V jiném zvláště preferovaném případě vynálezu je jehličnan z druhu Picea, jako Picea abies L. Karst., nebo Picea sítchensis (Bong.) Carr.
Když je jehličnan z druhu Abies, jako Abies nordmanniana je výhodnější, když je anti-auxin PCIB v koncentraci mezí 1 a 100 μΜ. Experimentální údaje ukazují, že to je koncentrační rozsah nezbytný pro získání účinku podle myšlenky vynálezu. Příliš nízké koncentrace nevedou k požadovaným účinkům.
Když je jehličnanem druh Picea, preferuje se PCIB v koncentracích mezi 0,1 a 50 μΜ. Experimenty ukázaly, že aby se dosáhlo účinku podle vynálezu, měla by být koncentrace anti-auxinu relativně nízká. Jestliže se přidá příliš velká koncentrace, je účinek v případě druhů Picea více či méně smrtelný. Jednou velkou výhodou metody je to, že buněčné linie u kterých nedochází normálně k dozrávání (jako např. tak zvané buněčné linie B-typu u Picea abies ) poskytnou vlastně významné množství embryí podle předkládaného vynálezu.
V jiném aspektu vynálezu obsahuje živné médium, použité alespoň během části třetího kroku (po kroku s anti-auxinem), auxin.
Pozorovalo se, že v některých případech může být částečně inhibováno prodloužení buněk dozrávajících embryí dokonce i po přemístění z média obsahujícího anti-auxin. Přidání auxinu do média-během třetího kroku dozrávání může tento problém vyřešit a prodlužování pokračuje podle potřeb.
Koncentrace auxinu v živnéffl-médiu je přednostně mezi 0,001 a 100 μΜ. Auxin se přednostně vybere ze skupiny obsahující (angí. termíny) «indole acetic acid,.indolebutyric acid, kyselina naftalen octovou (naphtalene acetic acid) , 2,4-D, 2-naphtyloxyacetíc acid (NOA), 4-chloropheboxyacetic acid (4-CPA),
2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid:(MCPA),
2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 3,6-dichloroanisic acid (dí-camba), 4-amino-3,5,5-trichloropicolinic acid (picloram), othonil, 2-chloro-3(2,3-dichloro-phenyl)-propionitril (CDPPNj ».
Přesná délka expozice auxinu během třetího kroku by se měla určit experimentálně a může se pohybovat kdekoliv mezi 2 dny a 40 týdny.
Druhým aspektem vynálezu je poskytnutí dozrálého somatického •· ···· • · ’ · · » · · embrya jehličnanu získaného kteroukoliv z metod popsaných výše. V mnoha případech nebylo možné doposud připravit takováto embrya ve větších množstvích. Navíc často nebylo možné připravit embrya očekávatelným a reprodukovatelným způsobem.
Embryo podle vynálezu má přednostně obsah voda menší než 70% při vyjádření na základě čerstvé hmotnosti (wet weight). Dříve nebylo vždy možné získat zralá somatická embrya s obsahem vody pod 70%, zejména v případech, kdy docházelo během dozrávacího kroku k výrazné proliferaci. Protože se proliferace nedá postupy vynálezu usměrňovat, je také možné prodloužit období dozrávání a tak umožnit embryím nashromáždit větší množství skladovacího materiálu, jako například triacylglyceridů a skladovacích proteinů. Akumulace skladovacích látek má výrazný vliv na následující proces klíčení.
Embryo podle vynálezu může být tranšgenní a obsahovat tedy rekombinantní DNA sekvence; transformace se provádí v kroku před dozráváním. V současnosti je jediný způsob jak vytvořit tranšgenní embrya jehličnanů - transformací buněk různými .známými způsoby a následovnou regenerací rostlin somatickou embryogenezí. V mnoha případech nebylo možné získat somatická embrya z transformovaných hmot embryogenních buněk. Transformace a následující proces selekce vystaví hmotu embryogenních buněk stresu a trvá také velmi dlouho. Proto v tomto kroku buněčné linie často...ztrácí svojí schopnost tvořit somatická embrya. To je problém zvláště u druhů Pinus., kde schopnost produkovat dospělá somatická embrya klesá rychle s věkem.
Třetí aspekt vynálezu zahrnuje- rostliny jehličnanů získané z embryí podle vynálezu. Pro mnoho jehličnanových druhů a mnoho buněčných linií nebylo dříve možné regenerovat rostliny. S použitím metod podle předkládaného vynálezu procento druhů a buněčných linií, ze kterých se můžou získat dospělá embrya, výrazně vzrostlo. Protože embrya podle předkládaného vynálezu mají také vyšší kvalitu, zlepší se také klíčení embryí, otužování a další růst vyklíčených rostlin.
Rostliny podle vynálezu můžou být -také tranšgenní a obsahovat rekombinantní DNA sekvence.
Detailní popis.
Vynález je nyní detailněji popsán řadou příkladů a následujících obrázků:
*· 444»
4 • 4 • 4 • · 4 <·«
4» 44 : ; · « · i · · • · ·»
4444
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. Fotografie rychle rostoucí buněčné linie Abies nordmanniana vykazující dozrávání podle vynálezu a podle starších metod.
Obrázek 2. Fotografie pomalu rostoucí buněčné linie Abies nordmanniana vykazující dozrávání podle vynálezu a podle starších metod.
Obrázek 3. Grafické znázornění preferovaných aspektů anti-auxinové fáze podle vynálezu.
Obrázek 4. Preferovaný a nepreferovaný vzhled embrya podle vynálezu.
Obrázek 5. Fotografie buněčné linie. Abies nordmanniana dozrálé podle různých aspektů vynálezu.
Obrázek 6. Fotografie buněčné linie Abies nordmanniana dozrálé podle různých aspektů vynálezu.
Obrázek 7. Grafické znázornění hladiny endogenní kyseliny idolyl octové (IAA) ve třech liniích Abies nordmanniana.
Obrázek 8. Fotografie klíčeni a otužování embryí podle vynálezu.
Obrázek 9. Fotografie tří dospělých somatických embryí Abies nordmanniana; vlevo obrázek ukazující typické embryo postupu B) , uprostřed obrázek ukazující typické embryo postupu D) a vpravo obrázek ukazující typické embryo postupu. C).
Nová myšlenka se- testovala v řadě různých situací, s různými jehličnany a buněčnými liniemi různých vlastností, jako nově .. založené buněčné linie a starší buněčné linie, pomalu rostoucí buněčné linie, rychle proliferující buněčné linie, transgenní buněčné linie, buněčné linie, které můžou produkovat dospělá embrya známými metodami (jako buněčné linie A-typu) a buněčné linie, které neprodukují dospělá embrya známými metodami (jako buněčné linie B-typu). ..
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Dozrávání u založené (established) buněčné linie Abies nordmanniana
Materiál a metody:
··*· • t ···*
Rostlinný materiál
V předkládané studii se použily tři různé buněčné linie Abies nordmanniana. Testované buněčné linie se pěstovaly v nepřetržité kultuře po několik let. Buněčná linie G.3.8 se založila z nezralého zygotického embrya v roce 1989 na polovičním MS médiu (Murashige and Skoog, 1962), jak se popsalo dříve (N?rgaard & Krogstrup 1991), buněčná linie G.35.8 se založila se zralého zygotického embrya v roce 1991 na SH médiu (N?rgaard & Krogstrup 1995) a buněčná linie G.78.14 se založila v roce 1993 z nezralého zygotického embrya na modifikované polovičním BLG médiu (Verhagen and Wann, 1989), Od roku 1996 se všechny kultury udržovaly pasážováním jednou za čtrnáct dní na čerstvé poloviční BLG médium a kultivací při 24 ± 1 °C ve tmě. Buněčné linie G.3.8 a G.78.14 na udržovacím médiu rychle proli-ferovaly; doba pro zdvojnásobení hmotnosti byla kratší než 14 'dnů. Buněčná linie G.35.8 proliferovala relativně pomalu - doba nutná pro zdvojnásobení hmotnosti byla delší než dva týdny.
