JP2000510707A

JP2000510707A - カッサバプロトプラストの生産及び形質転換方法

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Publication number: JP2000510707A
Application number: JP09542082A
Authority: JP
Inventors: ヴィセル、リチャード・ゲラルダス・フランシスカス; ラエマケルス、クリスチアアン・ジョセフ・ジョハンネス; ジャコブソン、エヴェルト; ベルゲルヴォエト―ヴァン・デエレン、ジョハンナ・エリサベス・マリア
Priority date: 1996-05-20
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2000-08-22
Also published as: EP0902838A1; ATE332384T1; DE69736286T2; US6551827B1; CN1219202A; WO1997044473A1; BR9709014A; AU2914897A; ZA974383B; AR007208A1; DE69736286D1; ID16936A; EP0902838B1; CN1230547C

Abstract

(57)【要約】カッサバ又は極関連した種のプロトプラストを生産するための方法。プロトプラストは、植物に再生可能である。この方法は、カッサバ又は極関連した種の移植片からフライアブルすなわち非常にもろい胚形成カルスを生産する工程、及び前記フライアブル胚形成カルスからプロトプラストを分離する工程、を含む。プロトプラストは、このような方法により得ることができる。カッサバ又は極関連した種のこのようなプロトプラストを形質転換する方法、及びこれにより得ることのできる形質転換したプロトプラスト。これら方法から植物を再生するための方法、及びこれにより得ることのできるカッサバ植物又は極関連した種。

Description

【発明の詳細な説明】カッサバプロトプラストの生産及び形質転換方法遺伝子修飾又は形質転換は、一又は数個の遺伝子を商業的に関心のある遺伝子型又はクローンに加える技術である。原理的に、好結果の得られる形質転換システムは、新しい植物が特定の植物の部分（茎、葉、節、等々）又はプロトプラスト（細胞壁のない単一細胞）から形成される有効なシステム、ＤＮＡ分子を植物の部分又はプロトプラストに移植できるシステム、及び外来遺伝子を含み且つこの外来遺伝子に関する形質を発現する植物及び組織を選択できるシステム、を必要とする。原理的に、プロトプラストは、ＤＮＡ導入（delivery）に最も理想的なシステムである。プロトプラストは、単一細胞として培養でき、多細胞のコロニーを生じ、このコロニーから植物が発生する。プロトプラストから再生した植物は、起源的にほぼクローンである。これは、遺伝子導入植物でのキメラ現象を除くので、いずれの形質転換システムにも有用なツールを与える。カッサバは、プロトプラストの植物再生には非常に扱いにくいものである。カッサバのプロトプラストからの苗条再生に関する報告書が一つだけある（Shahin 及びShephard、1980年）。彼らは、プロトプラストの分離のため、よく広げた葉を使用した。努力の甲斐なく、（葉、茎及び根から分離した）プロトプラストからの植物再生は、以来まったく繰り返して行われてこなかった（Anonymus（1985）、Nzoghe（1991）、Anthonyら（1995 ）、Sofiari（1996））。胚形成細胞を含む組織を使用して論理学的に行われた。このような細胞は、オーキシン補充培地に培養した先端分裂組織、若い葉、又は不定胚（somatic embryos）にみられる（Stamp及びHenshaw（1987a）、Raemak ersら（1993a））。しかし、これら組織から分離されたプロトプラストが、最良の場合の緑色カルス及び不定根に与えた（sofiari（1996））。近年、新型の不定胚形成が開発された。この生体外システムでは、胚が（前下がり）球形（（pr o-）globular）段階を越えて発生せず、胚形成カルスが高度にフライアブル（fr iable）すなわち非常にもろい（Taylorら（1995））。このフライアブル胚形成カルス（ＦＥＣ:Friable Embryogenic Callus）の液体培地への移植が浮遊培養となった。セイヨウネギ（Buitenveld及びCreemers（1994））、ペチュニア（po werら（1979））、イネ（Kyozukaら（1988））、サトウキビ（Chenら（1988））、及びコムギ（Changら（1991））では、このような培養がプロトプラスト再生の優れたソースであった。カッサバにおいて、ＦＥＣが、プロトプラストが組織から分離でき植物に再生できる唯一の組織であることがわかった。よって、本発明は、プロトプラストの植物への再生が可能であるところの、カッサバ又は極関連した種のプロトプラストを生産するための方法を提供する。この方法は、フライアブル胚形成カルスをカッサバ又は極関連する種の移植片から生産する工程、及びプロトプラストを前記フライアブル胚形成カルスから分離する工程を含む。以下で説明するように適当なプロトプラストを得るためにはＦＥＣの溶液の培養が非常に重要であることがわかる。したがって、本発明は、さらに、フライアブル胚形成カルスを液体培地で培養する方法を提供する。プロトプラストは、好適に、植物細胞の細胞壁を酵素分解させることによって生産される。よって、本発明は、セルラーゼ、ペクトリアーゼ（pectolyase）及び／又はマセロチーム（macerozyme）といった細胞壁分解酵素の混合物を使用してプロトプラストを生産するための方法を提供する。また、移植片がとられる植物が前処理されるときに、本発明に従った方法が最も良く働くことがわかる。したがって、本発明は、以下で説明するように、移植片がとられる植物をオーキシンで前処理する方法を提供する。