DE69736286T2

DE69736286T2 - Verfahren zur herstellung und transformation von manioka protoplasten

Info

Publication number: DE69736286T2
Application number: DE69736286T
Authority: DE
Inventors: Richard Gerardus Franciscus Visser; Christiaan Josef Johannes Raemakers; Evert Jacobson; Johanna Elisabeth Maria Bergervoet-Van Deelen
Original assignee: Cooperative Avebe UA; National Starch and Chemical Investment Holding Corp
Current assignee: Brunob II BV; Cooperative Avebe UA
Priority date: 1996-05-20
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2017-05-21
Also published as: EP0902838A1; ATE332384T1; JP2000510707A; US6551827B1; CN1219202A; WO1997044473A1; BR9709014A; AU2914897A; ZA974383B; AR007208A1; DE69736286D1; ID16936A; EP0902838B1; CN1230547C

Description

Die gentechnische Veränderung oder Transformation ist ein Verfahren, in welchem ein oder mehrere Gene einem kommerziell interessierenden Genotyp oder Klon hinzugefügt werden. Im Prinzip erfordert ein erfolgreiches Transformationssystem ein effizientes System, in welchem neue Pflanzen aus bestimmten Pflanzenteilen (Stängel, Blatt, Knoten usw.) oder aus Protoplasten (einzelne Zellen ohne Zellwand), die sich von diesen Zellen ableiten, gebildet werden, ein System zum Transfer von DNA-Molekülen auf die Pflanzenteile oder Protoplasten und ein System, um Gewebe und Pflanzen, die das (die) eingeführte(n) Gen(e) enthalten und exprimieren, auszuwählen.
Im Prinzip sind Protoplasten das ideale System für die Lieferung von DNA. Sie können als einzelne Zellen kultiviert werden, die vielzellige Kolonien produzieren, aus welchen sich Pflanzen entwickeln. Pflanzen, die von Protoplasten abgeleitet sind, sind im Allgemeinen vom Ursprung her klonal. Dies erweist sich als ein nützliches Hilfsmittel für ein Transformationssystem, da es Chimärenbildung in transgenen Pflanzen ausschließt.
Maniok ist für die Pflanzenregeneration aus Protoplasten sehr widerspenstig. Es gibt nur einen Bericht über die Schösslingsregeneration aus Maniokprotoplasten (Shahin und Shephard, 1980). Diese verwendeten gut entwickelte Blätter für die Isolation von Protoplasten. Trotz beträchtlicher Erfolge ist die Pflanzenregeneration aus Protoplasten (isoliert aus Blättern, Stängeln und wurzeln) seitdem nicht wieder wiederholt worden (Anonymus, 1985; Nzoghe, 1991; Anthony et al., 1995; Sofiari, 1996).
Ein logischer Ansatz wäre, Gewebe zu verwenden, die embryogene Zellen enthalten. Solche Zellen lassen sich finden in den apikalen Meristemen, jungen Blättern oder somatischen Embryos, die in mit Auxin ergänzten Medien kultiviert werden (Stamp und Henshaw, 1987a; Raemakers et al., 1993a). Jedoch ergaben die aus diesen Geweben isolierten Protoplasten bestenfalls einen grünen Kallus und zufällige Wurzeln (Sofiari, 1996). Jüngst ist jedoch ein neuer Typ der somatischen Embryogenese entwickelt worden. In diesem in-vitro-System entwickeln sich die Embryos nicht über das (vor-)globuläre Stadium hinaus, und der embryogene Kallus ist sehr krümelig (Taylor et al., 1995). Der Transfer dieses krümeligen embryogenen Kallus (FEC) auf ein flüssiges Medium resultierte in einer suspensionsartigen Kultur. Bei Lauch (Buitenveld und Creemers, 1994), Petunien (Power et al., 1979), Reis (Kyozuka et al., 1988), Zuckerrohr (Chen et al., 1988) und Weizen (Chang et al., 1991) waren solche Kulturen eine ausgezeichnete Quelle für die Protoplastenregeneratian.
Nun ist von uns festgestellt worden, dass bis jetzt bei Maniok FEC das einzige Gewebe ist, aus welchem sich Protoplasten isolieren lassen, die in der Lage sind, zu Pflanzen zu regenerieren.
Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Maniokprotoplasten bereitgestellt, wobei die Protoplasten zur Regeneration in Pflanzen befähigt sind, umfassend das Herstellen von krümeligem embryogenem Kallus aus Explantaten von Maniok und das Isolieren von. Protoplasten aus dem krümeligen embryogenen Kallus. Dabei hat es sich gezeigt, wie weiter unten beschrieben werden wird, dass, um geeignete Protoplasten zu erhalten, die Kultivierung des FEC in Lösung recht bedeutend ist. Des halb wird erfindungsgemäß weiterhin ein Verfahren bereitgestellt, in welchem der krümelige embryogene Kallus in einem flüssigen Medium kultiviert wird.
Protoplasten werden vorzugsweise hergestellt, indem Pflanzenzellen einem enzymatischen Abbau der Zellwände unterworfen werden. Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt, in welchem ein Gemisch von Zellwand abbauenden Enzymen wie eine Cellulase, eine Pektolyase und/oder ein Mazerozym verwendet wird, um Protoplasten zu erzeugen.
Weiterhin hat es sich gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren am besten funktioniert, wenn die Pflanzen, welchen Explantate entnommen werden, vorbehandelt werden. Deshalb wird erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt, in welchem die Pflanzen, denen Explantate entnommen werden, mit einem Auxin, wie weiter unten beschrieben wird, vorbehandelt werden.
Bei den Explantaten wird vorzugsweise eine Embryogenese ausgelöst, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren resultiert, wodurch der krümelige embryogene Kallus aus spindelförmigen primären oder reifen Embryos hergestellt wird. Der Grund dafür wird in der speziellen Beschreibung erläutert. Protoplasten, die durch das weiter oben offenbarte Verfahren erhältlich sind, sind ebenfalls ein erfindungsgemäßer Bestandteil.
