CN101186910B - 花生转基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生转基因的方法，其步骤是首先建立花生的重复体细胞胚发生培养物；其次是将外源DNA或基因构建在植物表达框或表达载体中，抽提、纯化和确定外源DNA的浓度；第三是微粒轰击转化重复体细胞胚发生培养物和筛选独立抗性细胞系；第四是再生植株和传代；第五是转基因植株和转基因后代分子分析。本发明采用保存0-6年的成熟花生种子诱导的，启始培养后1-10个月的重复体细胞胚发生培养物为转基因受体；转基因效率高，转化通量高；轰击后筛选效率高，无逃逸，无嵌合体；整个过程不存在基因型依赖，且再生植株高效容易，可大量获得转基因后代种子，且外源基因可稳定整合、表达遗传。

Description

花生转基因的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种花生转基因的方法，该方法适用于所有的花生品种、品系或种质资源材料。

背景技术

植物转基因技术通过各种不同的转化系统，把从动物、微生物、病毒或植物等中分离到的目的基因(外源基因)，通过各种方法转移到受体植物的基因组上，使得外源基因在受体植物中稳定遗传，并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。

花生是我国主要的油料作物，富含油脂和蛋白。利用生物工程和转基因的手段进行品种改良和遗传学研究是花生基因工程的重要内容。自1993年获得第一例转基因花生以来(Ozias-Akins P，Schrmll JA，Anderson WF et al.Regeneration of transgenic peanut plants from stably transformedembryogenic callus.Plant Science，1993，93：185-194)，花生的基因转化方法得到很多改进(许泽永，花生转化和再生研究进展。农业生物技术学报，2001，9(2)：107-111)。

花生的转化方法可以分为基于组织培养的基因转化和非组织培养的基因转化。

基于组织培养的基因转化是以外植体和源于之的培养物为转基因受体。这些外植体包括成熟胚或无菌苗的胚轴、子叶、幼叶，未成熟胚及其胚轴、子叶等，源于之的培养物主要分为不定芽发生培养物和体细胞胚发生培养物。这些受体接受外源DNA的主要方法为农杆菌介导基因转化、基因枪介导基因转化。转化后都要经过组织培养筛选抗性的转化系和再生抗性转化植株过程。此过程需要无菌环境、人工光照和控制温/湿度等培养条件，一般受到基因型、外植体类型、受体状态、培养筛选和再生植株方法和条件等很多因素的影响，因此高效组培植株再生技术是基于组织培养的基因转化必要的前提条件之一。以上述不同花生器官、组织为外植体，通过器官发生和/或体胚发生途径再生植株均获得成功，随着再生和转化技术的进步，目前形成两种主要花生基因转化技术体系。农杆菌介导基因转化以花生幼苗嫩叶、种子子叶为外植体诱导的不定芽发生培养物，通过卡那霉素筛选、器官发生再生转化植株；基因枪介导转化以未成熟胚(子叶)和成熟种胚、胚小叶为外植体诱导的胚性愈伤，通过潮霉素筛选获得抗性转化体胚，再生转化植株。这均建立在比较成熟的器官和体胚发生再生植株研究的基础上。

以幼叶、胚小叶和子叶为外植体的器官发生植株再生技术研究。在80年代获得成功的基础上，致力于提高植株再生效率。Mckently等(McKently AH，MooreGA.Gardner FP.Regeneration of peanut and perennial peanut from culturedleaftissue.Crop Science，1991，31(3)：833-83)以花生品种Florigiant 8d龄苗幼叶为外植体，比较不同BA浓度，以5mg/L BA(苄氨基嘌呤)和1mg/L NAA(α-萘乙酸)MS培养基最优，90％以上外植体长出愈伤，其中38％长出芽点。转至5mg/L BA MS培养基，84％长出枝条，平均每个外植体1-3个枝条。Eapen等(EapenS，George L.Plant regeneration from leaf discs of peanut and pigeonpea：influence of benzyladenine，indole acetic acid and indole aceticacid-amino acid conjugates.Plant Cell Tissue and Organ Culture，1993，35(3)：223-27)以花生10-12d苗龄幼叶为外植体，在含10μM BA和0.5μM IAA(吲哚乙酸)MS培养基中，约1/3外植体长出枝条，平均每个外植体长出枝条7个。Livingstone和Birch(Livingstone DM，Birch RG.Plant reganerafion andmicroprojectile-mediated gene tansfer in embryonic leaflets of peanut(Arachis hypogaea L.)Australian Journal of Plant Physiology，1995，22：585-591)以成熟种子胚小叶为外植体，在3mg/L BA和1mg/L NAA MS培养基培养6周。参试两品种分别有50％和66％外植体长出愈伤和芽点，平均芽点数分别为9.4和13个；转移到5mg/L BA MS培养基有助于枝条长出，平均每个外植体5个枝条。国内，方小平等(方小平，许泽永，张宗义等.花生小叶外植体植株再生及农杆菌介导的基因遗传转化。中国油料，1996，18(4)：52-5)以鄂花4号等3个品种4d龄苗幼叶为外植体，应用Livingstone方法。外植体愈伤诱导率提高到86-100％，平均再生植株达到了5个。Sharma(Sharma KK.Anefficient method for the production of transgenic plants(Arachlshypogaea L.)through Agrobacterium tumefaciens-mediated genetictransformation.Plant Science，2000，159(1)：7-19)以成熟种子子叶为外植体，在含20μM BA和10μM 2，4-D(2，4-二氯苯乙酸)MS诱导培养基上从子叶节伤口处诱导出大量芽点。随后通过含2μM BA枝条伸长培养基获得枝条。90％以上外植体长出芽点。平均每个外植体获得4-8个枝条。