本発明に方法により、好適に、移植片に胚形成が誘導され、フライアブル胚形成カルスが魚雷型の一次胚又は成長しきった胚（又は成熟胚）から生産される。この理由については、詳細な説明の欄で説明する。また、上述のような方法によって得ることのできるプロトプラストも本発明の一部である。何故植物へ再生できるプロトプラストを有したいのか、という重要な理由は、当然に、プロトプラストが、他のいずれの適当な方法によっても付加的な遺伝子情報を容易に形質転換又は形質導入又は与えられるからである。よって、カッサバ植物又は極関連した種に、対象の遺伝子物質を与えることができる。よって、本発明は、（いずれの適当なやり方でも与えるように定義した）カッサバ又は極関連した種のプロトプラストを形質転換する方法も提供する。この方法は、前記プロトプラストを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのような、付加的な遺伝子情報を含むバクテリアによる感染を介して与えることによってなされる。これは、前記の付加的な遺伝子情報を含むベクターを与える電気穿孔法又は化学的穿孔法によるか、又は粒子を付加的な遺伝子情報と一緒にコーティングする粒子射突によってなされ、フライアブル胚形成カルスから得ることのできるプロトプラストが形質転換される。また、本発明は、このような方法によって得ることのできる形質転換されたプロトプラストも含む。以下、カッサバのような植物を形質転換することの有用性について簡単に紹介する。植物遺伝子技術の応用範囲は、有用な遺伝子、その特性及び操作から植物への一次変異構造の再導入にわたる多くの異なった技術を含む（Lonsdale（1987））。植物遺伝子技術は、イネ（Chenら（1987）、Shimamotoら（1989））、トウモロコシ（Gordon-Kammら（1990）、Vainら（1993））及びコムギ（Marksら（1989 ））及びポテト（De Block（1988）、Visserら（1989））といったトランスゲニック穀物で例示されるような品種改良を触媒促進する。遺伝子技術の急速な発展は、植物病原体識別の複雑な分子機構や宿主植物の自然防衛戦略にみられる。また、この技術は、伝統的な品種改良の可能性をはるかに越えた所望の遺伝子型の制御と有効な識別のために使用できる。例えば、浮遊培養に由来するプロトプラストの電気穿孔法が、トウモロコシ（ Rhodesら（1988））、イネ（Toriyamaら（1988））及びカモガヤ（Homら（1988 ））の形質転換に先立って行われた。好結果が得られる試みが、タバコ（Powel Abelら（1986））のトバモウイルス（tobamovirus）、及びポテト（Hoekemaら（1989））やパパイア（Fitchら（199 2））のポテックスウイルス（potexvirus）のような病原ウイルスに対する抵抗性を改良するためになされてきた。上記の例では、コート（coat）蛋白質をコードする単一の遺伝子の形質を発現することに基づいて導入される。カッサバでは、アフリカンカッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）及びカッサバコモンモザイクウィルス（ＣＣＭＶ）がコート蛋白質培地抵抗技術（Ｆａｕｑｕｅｔら（1992））により制御され得る。シアン化物形成の遺伝子解読キー酵素がクローン化（Hughesら（1994））され、実行可能の反対の方法を使用して遺伝子形質転換によりカッサバシアン化物形成の操作がなされる。よって、本発明は、付加的な遺伝子情報が、アンチセンス構造（antisense co nstruct）、特にアミロース合成経路を示すことのできるアンチセンス構造を含む、形質転換原形質を提供する。プロトプラストが、田畑で成長できず、収穫できない。プロトプラストが形質転換に必要であるが、前記プロトプラストを胚及び／又は植物に再生できなければならない。これは、カッサバのプロトプラストからの再生が困難であることを示したので、本発明の重要な実施例である。どのようにこれが達成されるかについては詳細な説明の欄で説明する。詳細は、本願に同封のE.Sofiariの論文「Reg eneration and Transformation of Cassava（Manihot Esculenta Crantz）」（未発行）を参照。よって、本発明は、プロトプラストから植物を再生するための方法を提供し、本発明に従ったプロトプラストが胚を生産するために誘導され、その結果として胚が植物を生産するために誘導される。前記方法によって得ることのできる植物、特に塊茎が本質的にアミロースを全く含まない植物も本発明の一部である。詳細な説明ＦＥＣの開始ＦＥＣを得るための手順の概略を図１に示す。まず、一次胚を誘導する。一次胚は、二つの工程で形成される。第一の工程では、移植片が、胚の開始のためのオーキシン（例えば、1-8ｍｇ/ｌのピクロラム又はダイカンバ（dicamba）又は2 ,4-Ｄ）、炭水化物ソース（例えば、20ｍｇ/ｌのスクロース）、ソルト及びビタミン（好適に、Murashige及びSkoog（1962））を補充した培地で培養される。10 から15日後、この最初の培地に双極（bipolar）魚雷型胚が形成される。魚雷型胚は、クリア（clear）胚軸及び子葉原始細胞を有する。魚雷型胚をもつ移植片を第二の工程の培地（オーキシンのない第一の工程の培地と同一の培地）に移植した後、魚雷型胚が成熟する。成熟胚は、大きい緑色子葉を有する。接合子胚（ Stamp及びHenshaw（1982）;Konanら（1994））、若い葉の移植片又は先端分裂組織（Stamp及びHenshaw（1987a）;Szabadosら（1987)；Mroginski及びScocchi（1 993）;Raemakers（1993a）；Narayamaswamyら（1995））及び花（floral)組織（ Mukherjee（ 1995））が、一次胚を得るために使用される。