Ein wesentlicher Grund dafür, dass es erwünscht ist, über Protoplasten zu verfügen, die zu Pflanzen regeneriert werden können, ist selbstverständlich, dass sich Protoplasten leicht transformieren, transduzieren oder mit zusätzlichen genetischen Informationen durch ein beliebiges anderes geeignetes Verfahren versehen lassen. Somit ist man nun in der Lage, Maniokpflanzen oder damit eng verwandte Spezies mit einem interessierenden genetischen Material zu versehen. Erfindungsgemäß wird somit auch ein Verfahren zum Transformieren (das als ein Liefern auf beliebige geeignete Art und Weise definiert wird) eines Protoplasten von Maniok oder einer damit eng verwandten Spezies bereitgestellt, indem man den Protoplasten mit zusätzlicher genetischer Information versieht, und zwar durch Infektion mit einem diese zusätzliche genetische Information enthaltenden Bakterium wie Agrobacterium tumefaciens, durch Elektroporation bzw. chemische Poration, was einen Vektor ergibt, der die zusätzliche genetische Information umfasst, oder durch Teilchenbombardement, wodurch die Teilchen mit der zusätzlichen genetischen Information beschichtet werden, wobei ein Protoplast, der aus dem krümeligen embryogenen Kallus erhältlich ist, transformiert wird. Die Erfindung umfasst auch transformierte Protoplasten, die durch ein solches Verfahren erhältlich sind.
Weiter unten wird eine kurze Einführung über die Nützlichkeit transformierter Pflanzen wie Maniok gegeben.
Die Anwendung der Pflanzengentechnik umfasst eine Vielzahl verschiedener Verfahren, die von der Isolation nützlicher Gene, deren Charakterisierung und Manipulation, bis zur Rückeinführung modifizierter Konstrukte in die Pflanzen (Lonsdale, 1987) reichen. Die Pflanzengentechnik wird den Fortschritt in der Pflanzenzucht beschleunigen, wie durch einige Beispiele transgener Kulturpflanzen wie Reis (Chen et al., 1987; Shimamoto et al., 1989), Mais (Gordon-Kamm et al., 1990; Vain et al., 1993), Weizen (Marks et al., 1989) und Kartoffeln (De Block, 1988; Visser et al., 1989) exemplifiziert. Der schnelle Fortschritt der Gentechnik hat eine Einsicht in den komplexen molekularen Mechanismus der Pflanzenpathogenerkennung und der natürlichen Verteidigungsstrategien von Wirtspflanzen erlaubt. Diese Technologie kann auch zur kontrollierten und effizienten Identifizierung erwünschter Genotypen weit über die Möglichkeiten der klassischen Züchtung hinaus angewendet werden.
So führte beispielsweise die Elektroporation von Protoplasten, die von Suspensionkulturen abgeleitet worden sind, zur Transformation von Mais (Rhodes et al., 1988), Reis (Toriyama et al., 1988) und Wiesen-Knäuelgras (Horn et al., 1988).
Es sind erfolgreiche Versuche unternommen worden, um die Resistenz gegen pathogene Viren wie das Tobamovirus bei Tabak (Powel Abel et al., 1986) und das Potexvirus bei Kartoffeln (Hoekema et al., 1989) und Papaya (Fitch et al., 1992) zu verbessern. In diesen Beispielen basierte die eingeführte Behandlung auf der Expression einzelner Gene, die für das Beschichtungsprotein codieren. Bei Maniok können das afrikanische Maniok-Mosaikvirus (ACMV) und das gemeine Maniok-Mosaikvirus (CCMV) durch das Beschichtungsprotein-vermittelte Resistenzverfahren bekämpft werden (Fauquet et al., 1992). Die Gene, welche für die Schlüsselenzyme der Cyanogenese codieren, sind kloniert worden (Hughes et al., 1994), was die Manipulation der Maniok-Cyanogenese durch genetische Transformation unter Anwendung des antisense-Ansatzes ermöglicht. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Manipulation von Stärke in Maniokknollen.
Somit wird erfindungsgemäß ein transformierter Protoplast bereitgestellt, wobei die zusätzliche genetische Information ein antisense-Konstrukt umfasst, insbesondere eine, wobei das antisense-Konstrukt in der Lage ist, den Amylose-Syntheseweg zu hemmen.
Ein Protoplast kann weder auf dem Feld wachsen noch kann er geerntet werden. Obwohl Protoplasten für die Transformation erforderlich sind, muss es möglich sein, diese Protoplasten zu Embryos und/oder Pflanzen zu regenerieren. Dies ist eine sehr bedeutende erfindungsgemäße Ausführungsform, da es sich gezeigt hat, dass Maniok schwierig aus Protoplasten zu regenerieren ist. Die spezielle Beschreibung wird erläutern, wie dies erreicht werden kann. Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Regenerieren von Pflanzen aus Protoplasten bereitgestellt, in welchem ein erfindungsgemäßer Protoplast induziert wird, um einen Embryo zu erzeugen, der anschließend induziert wird, um eine Pflanze zu produzieren.
Spezielle Beschreibung
Auslösen des FEC
Das Verfahren, um einen FEC zu erhalten, ist in 1 dargestellt. Es beginnt mit der Induktion primärer Embryos. Primäre Embryos werden in einem zweistufigen Verfahren gebildet. In der ersten Stufe werden Explantate in einem Medium kultiviert, das ergänzt ist mit Salzen und Vitaminen (vorzugsweise Murashige und Skoog (1962)), einer Kohlenhydratquelle (beispielsweise 20 g/l Sucrose) und einem Auxin (beispielsweise 1 bis 8 mg/l Picloram, Dicamba oder 2,4-D), zum Induzieren der Embryos. Nach 10 bis 15 Tagen in diesem ersten Medium bilden sich bipolare spindelförmige Embryos. Spindelförmige Embryos besitzen klare Hipokotyl- und Keimblattprimordia. Nach Transfer der Explantate mit spindelförmigen Embryos in das Medium der Stufe 2 (dasselbe Medium wie in Stufe 1, aber ohne Auxin) reifen die spindelförmigen Embryos. Reife Embryos besitzen große grüne Keimblätter. Zygotische Embryos (Stamp und Henshaw, 1982; Konan et al., 1994), junge Blattexplantate, apikale Meristeme (Stamp und Henshaw, 1987a; Szabados et al., 1987; Mroginsky und Scocchi, 1993; Raemakers, 1993a; Narayanaswamy et al., 1995) und Blütengewebe (Mukherjee, 1995) können zur Gewinnung primärer Embryos verwendet werden. Auf diese Weise wurden viele verschiedene Genotypen auf ihr Vermögen zur Bildung primärer Embryos bewertet. In dieser Vorschrift wurden primäre somatische Embryos nur nach Kultivierung auf einem festen Medium und niemals nach Kultivierung im flüssigen Medium gebildet. Weiterhin wurden somatische (primäre) Embryos nur, wenn die Auxine Picloram, Dicamba oder 2,4-D verwendet wurden, und nicht mit IAA, IBA oder NAA beobachtet.
