CN108007753A - 一种浒苔孢子体的染色体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:取材、脱水、秋水仙素预处理、固定、混合酶液酶解、70%乙醇终止酶解、高位滴片和DAPI染色;将浒苔孢子体细胞经秋水仙素处理,使其固定在细胞分裂中期,经混合酶液处理后高位滴片,浒苔孢子体的细胞壁、细胞膜以及细胞内多糖等物质彻底去除,实现细胞分散均匀、染色体分散良好,背景清晰,中期分裂细胞相对较多,由上述方法制得浒苔孢子体的染色体为1~2μm的短棒状小染色体,2n=18,有利于后期浒苔孢子体的染色体核型分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞遗传学领域,特别涉及一种浒苔孢子体的染色体制备方法。
背景技术
绿潮是一种由某些绿藻暴发性生长而产生的一种有害生态现象,目前已发展成为全球性环境问题,正得到越来越多的关注。绿潮暴发导致大量的绿藻藻体堆积在海岸上,严重影响近海和沿岸景观,给旅游观光和水上运动等旅游经济造成负面效应。此外,绿潮暴发时大量绿藻生物质还会导致一系列的次生灾害,危害海岸环境和海洋群落的生态平衡。黄海绿潮自2007年首次发生以来,已连续10年大规模暴发,其中浒苔(Ulva prolifera)被鉴定为黄海绿潮优势种。近年来,对浒苔的生理生态学研究取得诸多成果,然而其基因遗传学研究却进展缓慢,通过浒苔染色体的研究,才能在基因组水平上真正解密绿潮暴发机制。
浒苔藻细胞染色体在物种亲缘关系鉴定、染色体变异和物种分析等工作中有广泛用途,是遗传学研究中最基本和最常用的方法。染色体制备技术是其核型观察与分析的重要依据和途径,此外,染色体的制备识别是浒苔基因组研究的基础,其制备技术的优劣直接制约着染色体观察质量的高低,因此染色体制备作为浒苔基因组研究的第一步,就显得尤为重要。但由于浒苔孢子体的染色体非常小,一般较难制备,国内对于浒苔孢子体的染色体制备方法还未见报道。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷,本发明的目的在于提供一种浒苔孢子体的染色体制备方法,得到稳定而清晰的浒苔孢子体的染色体,填补国内尚无浒苔孢子体的染色体制备技术的空白。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的浒苔孢子体藻体放入离心管中,用灭菌海水清洗2~3次,12000rpm离心2min,去除多余水分;
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入秋水仙素,4℃冰箱内放置6~12h;
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h;
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用水清洗,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量混合酶液,酶解;
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物3~4次;
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,自然晾干;
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μL DAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
进一步地,步骤(2)中,所述秋水仙素质量浓度为0.2%。
进一步地,步骤(4)中,所述水洗采用灭菌海水清洗3~5次。
进一步地,步骤(4)中,所述混合酶液包括纤维素酶、果胶酶和离析酶,且所述纤维素酶、果胶酶和离析酶的质量比为1:2:1。
进一步地,步骤(4)中,所述酶解为37℃水浴锅中酶解12~24h。
进一步地,步骤(6)中,所述高位滴片的滴片高度为30~50cm。
另外需要说明的是,本发明的一个优选实施例中,步骤(1)中采用的离心管为1.5~2mL除酶离心管,步骤(3)采用的卡诺固定液为体积比为1:3的冰乙酸:无水乙醇。在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件可以任意组合即得本发明各较佳实例;另外本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外,均市售可得或为常规选择。
与现有技术相比,本发明的积极进步效果在于:
1、本发明填补了浒苔孢子体的染色体制备领域的技术空白。
2、本发明利用秋水仙素处理浒苔孢子体的细胞,秋水仙素能抑制有丝分裂,破坏纺锤体,使染色体停滞在分裂中期,从而增加浒苔孢子体的细胞分裂中期的比例。
3、本发明中使用的工具酶较为常见,方便获取,节约成本;根据分析浒苔孢子体的细胞成份选取纤维素酶、果胶酶和离析酶,摸索纤维素酶、果胶酶和离析酶几种工具酶的质量浓度和体积配比,进行优化配合,以去除细胞壁、细胞膜、多糖等杂质,可以获得高质量浒苔孢子体的染色体。
3、本发明高位滴片操作简单,利用30~50cm高度距离滴片,使细胞分散、破碎效果良好。
4、本发明采用DAPI染色,染色体制片背景清晰,方法简便,实验周期短,所制备染色体质量较高,有利于开展核型分析等后续工作。
附图说明
图1为本发明制备的DAPI染色后浒苔孢子体的染色体荧光显微镜下的照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明,以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种浒苔孢子体的体染色体的制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的藻体放入1.5mL除酶离心管中,用灭菌海水清洗2次,12000rpm离心2min,去除多余水分。
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2%的秋水仙素,4℃冰箱内放置6h。
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入冰乙酸:无水乙醇体积比为1:3的卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗3次,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1:2:1的混合酶液,37℃水浴中酶解12h。
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物3次。
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,滴片高度为30cm,自然晾干。
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
参见附图1,可以看出由上述制备方法制得浒苔孢子体的染色体为1~2μm的短棒状,属于小染色体,2n=18。
实施例2
一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中,用灭菌海水清洗3次,12000rpm离心2min,去除多余水分。
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2%的秋水仙素,4℃冰箱内放置7h。
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入冰乙酸:无水乙醇体积比为1:3的卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗4次,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1:2:1的混合酶液,37℃水浴中酶解14h。
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物3次。
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,滴片高度为35cm,自然晾干。
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例3
一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的藻体放入1.5mL除酶离心管中,用灭菌海水清洗2次,12000rpm离心2min,去除多余水分。