このやり方では、多数の異なった遺伝子型が、第一の胚を形成するこれらの能力について評価される。このプロトコルでは、一次不定胚が、固体培地での培養後に形成されるだけであり、液体培地での培養後には形成されない。さらに、オーキシンピクロラム、ダイカンバ（ Dicamba）又は2,4-Ｄが使用され且つＩＡＡ、ＩＢＡ又はＮＡＡと一緒でない場合、不定胚（一次）が観察されるだけである。現在使用のプロトコルでは、培養した移植片ごとに形成される成熟胚の数に遺伝子型の変化がある。遺伝子型M.Coll505、M.Col22及びGadingにより、培養した葉の移植片（ＭＥ/ＣＬＥ）ごとの成熟胚の最も高い数が与えられた。しかし、形成された成熟胚の数は低かった。M.Col22では、最大22％の葉の移植片が生体外で生育した植物から分離され、4ｍｇ/ｌの2,4-Ｄを有する第一の培地で培養され、最大数0.8ＭＥ/ＣＬＥのＭＥを形成した。第一の工程の8ｍｇ/ｌの2,4-Ｄを有する培地では、最大49％の葉の移植片が、最大数3.5ＭＥ/ＣＬＥをもつＭＥを形成した。より高濃度の2,4-Ｄが、移植片の胚形成容量をさらに改良することはなかった。一次不定胚を生産するために葉の移植片の能力を改良しようとする試みでは、ドナー植物を異なった条件下で生育した。異なった照光条件下（8、12 、16又は24時間）でのin vitroでのドナー植物の生育は、胚形成反応に何も影響を与えなかった。しかし、光強度の減少が、影響を与えた。最良の結果は、8μＥｍ^-2s^-1で生育し且つ第一の工程の培地で培養したドナー植物から分離した葉の移植片で得られた。特定の遺伝子型においては、一次胚形成を誘導するにはダイカンバ（1-55ｍｇ /ｌ）及びピクロラム（1-12ｍｇ/l）が2,4-Ｄよりも優れていることが、他の研究者によって示された（Ｎｇ（1992）；Sudarmonowati及びHenshaw（1993）；Ta ylor及びHenshaw（1993））。Mathewsら（1993）は、0.5％チャコールを有する成長調節物質の入っていない培地に第一の工程の培地の15日後の移植片を移植することによって、遺伝子型M.Coll505の一次胚形成の効率を改良した。この培地では、成熟が向上し、その結果、成熟胚が、0.4から3.4ＭＥ/ＣＬＥへ増大した。ドナー植物が2,4-Ｄ又はピクロラム又はダイカンバのようなオーキシンで前処理されると、最良の結果が得られた。このため、植物が、液体ＭＳ20で生育され、増殖12日後にオーキシン（最終濃度8ｍｇ/ｌ）が供給された。二日後、葉の移植片が、ドナー植物から分離され、8ｍｇ/lの2,4-Ｄ、ピクロラム又はダイカンバを有する第一の工程の培地で培養された。クローンM.Col22では、これが、9.4 ＭＥ/ＣＬＥの生産となった。これは、Ｈ₂Ｏ-処理制御-植物におけるよりも著しく高かった（ここで、3.5ＭＥ/ＣＬＥが生産された）（表３）。オーキシン前処理の一般的な応用性は、様々の異なった遺伝子型で試験された。ドナー植物の前処理なしで、二つの遺伝子型が低い頻度でＭＥを形成した。ドナー植物の前処理後、ほぼ全ての遺伝子型の葉の移植片がＭＥを形成した。最終的に、我々は、表１の22の試験遺伝子型のうちの18のもの（ＴＭＳ30221 、ＴＭＳ30001、ＴＭＳ30572及びSao Paoloを除く）から、成熟した一次不定胚を得ることができた。二次胚を開始するために、接合子や葉に由来した一次不定胚が移植片として使用された（Stamp及びHenshaw（1987b）;Szabadosら（1987）；Mathewsら（1993 ）；Raemakersら（1993bc）；Luongら（1995））。オーキシン補充培地での不定胚の連続培養が、不定胚形成のサイクリックシステムとなった。二次胚形成のために不定胚を二次培養するやり方は、胚形成組織の構造に影響するようにみえる。不定胚の凝集は、古い胚の先端に形成した最初の指状の胚に成長した固体2,4- Ｄを含む暗室培地で毎月再培養された。胚は、魚雷型の段階を経ることはなかった。胚の凝集が光のある第二の工程の培地に移植されると、さらに成長した。通常、成熟不定胚は、光のある第一の工程の培地で培養され、20日後、移植片が成熟のため第二の工程の培地に移植された。他のシステムでは魚雷型胚が二次胚不定胚形成の新たなサイクルを始めるために使用されたが、このシステムでは、胚は成熟し、大型の緑色子葉を有する成熟胚が胚形成の新たなサイクルを始めるために使用された。このような成熟胚の増殖システムは、遺伝子型に関連して説明した表１のもののうちの14のもので試験された。ほとんどの遺伝子型では、幾つかの成熟した一次胚が入手でき、一つを除く全ての遺伝子型が2,4-Ｄ補充培地での培養後に一次不定胚形成で観察したように非常に高い頻度で新しい成熟胚を与えた。胚形成は、１年以上の間、成熟胚の通常の二次培養により維持された（Szabadosら（1987 ）；Mathewsら（1993）；Raemakers（1993））。新しい不定胚が、液体及び固体の両方の培地で形成される。全ての遺伝子型において、液体培地では、固体培地よりも多くの胚が形成されたこと、及び胚全体と比較して二次胚不定胚形成の新しいサイクル前の胚の断片化がその生産を増加したこと、が観察された。例えば、Ｍ.Ｃol22では、断片化した胚が液体培地で培養されて培養胚ごとに32の胚が生産される（Raemakersら（1993c））のではなく、胚全体が、固体培地で培養されて培養胚ごとに8の胚が生産された。2,4-Ｄ、ピクロラム又はダイカンバだけでなく、ＮＡＡも二次胚形成を誘導した。ＩＢＢ及びＩＡＡは、二次胚形成を誘導しなかった。ＮＡＡが、Adira 1、Adira 4、Gading、Line 11、M.Col22、M.Co ll505、ＴＭＳ90853及びGadingで使用され、好結果を得た。一般に、より多くの成熟胚が、 2,4-Ｄ、ピクロラム又はダイカンバ補充培地よりもＮＡＡ補充培地で生産された。さらに、胚を誘導したＮＡＡの成長は、2,4-Ｄ、ピクロラム又はダイカンバよりも速い。