In der gegenwärtig benutzten Vorschrift gibt es eine genotypische Variation in der Anzahl der pro kultiviertes Explantat gebildeten reifen Embryos. Die Genotypen M.Col1505, M.Col22 und Gading ergaben die größte Anzahl reifer Embryos pro kultiviertes Blattexplantat (ME/CLE). Jedoch war die Anzahl der gebildeten reifen Embryos klein. Bei M.Col22 bildeten maximal 22% der Blattexplantate, die aus in vitro gezüchteten Pflanzen isoliert und in einem Medium der Stufe 1 mit 4 mg/l 2,4-D, kultiviert worden waren, ME mit einer maximalen Anzahl von 0,8 ME/CLE. In einem Medium der Stufe 1 mit 8 mg/l 2,4-D bildeten maximal 49% der Blattexplantate ME mit einer maximalen Anzahl von 3,5 ME/CLE. Höhere 2,4-D-Konzentrationen verbesserten das embryogene Vermögen der Explantate nicht weiter. In einem Versuch, das Vermögen von Blattexplantaten, primäre somatische Embryos zu bilden, zu verbessern, wurden Spenderpflanzen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet. Die Züchtung von in-vitro-Spenderpflanzen unter verschiedenen Lichtregimes (8, 12, 16 oder 24 Stunden) hatte keinen Einfluss auf die embryogene Antwort. Jedoch hatte eine Verringerung der Bestrahlungsstärke einen positiven Effekt. Die besten Ergebnisse wurden mit Blattexplantaten erhalten, die aus Spenderpflanzen isoliert, bei 8 μE m^–2s^–1 gezüchtet und im Medium der Stufe 1 kultiviert worden waren.
Andere Forscher haben gezeigt, dass bei bestimmten Genotypen Dicamba (1 bis 66 mg/l) und Picloram (1 bis 12 mg/l) 2,4D bei der Induktion der primären Embryogenese überlegen sind (Ng 1992; Sudarmonowati und Henshaw, 1993; Taylor und Henshaw, 1993). Mathews et al. (1993) erhöhten die Wirksamkeit der primären Embryogenese im Genotyp M.Col1505 durch den Transfer von Explantaten nach 15 Tagen im Medium der Stufe 1 in ein von einem Wachstumsregulator freies Medium, das mit 0,5% Aktivkohle ergänzt war. In diesem Medium war die Reifung verbesser, und als Ergebnis stieg die Anzahl der reifen Embryos von 0,4 in der Kontrolle auf 3,4 ME/CLE.
Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Spenderpflanzen mit Auxinen wie 2,4-D, Picloram oder Dicamba vorbehandelt wurden. Dazu wurden die Pflanzen in einem flüssigen MS20-Medium, das nach 12 Tagen Wachstum mit dem Auxin (Endkonzentration 8 mg/l) ergänzt wurde, gezüchtet.
Zwei Tage später wurden Blattexplantate aus den Spenderpflanzen isoliert und in einem Medium der Stufe 1 mit 8 mg/l 2,4-D, Picloram oder Dicamba kultiviert. Bei dem Klon M.Col22 resultierte das in der Produktion von 9,4 ME/CLE. Das war signifikant höher als bei den mit H₂O behandelten Kontrollpflanzen, wo 3,5 ME/CLE produziert wurden (Tabelle 3).
Die allgemeine Anwendbarkeit einer Auxinvorbehandlung wurde an verschiedenen Genotypen getestet. Ohne Vorbehandlung der Spenderpflanzen bildeten zwei Genotypen ME mit geringer Häufigkeit. Nach einer Vorbehandlung der Spenderpflanzen bildeten die Blattexplantate fast aller Genotypen ME.
Schließlich waren wir in der Lage, reife primäre somatische Embryos von 18 der 22 getesteten Genotypen zu erhalten (Tabelle 1, außer TMS30221, TMS30001, TMS30572 und Sao Paolo).
Primäre somatische Embryos, die sich von Zygotenembryos und von Blättern ableiteten, sind als Explantate verwendet worden, um sekundäre Embryos auszulösen (Stamp und Henshaw, 1987b; Szabados et al., 1987; Mathews et al., 1993; Raemakers et al., 1993bc und Luong et al., 1995). Die kontinuierliche Kultivierung somatischer Embryos in einem mit Auxin ergänzten Medium führte zu einem zyklischen System der somatischen Embryogenese. Die Art und Weise der Subkultivierung somatischer Embryos für die sekundäre Embryogenese schien die Morphologie des embryogenen Gewebes zu beeinflussen. Klumpen aus somatischen Embryos, die monatlich auf einem festen 2,4-D enthaltenden Medium in der Dunkelheit rekultiviert wurden, entwickelten sich zu fingerartigen Embryoanfängen, die sich an der Spitze älterer Embryos bildeten. Diese Embryos gingen nicht in das spindelförmige Stadium über. Eine weitere Entwicklung fand statt, wenn die Klumpen mit den Embryos in das Medium der Stufe 2 im Licht transferiert wurden (Szabados, 1987). Normale reife somatische Embryos wurden im Medium der Stufe 1 im Licht kultiviert, und 20 Tage später wurden die Explantate in das Medium der Stufe 2 zur Reifung transferiert. In diesem System entwickelten sich die Embryos bis zur Reife, und reife Embryos mit großen grünen Keimblättern wurden verwendet, um einen neuen Embryogenesezyklus zu starten, während in dem System weitere spindelförmige Embryos verwendet wurden, um einen neuen Zyklus der sekundären somatischen Embryogenese zu beginnen. Dieses System der Vervielfältigung reifer Embryos wurde an 14 der in Tabelle 1 genannten Genotypen getestet. Trotz der Tatsache, dass bei den meisten Genotypen nur einige reife primäre Embryos erhältlich waren, ergaben alle Genotypen, außer einem, neue reife Embryos nach Kultivierung auf einem mit 2,4-D ergänzten Medium mit einer viel größeren Häufigkeit als bei der primären somatischen Embryogenese beobachtet. Die Embryogenität blieb durch reguläre Subkultivierung reifer Embryos mehr als ein Jahr lang erhalten (Szabados et al., 1987; Mathews et al., 1993; Raemakers, 1993). Neue somatische Embryos bildeten sich sowohl im flüssigen als auch im festen Medium. Bei allen Genotypen wurde beobachtet, dass sich im flüssigen Medium mehr Embryos bildeten als im festen Medium, und dass eine Fragmentierung von Embryos vor Beginn eines neuen Zyklus der sekundären somatischen Embryogenese die Produktion, verglichen mit ganzen Embryos, erhöhte. In beispielsweise M.Col22 produzierten ganze Embryos, die auf einem festen Medium kultiviert worden waren, 8 Embryos pro kultiviertes Embryo, während fragmentierte Embryos, die in einem flüssigen Medium kulti viert worden waren, 32 Embryos pro kultiviertes Embryo produzierten (Raemakers et al., 1993c). Nicht nur 2,4-D, Picloram und Dicamba, sondern auch NAA hatte das Vermögen, die sekundäre Embryogenese auszulösen. IBA und IAA induzierten keine sekundäre Embryogenese. NAA wurde erfolgreich in Adira 1, Adira 4, Gading, Line 11, M.Col22, M.Col1505, TMS90853 und Gading verwendet. Im Allgemeinen wurden mehr reife Embryos in mit NAA ergänztem Medium als in mit 2,4-D, Picloram oder Dicamba ergänztem Medium produziert. Weiterhin verlief die Entwicklung von NAA-induzierten Embryos schneller als mit 2,4-D, Dicamba oder Picloram. Eine Verkürzung der Kultivierungsdauer hat einen vorteilhaften Effekt, insbesondere, wenn im technischen Maßstab gearbeitet wird.