以未成熟胚(子叶)和成熟种胚、胚小叶为外植体的体胚发生再生植株技术。Ozias-Akins(Ozias-Akins P.Plant regeneration from immature embryosof peanut.Plant Cell Reports，1989，8：217-218)以未成熟胚为外植体，在含0.5-2.0mg/L Picloram(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶-2-甲酸，毒莠定)的培养基中。50-60％的外植体诱导形成体胚，并获再生植株。进一步研究表明在含0.5mg/LPicloram MS培养基中，未成熟子叶比胚轴诱导形成的体胚易于再生；胚性愈伤转到含3mg/L picloram的培养基可以长期保存即获得重复体胚发生培养物。体胚再生植株，先后通过含1mg/L NAA MS培养基以及含0.1mg/L BA和0.1mg/LNAA MS培养基培育。再转到含3mg/L BA和1mg/LGA(赤霉素)培养基促使茎伸长，一次实验获得913个枝条(Ozias-Akins P，Schrmll JA，Anderson WF et al.Regeneration of transgenic peanut plants from stably transformedembryogenic callus.Plant Science，1993，93：185-194)。Hazara等(HazraS，et al.Direct somatic embryogenesis in peanut(Arachis hypogea)Biotechnology.1989，7：949-95)以含3mg/L 2，4-D MS培养基，诱导未成熟种胚直接形成体胚，每个外植体产生8-15个体胚。Baker等(Baker CM，BurnsJA，Wetzstein HY.Influence of photoperiod and medium formulation onpeanut somatic embryogenesis.Plant Cell Reports，1994，13(3-4)：159-163)，Baker和Wetzstein(Baker CM，Wetzstein HY.Repetitive somaticembryogenesis in peanut cotyledon cultures by continual exposure to2，4-D.Plant Cell Tissue Org Cult，1995，40：249-254)以20mg/L 2，4-D诱导未成熟胚子叶形成体胚效果最好并可获得重复体胚发生培养物；光强度和暗培养对体胚形成效率没有影响，但对体胚形状影响很大。光培养条件下形成的体胚粗糙、木质化，难于分离；而暗培养形成的体胚，光滑、易于分离。由于末成熟种胚的取材受到限制，从土中取出的荚果和胚极易污染等缺点。因此，各国科学家分别以成熟种子为材料开展研究。Chengalrayan等(ChengalrayanK，Sathaye SS，Hazra S.Somatic embryogenesis from mature embryo-derivedleaflets of peanut(Arachis hypogaea L).Plant Cell Reports，1994，13(10)：578-581)以胚小叶为外植体，在含20mg/L 2，4-D MS培养基上诱导胚性愈伤，转到含3mg/L 2，4-D的培养基上20d内有90％的愈伤产生体胚。Baker等(BakerCM，Durham RE，Bums JA，et al.High frequency somatic embryogenesis inpeanut(Arachis hypogaea L.)using mature，dry seed.Plant Cell Report，1995，15：38-42)用源于成熟种胚的外植体诱导胚性愈伤和体胚，以20mg/L2，4-D暗培养最优，96％外植体产生体胚，平均每个外植体产胚7.6个，而品种间体胚诱导量有明显差异。Livingstone等(Livingstone DM，Birch RG.Eficient transformation and regeneration of diverse cultivars of peanut(Arachis hypoaea L.)by particle bombardment into embryogenic callusproduced from mature seeds.Molecular Breeding，1999，5(1)：43-51)进一步完善诱导条件，在含5mg/L picloram MS培养基上暗培养6周，珍珠豆型品种Gajah每个种胚平均产生6.3体胚，普通型品种NC-7平均产生14.3个体胚。并应用渗透剂干燥处理，使得体胚再生植株率提高到60％。Chengalrayan等(Chengalrayan K，Mhaske VB，Hazra S.High-frequency conversion ofabnormal peanut somatic embryos.Plant Cell Reports，1997，16：783-786)通过含8.9μM BA和14μM KT(激动素)MS培养基，或含22.7μM TDZ(噻二唑苯基)MS培养基培育，使体胚再生植株效率分别提高到86％和92％。国内，邓向阳和卫志明(邓向阳，卫志明.幼胚长度、2，4-D浓度、光强度等对花生体细胞胚发生的影响及高效再生系统的建立。植物生理学报，2000，26(6)：525-531)以我国花生品种粤油116、鲁花9号幼胚为材料通过含5-40mg/L 2，4-D培养基上胚性愈伤率达75％以上，平均产胚量3个以上，并易再生植株。晏立英等(晏立英，陈坤荣，罗莉霞，许泽永，张宗义，方小平，陈金香。Birch RG，Dieztgen RG.花生体胚诱导和植株再生研究。中国油料作物学报，2000，22(3)：9-12)以我国花生品种鄂花4号为材料，成熟种胚为外植体，无论是20mg/L 2，4-D或5mg/L picloram MS培养基上胚性愈伤率达55-78％。平均产胚量4个。13个品种体胚诱导率6.0-83.3％。产胚量1.2-4.5个，差异显著。8个品种体胚技条再生率达36.3-77.8％。

农杆菌介导转化通过器官发生再生转化植株研究。巴西Lacorte等(LacorteC，Mansur E，Timmerman B，et al.Gene transfer into peanut(Arachishypogaea L.)by Agrobacterium tumefaciens.Plant Cell Reports，1991，10：354-357)，我国莱阳农学院分别报道农杆菌对花生有侵染力(Dong J，Bi Y，XiaL，et al.Teratoma induction and nopaline synthase gene transfer in Peanut.Acta Genetica Sinica，1990，17(1)：13-16)。前者测定4个农杆菌菌株，依据茎伤口接种致瘤数量和大小。以A281菌株致病力最强，Bo542和A208菌株次之，T37最差。后者仅用T37菌株接种41个花生品种和材料，仅6个产生肿瘤，也证实了T37菌株致病力弱。Mckently等(McKently AH，Moore GA，DoostarH，Niedz RP.Agrobacterium-mediated transformation of peanut(Arachishypogaea L.)Embryo axes and the developmem of transgenic plants.PlantCell Repots，1995，14：699-703)测定5个菌株对花生致病力，以A281菌株最强，C58、A518和B6之，T37最弱。Mansur等(Mansur EA，Lacort C，FreitasG et al.Regulation of transformation efficiency of peanut(Arachishypogaea L.)explants by Agrobacterium tumefaciens Plant Science，1993，89：93-99)以A281菌株优化转化条件，共培以固体培养基好于液体，嫩叶外植体好于带胚或不带胚子叶，7-10 d苗龄好于苗龄低的嫩叶，嫩叶前端外植体好于基端，接种菌合适浓度为1-5×10⁹，接种前丁香酮(AS)处理没有提高致病力的作用。印度Eapen和George(Eapen S，George L.Agrobacteriumtumefaciens-mediated gene transfer in peanut(Arachis hypogaea L.).Plant cell reports，1994，13：582-586)首次报道通过农杆菌转化获得转基因花生植株。他们以9-10d苗龄嫩叶为外植体与含双元质粒pBI121的农杆菌LBA4404菌株共培3d，50-100mg/L卡那霉素筛选，获得抗卡那霉素、β-葡糖苷酸酶(GUS)活性阳性的转基因花生。在温室内20株转基因花生植株均能开花，但仅3株结实，所结种子皱缩，末充分成熟。分子检测证实外源基因已整合到花生基因组。美国Cheng Ming等(Cheng M，Jarret RL，Li Z，Xing A，DemskiJW.Production of fertile transgenic peanut(Arachis hypogaea L.)plantsusing Agrobacterium tumefaciens.Plant Cell Reports，1996，15：653-657；Cheng M，Jarret RL，Li Z，Demski JW.Expression and inheritaneof foreign genes in transgenic peanut plants generated byAgrobacterium-mediated transformation.Plant Cell Reports，1997，16：541-544)报道通过农杆菌转化获得5个独立的转化系，共52株转基因植株，并首次得到成熟T₁代种子及后代。他们以花生10d龄苗嫩叶为外植体，与含pBI121双元质粒的EHA101菌株共培2d，150mg/L卡那霉素筛选。用烟草叶片提取液处理农杆菌后接种，提高了GUS活性瞬间表达。转化效率达0.2-0.3％。在T₂代转基因花生植株中，GUS基因或百分之百表达，或3∶1的比例分离，证实外源基因巳整合进基因组并在后代稳定表达。同一实验室的Li Zhi-jian等(Li ZJ，Janet RL，Demski J.Engineered resistance to tomato spored wiltvirus in transganic peanut expressing the viral nucleocapsid ganeTransgenic Research，1997，6：297-305)改进上述方法：用繁殖中期(O.D₆₀₀＝0.8-1.0)的农杆菌接种。随后头孢霉素从300mg/L降到100mg/L，卡那霉素降到100mg/L，结果缩短了获得枝条所需时间，转化效率提高到1.5％。他们获得转番茄斑萎病毒壳蛋白编码基因N(TSWV-N)基因花生植株，Southern分子杂交证实TSWV-N基因已整合进花生基因组，在花生植株内的表达。对T₂代转基因花生抗性鉴定，转基因花生植株接种叶症状比对照推迟约一周，褪绿斑明显减少。接种30d后，所有对照花生均出现典型TSWV病害症状，而转基因花生植株未出现系统症状，长势同花生健株相似。国际半干旱热带地区作物所Sharma和Anjaiah(Sharma KK.An efficient method for the production oftransgenic plants(Arachls hypogaea L.)through Agrobacteriumtumefaciens-mediated genetic transformation.Plant Science，2000，159(1)：7-19)用农杆菌C58(disarmed)菌株转化成熟种子子叶外植体，通过125mg/L卡那霉素筛选，产生55％转基因植株，移栽到温室内获得75个独立的转化系。Southernblot杂交证实外源基因已整合进基因组。国内方小平等(方小平，许泽永，张宗义等.花生小叶外植体植株再生及农杆菌介导的基因遗传转化。中国油料，1996，18(4)：52-5；方小平，许泽永，张宗义，晏立英，陈坤荣，罗莉霞，陈金香，BirchRG，DieztgenRG.GUS基因和NPT II基固在转基因花生后代的遗传研究.花生科技，1999，(增刊)：241-245)花生品种鄂花4号4d龄苗嫩叶作外植体，与AGL1菌株共培，经卡那霉素筛选获得转基因花生。转基因花生在温室内开花结实.获得T₁代种子。外源基因表达通过卡那霉素抗性和GUS活性组织化学检测得到证实。对转基因T₁-T₃后代分析表明GUS基因以1∶1和3∶1比例分离，随代数增加，3∶1分离比例增加。T₃代可选择到GUS基因纯合单株。

