CN108007753A - 一种浒苔孢子体的染色体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：取材、脱水、秋水仙素预处理、固定、混合酶液酶解、70％乙醇终止酶解、高位滴片和DAPI染色；将浒苔孢子体细胞经秋水仙素处理，使其固定在细胞分裂中期，经混合酶液处理后高位滴片，浒苔孢子体的细胞壁、细胞膜以及细胞内多糖等物质彻底去除，实现细胞分散均匀、染色体分散良好，背景清晰，中期分裂细胞相对较多，由上述方法制得浒苔孢子体的染色体为1～2μm的短棒状小染色体，2n＝18，有利于后期浒苔孢子体的染色体核型分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞遗传学领域，特别涉及一种浒苔孢子体的染色体制备方法。
背景技术
绿潮是一种由某些绿藻暴发性生长而产生的一种有害生态现象，目前已发展成为全球性环境问题，正得到越来越多的关注。绿潮暴发导致大量的绿藻藻体堆积在海岸上，严重影响近海和沿岸景观，给旅游观光和水上运动等旅游经济造成负面效应。此外，绿潮暴发时大量绿藻生物质还会导致一系列的次生灾害，危害海岸环境和海洋群落的生态平衡。黄海绿潮自2007年首次发生以来，已连续10年大规模暴发，其中浒苔(Ulva prolifera)被鉴定为黄海绿潮优势种。近年来，对浒苔的生理生态学研究取得诸多成果，然而其基因遗传学研究却进展缓慢，通过浒苔染色体的研究，才能在基因组水平上真正解密绿潮暴发机制。
浒苔藻细胞染色体在物种亲缘关系鉴定、染色体变异和物种分析等工作中有广泛用途，是遗传学研究中最基本和最常用的方法。染色体制备技术是其核型观察与分析的重要依据和途径，此外，染色体的制备识别是浒苔基因组研究的基础，其制备技术的优劣直接制约着染色体观察质量的高低，因此染色体制备作为浒苔基因组研究的第一步，就显得尤为重要。但由于浒苔孢子体的染色体非常小，一般较难制备，国内对于浒苔孢子体的染色体制备方法还未见报道。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种浒苔孢子体的染色体制备方法，得到稳定而清晰的浒苔孢子体的染色体，填补国内尚无浒苔孢子体的染色体制备技术的空白。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的浒苔孢子体藻体放入离心管中，用灭菌海水清洗2～3次，12000rpm离心2min，去除多余水分；
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入秋水仙素，4℃冰箱内放置6～12h；
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h；
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用水清洗，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量混合酶液，酶解；
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物3～4次；
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，自然晾干；
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μL DAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
进一步地，步骤(2)中，所述秋水仙素质量浓度为0.2％。
进一步地，步骤(4)中，所述水洗采用灭菌海水清洗3～5次。
进一步地，步骤(4)中，所述混合酶液包括纤维素酶、果胶酶和离析酶，且所述纤维素酶、果胶酶和离析酶的质量比为1：2：1。
进一步地，步骤(4)中，所述酶解为37℃水浴锅中酶解12～24h。
进一步地，步骤(6)中，所述高位滴片的滴片高度为30～50cm。
另外需要说明的是，本发明的一个优选实施例中，步骤(1)中采用的离心管为1.5～2mL除酶离心管，步骤(3)采用的卡诺固定液为体积比为1：3的冰乙酸：无水乙醇。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件可以任意组合即得本发明各较佳实例；另外本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得或为常规选择。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
1、本发明填补了浒苔孢子体的染色体制备领域的技术空白。
2、本发明利用秋水仙素处理浒苔孢子体的细胞，秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，从而增加浒苔孢子体的细胞分裂中期的比例。
3、本发明中使用的工具酶较为常见，方便获取，节约成本；根据分析浒苔孢子体的细胞成份选取纤维素酶、果胶酶和离析酶，摸索纤维素酶、果胶酶和离析酶几种工具酶的质量浓度和体积配比，进行优化配合，以去除细胞壁、细胞膜、多糖等杂质，可以获得高质量浒苔孢子体的染色体。
3、本发明高位滴片操作简单，利用30～50cm高度距离滴片，使细胞分散、破碎效果良好。
4、本发明采用DAPI染色，染色体制片背景清晰，方法简便，实验周期短，所制备染色体质量较高，有利于开展核型分析等后续工作。
附图说明
图1为本发明制备的DAPI染色后浒苔孢子体的染色体荧光显微镜下的照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种浒苔孢子体的体染色体的制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的藻体放入1.5mL除酶离心管中，用灭菌海水清洗2次，12000rpm离心2min，去除多余水分。
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2％的秋水仙素，4℃冰箱内放置6h。
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入冰乙酸：无水乙醇体积比为1：3的卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗3次，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1：2：1的混合酶液，37℃水浴中酶解12h。
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物3次。
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，滴片高度为30cm，自然晾干。
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
参见附图1，可以看出由上述制备方法制得浒苔孢子体的染色体为1～2μm的短棒状，属于小染色体，2n＝18。
实施例2
一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中，用灭菌海水清洗3次，12000rpm离心2min，去除多余水分。
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2％的秋水仙素，4℃冰箱内放置7h。
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入冰乙酸：无水乙醇体积比为1：3的卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗4次，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1：2：1的混合酶液，37℃水浴中酶解14h。
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物3次。
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，滴片高度为35cm，自然晾干。
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例3
一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的藻体放入1.5mL除酶离心管中，用灭菌海水清洗2次，12000rpm离心2min，去除多余水分。
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2％的秋水仙素，4℃冰箱放置8h；
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入冰乙酸：无水乙醇体积比为1：3的卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1：2：1的混合酶液，37℃水浴中酶解16h。
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物3次。
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，滴片高度为40cm，自然晾干。
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例4
一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中，用灭菌海水清洗2次，12000rpm离心2min，去除多余水分。
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2％的秋水仙素，4℃冰箱内放置9h。
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入冰乙酸：无水乙醇体积比为1：3的卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗4次，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1：2：1的混合酶液，37℃水浴中酶解18h。
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，滴片高度为45cm，自然晾干。
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例5