Histologisch hefteten sich die durch 2,4-D neu induzierten sekundären Embryos vertikal an die Explantate an, während die durch NAA induzierten horizontal waren. Es gibt immer noch ein Problem beim Erhalten embryogener Maniokkulturen (Mroginski und Scocchi, 1992; Taylor et al., 1992; Narayanaswamy et al., 1995; Sudarmonowati und Bachtiar, 1995). Dabei ist das Hauptproblem nicht, dass embryogenes Gewebe aus primären Explantaten erhalten werden kann, sondern die Vervielfältigung dieses Gewebes durch sekundäre Embryogenese im großen Maßstab. Zu diesem Zweck kann entweder Gewebe, das aus spindelförmigen Embryos oder aus reifen Embryos besteht, verwendet werden. Die Vervielfältigung von spindelförmigen Embryos ist stark vom Genotyp abhängig, während die Vervielfältigung von reifen Embryos weitgehend vom Genotyp unabhängig ist (Raemakers, 1993). Sowohl die primäre als auch die sekundäre somatische Embryogenese ist charakterisiert durch die Bildung von Brutkörpern mit bipolarer Struktur. Diese bipolaren torpedoförmigen Embryos bilden sich bereits in dem mit Auxin ergänzten Medium der Stufe 1. Deshalb schlugen Taylor et al. (1995) die Bezeichnung "organisierte Embryogenese" vor. Organisierte Zellen sind definiert als eine Gruppe sich aktiv teilender Zellen mit Geweben und Organen, die sich zu einem charakteristischen vereinigten Ganzen bilden (Walker, 1989).
Ein weniger organisierter Typ der somatischen Embryogenese wurde entwickelt von Taylor et al. (1995). Bei kontinuierlicher Selektion wandelte sich ein organisiertes embryogenes Gewebe, das auf einem Medium mit Salzen und Vitaminen (Gresshoff und Doy (1972)), ergänzt mit 10 mg/l Picloram (GD2), kultiviert wurde, allmählich in ein weniger organisiertes Gewebe um. Dieses Gewebe bestand aus einer kallusartigen Masse aus (pro-)globularen Embryos, die sehr krümelig war. Deshalb wurde dieses Gewebe als krümeliger embryogener Kallus (FEC) bezeichnet. Die Zellen im FEC sind kontinuierlich in einem Zustand, in welchem sie aus der Gruppenkontrolle ausbrechen und sich deshalb nicht zu einer vereinigten Struktur organisieren. FEC wird in einem Medium aufrechterhalten, das aus Gresshoff-und-Doy-(1972)Vitaminen und -Salzen, 7 g/l Daichinagar, 20 g/l Sucrose und 10 mg/l Picloram (festes GD2) besteht. Alle drei Wochen wurden die krümeligen Embryos in dem zuvor genannten Medium subkultiviert. Um flüssige Suspensionskulturen auszulösen, wurde 0,5 g krümelige Embryos in einen 200-ml-Kolben mit 50 ml flüssigem Medium, ergänzt mit Schenk-und-Hildebrandt(1972)-Salzen und -Vitaminen, 60 g/l Sucrose und 10 mg/l Picloram (flüssiges SH6), überführt. Es wurde das Medium alle zwei Tage erneuert und nach 14 Tagen der Inhalt eines jeden Kolbens auf 5 neue Kolben aufgeteilt. Vor dem Autoklavieren wurde der pH-Wert auf 5,7 eingestellt. Die Temperatur in der Züchtungskammer betrug 30°C, die Lichtperiode 12 Stunden und die Bestrahlungsstärke 40 μmol m^–2s^–1. Suspensionskulturen wurden ausgelöst durch Kultivieren von FEC in Schenk-und-Hildebrand(1972)-Medium, ergänzt mit 6% (Gew./Vol.) Sucrose und 10 mg/l Picloram (SH6). Alle 2 bis 3 Tage wurde dieses Medium erneuert.
Um eine Kultur in einem stark krümeligen Zustand zu halten, muss der FEC einmal innerhalb von zwei Monaten gesiebt werden. In der Praxis wird der Teil des FEC, der durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm² hindurchpasst, für die Subkultur verwendet.
FEC bildet fast nie spindelförmige Embryos auf einem GD2- oder SH6-Medium. Spindelförmige und anschließend reife Embryos bilden sich, wenn FEC auf einem Reifungsmedium kultiviert wird. Reifungsmedium besteht aus Murashige- und-Skoog(1962)-Salzen und -Vitaminen, 0,1 g/l Myoinositol, 20 g/l Sucrose, 18,2 g/l Mannit, 0,48 g/l MES, 0,1 g/l Caseinhydrolysat, 0,08 g/l Adeninsulfat, 0,5 mg/l d-Calciumpanthotenat, 0,1 mg/l Cholinchlorid, 0,5 mg/l Ascorbinsäure, 2 mg/l Nicotinsäure, 1 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl, 0,5 mg/l Folsäure, 0,05 mg/l Biotin, 0,5 mg/l Glycin, 0,1 mg/l L-Cystein, 0,25 mg/l Riboflavin und 1 mg/l Picloram. Dieses Reifungsmedium wurde alle 3 Wochen erneuert.