基因枪介导转化胚性愈伤组织或幼胚，通过体胚再生转化株研究。美国Ozias-Akins等(Ozias-Akins P，Schrmll JA，Anderson WF et al.Regeneration of transgenic peanut plants from stably transformedembryogenic callus.Plant Science，1993，93：185-194)首次报道用基因枪转化胚性愈伤组织，经过潮霉素(固体-液体培养基)筛选，得到转化植株。他们以未成熟种子子叶和胚作外植体。在含0.5mg/L picloram的MS培养基上诱导体胚和胚性愈伤，再转移到含3mg/L picloram MS培养基上暗培养长期保存。保存1-2年的胚性愈伤组织为转化对象，通过基因枪轰击，将含潮霉素抗性基因和Gus基因的质粒导入。5周后，在含5-10mg/L潮霉素固体培养基上筛选2轮4w，再通过20mg/L潮霉素液体培养基2w连续筛选，每次转化实验获得2个转基因的胚性愈伤细胞系，约1％的愈伤组织经转化后获得一个稳定的转化细胞系。转化细胞系再生获得100株花生植株。PCR扩增和Southern分子杂交证实外源基因已整合进花生基因组。在同一实验中，采取固体连续筛选中可获得抗性转化细胞系，但未获得再生植株，并认为液体筛选更快、有效。该实验室采用类似改进的转化(全液体培养基)筛选系统有多个报道：Wang等(Wang AM，Fan HL，Singsit C，Ozias-Akins P.Transformation of peanut with a soybeanvspB promoter-uidA chimeric gene I.Optimization of a transformationsystem and analysis of GUS expression in primary transgenic tissues andplants.Physiol Plant，1998，102：38-48)用3个花生品种为材料，每次基因枪轰击4.9cm²大小愈伤，轰击后1-4d含10mg/L潮霉素液体培养基筛选1w，再20mg/L潮霉素液体培养基筛选6w，共获得160个抗潮霉素细胞系，其中从38个细胞系中获得200株转基因植株，但19个细胞系79株植株开花、结实，他们认为可能是胚性惫伤保存过久引起染色体异常的缘故。Singsit等(SingsitC，Adang MJ，Lynch RE，Anderson WF，Wang AM，Cardineau G，Ozias-AkinsP.Expression of a Bacillus thuringiensis cryIA(c)gene in transgenicpeanut plants and its efficacy against lesser cornstalk borer.TransgenRes.1997，6：169-176)报道通过基因枪转化，将BtCryIA基因导入花生胚性愈伤。每次基因枪轰击平均获得0.5个抗潮霉素转基因细胞系，8次实验平均每次获得4.8个潮霉素抗性细胞系，再生获得119株转基因植株。PCR和Southern分子杂交证实BtCrylA基因和hph基因巳整合进花生基因组。通过酶联免疫实验证实CryIA(c)基因在花生植株内表达，CryIA(c)蛋白占整个可溶性蛋白的0.18％。非洲蔗螟(Elasmopalpus lingosellus Zeller)饲养实验证实转基因花生具有抗虫性，饲喂转基因花生非洲蔗螟幼虫由完全致死到减重66％。该实验室同时获转Tswv核表壳蛋白N基因花生(Yang H，Singsit C，Wang A，Gonsalves D，Ozias-Akins P.Transgenic peanut plants containing anucleocapsid protein gene of tomato spotted wilt virus show divergentlevels of gene expression.Plant Cell Rep，1998，17(9)：693-699)。美国另一实验室(Magbanua ZV，Dayton Wilde H，Roberts JK，Chowdhury K，AbadJ，Moyer JW，Wetzstein HY，Parrott WA(2000)Field resistance to Tomatospotted wilt virus in transgenic peanut(Arachis hypogaea L.)expressingan antisense nucleocapsid gene sequence.Mol Breeding 6：227-236)以源于成熟种胚的外植体2，4-D诱导重复体胚发生培养物(液体)，基因枪轰击后8d开始液体培养基筛选获转Tswv核表壳蛋白N基因花生，大田实验表现Tswv抗性。澳大利亚Livingstone和Birch(Livingstone DM，Birch RG.Eficienttransformation and regeneration of diverse cultivars of peanut(Arachishypoaea L.)by particle bombardment into embryogenic callus producedfrom mature seeds.Molecular Breeding，1999，5(1)：43-51)以源于成熟种胚的外植体picloram诱导体胚和胚性愈伤。用分别含报告基因uidA和筛选基因(hph)的质粒包裹钨粉，每次基因枪轰击10cm²大小胚性愈伤，轰击后2周后开始20mg/L潮霉素(固体培养基)筛选可获得转化体胚。每次轰击获得3-6个独立的转化系。轰击后6个月，获得再生转化植株。约有50％的转化系同时获得报告基因和筛选基因表达。Southern分子杂交证实外源基因已整合进T1代转基因花生基因组。国内，许泽永等(许泽永，陈坤荣，晏立英，罗莉霞.张宗义，方小平，陈金香，Dietzgen RG，Birch RG.花生体胚诱导、植株再生和基因枪介导遗传转化。《二十一世纪农业生物技术展望论坛》论文摘要集，1999：58-59)以我国花生品种“中花3号”为材料，采用上述转化技术，获得16个独立的抗潮霉素体胚，并再生植株。PCR扩增和生物学测定表明，其中9个已导入抗潮霉素基因，5个同时导入花生条纹病毒CP基因。Deng Xiang-Yang等(Deng XY，Wei ZM，An HL(2001)Transgenic peanut plants obtained byparticle bombardment via somatic embryogenesis regeneration system.Cell Res，11(2)：156-160)以我国花生品种粤油116、鲁花9号幼胚为靶材料通过基因枪介导转化含潮霉素抗性基因和GUS基因的质粒pCAMBIA1301后，于含2，4-D培养基中恢复诱导胚性愈伤10d后，在含10-20mg/L潮霉素固体培养基筛选4w，再经20mg/L潮霉素液体培养基筛选6w，得到抗潮霉素体胚并再生植株。PCR和Southern分子杂交证实外源基因已整合进花生基因组。