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2%的秋水仙素,4℃冰箱放置8h;
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入冰乙酸:无水乙醇体积比为1:3的卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1:2:1的混合酶液,37℃水浴中酶解16h。
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物3次。
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,滴片高度为40cm,自然晾干。
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例4
一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中,用灭菌海水清洗2次,12000rpm离心2min,去除多余水分。
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2%的秋水仙素,4℃冰箱内放置9h。
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入冰乙酸:无水乙醇体积比为1:3的卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗4次,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1:2:1的混合酶液,37℃水浴中酶解18h。
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,滴片高度为45cm,自然晾干。
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例5
一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中,用灭菌海水清洗2次,12000rpm离心2min,去除多余水分。
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2%的秋水仙素,4℃冰箱内放置10h。
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入冰乙酸:无水乙醇体积比为1:3的卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1:2:1的混合酶液,37℃水浴中酶解20h。
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,滴片高度为50cm,自然晾干。
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例6
一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的藻体放入1.5mL除酶离心管中,用灭菌海水清洗2次,12000rpm离心2min,去除多余水分。
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2%的秋水仙素,4℃冰箱内放置11h。
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入冰乙酸:无水乙醇体积比为1:3的卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1:2:1的混合酶液,37℃水浴中酶解22h。
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,滴片高度为38cm,自然晾干。
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例7
一种浒苔孢子体的染色体制备方法,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中,用灭菌海水清洗3次,12000rpm离心2min,去除多余水分。
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2%的秋水仙素,4℃冰箱内放置12h。
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入冰乙酸:无水乙醇体积比为1:3的卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次,12000rpm离心2min后取沉淀藻体,加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1:2:1的混合酶液,37℃水浴中酶解24h。
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,滴片高度为36cm,自然晾干。
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色,15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
以上所述为本发明的较佳实施例而已,但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改,都落入本发明保护的范围。
Claims (9)
1.一种浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取材及预处理:取微量状态良好的孢子体藻体放入离心管中,用灭菌海水清洗2~3次,12000rpm离心2min,去除多余水分;
(2)秋水仙素处理:向步骤(1)预处理后的孢子体藻体加入秋水仙素,4℃冰箱内放置6~12h;
(3)固定:将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物,加入卡诺固定液振荡摇匀,4℃冰箱内放置不低于24h;
(4)浒苔藻体细胞酶解:将步骤(3)固定后的物质水洗后,12000rpm离心2min取沉淀,加入适量混合酶液进行酶解反应;
(5)终止酶解:向步骤(4)酶解后的物质中加入70%的乙醇终止酶解反应,并水洗;
(6)滴片:向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸,振荡混匀,取少量酶解产物高位滴片,自然晾干;
(7)DAPI染色:将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min,在相差显微镜下进行镜检,选取染色体分裂相分散好的部位加入15μL DAPI染色,即得。
2.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述秋水仙素的质量浓度为0.2%。
3.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述4℃冰箱内放置8~10h。
4.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述水洗为采用灭菌海水洗3~5次。
5.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述混合酶液包括纤维素酶、果胶酶和离析酶,且所述纤维素酶、果胶酶和离析酶的质量比为1:2:1。
6.一种如权利要求1或5所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,进一步地,步骤(4)中,所述酶解采用37℃水浴反应12~24h。
7.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,步骤(5)中,所述水洗采用灭菌去离子水洗3~4次。
8.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,步骤(6)中,所述高位滴片的滴片高度为30~50cm。
9.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述离心采用1.5~2mL除酶离心管。
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