Reife Embryos konnten zur sekundären somatischen Embryogenese durch Kultivieren im MS20-Medium, ergänzt mit 2,4-D, Picloram, Dicamba oder NAA, induziert werden. Die primäre und die sekundäre somatische Embryogenese sind relativ leicht innerhalb eines großen Bereichs von Genotypen (siehe Tabelle 1) stattfinden zu lassen, während FEC zurzeit auf einige wenige Genotypen beschränkt ist. Die Aussichten bei FEC auf ein neues System der somatischen Emb ryogenese und genetischen Transformation sind vielversprechend, obwohl weitere Forschungen erforderlich sind, um dieses System auf mehr Genotypen anwendbar zu machen. Wesentlich für diesen Vorgang ist die Verfügbarkeit von organisiertem Gewebe mit hoher Qualität und das Vermögen dieses Gewebes, sich in FEC umzuwandeln. Taylor et al. (1995) "verwendeten organisierte Gewebe", die im spindelförmigen Zustand vervielfacht wurden, um FEC auszulösen. In diesem Fall sind zwei Stufen (Auslösen des organisierten Gewebes und Umwandlung in unorganisiertes Gewebe) bestimmend für die erfolgreiche Auslösung von FEC. Beide Stufen sind Genotyp-abhängig. Wenn organisiertes Gewebe im reifen Zustand vervielfacht wird, wie von Raemakers (1993) beschrieben, ist nur das Vermögen dieses Gewebes, sich in FEC umzuwandeln, für die Auslösung des FEC ein bestimmender Schritt. Es bleibt noch zu untersuchen, ob gegebenenfalls organisiertes Gewebe als Ausgangsmaterial verwendet werden kann. Kann organisiertes Gewebe nicht verwendet werden, dann sollte dieses Gewebe zunächst im unreifen Zustand vervielfacht werden, bevor es zur Auslösung von FEC verwendet werden kann. Dies lässt sich leicht entweder durch Kultivierung von Explantaten mit einer hohen Dichte oder durch Verringerung der Zyklusdauer erreichen.
Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten
Isolation von Protoplasten
Zur Protoplastenisolation kann sowohl FEC kultiviert auf festem GD2 als auch flüssigem SH6 verwendet werden. Die höchsten Protoplastenausbeuten wurden von FEC erhalten, der 1 bis 3 Wochen lang in flüssigem SH6 kultiviert wurde.
Zwei Gramm FEC wurden in Petrischalen (∅ 9 cm) gefüllt, die 10 ml Zellwandverdauungslösung enthielten. Die Zellwandverdauungslösung bestand aus einem Gemisch aus zellwandabbauenden Enzymen, 10 mg/l Pektolyase, 10 g/l Cellulose, 200 mg/l Machroenzymwachstumsregulatoren (NAA 1 mg/l, 2,4-D 1 mg/l, Zeatin 1 mg/l), Haupt-Salzen (368 mg/l CaCl₂, 34 mg/l KH₂PO₄, 740 mg/KNO₃, 492 mg/l MgS₄·7H₂O), Neben-Salzen (19,2 mg/l NA-EDTA und 14 mg/l FeSO₄·7H₂O) und Osmotikum (91 g/l D-Mannit) und 0,5 g/l MES. Die zellwandabbauenden Enzyme Cellulase (1 bis 10 g/l) plus Macerozym (200 mg/l) waren für die Protoplastenisolation erfolgreich. Die extra Zugabe von Pektolyase (0,001 bis 0,01 g/l) und/oder Driselase (0,02 g/l) erhöhte die Protoplastenausbeute. Nach 18 h Inkubation wurden 10 ml Waschmedium zu der Lösung zugegeben. Waschmedium mit einer Osmolarität von 0,530 mOsm/kg bestand aus Haupt-Salzen (siehe Zellwandverdauungslösung), 45,5 g/l Mannit und 7,3 g/l NaCl. Das verdaute Gewebe wurde durch einen 73-μM-Poren-Filter (PA 55/34 Nybolt – Schweiz) in ein 250-ml-Becherglas filtriert. Das Filtrat wurde gleichmäßig auf zwei 12-ml-Zentrifugierröhrchen mit Schraubkappe aufgeteilt und 3 min lang bei 600 U/min (Mistral 2000) zentrifugiert. Der Waschvorgang wurde ein mal nach Entfernung des Überstandes wiederholt. Die Protoplastenlösung wurde durch Aufschwimmen auf 9,5 ml Lösung, die Haupt- und Nebensalze (siehe Zellwandverdauungslösung) und 105 g/l Sucrose enthielt, resuspendiert. Der pH-Wert betrug 5,8 und die Osmolarität 0,650 mOsm. Die Lösung mit den Protoplasten wurde fünf Minuten lang den Gleichgewichtszustand erreichen gelassen, wonach 0,5 ml Waschmedium vorsichtig von oben zugegeben wurden. Nach 15 min Zentrifugieren bei 700 U/min (Mistral 2000) wurden die Protoplasten in einem Band zwischen Sucrose und Waschmedium auf konzentriert. Die Protoplastenschicht wurde mit einer Pasteurpipette geerntet und die Ausbeute in einer Standard-Hämozytometerkammer ausgezählt.
Protoplastenkultivierung
Die Protoplasten wurden in Medien, die mit Agarose 0,2% Gew./Vol. (Dons und Bouwer, 1986) verfestigt worden waren, in Petrischalen, die 10 ml desselben flüssigen Mediums enthielten, kultiviert. Folgende Medien resultierten in der Bildung eines Mikrokallus:

– TM2G-Medium (Wolters et al., 1991), ergänzt ausschließlich mit Auxinen (0,1 bis 10 mg/l NAA oder 0,1 bis 10 mg/l Picloram oder 0,1 bis 10 mg/l IAA oder 0,1 bis 10 mg/l 2,4-D oder 0,1 bis 10 mg/l Dicamba oder 0,1 bis 10 mg/l oder 0,1 bis 10 mg/l) oder Auxinen plus Cytokininen (0,01 bis 1 mg/l Zeatin, 0,01 bis 1 mg/l 2-iP, 0,01 bis 1 mg/l BA, 0,01 bis 1 mg/l TDZ, 0,01 bis 1 mg/l Kinetin) und
– Medium A (Murashige-und-Skoog(1962)-Salze und -Vitamine, 4,5 g/l Myoinositol, 4,55 g/l Mannit, 3,8 g/l Xylit, 4,55 g/l Sorbit, 0,098 g/l MES, 40 mg/l Adeninsulfat und 150 mg/l Caseinhydrolysat, 0,5 mg/l d-Calciumpanthotenat, 0,1 mg/l Cholinchlorid, 0,5 mg/l Ascorbinsäure, 2,5 mg/l Nicotinsäure, 1 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl, 0,5 mg/l Folsäure, 0,05 mg/l Biotin, 0,5 mg/l Glycin, 0,1 mg/l L-Cystein und 0,25 mg/l Riboflavin und 59,40 g/l Glucose), ergänzt mit ausschließlich Auxinen (0,1 bis 10 mg/l NAA oder 0,1 bis 10 mg/l Picloram oder 0,1 bis 10 mg/l IAA oder 0,1 bis 10 mg/l 2,4-D) oder 0,1 bis 10 mg/l Dicamba plus Cytokininen (0,01 bis 1 mg/l Zeatin, 0,01 bis 1 mg/l 2-iP, 0,01 bis 1 mg/l BA, 0,01 bis 1 mg/l TDZ, 0,01 bis 1 mg/l Kinetin).