综合上述，国外美国、澳大利亚、印度及国际半干旱热带地区作物研究所相关实验室已分别建立花生转化和再生技术。美国率先获得转基因抗病、抗虫花生。国内部分实验室也已初步建立起花生转化和再生技术，分别通过农杆菌和基因枪介导的基因转化获得转基因花生。但是，目前无论是农杆菌还是基因枪介导的基因转化均存在转化和再生效率低、基因型限制、嵌合体和逃逸的问题。就农杆菌介导基因转化技术来说。转化和再生效率受花生品种影响(基因型影响)较大，嵌合体和逃逸问题严重，转化率不高；但其优点是所需时间短，从外植体与农杆菌共培到获得转化植株，一般只需6个月。基因枪介导转化虽然受花生品种因素影响相对小，转化率仍低，虽嵌合体和逃逸问题不严重，但仍有少量逃逸嵌合体。其缺点是需要一定设备条件，同时从外植体准备到获得转化植株需要12个月，耗费人力、物力，且易产生体细胞变异，造成再生植株开花而不结实。因此，上述技术均需要进一步完善。

非组织培养的基因转化方法。不通过组培，直接转化成熟种胚或种胚生长点获得转化植株的报道。美国Mckently等(McKently AH，Moore GA，DoostarH，Niedz RP.Agrobacterium-mediated transformation of peanut(Arachishypogaea L.)Embryo axes and the developmem of transgenic plants.PlantCell Repots，1995，14：699-703)报道将保留一片子叶的种胚划伤接种EHA101菌株，直接播于消毒土内，由种胚接种后直接长出转化株，获得转基因花生植株。实验用花生品种Florigiant 800粒种胚，约120粒种胚存活长出植株，其中11株花生有一片或更多叶片表达GUS活性，10株获得种子。PCR和Southern分子杂交证实外源基因已整合进花生基因组。其中11号株为嵌合体，T₁代20株苗，GUS活性阳性3株。T₃代植株GUS基因遗传符合3∶1的分离规律。印度Rohini等(RohiniV K.Rao KS.Transformation of peanut(Arachis hypogaeaL.)：a non-tissue culture based approach for generating transgenic plants.Plant Science，2000，150：41-49)报道用LBA4404菌株采用相同接种技术，获得转基因花生。优化条件实验表明，在农杆菌菌液中加入烟草汁液，与花生种胚共培16h可以增加转化效率，获得3.3％的转化植株，并通过分子杂交证实外源基因已整合进花生基因组。Brar等(Brar GS，Cohen BA，Vick CL，JohnsonGW.Recovery of transgenic peanut(Arachis hypogaea L.)plants from elitecultivars utilizing ACCELL technology.Plant Journal，1994，5(5)：745-753)报道成熟种胚顶端分生组织，经基因枪用包被含GUS、Bar和番茄斑萎病毒外源基因的金粉轰击，3-4周后95％的外植体直接伸长出枝条，枝条数量平均5个。通过GUS活性检测筛选转化枝条，结果说明，供试的两个品种，嵌合的转化枝条分别为8.8％和6.4％，GUS活性全株均匀表达的分别为2-3％和0.6％，分别获得8和3个转基因系。Southern分子杂交证实外源基因已整合到和T_0-1代转基因花生植株的基因组。不通过组培，通过农杆菌和基因枪转化成熟种胚，由生长点直接获得转化植株获得成功。该项技术不需要组培设备，技术简单，并可缩短选育时间。问题是嵌合体问题严重，筛选纯合转化株工作量大。通过导入抗除草剂的Bar基因，可以用除草剂筛选，提高筛选效率。国内一些实验室应用花粉管通道技术将外源基因导入花生，已获得不少经验，因为是种质系统转化法，以生殖器官或细胞为受体，直接利用植物受体本身的有性生殖过程或者种子发育过程，既免除了离体再生的组织培养，又缩短了获得可遗传转基因种子的时间，值得进一步深入研究。

综上所述，不管是基于组织培养的基因转化法，还是非组织培养的转化法，都存在着转化和再生效率低、基因型依赖、存在逃逸、嵌合体问题、从转化到获得转基因(纯合)种子的周期长、工作量大等缺点中的一项或几项。目前还没有一种花生转基因方法实现了高通量、高效率转化并解决逃逸、嵌合体问题，

发明内容

本发明的目的是在于提供一种花生转基因的方法，解决目前常用的花生遗传转化方法中转化效率低，通量小，依赖基因型，存在逃逸，嵌合体等问题，该方法不仅转化效率高、通量高、不存在基因型依赖，而且筛选效率高，避免了逃逸，嵌合体的问题。

本发明提供的转化体系有望解决相关技术瓶颈。发明人为了实现高通量、高效率的花生基因转化，发明了花生转基因技术。本发明的技术解决方案是以源于成熟种子胚轴上部的重复体细胞胚发生培养物为转基因受体。在建立各类型花生的重复体细胞胚发生培养物及再生植株系统基础上，确定了基因枪转化的各条件组合。在各条件组合下，使携带外源基因(如：潮霉素抗性、草铵膦抗性、草甘膦抗性等各种筛选标记基因和其它目的基因)的DNA转化重复体细胞胚发生培养物细胞，在轰击1-10天后通过含致死浓度的筛选剂(如：20mg/L潮霉素Hygromycin)的半固体培养基连续筛选获得独立的抗性细胞系后，无筛选下再生获得转基因花生植株T₀代苗，及转基因的T₁代合子(种子)。进行分子生物学方法(如：PCR)筛选和分析(如：Western blot)表明外源基因稳定整合、表达遗传。本发明可采用保存0-6年的成熟花生种子诱导的，启始培养后1-10个月的重复体细胞胚发生培养物为转基因受体；转基因效率(所有实验平均效率是每轰击平均获得约15.7个独立的抗性细胞系)明显提高，是以往报道的相似方法的最好效率(最好条件下为3-6独立的抗性细胞系/每轰击，Livingstone和Birch，Eficient transformation and regeneration ofdiverse cultivars of peanut(Arachis hypoaea L.)by particle bombardmentinto embryogenic callus produced from mature seeds.Molecular Breeding，1999，5(1)：43-51)的至少3倍以上，转化通量高；筛选效率高，无逃逸，无嵌合体；不存在基因型依赖，且再生植株高效容易；可大量获得转基因后代种子，且外源基因可稳定整合、表达遗传。这一转基因方法，可以适用于所有花生品种或品系或种质资源材料，涉及的筛选标记基因和其它目的基因也不仅限于实施例陈述用的潮霉素抗性基因和人Bcl-x1。