培養期間の短縮は、特に大型のものを操作するときに、有益である。歴史的に、2,4-Ｄにより新しく誘導された二次胚は、移植片に、ＮＡＡにより水平方向に付着されるのではなく、垂直に付着された。カッサバの胚形成培養を得るには、まだ問題がある（Mroginski及びScocchi（ 1992）；Taylorら（1992）；Narayanaswamyら（1995）；Sudarmonowati及びBach tiar（1995））。主たる問題は、一次の移植片からの胚形成組織が得られることではなく、二次胚形成によるこの組織の大規模な増殖である。この目的のため、魚雷型胚を含む組織か又は成熟胚を使用した。魚雷型胚の増殖は遺伝子型に非常に依存し、一方、成熟胚の増殖は遺伝子型に依存しない（Raemakers（1993））。一次及び二次胚両方の不定胚は、双極（bipolar）構造を有する胎芽の形状に特徴がある。この双極魚雷型胚は、オーキシンを補充した第一の工程の培地ですでに形成される。したがって、Taylorら（1995）が、用語「有機化（organized ）胚形成」を提案した。有機化細胞は、全体を特徴的に一体化したものに形成される組織及び有機物を有する能動的に分裂する細胞のグループ、と定義される（ Walker（1989））。より少ない有機化型の不定胚形成がTaylorら（1995）によって開発された。連続的に選択して、有機化胚形成組織は、Gresshoff及びDoy（1972）のソルト、ビタミン、及びピクロラム（10ｍｇ/l）（ＧＤ2）補充培地で培養され、より少ない有機化組織に徐々に転換された。この組織は、（前下がり）球形胚のカルス状のマス（mass）を含み、非常にフライアブル、つまり非常にもろい。このことから、この組織は「フライアブル胚形成カルス（ＦＥＣ）」と呼称された。ＦＥＣの細胞は、一体化構造に有機化されないので、連続的に、グループコントロール（group control)から逸脱した状態にある。ＦＥＣは、Gresshoff及びDoy（1972 ）のビタミン及びソルト、ダイチン・アガー（Daichin agar）（7g/l）、スクロース（20b/l）及びピクロラム（固体ＧＤ2）（10ｍｇ/ｌ）を含有する培地に維持される。フライアブル胚は、三週間ごとに上記の培地で二次培養される。液体浮遊培養を開始するために、0.5gのフライアブル胚が、Schenk及びHildebrandt （1972）のソルト及びビタミン、スクロース（60g/l）及びピクロラム（液体ＳＨ6）（10ｍｇ/ｌ)を補充した50ｍｌの液体培地を入れた200ｍｌのフラスコに移された。この培地は、二日ごとに新たに供給され、14日後、各フラスコの含有物が5つを越える新しいフラスコに分けられた。ｐＨは、オートクレーブに入れる前、507に調節された。増殖チャンバ内の温度は30℃、光周期は12時間、放射照度は40μｍｏｌｍ^-2ｓ^-1であった。浮遊培養が、6％（w/v）のスクロース及び10 ｍｇ/ｌのピクロラム（ＳＨ６）を補充したSchenk及びHidebrandt（1972）の培地にＦＥＣを培養することによって開始された。2又は3日ごとにこの培地が新たに供給された。高いフライアブル状態に培養を維持するために、ＦＥＣは、二ヶ月に一回篩いにかけなければならない。実用的には、ＦＥＣの一部が1ｍｍ²メッシュの篩いにかけられ、二次培養に使用される。ＦＥＣは、ＧＤ2又はＳＨ6の培地では、魚雷型胚をほとんど形成しない。魚雷型及びそれに続く成熟胚は、ＦＥＣが成熟培地で培養されると、形成される。成熟培地は、Murashige及びSkoog（1962）のソルト及びビタミン、ミオ-イシトール（0.1g/l）、スクロース（20g/l）、マンニトール（18.2g/l）、ＭＥＳ（0.48 g/l）、カゼインヒドロリセート（caseinhydrolysate）（0.1g/l）、アデニン硫酸塩（0.08g/l）、d-カルシウム-パントテナート（panthotenate）（0.5ｍｇ/ｌ）、コリンクロライド（choline chloride）（0.1ｍｇ/ｌ）、アスコルビン酸（ 0.5ｍｇ/ｌ）、ニコチン酸（2ｍｇ/ｌ）、ピリドキシン（pyridoxine）-ＨＣＩ（1ｍｇ/ｌ）、チアミンＨＣＬ（10ｍｇ/ｌ）、葉酸（0.5ｍｇ/ｌ）、ビオチン（0.05ｍｇ/ｌ）、グリシン（0.5ｍｇ/ｌ）、Ｌ-システイン（0.1ｍｇ/ｌ）、リボフラビン（0.25ｍｇ/ｌ）及びピクロラム（1ｍｇ/ｌ）を含有する。この成熟培地は、3週間ごとに新たに供給された。成熟胚は、2,4-Ｄ、ピクロラム、ダイカンバ又はＮＡＡを補充したＭＳ20培地で培養することによって二次胚不定胚形成に誘導される。一次及び二次胚不定胚形成は、広い範囲の遺伝子型（表１を参照）で確立するのに比較的容易であり、一方、ＦＥＣは幾つかの遺伝子型に制限される。ＦＥＣは、不定胚形成及び遺伝し形質転換の新しいシステムにおいて、このシステムをよりいっそうの遺伝子型に適用可能にするために、よりいっそうの研究が必要であるが、有望である。高品質の有機化組織の利用可能性、及びＦＥＣに転換するこの組織の能力が、このプロセスには不可欠である。この場合、二つの工程（有機化組織の開始、及び非有機化組織への転換）が好結果のＦＥＣの開始のために確定的である。これら工程の両方が遺伝子型に依存する。有機化組織がRaemakers（1993）に説明されるような成熟状態に増殖されると、ＦＥＣに転換するこの組織の能力だけがＦＥＣを開始する確定的な工程である。いずれにしても、有機化組織が、開始物質として使用できる。有機化組織が使用できなければ、この組織は、ＦＥＣの開始に使用される前に非成熟状態で最初に増殖される。これは、高密度で移植片を培養するか又はサイクリック期間を短縮することによって明らかに達成される。プロトプラストからの植物の再生プロトプラストの分離プロトプラストの分離のために、固体ＧＤ2又は液体ＳＨ6のどちらで培養したＦＥＣでも使用することができる。