Živná média pro iniciaci a udržování
Poloviční MS médium (Murashige and Skoog, 1962) obsahovalo poloviční koncentraci MS makro, mikro a FeEDTA. MS vitamíny se modifikovaly - lOx thiamin-HCl, 100 mg/1 inositol, 500 mg/1 L-glutamin a kasein hydrolyzát. SH médium (Schenck and Hildebrandt, 1972) se modifikovalo přidáním 500 mg/1 L-glutaminu a kasinového hydrolyzátu. Poloviční BLG médium (Verhagen and Wann, 1989) se modifikovalo z polovičního MS média vynecháním NH4NO3 a snížením KNO na 50 mg/1. Přidal se KC1 (372,5 mg/1), L-glutamin (750 mg/1) a L-asparagin (50 mg/1). Vitaminy se modifikovaly použitím lOx thiamin-HCl, 100 mg/1 inositulu. U všech médií se pro ztuhnutí použil Phytagel (Gellan Gum) v množství 1,8 g/1 a pH se upravilo před autoklávováním na 5,7. Pro proliferaci se použila sacharóza v koncentraci 1% a BAP v koncentraci 5 μΜ. V udržovacím médiu se nepoužíval auxin. Aminokyseliny se připravily ve formě zásobního roztoku sterilizovaného filtrováním a přidaly po zautoklávování a ochlazení média na asi 50 °C.
Dozrávání
Standardní médium pro dozrávání (kontrola) je modifikované poloviční BLG proliferační médium popsané výše. Médium neobsahuje sacharózu a BAP, ale je doplněné 45 g/1 maltosy (Merck 5911), 50 g/1
4
PEG-4000 (Fluka) a 40 μΜ ΑΒΑ (Sigma A1049). Výběr těchto tří doplňků živného média je dán především druhy jehličnanů o které se jedná. Je známé, že u Abies nordmanniana se dosáhne nej lepšího dozrávání při použití maltózy místo sacharózy jako zdroje uhlíku. Podobně je známé, že přídavek PEG-4000 zlepšuje dozrávání. Nicméně je možné dosáhnout stejně dobrých výsledků s jinými kombinacemi těchto složek a také s využitím jiných složek s obdobnými účinky.
Podobně poloviční BLG médium se vybralo proto, že se zjistilo, že je vhodné pro mnoho jehličnanů včetně druhů Abies, Picea a Pinus. Rovnocenné základní médium se může použít se stejnými výsledky jako u BLG média; důležité je, že by základní médium mělo být vyvážené tak, aby splňovalo požadavky druhu jehličnanu, pro které je určené.
V tomto experimentu se standardní dozrávaní médium modifikovalo vynecháním PEG a přidáním tří následujících chemikálií, o kterých se tradičně předpokládá, že ovlivňují endogenní: .koncentraci přirozeně · se vyskytujícího auxinu IAA, nebo že ovlivňují normální účinky auxinu v rostlinných buňkách: 1) PCIB (antagonist.a auxinu) v koncentraci 25 nebo 117 μΜ, 2) TIBA (inhibitor transportu auxinu) v koncentraci 5 nebo 50 μΜ, 3) flouroglucinoí (phlouroglucinol) (inhibitor degradace auxinu) (viz George 1993, strana 429 dole až 430) v koncentraci 30 μΜ. Kromě těchto modifikací se standardní dozrávací médium modifikovalo 4) snížením koncentrace bóru (prekurzor pro syntézu kyseliny indolyl octové) na 10 μΜ, tj. na 20% normální koncentrace a nakonec 5) přidáním 25 μΜ PCIB do média bez ABA.
Kultury dozrávaly ve tmě při 24 + 1 °C.
Anti-auxiny a prostředky pro snížení vlivu endogenního auxinu se vybraly tak, aby representovaly různé druhy ošetření nebo různé sloučeniny. Experiment tak představuje velmi různé způsoby snížení koncentrace, auxinu nebo snížení účinku auxinu a také nezbytné kontroly a ošetření, u kterých se očekávalo zvýšení, koncentrace endogenního auxinu.
Očkování na plotny (Plating)
Dva týdny po posledním pasážování se přenesly 4 gramy embryogenních buněk do 250 ml lahve (modrý uzávěr) společně s magnetickým míchadlem. Přidá se 100 ml tekutého proliferačního média a suspenze se míchá 5 minut vysokou rychlostí na magnetickém míchadle; tak se získá homogenní suspenze buněk a buněčných shluků.
• · · ·
Kultura se potom jeden týden předkultivovala na rotačním míchadle (120 otáček/minutu) při 24+ 1 °C ve tmě. Po předkultivaci se kultura opět 5 minut míchala vysokou rychlostí na magnetickém míchadle. Pak se kultura přenesla do 100 ml odměrného válce a nechala 30 minut usadit. Supernatant se odstranil a ze zbývájící kultury se přenesou pipetou s uříznutým koncem 1 ml alikvotnl části na filtrační papír (Whatmann #2), umístěný na 25 ml dozrávacího média v 10 cm Petriho miskách (Nunc, Dánsko). Filtry obsahující dozrávající somatické kultury se přenesly na čerstvé médium každé 2 týdny.
Cílem očkování kultur na dozrávací médium je získat stejnoměrné rozmístění očkovaných buněk na pevném povrchu (v tomto případě' filtračním papíru) s cílem zvýšit reprodukovatelnost a snížit variábilitu. Dozrávání se může také vyvolat jednoduše přenesením shluků embryogenní buněčné hmoty do dozrávacího média. '
Klíčení
Dobře vyvinutá dospělá embrya se shromáždila pro aplikaci chladu asi po 20 týdnech dozrávání. Izolovaná dospělá embrya se přenesla na nylonový filtr, který se umístil na podložku z pěnové gumy ve vysokých Petriho miskách. Na dno a do víčka Petriho misky se umístil vlhký filtrační papír. Pro působení chladu se Petriho miska uzavřela, zalepila dvěmi otočkami polyetylenového filmu, obalila hliníkovou fólií a pak umístila na 4 týdny do tmy a 4 °C. Po ošetření chladem se nylonový filtr s dozrálými embryi přenesl na BMG-2 medium -(Krogstrup et al., 1988). BGM-2 médium obsahovalo 20 g/1 sacharózy, 10 g/1 aktivního živočišného uhlí (Merck 5411) a ztužilo se 3,5 g/1 Phytagelu (Gellan gum). Petriho misky se umístily v růstové místnosti při 20 °C s 16 hodinovou fotoperiodou. Po jednom týdnu klíčení se nylonová síť odstranila a embrya se dostala do přímého kontaktu s médiem. Po dvou týdnech klíčení se umístí embrya s kořeny vertikálně, s kořeny ponořenými do média. Později se klíčící embrya přenesou do půdy a umístí do řízeného skleníku.
Popsaná metoda pro dozrávání je pouze jedna z mnoha různých metod, které se můžou použít pro klíčení somatických embryí jehličnanů. Může se zjistit, že je výhodné zahrnout vysušovací krok mezi dozráváním embrya a klíčením. Během tohoto kroku se může embryo podrobit řízenému vysušování s cílem simulovat vysychání při dozrávání, ke kterému dochází v odpovídající poslední fázi dozrávání semene.