一种花生转基因的方法，包括下列步骤：

一、建立各类型花生的重复体细胞胚发生培养物

保存0-6年的各类型(如：兰娜/弗吉尼亚型、西班牙型、中间型或品系或种质资源材料等)花生的成熟荚去壳，种仁乙醇表面消毒，然后NaOCl消毒，重蒸馏水3-5次漂洗。无菌条件下去掉种皮。成熟胚胚轴上部接种于含生长素的SEM培养基(体胚发生培养基，MS盐，B5维生素，0.088M(3％)蔗糖，12.42μM(3mg/L)picloram和0.8％琼脂，调pH5.8，121℃灭菌15分钟后，适当温度控制在(55-60℃)时补充过滤灭菌6.84μM(1g/L)的谷氨酰胺)。培养皿28℃黑暗培养20-30天。每2-4周转移体胚和胚性愈伤到新SEM培养基中继代培养1-10个月获得重复体细胞胚发生培养物。在本发明实施例陈述中主要使用‘佐治亚绿’品种实验数据，但本发明不限于此花生品种及类型。

二、外源DNA或基因构建在适当的植物表达框中并可在同一或不同载体上，抽提、纯化外源基因植物表达框(DNA片段)或载体(质粒)和确定其浓度

在本发明陈述的程序中，待转化的外源DNA是各种筛选标记基因和目的基因。筛选标记基因可为植物表达载体携带的潮霉素抗性、草铵膦抗性、草甘膦抗性等筛选标记基因植物表达框。基因植物表达框包括基因编码序列和在植物中调控基因表达的基本元件，一般为启动子::基因编码序列::转录终止子。植物表达载体可为pCAMBIA系列和pRT系列等。待转化的外源目的基因为植物病原菌抗性基因、作物品质和产量等相关基因，可为人Bcl-xl基因；拟南芥RRS1-R基因；花生FAD2基因；花生Arah基因等(人Bcl-x1基因，DickmanMB，Park YK，Oltersdorf T，Li W，Clemente T，French R.Abrogation ofdisease development in plants expressing animal antiapoptotic genes.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：6957-6962；拟南芥RRS1-R基因，Deslandes，L.，Olivier，J.，Peeters，N.，Feng，D.X.，Khounlotham，M.，Boucher，C.，Somssich，I.，Genin，S.and Marco，Y.Physical interaction between RRS1-R，a protein conferring resistance to bacterial wilt，and PopP2，a type IIIeffector targeted to the plant nucleus.Proc.Natl Acad.Sci.USA，2003，100，8024-8029.；花生FAD2基因，Jung S，Swift D，Sengoku E，Patel M，Teul7 F，Powell G，Moore K，Abbott A(2000b)The high-oleate trait inthe cultivated peanut[Arachis hypogaea L.].I.Isolation andcharacterization of two genes encoding microsomal oleoyl-PC desaturases.Mol Gen Genet 263：796-805；花生Ara h基因，Viquez，O.M.，Koffi，K.N.，Dodo，H.W.，2003.Structure and organization of the genomic clone of amajor peanut allergen gene，Ara h 1.Mol.Immunol.40，565-571.等)。目的基因可通过常规分子克隆方法在适当的植物表达载体上(如：pCAMBIA系列，pRT系列)构建目的基因植物表达框。目的基因与筛选标记基因植物表达框可连一起，即构建到同一植物表达载体上；目的基因与筛选标记基因植物表达框也可以分别处于不同植物表达载体上(如：pCAMBIA系列，pRT系列)或DNA片段中。外源基因的植物表达框或载体构建、质粒或DNA片段的抽提、纯化和确定浓度的具体操作参照常规分子克隆方法(J.萨姆布鲁克等著，金东雁等译，候云德等校，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1998)。在本发明实施例陈述中以潮霉素抗性基因为筛选标记基因，人Bcl-xl为目的基因，但本发明不限于用潮霉素抗性基因和人Bcl-xl基因。

三、微粒轰击转化重复体细胞胚发生培养物和筛选独立抗性细胞系

放置重复体胚发生胚性组织在SEM培养基中。准备金微粒悬浮液；金微粒悬浮与含筛选基因和非筛选目的基因的质粒或DNA片段混合。震荡中依次加入氯化钙和亚精胺。震荡悬浮，短暂离心。乙醇漂洗包裹质粒或DNA片段的金微粒，乙醇重悬微粒，重悬微粒滴于金微粒载片(Macrocarrier)。根据Bio-Rad PDS1000/He系统说明书进行轰击。在轰击后1-10天，被轰击的胚性组织转入含相应致死浓度筛选剂(如：20mg/L潮霉素)的半固体SEM培养基连续筛选。在筛选约1个月后，仔细地辨认、分离独立的可能的抗性细胞系。各系组织直接地继代培养于新鲜的含致死浓度筛选剂的半固体SEM培养基中筛选。在以后各轮筛选，可存活增殖，抗性被证实的独立系获得抗性细胞系系号。在筛选之下继代培养(约1-2个月)增殖抗性细胞系，增殖体胚用于植株再生。在本发明实施例陈述中使用潮霉素抗性基因和潮霉素，以筛选转基因抗性细胞系，但本发明不限于用潮霉素抗性基因和潮霉素。

四、再生植株和传代

抗性细胞系体胚在含植物调节物质的培养基中26℃黑暗成熟。体胚转移入含细胞分裂素的培养基中，经培养基操作过程1TDZ或3B1G，在16/8小时光周期光照培养(约6w)萌芽。切下至少2cm长的芽于含生长素的培养基生根(约1w)。生根的小植株移入花土中，最后转移到温室。在人工生长室按照正常的栽培管理措施管理，收获T₁代合子(种子)。按照正常的栽培管理措施对各T₁代种子系继续传代选育。

五、转基因植株和转基因后代分子分析

分子分析抗性细胞系、再生植株和种子。参照常规方法，从发明内容二、三、四中不同的抗性细胞系、再生植株和种子获得适量的愈伤、再生植株叶、种子子叶提取DNA(Yang H，Singsit C，Wang A，Gonsalves D，Ozias-AkinsP.Transgenic peanut plants containing a nucleocapsid protein gene oftomato spotted wilt virus show divergent levels of gene expression.PlantCell Rep，1998，17(9)：693-699)或RNA(Yang H，Singsit C，Wang A，GonsalvesD，Ozias-Akins P.Transgenic peanut plants containing a nucleocapsidprotein gene of tomato spotted wilt virus show divergent levels of geneexpression.Plant Cell Rep，1998，17(9)：693-699)或蛋白质(Singsit C，Adang MJ，Lynch RE，Anderson WF，Wang AM，Cardineau G，Ozias-Akins P.Expression of a Bacillus thuringiensis cryIA(c)gene in transgenicpeanut plants and its efficacy against lesser cornstalk borer.TransgenRes.1997，6：169-176)。按照常规分子分析方法(J.萨姆布鲁克等著，金东雁等译，候云德等校，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1998)PCR分析初步确定目的基因和筛选基因整合与否。Southern blot分析进一步确定外源基因在抗性细胞系、再生植株和种子中的稳定整合转化性和转化事件独立性(J.萨姆布鲁克等著，金东雁等译，候云德等校，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1998)。Northern blot(Yang H，Singsit C，Wang A，GonsalvesD，Ozias-Akins P.Transgenic peanut plants containing a nucleocapsidprotein gene of tomato spotted wilt virus show divergent levels of geneexpression.Plant Cell Rep，1998，17(9)：693-699)、Western blot(J.萨姆布鲁克等著，金东雁等译，候云德等校，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1998)、ElISA(Singsit C，Adang MJ，Lynch RE，Anderson WF，WangAM，Cardineau G，Ozias-Akins P.Expression of a Bacillus thuringiensiscryIA(c)gene in transgenic peanut plants and its efficacy against lessercornstalk borer.Transgen Res.1997，6：169-176)等分析进一步确定目的基因和筛选基因的表达水平、稳定性和传代遗传情况。在各代中筛选剂抗性分析进一步确定筛选基因的表达水平、稳定性和传代遗传情况。