一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中，用灭菌海水清洗2次，12000rpm离心2min，去除多余水分。
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2％的秋水仙素，4℃冰箱内放置10h。
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入冰乙酸：无水乙醇体积比为1：3的卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1：2：1的混合酶液，37℃水浴中酶解20h。
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，滴片高度为50cm，自然晾干。
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例6
一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的藻体放入1.5mL除酶离心管中，用灭菌海水清洗2次，12000rpm离心2min，去除多余水分。
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2％的秋水仙素，4℃冰箱内放置11h。
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入冰乙酸：无水乙醇体积比为1：3的卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1：2：1的混合酶液，37℃水浴中酶解22h。
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，滴片高度为38cm，自然晾干。
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
实施例7
一种浒苔孢子体的染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的藻体放入2mL除酶离心管中，用灭菌海水清洗3次，12000rpm离心2min，去除多余水分。
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的藻体加入质量浓度为0.2％的秋水仙素，4℃冰箱内放置12h。
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入冰乙酸：无水乙醇体积比为1：3的卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h。
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质用灭菌去离子水清洗5次，12000rpm离心2min后取沉淀藻体，加入适量纤维素酶、果胶酶和离析酶质量比为1：2：1的混合酶液，37℃水浴中酶解24h。
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并用去离子水清洗酶解产物4次。
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，滴片高度为36cm，自然晾干。
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μLDAPI染色，15min后在荧光显微镜下观察、拍照并测量。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (9)
1.一种浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取材及预处理：取微量状态良好的孢子体藻体放入离心管中，用灭菌海水清洗2～3次，12000rpm离心2min，去除多余水分；
(2)秋水仙素处理：向步骤(1)预处理后的孢子体藻体加入秋水仙素，4℃冰箱内放置6～12h；
(3)固定：将步骤(2)处理后的物质离心取沉淀物，加入卡诺固定液振荡摇匀，4℃冰箱内放置不低于24h；
(4)浒苔藻体细胞酶解：将步骤(3)固定后的物质水洗后，12000rpm离心2min取沉淀，加入适量混合酶液进行酶解反应；
(5)终止酶解：向步骤(4)酶解后的物质中加入70％的乙醇终止酶解反应，并水洗；
(6)滴片：向步骤(5)水洗后的酶解产物加入100μl 4℃的冰醋酸，振荡混匀，取少量酶解产物高位滴片，自然晾干；
(7)DAPI染色：将步骤(6)所得制片在湿润的盒子中保存5min，在相差显微镜下进行镜检，选取染色体分裂相分散好的部位加入15μL DAPI染色，即得。
2.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述秋水仙素的质量浓度为0.2％。
3.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述4℃冰箱内放置8～10h。
4.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述水洗为采用灭菌海水洗3～5次。
5.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述混合酶液包括纤维素酶、果胶酶和离析酶，且所述纤维素酶、果胶酶和离析酶的质量比为1：2：1。
6.一种如权利要求1或5所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，进一步地，步骤(4)中，所述酶解采用37℃水浴反应12～24h。
7.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述水洗采用灭菌去离子水洗3～4次。
8.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述高位滴片的滴片高度为30～50cm。
9.一种如权利要求1所述浒苔孢子体的染色体制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心采用1.5～2mL除酶离心管。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997044473A1 (en) * | 1996-05-20 | 1997-11-27 | Coöperatieve Verkoop- En Productievereniging Van Aardappelmeel En Derivaten Avebe B.A. | Methods for producing and transforming cassave protoplasts |
| CN102703599A (zh) * | 2012-06-26 | 2012-10-03 | 山东东方海洋科技股份有限公司 | 一种改进的海带染色体的制备方法 |
| JP2013198465A (ja) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Bridgestone Corp | パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法 |
| CN103804503A (zh) * | 2012-11-13 | 2014-05-21 | 烟台大学 | 一种分步酶解提取浒苔多糖的方法 |
| CN105941148A (zh) * | 2016-05-12 | 2016-09-21 | 上海交通大学 | 矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法 |
-
2018
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997044473A1 (en) * | 1996-05-20 | 1997-11-27 | Coöperatieve Verkoop- En Productievereniging Van Aardappelmeel En Derivaten Avebe B.A. | Methods for producing and transforming cassave protoplasts |
| JP2013198465A (ja) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Bridgestone Corp | パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法 |
| CN102703599A (zh) * | 2012-06-26 | 2012-10-03 | 山东东方海洋科技股份有限公司 | 一种改进的海带染色体的制备方法 |
| CN103804503A (zh) * | 2012-11-13 | 2014-05-21 | 烟台大学 | 一种分步酶解提取浒苔多糖的方法 |
| CN105941148A (zh) * | 2016-05-12 | 2016-09-21 | 上海交通大学 | 矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| SRINIVASA RAO UPPALAPATI等: "A simple method for mass isolation of protoplasts from species of Monostroma, Enteromorpha and Ulva (Chlorophyta, Ulvales)", 《JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY》 * |
| 刘吉华主编: "《中药生物技术》", 31 October 2015, 中国医药科技出版社 * |
| 刘宇等: "海带染色体的DAPI 染色及核型初步分析", 《水产学报》 * |
| 王帅: "孔石莼(Ulva pertusa Kjellm.)繁殖细胞的获得及早期发育的观察", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
| 王浩东: "浒苔(Ulva prolifera)生殖遗传学的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
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