Obsah vody
Obsah vody ve zralých somatických embryích a embryích ze semen se měřil zvážením přibližně 25 embryí (čerstvá hmotnost, fresh weight, FW), vysušením při 60 °C po dobu dvou dnů a novým zvážením embryí (suchá hmotnost, dry weight, DW). Obsah vody se vypočítal z čerstvé hmotnosti: (FW-DW)/FW.
Výsledky
Obrázky 1 a 2 ukazují dozrávání dvou embryogenních buněčných linií Abies nordmanniana. Buněčná linie G.3.8 (Obrázek 1) je jedna z kultur, která na proliferačním médiu rychle prolíferuje. Stávající metody nevedou k tvorbě somatických embryí, nebo je jich velmi málo. Buněčná linie G.35.8 (Obrázek 2) je jedna z kultur, které proliferují na proliferačním médiu relativně pomalu. Stávající metodami tvoří několik zralých somatických embryí. Testovaly se čtyři různé protokoly pro dozrávání: : A) dozrávání po dobu 20 měsíců na médiu pro dozrávání s 40 μΜ ΑΒΑ a 5% PEG-4000 (kontrolní metoda). B) Dozrávání jako v A), ale v týdnu 4 až 8 kultury dozrávaly na médiu obsahujícím 40 μΜ ΑΒΑ a 25 μΜ PCIB. C) Dozrávání po dobu 20 týdnů na dozrávacím médiu obsahujícím 40 μΜ ΑΒΑ a 25 μΜ PCIB. D) Dozrávání po dobu 20 týdnů na médiu bez ABA, ale s 25 μΜ PCIB.
Obrázek 3 ukazuje několik dobře vyvinutých dozrálých somatických embryí na každé Petriho misce u linií G.3.8 a G.35.8 po dvaceti týdnech dozrávání podle čyř různých dozrávacích protokolů popsaných výše.
U testovaných embryogenních buněčných linií Abies nordmanniana došlo na kontrolním médiu s ABA a PEG (Obrázek ΙΑ, 2A a 3) k vytvoření pouze několika zralých embryí. Ve většině případů u těchto kultur došlo k iniciaci dozrávání embryí, ale díky proliferaci okolního pletiva byla vyvíjející se embrya přerostlá.a dále se nevyvíjela. Na médiu obsahujícím jak ABA a 25 μΜ PCIB byla proliferace omezená a během dozrávání se vyvinul velký počet embryí (Obrázek 1B, 2B a 3), Počet dobře vyvinutých zralých embryí byl ale závislý jak na koncentraci, tak na období aplikace PCIB (Obrázek 3). Některé testované linie proliferovaly velmi rychle, zatímco buněčné linie na udržovacím médiu proliferovaly pouze pomalu. Tyto charakteristiky se zjistily také u buněčných linií pěstovaných na dozrávacím médiu a rychlost proliferace během dozrávání byla silně • · • · · ···· · · · • · ·· · · 9 · • 9 9 9 9 9 9 9 9 · ··· · · 9 · · · · • •9 99 ·· ···· 99 99 závislá na buněčné linii. Zjistilo se, že optimální aplikace PCIB během dozrávání je určená částečně rychlostí proliferace buněčné linie a není tedy možné najít obecný protokol pro aplikaci PCIB u všech testovaných linií. Pro ilustraci jsou uvedené výsledky u „rychle a „pomalu proliterující buněčné line. . .
Buněčná linie G.3.8 proliferovala rychle na udržovacím médiu a na dozrávacím médiu obsahujícím ABA a PEG a na médiu bez PCIB nedošlo k tvorbě dobře utvářených embryí vyvinutých během dozrávání (Obrázek 1A a 3). Když se do média přidalo 25 μΜ PCIB’ v týdnech 4 až 8 z dozrávacího období v délce 20 týdnů, došlo k tvorbě asi 40 dobře vyvinutých embryí a proliferace se lehce snížila (Obrázek 1B a 3). Při aplikaci 25 μΜ PCIB během celé dozrávací doby došlo ale k vytvoření 125 dobře formovaných embryí na Petriho misce a proliferace byla silně snížena (Obrázek 10 a Obrázek 3).
Buněčná linie G.35.8 proliferovala pomalu na udržovacím médiu a také během dozrávání na médiu obsahujícím ABA a PEG. Na kontrolním médiu došlo k vytvoření pouze několika dospělých embryí (Obrázek 2A a 3) a zahrnutí PCIB do dozrávacího média mělo jasně pozitivní účinek na počet dobře vyvinutých embryí u této buněčné linie.
Nej lepších výsledků se ale dosáhlo, když se PCIB přidalo do dozrávacího média pouze v týdnech 4 až 8 z 20 týdenního dozrávacího období - došlo k vytvoření asi 250 embryí na Petriho misku (Obrázek 2B a 3) . Oproti, buněčné linii G.3.8, zahrnutí PCIB během celého dozrávacího období u buněčné linie G.35.8 mělo negativní účinek na počet dobře vyvinutých zralých embryí (Obrázek 2C a 3) - vytvořilo se pouze asi 15 dobře tvarovaných embryí na Petriho misku.
Jestliže se z dozrávacího média obsahujícího 25 μΜ PCIB vyřadila ABA, začal v kultuře dozrávat relativně vysoký počet embryí; ale na tomto médiu se vyvinulo pouze několik, zřetelně abnormálních a časně klíčících embryí u všech testovaných buněčných linií (Obrázek ID a 2D). Protože na médiu bez jak anti-auxinu, tak ABA prakticky nedocházelo k dozrávání, je jasné, že anti-auxiny hrají samy roli při dozrávání embryí. Jako v jiných případech, kdy došlo k přidání PCIB, omezila se proliferace.
Obrázek 4 ukazuje morfologii zralých somatických embryí Abies nordmanniana a typické abnormality způsobené předávkováním (over-exposure) PCIB během dozrávání. A: dobře vyvinuté embryo s rovnou osou od kořenů po nadzemní část (shoot) a asi 5 dělohami • ·· · • · · · · · • 4 · · · 4 · · · * · · · 4444
4444 4 · · 4 • 44 ··· ··· ··· ·· 44 ···· 44 44 obklopujícími nadzemní meristém (shoot meristem). B: embryo s pouze dvěmi dělohami. Embryo je relativně symetrické okolo vertikální osy a nadzemní meristém je normálně nedotčený. C: embryo s dvěma dělohami. Embryo je zřetelně asymetrické s velkou a malou dělohou. Nadzemní meristém je postižen abnormalitou. D: embryo s pouze jednou dělohou. Embryo nemá funkční nadzemní meristém.
Dobře vyvinuté dozrálé somatické embryo Abies nordmanniana má rovnou osu od kořenů po nadzemní část a asi 5 děloh (Obrázek 4A).
Když byly buněčné linie pěstované na dozrávacím médiu obsahujícím PCIB ve vyšší než optimální koncentraci (nebo pro některé buněčné linie po příliš dlouhou dobu), vyvinul se velký počet abnormálních dozrálých embryí. Velmi charakteristikou abnormalitou je. snížení počtu děloh (Obrázek 4B-D). Když se pomalu proliferující buněčné linie pěstovaly na médiu obsahujícím ABA a 25 μΜ PCIB po období delší jak. 4 týdny, vyvinula se embrya s pouze dvěmi symetrickými dělohami (Obrázek 4B). Když se u testovaných linií použila vyšší koncentrace PCIB než 25 μΜ, vyvíjela se embrya nesymetricky s jednou malou a jednou velkou dělohou (Obrázek 40), nebo s pouze jednou dělohou (Obrázek 4D). Tyto nadzemní meristémy se zdají být neporušené u zralých embryí se dvěmi symetrickými dělohami a tyto embrya můžou dále klíčit a vyvíjet se, ale zralá embrya se dvěmi asymetrickými dělohami nebo pouze jednou dělohou neklíčí správně.