しかし、プロトプラストの最高収率は、液体ＳＨ6で1〜3週間培養したＦＥＣより得ることができた。 2グラムのＦＥＣが、細胞壁消化溶液10ｍｌを入れたペトリ皿（Φ9ｃｍ）に置かれた。細胞壁消化溶液は、細胞壁分解酵素；10ｍｇ/ｌペクトリアーゼ、10g/l のセルラーゼ、200ｍｇ/ｌのマクロ酵素(machroenzyme)、成長調節物質（ＮＡＡ 1ｍｇ/ｌ）2,4-Ｄ 1ｍｇ/ｌ）ゼアチン1ｍｇ/ｌ）；メジャーソルト(major sal ts)（368ｍｇ/ｌＣａＣｌ₂、34ｍｇ/ｌのＫＨ₂ＰＯ₄、740ｍｇ/ｌのＫＮＯ₃、4 92ｍｇ/ｌのＭｇＳＯ₄.7Ｈ₂Ｏ）；マイナーソルト(minor salts)（19.2ｍｇ/ｌのＮＡ-ＥＤＴＡ、14ｍｇ/ｌのＦｅＳＯ₄.7Ｈ₂Ｏ）及びオスモチカム（91g/lのＤ-マンニトール）、並びに0.5g/lのＭＥＳの混合物を含む。細胞壁分解酵素セルラーゼ（1-10g/l）にマセロザイム（200ｍｇ/ｌ）を加えたものが、プロトプラストの分離に成功した。ペクトリアーゼ（0.001-0.011g/l）及び／又はドリセラーゼ（0.02g/l）をさらに添加すると、プロトプラストの収率が高くなった。1 8時間のインキュベーション後、溶液に10ｍｌの洗浄媒体（washing medium）が添加された。0.530ｍＯｓｍ/ｇのオスモル濃度である洗浄媒体は、メジャーソルト（細胞壁消化溶液参照）、45.5g/lのマンニトール及び7.3g/lのＮａＣｌを含む。消化された組織は、73μＭ孔径のフィルター（ＰＡ55/34Nybolt-Switzerland）を通して、250ｍｌビーカーガラスの中にろ過された。ろ液は等しく２つの12ｍｌ円すいスクリューに分けられ、600ｒｐｍで3 分間遠心された（Mistral2000）。洗浄手順は、上澄みの除去後、もう一度繰り返された。プロトプラスト溶液は、メジャー及びマイナーソルト（細胞壁消化溶液参照）及び105g/lスクロースを含む9.5ｍｌの溶液に浮かべられて再懸濁された。ｐＨは5.8であり、オスモル濃度は0.650ｍＯｓｍであった。プロトプラストを含んだ溶液は、0.5ｍｌの洗浄媒体を静かに頂部に添加する前に、5分間平衡をとることができた。700ｒｐｍで15分間遠心すると（Mistral2000）、プロトプラストは、スクロースと洗浄媒体の間のバンドに集められた。プロトプラストの層を、パスツール・ピペットで回収し、収率は、標準的なヘモサイトメーター・チェンバ(haemocytometer chamber)で計算された。プロトプラスト培養プロトプラストは、アガロース0.2％w/v（0.1-10ｍｇ/ｌ）（Dons en Bouwer, 1986）で凝固され、10ｍｌの同様の液体培地を含む媒体で、ペトリ皿において培養された。次の媒体が、微小なカルスを形成した：ＴＭ2Ｇ培地（Wolters et al.,1991）は、オーキシン（0.1-10ｍｇ/ｌのＮＡＡ若しくは0.1-10ｍｇ/ｌのピクロラム、又は0.1-10ｍｇ/ｌのＩＡＡ、又は 0.1-10ｍｇ/ｌの2,4-Ｄ)又は0.1-10ｍｇ/ｌのダイカンバ（dicamba）又は0.1-10 ｍｇ/ｌ、又は0.1-10ｍｇ/ｌ）のみを補充するか、又はオーキシンにサイトカイニン（0.01-1ｍｇ/ｌゼアチン、0.01-1ｍｇ/ｌの2-iP、0.01-1ｍｇ/ｌＢＡ、0.0 1-1ｍｇ/ｌＴＤＺ、0.01-1ｍｇ/ｌカイネチン）を加えたものを補充したものである。培地Ａ（Murashige and Skoog(1962)ソルト及びビタミン、4.5g/lミオ・イノシトール、4.55g/lマンニトール、3.8g/lキシリトール、4.55g/lソルシトール、 0.098g/l ＭＥＳ、40ｍｇ/ｌアデニン硫酸塩及び150ｍｇ/ｌカゼイン加水分解塩（caseinhydrolysate）、0.5ｍｇ/ｌ d-カルシウム-パントテナート（d-calcium -panthotcnate）、0.1ｍｇ/ｌ塩化コリン、0.5ｍｇ/ｌアスコルビン酸、2.5ｍｇ /ｌニコチン酸、1ｍｇ/ｌピリドキシン-ＨＣｌ、10ｍｇ/ｌチアミン-ＨＣｌ、0. 5ｍｇ/ｌ葉酸、0.05ｍｇ/ｌビオチン、0.5ｍｇ/ｌグリシン、0.1ｍｇ/ｌＬ-システイン及び0.25ｍｇ/ｌリボフラビン及び59.40g/lグルコース）は、オーキシン（0.1-10ｍｇ/ｌＮＡＡ若しくは0.1-10ｍｇ/ｌピクロラム、又は0.1-10ｍｇ/ ｌＩＡＡ、又は0.1-10ｍｇ/ｌ 2,4-Ｄ、又は0.1-10ｍｇ/ｌダイカンバ（dicamb a））のみを補充するか、又はオーキシンにサイトカイニン（0.01-1ｍｇ/ｌゼアチン、0.01-1ｍｇ/ｌ 2-iP、0.01-1ｍｇ/ｌＢＡ、0.01-1ｍｇ/ｌＴＤＺ、0.01 -1ｍｇ/ｌカイネチン）を加えたものを補充したものである。媒体は10日毎に、9ｍｌの新しい培地と交換することにより、新しくされた。最初の培地における培養から2ヶ月後、高品質のＦＥＣが選択され、さらなる増殖のためか、又は成熟のために培養された。増殖のために、ＦＥＣは、40g/lのスクロース、7g/lのダイシン-アガー（Daichin-agar）及び2ｍｇ/ｌのピクロラムが補われたGresshoff and Doy（1974）の培地（ＧＤ4）に移された。 3週間後、ＦＥＣは、20g/lのスクロース、7g/lのアガー及び10ｍｇ/ｌのピクロラムが補われたGresshoff and Doy（1974）の培地（ＧＤ2）に移された。1.0gのＦＥＣを、10ｍｇ/ｌのピクロラムが補われた液体ＳＨ6％培地に移すことにより、浮遊培養が開始された。2週間後、最初のパックされた細胞の量（packed cell volume）を1.0ｍｌにして、懸濁液が新しいフラスコに分けられた。培養2ヶ月後、10⁶/ｍｌの密度で培養されたプロトプラストは、64ミクロ−カリ（micro-calli）のみを生成するにすぎないが、0.5ｍｇ/ｌのＮＡＡ及び1ｍｇ /ｌのゼアチンを補われた10⁵/ｍｌの密度のＴＭ2Ｇで培養された10⁴プロトプラストは、1058ミクロ-カリ（micro-calli）を生成した。