Die Medien wurden alle 10 Tage durch Ersetzen von 9 ml durch frisches Medium erneuert. Nach zwei Monaten Kultivierung im ersten Medium wurde FEC mit hoher Qualität ausgewählt und entweder für eine weitere Vermehrung oder für die Reifung kultiviert. Für die Vermehrung wurde der FEC in ein Gresshoff-und-Doy(1974)-Medium, ergänzt mit 40 g/l Sucrose, 7 g/l Daichinagar und 2 mg/l Picloram (GD4), transferiert. Nach drei Wochen wurde der FEC auf ein Gresshoff-und-Doy-Medium, ergänzt mit 20 g/l Sucrose, 7 g/l Agar und 10 mg/l Picloram (GD2), transferiert. Suspensionskulturen wurden durch Transferieren von 1,0 g FEC auf flüssiges SH6%-Medium, ergänzt mit 10 mg/l Picloram, ausgelöst. Zwei Wochen später wurde die Suspension auf neue Kolben mit einem anfänglichen gepackten Zellvolumen von 1,0 ml aufgeteilt.
Nach zwei Monaten Kultivierung produzierten 10⁴ Protoplasten, kultiviert in TM2G, ergänzt mit 0,5 mg/l NAA und 1 mg/l Zeatin, mit einer Dichte von 10⁵/ml 1 058 Mikrokalli, während 10⁴ Protoplasten, kultiviert mit einer Dichte von 10⁶/ml, nur 64 Mikrokalli produzierten. Durch das Ersetzen des TM2G-Mediums durch das Medium A wurde bei beiden Dichten die Anzahl der Mikrokalli signifikant verringert. In diesem Stadium konnten mindestens drei Typen von Kalli unterschieden werden. Ein Typ bestand aus globular geformten Embryos, die meist bei mit einer Dichte von 10⁶ kultivierten Protoplasten beobachtet wurden. Einige davon entwickelten keimblattähnliche Strukturen mit hellgrüner Färbung. Jedoch konnten diese Embryos nicht richtig keimen. Ein weiterer Typ war schnellwachsend und bestand aus einem großen kompakten Kallus, sie wurden beobachtet in Protoplastenkulturen mit beiden Dichten. Dieser Kallus entwickelte niemals Embryos. Der dritte Typ war ein stark krümeliger Kallus und wurde bei beiden Dichten beobachtet. Bei einer Dichte von 2 bis 5·10⁵ (Medium TM2G) waren etwa 60% der Kalli krümelig und embryogen. Der FEC wurde entweder für eine weitere Vermehrung oder für eine Reifung subkultiviert.
Vermehrung von von Protoplasten abgeleitetem FEC
Nach Selektion des FEC wurde 0,1 g davon drei Wochen lang auf GD4 plus 2 mg/l Picloram kultiviert und zu 0,7 g Gewebe vermehrt. Mehr als 95% des Gewebes bestanden aus FEC mit hoher Qualität. Anschließend wurde dieses Gewebe durch Subkultivieren drei Wochen lang auf GD2-Medium, ergänzt mit 10 mg/l Picloram, gehalten. Zur Auslösung der Suspensionskultivierung wurde FEC auf ein flüssiges Medium übertragen. Die Vergrößerung des gepackten Zellvolumens (PCV) dieses Materials war etwas höher als diejenige des ursprünglichen Materials (die Daten sind nicht mitgeteilt).
Reifung von von Protoplasten abgeleitetem FEC
In einem Versuch, die Reifung von Embryos auszulösen, wurde FEC, der nach zwei Monaten Kultivieren in TM2G isoliert worden war, in einem Reifungsmedium kultiviert. Das Reifungsmedium bestand aus Murashige-und-Skoog(1962)-Salzen und -Vitaminen, 0,1 g/l Myoinositol, 20 g/l Sucrose, 18,2 g/l Mannit, 0,48 g/l MES, 0,1 g/l Caseinhydrolysat, 0,08 g/l Adeninsulfat, 0,5 mg/l d-Calciumpanthotenat, 0,1 mg/l Cholinchlorid, 0,5 mg/l Ascorbinsäure, 2 mg/l Nicotinsäure, 1 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl, 0,5 mg/l Folsäure, 0,05 mg/l Biotin, 0,5 mg/l Glycin, 0,1 mg/l L-Cystein, 0,25 mg/l Riboflavin und 1 mg/l Picloram. Dieses Reifungsmedium wurde alle drei Wochen erneuert.
In diesem Medium fand eine allmähliche Verschiebung von Vermehrung zu Reifung statt. Im Ergebnis hatte sich das gepackte Zellvolumen um den Faktor 4 nach zwei Wochen Kultivierung im flüssigen Reifungsmedium erhöht. Auch nach Übertragung auf ein festes Reifungsmedium findet eine Vermehrung statt. Nach zwei Wochen auf dem festen Medium hatten die meisten Embryos eine Kugelform erreicht, und nur einige dieser kugelförmigen Embryos entwickelten sich weiter. Die ersten spindelförmigen Embryos wurden nach einem Monat Kultivierung auf dem festen Reifungsmedium sichtbar. Die Anzahl der reifen und spindelförmigen Embryos korrelierte nicht mit der Ausbreitungseffizienz, sondern mit der Dichte der ursprünglich kultivierten Protoplasten. Keine solchen Embryos wurden erhalten, wenn die Protoplasten auf TM2G ohne Wachstumsregulatoren kultiviert wurden. Die höchste Anzahl von reifen und spindelförmigen Embryos wurde aus Protoplasten gebildet, die auf TM2G, ergänzt mit 0,5 mg/l NAA und 1 mg/l Zeatin, kultiviert wurden. Wurde NAA ersetzt durch Picloram, war die Anzahl der spindelförmigen und reifen Embryos deutlich kleiner (Tabelle 2). Von den getesteten Picloramkonzentrationen ergaben 2 mg/l die besten Ergebnisse. Nach drei Monaten Kultivierung wurden zwischen 60 und 200 spindelförmige und reife Embryos pro Agarosetropfen isoliert. Die spindelförmigen Embryos wurden reif mit großer Häufigkeit, wenn sie auf frischem Reifungsmedium oder auf MS2 plus 0,1 mg/l BAP kultiviert wurden.