Obrázek 5 ukazuje dozrávání buněčné linie G.78.14. Tato buněčná linie rychle proliferuje a produkuje dosavadními metodami velice málo normálních zralých-embryí. Buněčná linie dozrávala 20 týdnů na médiu obsahujícím 40 μΜ ABA a a) 25 μΜ PCIB, b) 0,4 mM floroglucinolu (phloroglucinol), nebo c) sníženou koncentraci bóru (20% normální koncentrace). Kontroly jsou na obrázcích la a 2a.
Médium se sníženou koncentrací bóru mělo také pozitivní vliv na počet dozrálých embryí (Obrázek 5). Na dozrávacím médiu se sníženou koncentrací bóru došlo u některých testovaných linií k jasnému zvýšení počtu vyvíjejících se dozrálých embryí. U těchto kultur ale pokračovala proliferace a přerostla vyvíjející se embrya a tím se snížil počet dobře vyvinutých embryí. Protože se snížená koncentrace bóru testovala pouze při jedné koncentraci je možné, že by se mohlo dosáhnout pozitivního účinku optimalizací koncentrace bóru.
Když proběhlo dozrávání embrya na médiu s floroglucinolem (0,4 mM), nevytvářela se u testovaných linií dobře vyvinutá embrya a zvýšila se proliferace (Obrázek 5). Předpokládá se, že floroglucinol • · • · · · » · · · · to O to · to • · toto to··· to to··· ♦··· · ··· · » · ···· ••to ·· ·· ···· ·· ·· působí jako inhibitor degradace auxinu a přidání floroglucinolu tak zřejmě způsobuje zvýšení'koncentrace endogenního auxinu.
Obrázek 6 ukazuje dozrávání buněčné linie G.78.14 po dobu 20 týdnů na dozrávacím médiu obsahujícím 40 μΜ ΑΒΑ a a) 2,5 mg/1 TIBA (5 μΜ), nebo b) 25 mg/1 TIBA (50 μΜ). . .
U obou testovaných koncentrací inhibitoru transportu auxinu, TIBA,, došlo k silnému snížení proliferace na dozrávacím médiu u všech testovaných buněčných linií, ale vyvinulo se pouze velmi málo zralých embryí , většinou nenormálních (Obrázek 6). Protože se TIBA testovala pouze ve dvou koncentracích (5 a 50 μΜ), není možné vyloučit možnost, že by se pozitivního účinku mohlo dosáhnout s nižší koncentrací.
Obrázek 7 ukazuje endogenní koncentraci kyseliny indolyl octové utři linií Abies nordmanniana. Koncentrace se měřila během proliferace kultur .. . Proužky představují standardní odchylku.
Endogenní IAA* se nalezla v proliferujících kulturách všech 3 testqvaných buněčných linií (Obrázek 7). Koncentrace IAA ss pohybovala v rozsahu od 6 do 9 nmol/mg suché hmotnosti u kultur, ale nezjistil se výrazný rozdíl mezi „rychle proliferující a~pomaleji proliferující buněčnou linií.
Obsah vody ve zralém zygotickém embryu Abies nordmanniana byl asi 30%. Obsah vody ve zralých somatických embryích byl závislý na genotypu, ale u obou buněčných linií byl obsah vody v somatických embryích vyšší, než obsah vody v zygotických embryích. Pro somatická embrya na dozrávacím médiu-S...PCIB byl obsah vody mezi 65 a 75%, což je méně, než u odpovídajících dozrálých somatických embryí z dozrávacího média bez PCIB.
Obrázek 8A ukazuje klíčící embrya získané podle vynálezu.
Embrya se podrobila dvoutýdennímu působení chladu a následně dvoutýdennímu klíčení na médiu pro klíčení. Obrázek 8B ukazuje vyklíčené rostliny podle vynálezu přenesené do půdy pro otužování (hardening).
S použitím PCIB v dozrávacím médiu se vyvinul z několika buněčných linií vysoký počet dozrálých embryí. Klíčení embryí bylo v pořádku a téměř 100% embryí vytvořilo kořeny i nadzemní část a více než 2000 rostlin se přeneslo do půdy a do.skleníků (Obrázek 8B). Regenerované rostliny byly obecně ve stavu vegetativního klidu (dormant), stejně jako v případě semenáčků toho samého druhu.
• * ·· • · · · · · • · v · · · · · · · • · · * · · · · • · · · · ··«· · ······ · · · · ··· ·· ·· ···· ·· ··
Rostliny přežívaly v půdě, ale bylo velmi těžké docílit dalšího růstu z pupenu. Problém se pravděpodobně vztahoval k dormanci a později bylo možné indukovat další růst optimalizací protokolu pro klíčení. Je známé,; že když se podrobí takovéto dormantní rostliny podmínkám krátkého dne a nízkých teplot po experimentálně určené časové období, dochází k vyrašení pupenů a tedy k pokračování růstu.
Příklad 2: Dozrávání u nově založených embryogenních kultur Abies nordmanniana.
Asi 50 buněčných linií se založilo z dospělých semen stejným způsobem jako u linie G.78.14 (Příklad 1). Kultury se založily a udržovaly na modifikovaném polovičním BLG mediu (viz Příklad 1). Kultury byly před dozrávacím postupem mladší než 6 měsíců.
Protokol
Kultury se očkovaly postupem popsaným v- Příkladu 1. U kultury se použily dva různé dozrávací protokoly.
1) Dozrávání po dobu 8 týdnů na živném médiu obsahujícím 40‘μΜ ΑΒΑ a 5¾ PEG-4000.
2) Dozrávání jako u 1), ale od 2 do 4 týdne byly kultury na médiu obsahujícím 40 μΜ ΑΒΑ a 25 μΜ PCIB.
Výsledky:
Předběžné výsledky ukázaly, že bylo škodlivé podrobit tyto nově ustanovené buněčné linie nepřetržitému působení anti-auxinu. Proto se zařadilo pouze jedno krátké období s působením anti-auxinu.
Především by se mělo uvést, že nově ustanovené buněčné linie vyžadují pro dozrávání podstatně kratší dobu, než starší buněčné linie. Část buněčných linií produkuje ve srovnání s kontrolou (ošetření 1) vysoký počet dobře vyvinutých zralých somatických embryí. Ostatní buněčné linie je neposkytovaly.
Při působení anti-auxinu po dobu dvou týdnů, jak je uvedeno výše,- produkovaly téměř všechny buněčné linie vysoký počet zralých somatických embryí podle vynálezu. Výsledkem je tedy to, že je možné produkovat zralá somatická embrya ze všech testovaných buněčných linií.
Příklad 3: Dozrávání u embryogeních kultur Picea abies.
• ··· • · • · · ·· ·
9 9 9 9 • 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 99
Rostlinný materiál
Pro uvedené experimenty se použily tři embryogenní buněčné linie, D.2.9, D.4.1, D.7.1 Picea abies, založené z nedozrálých semen v roce 1989 a uchovávané zamražené až do roku 1998, popsané Nlrgaard et al. (1993). Kultury se udržovaly na polotuhém proliferačním médiu BMI-S1 (Krogstrup 1986) zpevněném 1,8 g/1 gelritu (gelrite) dvoutýdenním pasážováním. Před přenesením na dozrávací médium se odvážily 4 g buněčné hmoty z každé buněčné linie a přenesly na 50 ml -tekutého proliferačního média v 250 ml Erlemayerových baňkách. Baňka obsahovala také sterilní magnet.