ＴＭ2Ｇ培地を培地Ａと置き換えると、どちらの密度においても、ミクロ-カリ（micro-calli）の数は著しく減少した。この段階において、少なくとも3タイプのカリを識別することができた。1つの型は、密度10⁶で培養されたプロトプラストに、最も多く観察される、球状胚から成った。それらのいくつかは、明るい緑色の、構造（structures ）のように発達した子葉であった。しかし、これらの胚は、正しく発芽することができなかった。もう１つの型は、早く生長し、大きく密集したカルスであり、このカルスは、どちらの密度で培養したプロトプラストにも観察された。第３の型は、どちらの密度でも観察された非常にもろいカルスであった。密度2-5×10⁵（ＴＭ2Ｇ培地）において、約60％のカリがもろく、胚が形成された。ＦＥＣは、さらなる増殖のためか、又は成熟のために継代培養された。プロトプラストに由来したＦＥＣの増殖次のＦＥＣの選択で、2ｍｇ/ｌピクトラムを加えたＧＤ4上で培養された0.1g のＦＥＣは、３週間後、0.7gの組織へと増殖した。組織の95％以上が、高品質のＦＥＣから成った。次にこの組織は、10ｍｇ/ｌピクトラムを加えたＧＤ2上での継代培養により、３週間維持された。浮遊培養を開始するために、ＦＥＣが液体培地へと移された。この物質のパックされた細胞量（ＰＣＶ）の増加は、元の物質のＰＣＶ（データは示していない）よりも、やや高かった。プロトプラストに由来したＦＥＣの成熟胚の成熟を誘導する試みでは、ＴＭ2Ｇで２ヶ月培養した後に分離されたＦＥＣが、成熟培地で培養された。成熟培地は、Murashige and Skoog(1962)ソルト及びビタミン、0.1g/lのミオ・イノシトール、20g/lのスクロース、18.2g/lのマンニトール、0.48g/lのＭＥＳ、0.1ｍｇ/ｌのカゼイン加水分解塩（caseinhydrolysate）、0.08g/lのアデニン硫酸塩、0.5 ｍｇ/ｌのd-カルシウム−パントテナート（d-calcium-panthotenate）、0.１ｍｇ/ｌの塩化コリン、０.5ｍｇ/ｌのアスコルビン酸、2.ｍｇ/ｌのニコチン酸、１ｍｇ/ｌのピリドキシン-ＨＣｌ、10ｍｇ/ｌのチアミン-ＨＣｌ、0.5ｍｇ/ｌの葉酸、0.05ｍｇ/ｌのビオチン、0.5ｍｇ/ｌのグリシン、0.1ｍｇ/ｌのＬ-システイン、0.25ｍｇ/ｌのリボフラビン及び1ｍｇ/ｌのピクロラムを含んだ。この成熟培地は３週間毎に新しい培地と交換された。この培地上で、増殖から成熟へのゆるやかなシフトがあった。結果として、パックされた細胞量は、液体成熟培地において２週間培養した後、ファクター４（ factor4）と共に増加した。固体成熟培地移した後も、増殖はある。固体培地上で２週間後、ほとんどの胚は球状型に達し、これらの球状胚のわずかなものだけが、さらに発達した。固体成熟培地で１月培養すると、一次魚雷型胚が見られるようになった。成熟胚及び魚雷型胚の数は、コロニー形成率に関連していないが、最初に培養されたプロトプラストの密度と関連していた。このような胚は、プロトプラストが成長調節物質なしにＴＭ2Ｇ上で培養されたならば、得ることができなかった。成熟胚及び魚雷型胚の最大数は、0.5ｍｇ/ｌのＮＡＡ及び1ｍｇ/ ｌのゼアチンを補ったＴＭ2Ｇ上で培養したプロトプラストから形成された。ＮＡＡをピクロラムで置き換えると、魚雷型胚と成熟胚の数は、著しく低くなった（表２）。テストされたピクロラム濃度2ｍｇ/ｌのものから、最良の結果が得られた。培養３ヶ月後、アガロース１滴当たり60から200の間の魚雷型胚及び成熟胚が分離された。魚雷型胚は、新しい成熟培地、又は0.1ｍｇ/ｌのＢＡＰを加えたＭＳ2で培養されると、高頻度で成熟胚になった。二次胚不定胚形成及びプロトプラストに由来した成熟胚の再生 10ｍｇ/ｌのＮＡＡ又は8ｍｇ/ｌの2,4-Ｄを補った液体又は固体ＭＳ2培地で培養すると、わずかな魚雷型胚のみが、二次胚を形成した（データは示していない）。成熟胚は、二次胚形成によりよく移植された。液体及び固体培地の両方において、二次胚の誘導のためには、ＮＡＡと比較して、2,4-Ｄが優れていた。成熟胚が第一に2,4-Ｄで培養され、次に液体ＮＡＡで培養されると、応答は2,4-Ｄ単独の培養と比較することができる。第一に2,4-Ｄを含む培地において二次胚形成のサイクルを経ている胚もまた、10ｍｇ/ｌのＮＡＡを補ったＭＳ20において、高い効率で二次胚を生成する。液体培地において、オーキシン2,4-Ｄジクロロフェノキシ酢酸（2,4-Ｄ）又はナフタレン酢酸（ＮＡＡ）により誘導された循環的（cyclic）又は二次胚の発芽が比較された。すべての遺伝子型において、乾燥は、胚に誘導されたＮＡＡの正常な発芽を刺激する。しかし、乾燥された胚では、高頻度の発芽のために、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）のようなサイトカイニンを補った培地が必要とされた。結果としてできた実生の形態は、ＢＡＰの濃度に依存した。1ｍｇ/ｌのＢＡＰでは、厚く短い主根及び短い節間をもつ枝分かれした苗条が生長した。0.1ｍｇ/ｌのＢＡＰでは、主根は薄くて細く、苗条は１つ又は２つのみの先端分裂組織を有していた。胚が部分最適に（sub-optimally）乾燥されると、胚が発芽を刺激されるように最適に乾燥された場合よりも、より高い濃度のＢＡＰが必要とされた。暗室で培養された、乾燥された胚は、より低い濃度のＢＡＰを必要とし、さらに、これらの胚は、明室で培養された胚よりも早く発芽した。不定胚誘導の開始から４週間後に、完全な植物体が得られた。2,4-Ｄは、異なった応答を示した胚を誘導した。１つの遺伝子型のみにおいて、乾燥が、胚に誘導された2,4-Ｄの発芽を強化し、その他の３つの型では、強化されなかった。すべての遺伝子型において、乾燥が根の形成を刺激した。明室で培養された胚が、優勢に主根を形成したが、暗室で培養された胚が優勢に不定根を形成した。 