Sekundäre somatische Embryogenese und Keimung von von Protoplasten abgeleiteten reifen Embryos
Nur einige spindelförmige Embryos bildeten sekundäre Embryos, wenn sie auf flüssigem oder festem MS2-Medium, ergänzt mit 10 mg/l NAA oder 8 mg/l 2,4-D, (Daten nicht mitgeteilt) kultiviert wurden. Reife Embryos waren bessere Explantate für die sekundäre Embryogenese. Sowohl im flüssigen als auch festen Medium war 2,4-D, verglichen mit NAA, bei der Induktion der sekundären Embryogenese überlegen. Wenn reife Embryos zunächst in 2,4-D und dann in flüssigem NAA kultiviert wurden, war die Reaktion vergleichbar mit der Kultivierung in 2,4-D allein. Auch Embryos, die zunächst einem Zyklus der sekundären somatischen Embryogenese im Medium mit 2,4-D unterworfen wurden, produzierten sekundäre Embryos in MS20, ergänzt mit 10 mg/l NAA, mit hoher Effizienz.
Es wurde die Keimung von zyklischen oder sekundären somatischen Embryos, induziert durch die Auxine 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) oder Naphthalinessigsäure (NAA), im flüssigen Medium verglichen. Bei allen Geno typen stimulierte eine Entwässerung die normale Keimung von NAA-induzierten Embryos. Jedoch erforderten die entwässerten Embryos ein Medium, ergänzt mit Cytokininen wie Benzylaminopurin (BAP), für eine sehr häufige Keimung. Die Morphologie des resultierenden Sämlings war abhängig von der BAP-Konzentration. Mit 1 mg/l BAP wurden Pflanzen mit dicken und kurzen Pfahlwurzeln und verzweigte Schösslinge mit kurzen Zwischenknoten gebildet. Mit 0,1 mg/l BAP waren die Pfahlwurzeln dünn und schlank und der Schössling hatte nur ein oder zwei apikale Meristeme. Wenn die Embryos suboptimal entwässert wurden, waren, um die Keimung zu stimulieren, höhere BAP-Konzentrationen erforderlich, als wenn die Embryos optimal entwässert wurden. Auch entwässerte Embryos, die in der Dunkelheit kultiviert worden waren, erforderten eine niedrigere BAP-Konzentration, weiterhin keimten diese Embryos schneller als Embryos, die im Licht kultiviert worden waren. Vollständige Pflanzen wurden vier Wochen nach Beginn der somatischen Embryoinduktion erhalten. 2,4-D-induzierte Embryos zeigten eine andere Reaktion. Bei nur einem Genotyp verstärkte die Entwässerung die Keimung von 2,4-D-induzierten Embryos und bei drei anderen Genotypen tat sie es nicht. Bei allen Genotypen stimulierte die Entwässerung die Wurzelbildung. In der Dunkelheit kultivierte Embryos bildeten vorwiegend zufällige Wurzeln, während im Licht kultivierte Embryos vorwiegend Pfahlwurzeln bildeten.
4.0 Gentransfersysteme
In den vergangenen Jahren sind einige Verfahren zum Transfer von DNA auf Pflanzenprotoplasten entwickelt worden, wie Siliciumfasern (Kaeppler et al., 1990), Mikroin jektion (DeLaat und Blaas, 1987) und Elektrophorese (Griesbach und Hammond, 1993). Die gebräuchlichsten und mit Potential anwendbaren sind Agrobacterium-vermittelte Genlieferung, Mikroprojektil/Teilchen-Bombardement und Protoplastenelektroporation.
Das Agrobacterium-tumefaciens-DNA-Liefersystem ist das am häufigsten angewendete Verfahren. Es beruht wahrscheinlich auf der ersten Erfindung einer DNA-Lieferung in Pflanzen durch dieses Verfahren. Ursprünglich war es auf Kalanchoë und Solanaceae, insbesondere Tabak, beschränkt. Zurzeit hat sich die Anwendung der Agrobacteriumvermittelten Transformation stark verändert, so ist es möglich, ein breites Spektrum von Pflanzen mit Beschränkung auf Einkeimblättrige (Übersicht von Wordragen und Dons, 1992) zu transformieren. Obwohl Maniok eine Wirtspflanze für Agrobacterium ist, hat es sich gezeigt, dass er dafür nicht sehr zugänglich ist.
Im Prinzip sind Protoplasten die idealen Explantate für die DNA-Lieferung. Sie können als einzelne Zellen kultiviert werden, die Mehrzellenkolonien bilden, aus denen sich Pflanzen entwickeln. Pflanzen, die von Protoplasten abgeleitet sind, sind im Allgemeinen vom Ursprung her Klone. Dies erweist sich als ein nützliches Hilfsmittel für ein beliebiges Transformationssystem, da es Chimärenbildung in transgenen Pflanzen ausschließt. Die Verwendung von Protoplasten wird jedoch von dem Regenerationssystem behindert, das in hohem Maße Spezies-abhängig ist. Für eine Transformation können Protoplasten zusammen mit PEG verwendet werden, um die Plasmamembran zu verändern, was eine reversible Permeabilisierung verursacht, welche die DNA in die Lage versetzt, in das Cytoplasma zu gelan gen, was beispielsweise bei Lolium multiform (Potrykus et al., 1985) und Triticum monococcum (Lörz et al., 1985) gezeigt wurde. Ein weiteres Verfahren, um die Permeabilität von Plasmamembranen und auch Zellwänden gegenüber DNA zu erhöhen, ist die Elektroporation (wegen einer Übersicht siehe Jones et al., 1987). In diesem Verfahren versetzen elektrische Impulse die DNA in die Lage, in die Zellen zu gelangen. Dabei war Reis die erste Kulturpflanze, bei welcher fruchtbare transgene Pflanzen aus Protoplastenelektroporation (Shimamoto et al., 1989) resultierten.