Předběžné ošetření
Pro rozrušení se kultury míchaly 5 minut magnetickým míchadlem. Potom se baňky 15 minut protřepávaly na rotačním míchadle při 175 ot./minutu. Médium s rozptýlenými buněčnými agregáty se následovně přelilo do 100 ml odměrného válce a nechalo 30 minut usadit. Odstranil se supernatant a 1 ml alikvoty buněk se nanesly na sterilní disky z papíru Whatman #54 umístěné na různých dozrávacích médiích. Pro každou kombinaci buněčné linie a ošetření se připravily tři opakování.
Protokoly pro dozrávání
Testovalo se pět protokolů pro dozrávání
A: Dozrávání na médiu BMG-1 (Krogstrup et al. 1988) modifikované zvýšením koncentrace ABA na 40 μΜ.
B: Jako A, ale od 2 do 4 týdně dozrávání na živném médiu obsahujícím 2,5 μΜ PC1B a 40 μΜ ΑΒΑ.
C: Jako A, ale od 2 do 4 týdne dozrávání na živném médiu obsahujícím 5,0 μΜ PCIB a 40 μΜ ΑΒΑ.
D; Dozrávání na médiu obsahujícím 2,5 μΜ PCIB a 40 μΜ ΑΒΑ
E: Dozrávání na médiu obsahujícím 5,0 μΜ PCIB a 40 μΜ ΑΒΑ
Výsledky
Buněčné linie D.4.1 a D.7.1, které jsou-typickými představitely buněčných linií tzv. A-typu, produkují zralá somatická embrya bez anti-auxinového kroku. Když se ale použil anti-auxinový krok, poskytly větší počet somatických embryí. Účinek anti-auxinového kroku bylo snížení proliferace během dozrávání.
Buněčná linie D.2.9 neprodukuje tolik embryí, jako zbývající dvě linie. Když dozrává bez anti-auxinového kroku, kultura postupně • ·»· zhňědne a ztrácí životaschopnost. Pak dojde k vytvoření zralých embryí. Když se zařadil anti-auxinový krok,. kultura nejdříve také začne hnědnout, ale později dojde k vytvoření nových shluků pěkné průsvitné proliferující embryogenní buněčné hmoty na okrajích kultury. Z této buněčné hmoty dochází následně k tvorbě vysokého počtu zralých somatických embryí.
Zdá se tedy, že zařazení anti-auxinového kroku má vliv na změnu buněčných linií, které nejsou schopné tvořit dospělá somatická embrya, na buněčné linie, které toho schopné jsou. Shluky nově formovaných buněčných hmot D.2.9 se přenesly zpět na proliferační médium a tak je možné produkovat z této kultury opět zralá embrya.
Je tedy možné použít jednu stránku metody podle vynálezu ke zlepšení schopnosti buněčných linií tvořit zralá somatická embrya. Toho se může zjevně dosáhnout podrobením kultur podmínkám popsaným výše u buněčné linie D.2.9, ale také; se toho může dosáhnout zahrnutím anti-auxinového kroku v proliferačním kroku, nebo v kroku mezi proliferaci a dozráváním.
Příklad 4: Dozrávání u embryogenních kultur Picea sitchensis.
Rostlinný materiál
V uvedené studii se použily dvě buněčné linie Picea sitchensis, G.1.12, G.1.13, založené z děloh ze zralých embryí. Kultury se založily a předběžně ošetřily na, BMI-S1 médiu stejně jako výše, ale s 1000 mg/1 kasein hydrolyzátu á 10 μΜ 2,4-D.
Předběžné ošetření, dozrávací médium a anti-auxinový krok stejné jako u Picea abies.
Výsledky
Obě testované buněčné linie produkovaly vysoký počet zralých somatických embryí jak s, tak bez anti-auxinového kroku.. Při zahrnutí anti-auxinového kroku došlo ale k jasnému omezení proliferace a zlepšil se všeobecný vzhled kultur.
Příklad 5: Transformace embryogeních buněčných kultur Abies nordmanniana a následující regenerace rostlin.
Embryogenní buněčné linie Abies nordmanniana sé transformovaly biolisticky s využitím metody uvedené ve Walter et al (1998) s několika modifikacemi. Zaprvé se místo Pinus radiata se jednalo o * · · · • · · · · ·
Abies nordmanniana. Pro proliferaci a také během selekčního kroku po transformaci se použilo poloviční BLG médium popsaném v Příkladě 1.
Přenášený plazmid byl plazmid pCW 122 obsahující reporterový gen uidA pod řízením CaMV 35S£promotoru a gen npt II selekčního znaku řízeného CaMV 35S promotorem.
Selekce se prováděla na proliferačním médiu obsahujícím 50 mg/1 geneticinu. Exprese reporterového genu uidA se detekovala v transformovaném embryogenním pletivu histochemicky (použitím GUS barvení) v odvozených zralých somatických embryích získaných postupem podle předloženého vynálezu a v regenerovaných rostlinách získaných také podle předkládaného vynálezu,.
Příklad 6: Dozrávání buněčných linií Abies nordmanniana zahrnující auxinovou fázi
Pro dozrávání buněčných linií se použily tři protokoly:
A) Dozráváni na živném médiu obsahujícím 40 μΜ ΑΒΑ a 5%
PEG-4000 (kontrola).
B) Jako A), ale živné médium obsahovalo 40 ug ABA a 25 ug PCIB od druhého do čtvrtého týdnu
C) Jako B), ale živné médium obsahovalo 40 ug ABA a 5 ug IAA od čtvrtého týdne.
Embrya připravená podle protokolu C byla delší, než embrya získaná podle protokolu B. Celková kvalita těchto embryí byla také vyšší, než kvalita embryí podle protokolu B.
Příklad 7: Dozrávání buněčných linií Abies nordmanniana se změnou maltózy na sacharózu jako zdroje sacharidů během posledního období (třetí fáze) dohrávacího období.
Kromě sacharidů mělo základní médium.pro dozrávání stejné složení jako kontrola v Příkladu ;1. Navíc zde ale bylo PCIB v dříve určené optimální koncentraci a období pro každou z testovaných buněčných linií. Během dozrávání se testovaly čtyři různé ošetření s různými kombinacemi sacharidů:
A) Dozrávání na živném médiu obsahujícím jako zdroj sacharidů během celého dozrávacího období 45 g/1 sacharózy.
B) Dozrávání na živném médiu obsahujícím jako zdroj sacharidů během celého dohrávacího období 45 g/1 maltózy. Typické embryo z tohoto ošetření je k vidění v levé části Obrázku 9.
4444 •4 4 4 · 4 · · « * · *4 4 4 * «
4444 4444 4 •·4 4·· 4444 ··· 44 44 4444 44 ··
C) Dozrávání na živném médiu obsahujícím v první fázi dozrávání 45 g/1 maltózy, nahrazené během posledních dvou týdnů dozrávacího období dozrávacím médiem s 22,5 g/1 sacharózy a 22,5 g/1 maltózy. Typické embryo z tohoto ošetření jsou k vidění v pravé části Obrázku
9.
D) Dozrávání na živném médiu obsahující jako zdroj sacharidů 45 g/1 maltózy během první fáze dozrávacího období, následované změnou dozrávacího média na dozrávací médium obsahující 45 g/1 sacharózy na poslední dva týdny dozrávacího období. Typické embryo z tohoto ošetření je k vidění ve střední části Obrázku 9.