4.0遺伝子移植システム過去何年もの間、シリコンファイバー法（Kaepplerら（1990））、ミクロ注入法（DeLaat及びBlaas（1987））及び電気泳動法（Griesbach及びHammond（1993 ））といった、ＤＮＡを植物プロトプラストヘ導入する様々な技術が開発されてきた。最も共通的に使用され且つ潜在的に応用可能なものは、アグロバクテリウム培養遺伝子導入法、ミクロ射出／粒子射突法及びプロトプラスト電気穿孔法である。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＤＮＡ導入システムは、最も共通的に使用される技術である。それは、この方法による植物のＤＮＡ導入の第一の発明に確率的に関連する。最初に、それは、リュウキュウベンケイ属の多肉植物及びナス科植物、特にタバコに限定された。今日では、アグロバクテリウム培養形質転換は、劇的に変化し、単子葉植物に限定されるものを含む広い範囲の植物の形質転換が可能である（Wordragen及びDons（1992）を参照）。カッサバはアグロバクテリウムのホストであるが、それを受けることがそれほど高くないことが証明された。原理的に、プロトプラストは、単一細胞として培養でき、多細胞のコロニーを生じ、このコロニーから植物が発生する。プロトプラストに由来した植物は、起源的にほぼクローンである。これは、遺伝子導入植物でのキメラ現象を除くので、いずれの形質転換システムにも有用なッールを与える。しかし、プロトプラストの使用は、種に非常に依存する再生システムによって妨害される。形質転換のため、例えば、ロリウムマルチフォーム（Lolium multiform）（Potrykusら（19 85））やトリチカムモノコッカム（Triticum monococcum）（Lorzら（1985））で展示されたようにＤＮＡを細胞質に入れ込むことのできる可逆的透過化を起こさせるプラズマメンブレン（plasma membrane ）を部分的に変更するＰＥＧに関連して使用できる。ＤＮＡに対するプラズマメンブレンや細胞壁の透過性を増大させる他の技術は、電気穿孔法（Jonesら（198 7）を参照）によるものである。この方法では、電気パルスがＤＮＡを細胞に入り込む。イネは、プロトプラスト電気穿孔法により繁殖能力のある導入遺伝子植物となった最初の収穫物であった（Shimamotoら（1989））。粒子射突法又はバイオリスチック（biolistic）を外来ＤＮＡの導入に使用すると、カッサバ形質転換の変形的な方法を与える。粒子射突法は、ほとんどの組織の細胞にＤＮＡ導入可能の唯一の手法である。この方法によって得られた最初の導入遺伝子植物は、タバコであった（Kleinら（1989））。この好結果の得られる形質転換方法に従って、粒子射突法が、アグロバクテリウム感染を受け入れにくい植物、特に単使用植物に広く使用される。粒子（ミクロ射出）を加速する様々なＤＮＡ導入装置の改良の結果が、最新式モデルの「Biolistic（商標）ＰＤＳ-1000」（Bio-Rad Laboratories：カリフォルニア州リッチモンド）である。これら装置は商業的に入手可能であるが、比較的高価であるのが現状である。ＤＮＡにコーティングしたタングステンや金の粒子がミクロ射出に共通的に使用され、ターゲット組織へのＤＮＡ導入がなされる（Songstadra（1995））。 5．選択及び遺伝子修飾に使用されるリポーター遺伝子形質転換細胞を識別可能とするため、対象の遺伝子は、選択可能のマーカー遺伝子と結合される。このマーカー遺伝子は、形質転換細胞を選択するのに必要である。選択は、形質転換細胞／組織の視覚的特徴に基づいてなされる。一例として、ホタルから分離したルシフェラーゼ遺伝子がある。この遺伝子を発現し且つ基質（ルシフェリン）と供給される植物細胞は、特殊な機器で検出できる光を発する（Owら（1986））。形質転換組織を選択する他のやり方は、抗生物質又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子の導入である（Thompsonら（1987）；Gord on-Kammら（1990））。多くの抗生物質及び除草剤が、植物形質転換での選択的な剤として使用されてきた。フォスフィノチリシン（phosphinothricin）（ＰＰＴ）除草剤に対する穀物の耐性は、導入遺伝子植物の選択のために選ばれた（Ca oら（1990））。カリカパパイヤ（Carica papaya）（Fitchら（1994））、ヴィチスヴィニフェラ（Vitis vinifera）（Nakanoら（1994）；Scorzaら（1995））、トウモロコシ（Rhodesら（1988））、及びイネ（Chenら（1987））では、カナミシン（kanamycin）及び関連した抗生物質（Fralyら（1986））に対する耐性をもつネオミシンフォスフォタンスフェラーゼ（neomycine phosphothansferase）（ＮＰＴII）遺伝子が選択可能なマーカーとして使用された。カッサバでは、上記の全ての選択のシステムが使用できるが、ＰＰＴに基づいた選択が平均的であり、成熟胚を形成するＦＥＣの能力改良し、このやり方で植物再生を増大する。図１の説明図１：一次、二次胚不定胚形成、フライアブル胚形成カルスの選択、発芽に従った成熟及び乾燥を含む、カッサバの不定胚形成を略示する。 