Die Anwendung von Teilchenbombardement oder Biolistik zur Lieferung fremder DNA ist ein alternatives Verfahren bei der Manioktransformation. Teilchenbombardement ist das einzige Verfahren, das ist in der Lage ist, DNA in Zellen fast jedes Gewebes zu liefern. Die erste transgene Pflanze, die durch Anwendung dieses Verfahrens erhalten wurde, war Tabak (Klein et al., 1989). Nach diesem erfolgreichen Transformationsverfahren wird das Teilchenbombardement in breitem Umfang bei Pflanzen angewendet, die einer Agrobacterium-Infektion weniger zugänglich sind, insbesondere Einkeimblättrigen. Die Verbesserung einiger DNA-Liefervorrichtungen, um die Teilchen (Mikroprojektile) zu beschleunigen, haben in dem jüngsten Modell Biolistic^TM PDS-1000 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Ca) resultiert. Diese Vorrichtungen sind kommerziell erhältlich, jedoch ist zurzeit ihr Preis noch relativ hoch. Wolfram- oder Goldteilchen, mit DNA beschichtet, werden üblicherweise als Mikroprojektile verwendet, um DNA in Zielgewebe zu bringen (Übersicht von Songstad et al., 1995).
5. Selektion und Reportergene, die zu gentechnischen Veränderungen verwendet werden
Um in der Lage zu sein, transformierte Zellen zu identifizieren, wird das interessierende Gen an ein auswählbares Markergen gekoppelt. Dieses Markergen ist erforderlich, um transformierte Zellen zu selektieren. Die Selektion kann auf visuellen Merkmalen der (des) transformierten Zelle/Gewebes basieren. Ein Beispiel ist das Luciferasegen, das aus dem Leuchtkäfer isoliert wurde. Pflanzenzellen, die dieses Gen exprimieren und mit dem Substrat (Luciferin) versorgt werden, emittieren Licht, das mit einer speziellen Ausrüstung (Ow et al., 1986) detektiert werden kann. Ein anderer Weg, um transformiertes Gewebe auszuwählen, ist die Einführung eines Gens, das für Resistenz gegenüber Antibiotika oder Herbiziden codiert (Thompson et al., 1987; Gordon-Kamm et al., 1990).
Es ist eine Anzahl von Antibiotika und Herbiziden als Auswahlmittel bei der Pflanzentransformation verwendet worden. Bei Getreide wurde die Resistenz gegenüber dem Herbizid Phosphinothricin (PPT) für die Selektion transgener Pflanzen (Cao et al., 1990) ausgewählt. Bei Carica Papaya (Fitch et al., 1994), Vitis vinifera (Nakano et al., 1994; Scorza et al., 1995), Mais (Rhodes et al., 1988) und Reis (Chen et al., 1987) war es das Neomycinphosphotransferase-(NPTII-)Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin und verwandten Antibiotika (Fraley et al., 1986) verleiht, das als Selektionsmarker verwendet wurde.
Für Maniok können alle diese Selektionssysteme verwendet werden, jedoch hat die auf PPT basierende Selektion den Vorteil, dass sie das Vermögen von FEC erhöht, reife Emb ryos zu bilden, und auf diese Weise die Pflanzenregeneration verbessert.
Erläuterungen zu 1
1: Schematische Darstellung der somatischen Embryogenese bei Maniok, einschließlich der primären und sekundären somatischen Embryogenese, Auswahl des krümeligen embryogenen Kallus, Reifung und Entwässerung mit anschließender Keimung

gd2 = Medium, ergänzt mit Gresshoff-und-Doy-Salzen (1974) und -Vitaminen plus 20 g/l Sucrose,
gd4 = Medium, ergänzt mit Gresshoff-und-Doy-Salzen (1974) und -Vitaminen plus 40 g/l Sucrose,
ms2 = Medium, ergänzt mit Murashige-und-Skoog-Salzen und -Vitaminen plus 20 g/l Sucrose,
pic = 10 mg/l Picloram, NAA = 10 mg/l Naphthalinessigsäure, 2,4-D = 8 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, sh6 = Medium, ergänzt mit Schenk-und-Hildebrandt(1972)-Salzen und -Vitaminen plus 60 g/l Sucrose.

^{a, b} Mittelwerte mit demselben Buchstaben sind nicht signifikant verschieden durch den Chi-Quadrat-Test (p < 0,1) bzw. LSD-Test (p < 0,1)

^a) Mittelwert aus drei versuchen (insgesamt 48 bis 74 Blattexplantate), ^b) Mittelwert von zwei Versuchen (insgesamt 24 bis 48 ME-Explantate)

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Claims

Verfahren zur Herstellung von Manlokprotoplasten, wobei die Protoplasten zur Regeneration in Pflanzen befähigt sind, umfassend das Herstellen von krümeligem embryagenem Kallus aus Explantaten von Maniok und das Isolieren von Protoplasten aus dem krümeligen embryogenen Kallus.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der krümelige embryogene Kallus einer Kultur in einem flüssigen Medium unterzogen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei ein Gemisch von zellwandabbauenden Enzymen, wie eine Cellulase, eine Pektolyase und/oder ein Mazerozym, verwendet wird, um Protoplasten zu erzeugen.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Pflanzen, aus denen Explantate entnommen werden, mit einem Auxin vorbehandelt werden.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der krümelige embryogene Kallus aus spindelförmigen primären oder reifen Embryos hergestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Embryos an primären Explantaten induziert werden.
Protoplasten, die nach einem verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche erhältlich und zur Regeneration in Pflanzen befähigt sind,
Verfahren zum Transformieren eines Protoplasten von Maniok, indem man den Protoplasten mit zusätzlicher genetischer Information versieht, und zwar durch Infektion mit einem Agrobacterium-tumefaciens-Bakterium, das die zusätzliche Information umfasst, oder durch Elektroporation oder chemische Poration, was einen Vektor ergibt, der die zusätzliche genetische Information umfasst, wobei ein Protoplast gemäß Anspruch 7 transformiert wird.
Transformierter Protoplast, der nach einem Verfahren gemäß Anspruch 8 erhältlich ist.
Transformierter Protoplast gemäß Anspruch 9, wobei die zusätzliche genetische Information ein interessierendes Gen umfasst.
Transformierter Protoplast gemäß Anspruch 9, wobei die zusätzliche genetische Information ein Antisense-Konstrukt umfasst.
Transformierter Protoplast gemäß Anspruch 11, wobei das Antisense-Konstrukt den Amylose-Syntheseweg hemmen kann.
Verfahren zum Regenerieren von Pflanzen aus Protoplasten, wobei das Erzeugen eines Embryos bei einem Protoplasten gemäß einem der Ansprüche 7 oder 9–12 induziert wird, wobei anschließend das Erzeugen einer Pflanze bei dem Embryo induziert wird.