Výsledky
Když se použila jako zdroj sacharidů sacharóza během celého dohrávaclho období (ošetření A) , nedošlo k tvorbě dobře vyvinutých zralých embryí. Všechna připravená zralá embrya vykazovala vyložené abnormality. Když se použila jako jediný zdroj sacharidů maltóza během celého dohrávacího období (ošetření B), připravil se velký počet embryí (jako na Obrázku 1C a 2B). Zralá embrya měla správný tvar, ale u většiny buněčných linií jsou tato embrya při srovnání se zralými zygotickými embryi malá.
Když se buňky přenesly -z dozrávacího média s maltózou během posledních dvou týdnů dozrávání na dozrávací médium obsahující sacharózu (ošetření C a D) , došlo k jasnému zvětšení velikosti dospělých embryí (Obrázek 9). Změnou na médium s 45 g/1 sacharózy (ošetření D) došlo k vývoji zralých embryí o podobné velikosti, jako zygotické embryo Abies nordmanniana. Průměrná čerstvá hmotnost zralých embryí z ošetření B) byla asi 50 mg ve srovnání se 120 mg průměrné čerstvé hmotnosti zralých embryí z.ošetření D). Další účinek ošetření D) ve srovnání s ošetřením B) bylo zkrácení dozrávacího období na asi 4 týdny. ..... .. ......
Pozorovaný účinek změny maltózy na sacharózu během poslední části období dozrávání byl překvapující a neočekávaný, protože předchozí výzkumy ukazovaly na jasně negativní účinek sacharózy během dozrávání somatických embryí z Abies nordmanniana (Plant Science vol 124: 211-221, N?rgaard) a jiných druhů jehličnanů (US 5187092 INSTITUTE OF PAPER SCIENCE AND TECHNOLOGY).
Dá se očekávat, že složky metabolizovatelného zdroje uhlíku a zejména zdroje sacharidů obecně budou mít neočekávané účinky na dozrávání. Bylo by možné navrhnout složky jako laktóza, fruktóza, • · • * ·· • · · · 4 4 «
4 4 · 4 » • · · · 4 · « • · 4 4 4 4 4
4444 «4 44 glukóza, maltotrióza, škrob, galaktóza nebo jejich směsi. Zvláště fruktóza a glukóza samotné nebo ve směsi vykazovaly podobné pozitivní účinky na zralá embrya. Živné médium má obsah fruktózy nebo glukózy mezi 1 a 100 g/1. ' ·♦·« • ·»« ·· ······· · • · ♦· · · 4 · • · · · · ♦··· · • · · 4 · 4 4 4 4 4 • 44 ·· 44 4444 ·· 44 von Arnold S, Egertsdotter U, Ekberg I, Gupta P, Mo.H, N?rgaard,J, 1995, Somatic embryogenesis. in Norway spruce (Picea abies), In: Somatic embryogenesis in woody plants, vol 3 (eds S Jáin, P Gupta, R Newton), Kluwer Academie Publishers, pp 17-36.
Aitken-Christie J, Parkes BD, 1996, Improved embryogenesis process for initiation and maturation, PCT-application, published as W096/37096.
Attree SM, Fowke LC, 1993, Maturation, desiccation, and encapsulation of gymnošperm somatic embryos, PCT-application, published as W093/11660.
George EF, 1993, Plant Propagation by Tissue Culture, Part 1, The Technology. Execetics Ltd, 2nc* Editidh.
Krogstrup P, 1986, Embryolike structures from cotyledons and ripe embryos of Norway spruce (Picea abies), Can. J. For. Res. vol. 16:664-668.
Krogstrup P, Enksen EN, Moller JD, Roulund H, 1988, Somatic embryogenesis in Sitka spruce (Picea sitchensis (Bong.) Carr.), Plant Cell Rep. vol. 7:594-597.
Murashige T, Skoog F, 1962, A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures, Phys.iol Plant vol. 15:473-497.
N0rgaard JV, 1997, Somatic embryo maturation and plant regeneration in Abies nordmanniana Lk., Plant Science vol 124:211-221.
NýJrgaard JV, Krogstrup P, 1991, Cytokinin induced somatic embryogenesis from immature embryos of Abies nordmanniana Lk.,
Plant Cell Rep vol 9:509-513.
N^rgaard JV, Duran V, Johnsen 0, Krogstrup P, Baldursson S, von Arnold S, 1993, Variations in cryotolerance of embryogenic Picea abies cell lineš and the association to genetic, morphological and physiological factors, Can J For Res 23:2560-2567.
«· 4444 • 4 • · 4 · · · · 4 4 β • · 44 4444
4444 4444 4
444 444 4444
444 44 44 4444 44 44
Nj^rgaard JV, Krogstrup Ρ, 1995, Somatic embryogenesis in Abies spp°, Somatic embryogenesis in Woody Plants, Eds S Jain, P Gupta, R Newton, vol 3:341-355.
Paques M, Bercetche J, 1999, Procede de rajeunissement de gymnospermes par embryogenese somatique, PCT-application, published as W099123874.
Roberts DR, Flinn BS, Webb DT, Webster FB, Sutton BCS, 1990, Abscisic acid and indole-3-butyric acid regulation of maturation and accumulation of storage proteins in somatic embryos of interior spruce, Physiol. Plant. Vol 78:355-360.
Schenck RU, Hildebrandt AC, 1972, Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures, Can. J. Bot. vol. 50:199-204. ’
Smith DR, 1996, Growth medium, US patent # 5565355, issued 15.10.1996.
Uddin MR, 1993, Somatic embryogenesis in gymnosperms, US patent # 5187092, issued 16.02.1993.
Verhagen SA, Wann SR, 1989, Norway spruce somatic embryogenesis: High frequency initiation from light-cultured mature embryos, Plant Cell Tiss. Org. Cult. vol. 16:103-111.
Walter C, Grace LJ, Wagner A, White DWR, Walden AR, Donaldson SS, Hinton H, Gardner RC, Smith DR, 1998, Stable transformation and regeneration of transgenic-plants of Pinus radiata D. Doň, Plant Cell Reports 17:460-468.
Claims (4)
- PATENjOVE nároky1. Metoda pro dozrávání somatických embryí jehličnanů, zahrnuj ící t ' krok, kde je embryogenní buněčná hmota pěstovaná s živným médiem obsahujícím anti-auxin.