本发明的特点是：转化效率高、通量高、不存在基因型依赖，而且筛选效率高避免了逃逸，嵌合体的问题。本发明的优点主要体现在以下几个方面：本发明提供以源于贮藏0-6年各类型花生的成熟种子胚轴上部建立花生重复体细胞胚发生培养物的方法及体胚再生的培养基操作过程1TDZ和3B1G两种再生植株方法，均不依赖于花生基因型且高效。在本发明提供的花生转化方法，对转化各条件进行分析、优化和组合，达到了提高转化效率的目的。本发明提供的花生转化方法效率高是目前报道的类似方法最好条件下最好效率的至少3倍以上，实现了高通量基因转化。在本发明提供的花生转化方法中转化不依赖于花生基因型，即适合任何品种、品系或种质资源材料，克服了农杆菌介导转化法中基因型依赖问题。本发明中轰击1-10d后在含致死浓度筛选剂的半固体培养基中启始筛选，筛选效率高，不仅提高了转化效率，也避免了目前普遍使用的转化方法中存在的逃逸和嵌合体问题。本发明获得的转基因植株可大量获得转基因后代种子，且外源基因可稳定整合、表达遗传。

附图说明

图1外源基因表达载体示意图。目的基因人Bcl-xl和筛选基因hpt均CaMV35S启动子控制下。

图2重复体细胞胚发生培养物。启始培养后3个月(4次继代培养)获得明显的花生重复体细胞胚发生培养物。

图3大约1个月筛选后，独立的可能的抗性细胞系。大约1个月筛选后，一部分胚状体能变成更大的坚实白色体胚，并且低部通常黑死，和一部分胚状体能形成新的次级体胚而旧体胚变成棕色(不生长)。这些白色体胚被认为是潜在的潮霉素抗性体胚。其它大多数胚状体则变棕黑，收缩或解体不可见；

图4从潮霉素抗性细胞系愈伤提取基因组DNA对(非筛选)目的基因Bcl-xl编码区(700bp片段)PCR分析。PCR模板在各反应中：空白对照(Null control)为水；负对照(Negative control)为非转化培养物愈伤提取基因组DNA；正对照(Postive control)为pRT-66-Bcl，即转化的质粒DNA。其他各孔为各潮霉素抗性细胞系其愈伤提取基因组DNA(标明了各潮霉素抗性细胞系系号)。约60％的潮霉素抗性细胞系Bcl-xl编码区PCR分析呈阳性，即产生特定的Bcl-xl编码区700bp片段条带。同时，所有花生基因组样品(包括负对照非转化花生基因组)可产生400bp条带，表明在此扩增条件下花生基因组自身的400bp片段被扩增。空白对照和正对照均无此400bp条带。

图5a为再生植株的叶子提取基因组DNA对筛选基因hpt(850bp片段)PCR分析。PCR模板在各反应中：空白对照(Null control)为水；负对照(Negativecontrol)为非转化培养物愈伤提取基因组DNA；正对照(Postive control)为pRT-66-Bcl，即转化的质粒DNA。其他各孔为再生植株的叶子提取基因组DNA(标明了各再生植株株号，由各潮霉素抗性细胞系系号加最后植株株号数字段形成)。100％的再生植株hpt筛选基因PCR分析呈阳性，即产生特定的hpt的850bp条带。即表明了转化筛选无逃逸。

图5b为再生植株的叶子提取基因组DNA(同样样品)对(非筛选)目的基因Bcl-xl编码区(700bp片段)PCR分析。PCR模板在各反应中：空白对照(Nullcontrol)为水；负对照(Negative control)为非转化再生植株提取基因组DNA；正对照(Postive control)为pRT-66-Bcl，即转化的质粒DNA。其他各孔为再生植株的叶子提取基因组DNA(标明了标明了各再生植株株号，由各潮霉素抗性细胞系系号加最后植株株号数字段形成)。可清楚地看到由同一潮霉素抗性细胞系再生的植株Bcl-xl编码区PCR分析完全相同，即都表现阳性产生特定的Bcl-xl编码区700bp片段条带或阴性。表明了同一潮霉素抗性细胞系是非嵌合体，即无嵌合体问题。图5B与图5A的各样品顺序和标示是完全一样的。

图6从再生植株的叶子提取蛋白Western blot分析Bcl-xl表达Bcl-xl蛋白水平。正对照(Postive control)为重组人Bcl-xL protein；负对照(Negativecontrol)为非转化植株。部分转化植株Bcl-xl基因稳定整合表达Bcl-xl蛋白，而负对照无信号

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1：获得花生重复体细胞胚发生培养物。

花生品种粤油116(广东农业科学院培育，连续开花亚种珍珠豆型，subsp.Fastigiata Var.vulgaris，spanish type西班牙型)、鲁花9号(山东农业科学院培育，连续开花亚种中间型)、‘佐治亚绿’(美国佐治亚大学培育，交替开花亚种普通型，Subsp.hypogaea Var.hypogaea，runner/virginia type兰娜/弗吉尼亚型)。这些品种是优质或抗病花生品种，是各地域主要栽培品种之一。按照正常栽培管理和肥水措施种植收获果荚(粤油116、鲁花9号本人留存，‘佐治亚绿’从美国佐治亚大学获得)。成熟果荚在密封塑料袋中5℃下贮藏1-6年。去壳种仁70％乙醇表面消毒1-3分钟，然后在1％NaOCl(20％Clorox商业漂白液)消毒30-60分钟，用重蒸馏水3-5次漂洗。无菌条件下去掉种皮。成熟胚胚轴上部接种SEM培养基(somatic embryogenesis medium，体胚发生培养基)：MS盐(Murashige和Skoog 1962)，B5维生素(Gamborg等1968)，0.088M(3％)蔗糖，12.42μM(3mg/L)picloram和0.8％琼脂，调pH5.8，121℃灭菌15分钟后，适当温度控制在(55-60℃)时补充过滤灭菌6.84μM(1g/L)的谷氨酰胺。培养皿Parafilm(American National Can，Chicago，IL.，USA)密封，28℃黑暗培养20-30天。观察统计产生胚性愈伤或体胚的外植体数量和外植体总数。每2-4周转移体胚和胚性愈伤到新SEM培养基中继代培养。观察统计体胚数、总胚性愈伤数及体胚发生方式等情况。在启始培养后约3个月(约4-5次继代培养)获得明显的花生重复体细胞胚发生培养物(附图2)。每次继代培养后体胚数至少翻倍，体细胞胚发生百分比效率在80％左右，培养物可继代多年仍保持再生能力。各类型花生及贮藏年限均对获得花生重复体细胞胚发生培养物无影响。(表1)。贮藏1-6年的花生成熟种子仍能用于诱导重复体细胞胚发生培养物是以往文献未报道的，将在实际育种和组培中有用。在本发明实施例陈述中使用‘佐治亚绿’品种实验数据，但本发明不限于此花生品种及类型。