gd2＝Gresshoff及びDoyのソルト（1974）、ビタミン及び20g/lのスクロースを補充した培地 gd4＝Gresshoff及びDoyのソルト（1974）、ビタミン及び40g/lのスクロースを補充した培地 ms2＝Murashige及びSkoogのソルト（1974）、ビタミン及び20g/lのスクロースを補充した培地 pic＝10ｍｇ/ｌのヒクロラムＮＡＡ＝10ｍｇ/ｌのナフタレン酢酸 2,4-Ｄ＝8ｍｇ/ｌの2,4-ダイクロロフェノキシ酢酸 sh6＝Schenk及びHildebrandt（1972）のソルト、ビタミン及び60g/lのスクロースを補充した培地表１不定胚形成に使用するカッサバの遺伝子型インドネシアナイジェリアＴＭＳ90853 M.Col22 Adira１ＴＭＳ50395 ＴＭＳ30555 ジンバブエ Tjurug ＴＭＳ60444 ＴＭＳ30211 Line11 Adira４ＴＭＳ90059 ＴＭＳ30395 ヴェネゼーラ Mangi４ＴＭＳ30572 ＴＭＳ30001 M.Ven77 Gading ＴＭＳ4(2)1244 コロンビアブラジル Faroka ＴＭＳ60506 M.Col1505 Sao Paolo 表２：生体外の、成熟胚の形状と反応する葉の移植片の数、及び培養葉移植片（ #ＭＥ/ＣＬＥ）ごとの成熟胚の数、に対するドナー植物の生育中の光強度の影響光強度移植片数反応移植片ａ生産物（μＥｍ^-2s^-1）（#ＭＥ/ＣＬＥ^b） 40 48 18b 1.7b 28 48 26ab 4.9ab 8 48 31a 6.6a 同一文字の上付きa、bは、それぞれカイ平方法試験（p＜0.1）及びＬＳＤ試験（p＜0.1）による差が小さいことを意味する。表３：11のナイジェリアンカッサバ遺伝子型とM.Col22における、第二の不定胚形成による成熟胚の生育に従った、一次の成熟胚（生体外の植物から分離した培養葉移植片ごとの成熟胚の数）の生産に対する2,4-Ｄ前処理の影響胚形成 −次a) 二次b) 2,4-Ｄ前処理 No Yes M.Col22 3.5 9.4 13.5 ＴＭＳ30555 0 0.7 6.2 ＴＭＳ50395 0 <0.1 5.3 ＴＭＳ60506 0 <0.1 0 ＴＭＳ90059 0 <0.1 7.2 TＭＳ30211 0 0 - ＴＭＳ60444 0 1.1 9.9 ＴＭＳ30395 0 0.1 6.7 ＴＭＳ90853 <0.1 0.2 8.2 ＴＭＳ4(2)1244 <0.1 0 5.4 ＴＭＳ30001 0 0 - ＴＭＳ30572 0 0 -^a) 三つの実験の平均（合計48-74の葉移植片）^b) 二つの実験の平均（合計28-48のＭＥ移植片）参照文献 Anonymus著,1985,ＣＩＡＴ:Annual report:Centro International de Agricultu ra Tropical,Cali,Columbia,pp197-217 Anthony,P.,Cavey,M.R.,Power,J.B.及びLowe,K.C.著,1995,An improved protoco l for the culture of cassava leaf protoplasts.Plant Cell Tissue and Orga n Culture.42:229-302 Buiteveld,J.及びCreemers-Molenaar,J.著,1994,Plant regeneration from prot oplasts isolated from suspension cultures of leek(Allium 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ラエマケルス、クリスチアアン・ジョセフ・ジョハンネスオランダ国アルンヘム6836シー・エヌ、ディー・アール．ダブリュ．ドレエシンゲル 39 (72)発明者ジャコブソン、エヴェルトオランダ国ワゲニンゲン6706ビー・ディー、リッツェマ・ボスウェグ77 (72)発明者ベルゲルヴォエト―ヴァン・デエレン、ジョハンナ・エリサベス・マリアオランダ国レンクム6871ジェイ・エム、ホゲンカムプセウェグ119

Claims

【特許請求の範囲】 1. カッサバ又は極関連した種の、植物に再生可能のプロトプラストを生産するための方法であって、カッサバ又は極関連した種の移植片からフライアブル胚形成カルスを生産すること、及び前記フライアブル胚形成カルスからプロトプラストを分離すること、を含む方法。 2. フライアブル胚形成カルスが、液体培地で培養される、請求項1の方法。 3. プロトプラストを生産するために、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、及び／又はマセロチームのような細胞壁分解酵素の混合物が使用される、請求項1又は2の方法。 4. 移植片をとる植物がオーキシンで前処理される、請求項1から3のいずれか1 の方法。 5. フライアブル胚形成カルスが、魚雷型の一次又は成熟胚から生産される、請求項1から4のいずれか1の方法。 6. 胚が、一次の移植片に誘導される、請求項5の方法。 7. 請求項1から6のいずれか1の方法により得られるプロトプラスト。 8. カッサバ又は極関連した種のプロトプラストを形質転換するための方法であって、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのような付加的な遺伝子情報を含むバクテリウムによる感染を介するか、前記付加的な遺伝子情報を含むベクターを与える電気穿孔法又は化学的穿孔法によるか、又は、粒子が前記付加的な遺伝子情報をコーティングされる粒子射突法により、前記付加的な遺伝子情報をもつ前記プロトプラストを与える工程、を含み、請求項7のプロトプラストが形質転換される、ところの方法。 9. 請求項8の方法により得られる形質転換したプロトプラスト。 10．付加的な遺伝子情報が対象の遺伝子を含む、請求項9の形質転換したプロトプラスト。 11．付加的な遺伝子情報がアンチセンス構造を含む、請求項9の形質転換したプロトプラスト。 12．アンチセンス構造が、アミローゼ合成経路を示すことができる、請求項11の形質転換したプロトプラスト。 13．胚を生産するために、請求項7、9-12のいずれか1のプロトプラストが誘導され、植物を生産するために、続けて、胚が誘導される、プロトプラストから植物を再生するための方法。 14．請求項13の方法によって得られる、カッサバ植物又はその極関連した種。 15．その塊茎が本質的にアミローゼを全く含まない、請求項12のプロトプラストから得られる請求項14の植物。