- 2. Metoda podle nároku 1, zahrnující dále druhý krok před ánti-auxinovým krokem, kde je embryogenní buněčná hmota pěstovanás' živným médiem. ž ivvt ”
- 3. Metoda podle nároku 1,zahrnující dále třetí krok po anti-auxinovém kroku’,·, kde je embryogenní buněčná hmota pěstovaná s živným médiem v podstatě bez auxinu. .y· j 4. Metoda podle nároku 1, kde anti-auxinový krok trvá od 2 dnů do 50 týdnů. ’5. Metoda podle nároku 2, kde druhý krok před anti-auxinovým krokem trvá od dvou dnů do 10 týdnů.'6. Metoda podle nároku 3, kde třetí krok pc anti-auxinovém kroku trvá od dvou dnů do 40 týdnů.7. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde živné 'médium alespoň v jednom kroku dále obsahuje dozrávací činidlo.8. Metoda podle nároku 7, kde živné médium ve všech krocích dále obsahuje alespoň jedno dozrávací činidlo.9. Metoda podle nároku 7, kde je dozrávací činidlo vybrané ze skupiny obsahující (angl .termíny) «abscisic acid, silver nitráte, jasmonic acid, abscisyl alcohol, acetylenic aldehyde, d ihydroacetylenic alcohol, phaseic acid, dihydrophaseic acid,6'-hydroxymethyl abscisic acid, beta-hydroxy abscisic acid, beta-methylglutaryl abscisic acid, beta-hydroxy-beta-methylglutarylhydroxy abscisic acid, 4'-desoxy abscisic acid, abscisic acid, beta-D-glucose ester,2-2(2-p-chlorophenyl-trans-ethyl)cyclopropane carboxylic acid»4444 ·· ·· ·· 4···
- 4 4 4 4 4 44 4 • 444 4 4 4 · · • 444 4 4 4 44« 4444 44 4«10. Metoda podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9, kde je dozrávacím činidlem kyselina abscisová (abscisic acid).11. Metoda podle nároku 10, kde je koncentrace kyseliny abscisové mezi 0,1 a 200 μΜ.12. Metoda podle nároku 1, kde je anti-auxin vybrán ze skupiny (angl. termíny) «?-(1-naphtylmethylsulfide)-isobutyric acid, ..?-(1-naphtylmethyl-sulfide)propionic acid, ?-(2-naphtylmethyl-sulfide)-isobutyric acid, ?-(2-naphtylmethyl-sulfide)-propionic acid, ?-(naphtylmethyl-selenide)-?-valeric acid, ř v, ~A (-)-?-(2,4,5-trichlorophenoxy)-propionic acid, (-)-?-(2,4-dichlorophenoxy)-propionic acid, (-)-?-(2-naphthoxy)-propionic acid, (+)-?-(1-naphthoxy)-propionic acid, (3-phenyl, 71/2,4-thiadiazol-5-yl)thioacetic acid (PTAA), ?-naphtalene acetic acid (?-NAA), ?-phenylbutyric acid,1-(naphthylmethyl-sulfide) -propionic acid, a-·· *· /=1- naphthylmethyl-selenidacetic acid, 72- (naphthylmethyl-sufide)-propionic acid,2- (o-chlorophenoxy)-2-methylpropionic acid,2,3,4,5,6-pentachlorophenoxyisobůtyric acid, 2,3,5-tri-iodobenzoic .acid (TIBA), 2,3,5-triiodobenzoic acid, ~2,4,5-trichiorophenox-ýisobutyric acid, 2,4,6-trích’lorophenoXyacetic acid (2,4,6-T), 2,4,6-trichlorophenoxyisobutyric acid,2.4- dichloroaniso]^ . (2,4-DCA), 2,4-dichlorophenoxyisobutyrie acid (2,4-DCIP), 2,4-dichlorophenylsulfoneacetic acid,2.4- dichlorophenylsulfoxideacetic acid, 2,6-dichlorophenoxyactic acid, 2-chlorophenoxyisobutyric acid, 2-naphtylmethyl-selenidacetic acid, 3-chlorophenoxyisobutyric acid, 3-indoleisobutyric acid,3- nitro-4-flourobenzoid acid, 4-chlorophenoxyisobutyric acid, 5-methyltryptophan, 7-aza-indol, 9-hydroxyfluorene-9-carboxylic acid (HFCA), ferulic acid, flavonoids, indole-isobutyric acid, kaempferol, maieic hydrazide, naptalam (N-l-naphtylphthalamic acid), p-Chlorophenoxyisobutyric acid (PCIB), p-coumaric acid, phenoxyacetic acid, phenoxyisobutyric acid, phenylpropionic acid, quercitin, trans-cinnamic acid».13. Metoda podle nároku 1, kde je anti-auxin PCIB.• ·· · «φ ··** ♦ « ·· ·>« tur··»· · • · · · » · · · • · · < · · · · · · • · · · · · · · · * ··· ·« ·· ···· ·· ··
14. Metoda podle nároku 1, kde j e anti-auxin PCIB v koncentraci mezi 0,01 a 200 μΜ. 15. Metoda podle nároku 1, kde j e anti-auxin PCIB v koncentraci mezi 1 a 50 μΜ. 16. Metoda podle nároku 1, kde j e jehličnan člen Pinaceae. 17. Metoda podle nároku 1, kde j e jehličnan vybrán j i rodů (from the genera) Pinus, Picea, Abies, Larix a Pseudotsuga. i 18. Metoda podle nároku 1, kde je jehličnan z druhu Abie.s. (Abies sp), .jako například Abies nordmanniana. 19. Metoda podle nároku 1, kde je jehličnan z druhu Picea (Picea sp), jako například Picea abies nebo Picea sitchensis.20. Metoda podle nároku 1, kde je jehličnan z druhu Abies (Abies sp), jako, například Abies nordmanniana a anti-auxinem je PCIB v koncentraci mezi 1 a 100 μΜ. ýl21. Metoda podle nároku 1, kde je jehličnan z druhu Picea a anti-auxinem je PCIB v koncentraci 0,1 a 50 μΜ.22. Metoda podle nároku 3, kde živné médium použité během alespoň části třetího kroku po anti-auxinovém kroku dále obsahuje auxin.23. Metoda podle nároku 22, kde je koncentrace auxinu.v živném médiu mezi 0,001 a 100 μΜ.24. Metoda podle nároku 22 nebo 23, kde je auxin vybraný ze skupiny obsahující (angl. termíny) «indole acetic acid, indolebutyr ic acid, naphtalene acetic acid, 2,4-D, 2-naphtyloxyacetic acid (NOA), 4-chloropheboxyacetic acid (4-CPA),2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA),2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 3,6-dichloroanisic acid (dicamba), 4-amino-3,5,5-trichloropicolinic acid (picloram), othonil, 2-chloro-3(2,3-dichloro-phenyl)-propionitdl (CDPPN)».25. Metoda podle kteréhokoliv z nároků 22 až 24, kde alespoň část třetího kroku zahrnující auxin trvá od dvou dní do 40 týdnů.• «··44 ··>·» • 4 44 «· · 4 4 · 4 · 4 »4 4 · » 4 4 4 4 • «444 444· 4444 ·«· 4444444 44 44 4444 44 4426. Metoda podle nároku 3, kde se embryogenní buněčná hmota dále kultivuje s živným médiem obsahujícím metabolizovatelný zdroj uhlíku.27. Metoda podle nároku 3, kde se embryogenní buněčná hmota dále kultivuje s živným médiem obsahujícím zdroj sacharidů.28. Metoda podle nároku 27, kde se embryogenní buněčná hmota dále kultivuje s živným médiem obsahujícím sacharózu.'29. Metoda podle nároku 27, kde se embryogenní buněčná hmota dále kultivuje s živným médiem obsahujícím fruktózu. n t30. Metoda podle nároku 27, kde se embryogenní buněčná hmota dále kultivuje s živným médiem obsahujícím glukózu.31. Metoda podle nároku 27, kde živné médim obsahuje mezi 1 a 100 g/1 metabolizovatelných zdrojů uhlíku..32. Metoda podle nároku 27, kde se další kultivování provádí po dobu od 2 dnů do 10 týdnů.33. Dospělé jehličnanové somatické embryo připravené metodou podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.34. Embryo podle nároku 33 s obsahem vody menším než 70%.35. Embryo-podle nároku 33, které je transgenní a obsahuje rekombinantní DNA sekvence.36. Rostlina jehličnanu připravená z embrya podle kteréhokoliv z nároků 33 až 35.37. Rostlina podle nároku 36 která je transgenní a obsahuje rekombinantní DNA sekvence.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99203104 | 1999-09-21 | ||
| US16193899P | 1999-10-28 | 1999-10-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021004A3 true CZ20021004A3 (cs) | 2003-05-14 |
Family
ID=56290059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021004A CZ20021004A3 (cs) | 1999-09-21 | 2000-09-20 | Metoda pro dozrávání somatických embryí jehličnanů |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1217884B1 (cs) |