表1不同贮藏年限“佐治亚绿”成熟种子启始培养3个月后重复体细胞胚发生百分比效率

成熟种子贮藏年限(年)	1	2	4	5	6
						体细胞胚发生百分比效率(％)	77.4	80.5	79.9	76.0	80.2

实施例2：外源DNA或基因构建在适当的植物表达框中并连在同一载体上，抽提、纯化外源基因植物表达载体(质粒)和确定其浓度。

pZP211-Bcl-xL中目的基因人Bcl-xl基因植物表达框(Dickman MB，ParkYK，Oltersdorf T，Li W，Clemente T，French R.Abrogation of diseasedevelopment in plants expressing animal antiapoptotic genes.Proc NatlAcad Sci USA，2001，98：6957-6962)经PstI酶切克隆于pUC19(本实验室保存)后经过SfoI/PciI双酶切亚克隆于质粒pRT-66(Dr.R.Tpfer惠赠)植物表达载体，质粒pRT-66带筛选标记基因(潮霉素抗性hpt基因)植物表达框(T

pfer R，Maas C，Horicke-Grandpierre C，Schell J，Steinbiss H-H.Expression vectors for high-level gene expression in dicotyledonous andmonocotyledonous plants.Meth Enzymol，1993，217：66-78)。质粒载体构建(附图1)、质粒的抽提、纯化、浓度确定和序列测定具体操作参照常规分子克隆方法或从商业服务获得。在本发明实施例陈述中使用潮霉素抗性基因为筛选标记基因，人Bcl-xl为目的基因，但本发明不限于用潮霉素抗性基因和人Bcl-xl基因。

实施例3：微粒轰击转化重复体细胞胚发生培养物和筛选独立抗性细胞系。

从实施例1中启始培养3-10个月后的花生重复体细胞胚发生培养物取大约10-15个重复体胚发生胚性组织，放置在SEM培养基中大约3cm直径区域之内(约7cm²)。将准备好的50μl金微粒(直径0.6或1.0阳，Bio-Rad)悬浮液(60mg/ml)(Ozias-Akins等1993)与5μl(1μg/μl)含CaMV35S启动子控制下筛选基因(hpt)和非筛选目的基因(人Bcl-xl)植物表达框的质粒混合。震荡中依次加入50μl 2.5M氯化钙和20μl 0.1M亚精胺。震荡悬浮5-8分钟，短暂离心10000rpm。100％乙醇漂洗金微粒，60μl 100％乙醇重悬(Ozias-Akins P，SchrmllJA，Anderson WF et al.Regeneration of transgenic peanut plants fromstably transformed embryogenic callus.Plant Science，1993，93：185-194)。吸取8-10μl微粒悬浮滴于金微粒载片(Macrocarrier)。根据Bio-Rad PDS1000/He系统说明书进行轰击，条件是：12410kPa(1800psi)破裂膜，95kPa(28英寸汞柱)真空压力，培养皿在金微粒载片下6cm。在轰击后1-10天，被轰击的胚性组织转入含20mg/L潮霉素(致死浓度)半固体SEM培养基。该筛选策略是以往文献从未采用的，具有明显新颖性。在约1个月筛选后，仔细地辨认、分离独立的可能的抗性细胞系(附图3)。各系组织直接地继代培养于新鲜的含20mg/L潮霉素(致死浓度)半固体SEM培养基中。在以后各轮筛选，可存活增殖、抗性被证实的独立系获得抗性细胞系系号。转基因效率在各条件组合下为每轰击平均获得15.7(1035/66，独立的抗性细胞系数/轰击数)个独立的抗性细胞系，最佳条件下的实验平均可达20.5以上(656/32)，转化通量高(表2)。在采取新筛选策略下，转化效率明显好于(3-6倍于)以往报道的相似方法的最好效率(最好条件下3-6独立的抗性细胞系/每轰击，Livingstone DM，BirchRG.Eficient transformation and regeneration of diverse cultivars ofpeanut(Arachis hypoaea L.)by particle bombardment into embryogeniccallus produced from mature seeds.Molecular Breeding，1999，5(1)：43-51)，体现了其创造性和实用价值，即高效率、高通量转化。在筛选之下继代培养(约1-2个月)增殖潮霉素抗性细胞系，增殖体胚用于植株再生。在本发明实施例陈述中使用潮霉素抗性基因(hpt)，以潮霉素筛选转基因抗性细胞系，但本发明不限于用潮霉素抗性基因和潮霉素筛选。

表2“佐治亚绿”重复体胚发生胚性组织在一些条件组合下转化效率.^#(独立的抗性细胞系/轰击数)

重复体胚发生胚性组织启始培养后(月)	5	9	9	9	9
						启始筛选在轰击后(天)每轰击平均获得独立的抗性细胞系数(个)	36(18/3)#	113(208/16)	220.5(656/32)	39.6(96/10)	511.4(57/5)

实施例4：再生植株和传代

实施例2获得部分(60个)独立的潮霉素抗性细胞系的体胚在MSB0培养基(MS盐、B5维生素和0.088M蔗糖)加5.37μM(1mg/L)NAA(称为1NAA)26℃黑暗培养促使体胚成熟。源于同一独立抗性细胞系的体胚随机地(不挑选)进入两个再生方法之一，培养条件均是30μMolm-2s-1光强、16/8小时光周期。其一的培养基操作过程(称为1TDZ)：通过含4.9μM(约1mg/L)TDZ(噻二唑苯基)MS培养基培育，促使体胚转换。第二种再生处理(称为3B1G)：转到于基础培养基加13.31μM(3mg/L)BA和2.89μM(1mg/L)GA培养基中促体胚转换。两种培养基操作过程在6个星期以后，统计枝芽的数量和体胚总数，体胚产生至少带一片四具小叶叶子的枝芽被认为是体胚转换(萌芽)。实验被重复一次。长度至少2cm的枝芽被切下于基础培养基加上0-0.54μM NAA生根1w(大约95％)。生根的小植株移入花土中，最后转移到温室观察再生植物的育性。结果表明两种再生方法的体胚转换(萌芽)率无明显差异(表3)，但比以往的相似转化系统的再生方法效率高和相当(Livingstone DM，Birch RG.Eficienttransformation and regeneration of diverse cultivars of peanut(Arachishypoaea L.)by particle bombardment into embryogenic callus producedfrom mature seeds.Molecular Breeding，1999，5(1)：43-51)。从启始培养到获得抗性再生植株大约需9-12个月，比以往的相似转化方法快和相当(Livingstone DM，Birch RG.Eficient transformation and regeneration ofdiverse cultivars of peanut(Arachis hypoaea L.)by particle bombardmentinto embryogenic callus produced from mature seeds.Molecular Breeding，1999，5(1)：43-51)。转移生根的植株入土生存率高(大约95％)。生存的三百左右植株移入温室后，大半开花，与以往的相似转化方法相当。在人工生长室按照正常的栽培管理措施管理，收获T₁代合子(种子)，多达2500颗正常种子，体现了高效率、高通量的特点。按照正常的栽培管理措施对各T₁代种子系继续传代选育。

表3两种再生方法的体胚转换(萌芽)率

再生方法	体胚总数	枝条总数	枝条总数/体胚总数
				1TDZ3B1G	802588	680429	0.850.73

实施例5：转基因植株和转基因后代分子分析

参照常规分子克隆方法，从发明内容二、三、四中不同的抗性细胞系、再生植株和种子获得适量的愈伤、再生植株叶、种子子叶以适当的方法提取DNA或RNA或蛋白质。按照常规分子分析方法PCR分析初步确定Bcl-xl和筛选基因整合与否。Southern blot分析进一步确定抗性细胞系、再生植株和种子的稳定整合转化性和独立性。Northern blot、Western blot、ELISA和其他适当方法分析进一步确定Bcl-xl的表达水平、稳定性和传代遗传情况。在各代中筛选剂抗性分析进一步确定筛选基因的表达水平、稳定性和传代遗传情况。

1)以PCR分析潮霉素抗性细胞系和再生植株为实施例进行陈述初步确定Bcl-xl和筛选基因(hpt)整合与否

从不同的潮霉素抗性细胞系取愈伤或再生植株叶大约70毫克以快速CTAB方法提取DNA。使用PCR扩增700bp Bcl-xl编码序列(正义引物：5’-ctagatatcatgagtcagagcaaccgggagctg-3’；反义引物：5’-catgagctctagatcatttccgactgaagag-3’)和850bp hpt序列(正义引物：5’-gaaaaagcctgaactcaccgcgac-3’；反义引物：5’-cgcccasgctgcatcatcgaaatt-3’)分析Bcl-xl和hpt整合与否。在20μl(微升)PCR体系中分别加入：去离子水13.3μl，10×Buffer 2μl，2.5mM dNTP 0.5μl，25mM MgCl₂ 1.5μl，Taq酶0.2μl(1单位)，植物总DNA 1μl(50-100ng)。PCR条件：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 60秒35个周期；72℃7分钟。1％琼脂糖胶TBE电泳分析PCR产品。从潮霉素抗性细胞系愈伤提取基因组DNA对非筛选基因Bcl-xl全长度编码区(700bp片段)PCR分析，估计Bcl-xl与hpt共转化效率大约是60％(附图4)。PCR分析证实所有从不同的系再生植株的叶子均整合筛选基因hpt，表明在这个转化系统中没有逃逸问题，既使在再生过程中没有筛选压力情况下(附图5a)。对非筛选目的基因Bcl-xl的PCR分析表示，从同一独立体胚系再生的不同的植物通常产生同一PCR结果，表明在这个转化筛选系统中嵌合体问题也几乎不存在(附图5b)。

2)以Western blot分析再生植株为实施例进行陈述初步确定Bcl-xl基因稳定整合表达与否

从不同再生植株取适当发育阶段的叶子，提取总蛋白。按照常规方法进行Western blot分析，所用仪器试剂为：电泳仪(mini-Protean II apparatus，Biorad，Hercules，CA)，正对照重组人Bcl-xL protein(ProteinX Lab，SanDiego，CA)，负对照非转化的‘佐治亚绿’，一抗为人Bcl-xL protein单克隆抗体(anti-Bcl-xL monoclonal antibody，Chemicon International，Temecula，CA)，酶联二抗(Alkaline phosphatase conjugated secondary antibody，Chemicon International，Temecula，CA)，显色检测系统(NBT-BCIP detectionsystem，Roche，Pleasanton，CA)。结果表明部分转化植株Bcl-xl基因稳定整合表达Bcl-xl蛋白，而负对照无信号(附图6)。

3)对各T₁代种子系继续传代，叶片潮霉素抗性抗性分析进一步确定筛选基因可以稳定性表达和遗传，Western blot分析表明Bcl-xl基因可以在部分后代中稳定整合表达Bcl-xl蛋白。

Claims (3)

1.一种花生转基因的方法，它包括下列步骤：

A、建立花生的重复体细胞胚发生培养物：贮藏0-6年花生的成熟荚去壳，种仁乙醇表面消毒，然后NaOCl消毒，重蒸馏水3-5次漂洗，无菌条件下去掉种皮，成熟胚胚轴上部接种于含生长素的体胚发生培养基，即：MS盐，B₅维生素，3％蔗糖，3mg/L picloram和0.8％琼脂，调pH5.8，121℃灭菌15分钟后，温度控制在55-60℃时补充过滤灭菌的1g/L谷氨酰胺，28℃黑暗培养20-30天，每2-4周转移体胚和胚性愈伤到新体胚发生培养基中继代培养1-10个月获得重复体细胞胚发生培养物；

B、外源DNA或基因构建在植物表达框中并在同一或不同载体上，抽提、纯化外源基因植物表达框或载体和确定其浓度：待转化的外源DNA是筛选标记基因和目的基因，筛选标记基因为植物表达载体携带的潮霉素抗性、草铵膦抗性、草甘膦抗性筛选标记基因植物表达框，植物表达载体为pCAMBIA系列和pRT系列，待转化的外源目的基因为植物病原菌抗性基因、作物品质和产量相关基因，为人Bc1-x1基因；拟南芥RRS1-R基因；花生FAD2基因；花生Ara h基因，在植物表达载体上构建目的基因植物表达框，目的基因与筛选标记基因植物表达框可连一起，即构建到同一植物表达载体上；目的基因与筛选标记基因植物表达框分别处于不同植物表达载体上或DNA片段中，外源基因的植物表达框或载体构建、质粒或DNA片段的抽提、纯化和确定浓度；

C、微粒轰击转化重复体细胞胚发生培养物和筛选独立抗性细胞系：放置重复体胚发生胚性组织在体胚发生培养基中，准备金微粒悬浮液，金微粒悬浮与含筛选基因和非筛选目的基因的质粒或DNA片段混合，震荡中依次加入氯化钙和亚精胺，震荡悬浮，离心，乙醇漂洗包裹质粒的金微粒，乙醇重悬微粒，重悬微粒滴于金微粒载片，轰击，被轰击的胚性组织转入含致死浓度筛选剂培养基，在1个月筛选后，分离独立的抗性细胞系，各系组织直接地继代培养于新鲜的含致死浓度筛选剂的半固体体胚发生培养基中筛选，存活增殖、抗性被证实的独立系获得抗性细胞系系号，在筛选之下继代培养增殖抗性细胞系，增殖体胚用于植株再生；

D、再生植株和传代：抗性细胞系体胚在含植物调节物质的培养基中26℃黑暗成熟，体胚转移入含细胞分裂素的培养基中，经培养基操作过程1TDZ或3B1G，在16/8小时光周期光照培养萌芽，切下2cm长的芽于含生长素的培养基生根，生根的小植株移入花土中，最后转移到温室，栽培管理，收获T₁代合子，对T₁代种子系继续传代选育，所述的培养基操作过程1TDZ是通过含4.9μM噻二唑苯基MS培养基培育，促使体胚转换；所述的培养基操作过程3B1G是转到基础培养基加13.31μM BA和2.89μM GA培养基中促体胚转换；

E、转基因植株和转基因后代分子分析，分子分析抗性细胞系、再生植株和种子：从B、C、D步骤中的抗性细胞系、再生植株和种子的愈伤、再生植株叶、种子子叶提取DNA或RNA或蛋白质，确定目的基因和筛选基因整合，确定外源基因在抗性细胞系、再生植株和种子的稳定整合转化性和转化事件独立性，确定目的基因的表达水平、稳定性和传代遗传。

2.根据权利要求1所述的一种花生转基因的方法，其特征在于：被轰击的胚性组织在轰击后1-10天，转入含致死浓度筛选剂的体胚发生培养基筛选。

3.根据权利要求1所述的一种花生转基因的方法，其特征在于：致死浓度筛选剂为20mg/L的潮霉素。

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