| AT (1) | ATE354272T1 (cs) |
| AU (1) | AU778180B2 (cs) |
| CA (1) | CA2414842A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20021004A3 (cs) |
| DE (1) | DE60033536T2 (cs) |
| DK (1) | DK1217884T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0202610A3 (cs) |
| PL (1) | PL201417B1 (cs) |
| WO (1) | WO2001020972A1 (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7598073B2 (en) | 2002-04-09 | 2009-10-06 | Weyerhaeuser Nr Company | Methods for producing high yields of zygotic-like cotyledonary pine embryos utilizing media that include a disaccharide and glucose |
| US7381562B2 (en) | 2002-05-30 | 2008-06-03 | Weyerhaeuser Company | Methods for producing cotyledonary pine embryos utilizing a gibberellin |
| CA2435337C (en) | 2002-11-14 | 2010-03-23 | Weyerhaeuser Company | Methods for producing conifer somatic embryos |
| US7521237B2 (en) | 2003-06-23 | 2009-04-21 | Weyerhaeuser Nr Company | Methods for promoting maturation of conifer somatic embryos |
| US7732205B2 (en) | 2003-07-30 | 2010-06-08 | Weyerhaeuser Nr Company | Development and stratification of pine somatic embryos using a liquid system |
| US7520089B2 (en) | 2003-11-25 | 2009-04-21 | Weyerhaeuser Nr Company | Method to improve manufactured seed germination |
| CA2495650C (en) | 2004-02-25 | 2011-05-24 | Weyerhaeuser Company | Continuous culture of conifer embryogenic tissue |
| CA2496880C (en) | 2004-03-02 | 2011-01-18 | Weyerhaeuser Company | Methods for developing conifer somatic embryos |
| CA2568476C (en) | 2005-12-22 | 2015-03-17 | Weyerhaeuser Company | Methods for storing conifer somatic embryo germinants |
| CN102599064B (zh) * | 2012-04-11 | 2013-12-04 | 成都大学 | 一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法 |
| CN103109747B (zh) * | 2013-03-10 | 2014-07-09 | 通化师范学院 | 一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法 |
| CN103461119B (zh) * | 2013-08-20 | 2015-10-28 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 粗枝云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法 |
| WO2019007854A1 (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-10 | University Of Copenhagen | PROCESS FOR CULTIVATION OF SOMATIC EMBRYOS OF CONIFERS IN TREES |
| CN110305833B (zh) * | 2019-07-10 | 2022-04-01 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1387821A (en) * | 1971-05-18 | 1975-03-19 | American Cyanamid Co | Producing chemical plant metabolites by suspension culture |
| US5187092A (en) | 1990-03-22 | 1993-02-16 | Institute Of Paper Science And Technology, Inc. | Somatic embryogenesis in gymnosperms |
| ATE202261T1 (de) | 1991-12-19 | 2001-07-15 | Univ Saskatchewan | Desikkation von gymnosperm somatischen embryonen |
| US5565355A (en) | 1991-12-19 | 1996-10-15 | New Zealand Forest Research Institute Limited | Growth medium |
| WO1996037096A1 (en) | 1995-05-25 | 1996-11-28 | Carter Holt Harvey Limited | Improved embryogenesis process for initiation and muturation |
| JP3198895B2 (ja) * | 1995-10-05 | 2001-08-13 | 王子製紙株式会社 | ユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法 |
| FR2770745B1 (fr) | 1997-11-10 | 2001-05-18 | Afocel | Procede de rajeunissement de gymnospermes par embryogenese somatique |
-
2000
- 2000-09-20 WO PCT/DK2000/000522 patent/WO2001020972A1/en active IP Right Grant
- 2000-09-20 PL PL356259A patent/PL201417B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-09-20 AT AT00962248T patent/ATE354272T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-20 AU AU74042/00A patent/AU778180B2/en not_active Ceased
- 2000-09-20 DK DK00962248T patent/DK1217884T3/da active
- 2000-09-20 CZ CZ20021004A patent/CZ20021004A3/cs unknown
- 2000-09-20 HU HU0202610A patent/HUP0202610A3/hu unknown
- 2000-09-20 DE DE60033536T patent/DE60033536T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-20 EP EP00962248A patent/EP1217884B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-20 CA CA002414842A patent/CA2414842A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1217884T3 (da) | 2007-06-18 |
| CA2414842A1 (en) | 2001-03-29 |
| HUP0202610A2 (hu) | 2002-11-28 |
| DE60033536T2 (de) | 2007-11-15 |
| DE60033536D1 (de) | 2007-04-05 |
| EP1217884A1 (en) | 2002-07-03 |
| WO2001020972A1 (en) | 2001-03-29 |
| EP1217884B1 (en) | 2007-02-21 |
| AU7404200A (en) | 2001-04-24 |
| PL201417B1 (pl) | 2009-04-30 |
| PL356259A1 (en) | 2004-06-28 |
| ATE354272T1 (de) | 2007-03-15 |
| HUP0202610A3 (en) | 2004-03-01 |
| AU778180B2 (en) | 2004-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pati et al. | In vitro propagation of rose—a review | |
| Carraway et al. | Plantlet regeneration from somatic embryos of American chestnut | |
| EP1217884B1 (en) | Method for maturation of conifer somatic embryos | |
| Atree et al. | Micropropagation through somatic embryogenesis in conifers | |
| Bele et al. | Massive In vitro cloning of sandalwood (Santalum album linn.) via cultured nodal segments | |
| Perán-Quesada et al. | Factors affecting maturation of avocado somatic embryos | |
| Gomez et al. | Factors controlling adventitious bud induction and plant regeneration in mature Juniperus oxycedrus leaves cultured in vitro | |
| WO2008128842A1 (en) | In vitro rooting of hoodia plants | |
| US6897065B1 (en) | Method for maturation of conifer somatic embryos | |
| Taniguchi et al. | Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic embryos of Hinoki cypress (Chamaecyparis obtusa Sieb. et Zucc.) | |
| Becwar | Conifer somatic embryogenesis and clonal forestry | |
| EP2332405B1 (en) | Media comprising gellan gum and methods for promoting maturation of conifer somatic embryos | |
| CA2435337C (en) | Methods for producing conifer somatic embryos | |
| Ishii et al. | Somatic embryogenesis of Japanese conifers | |
| JP4303509B2 (ja) | マツの子葉胚を発生させる方法 | |
| Chalupa | Protocol of somatic embryogenesis: pedunculate oak (Quercus robur L.) and sessile oak (Quercus petraea/Matt./Liebl.) | |
| Attree et al. | Conifer somatic embryogenesis, embryo development, maturation drying, and plant formation | |
| Klimaszewska | Somatic embryogenesis in Picea mariana (Mill.) | |
| WO2008128847A1 (en) | In vitro multiplication of hoodia plants | |
| JP3069694B1 (ja) | 針葉樹不定胚の培養方法 | |
| Webb et al. | Eastern white pine (Pinus strobus L.) | |
| AU2003231584B2 (en) | Methods for producing conifer somatic embryos | |
| Wilson et al. | Somatic Embryogenesis in Picea glauca (white spruce), P. engelmannii (Engelmann spruce) and P. glauca engelmannii complex (interior spruce) | |
| WO2024197373A1 (pt) | Processo para obtenção de calos embriogênicos vegetais, para obtenção de embriões somáticos vegetais, para obtenção de plântulas, para produção de semente sintética, para modificação genética, e, semente sintética | |
| AU2006299757B2 (en) | Method of culturing conifer somatic embryos using S(+)-abscisic acid |