CN109182276B - 一种甘蔗体细胞杂交的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物体细胞杂交技术领域，具体涉及一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：(1)亲本原生质体的制备；(2)原生质体的钝化；(3)原生质体融合诱导物的添加：其中一种亲本原生质体一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种亲本原生质体等体积混合得到混合原生质体；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体进行电融合。本发明利用硅与植物细胞膜表面的糖脂具有很高的亲和力的原理，两种亲本原生质体在硅的诱导下融合，达到提高一对一融合率的作用，杂交后代同时具有ROC22甘蔗高产高糖、高耐旱性的基因，同时具有GT28甘蔗的高糖耐寒基因。

Description

一种甘蔗体细胞杂交的方法
【技术领域】
本发明属于植物体细胞杂交技术领域，具体涉及一种甘蔗体细胞杂交的方法。
【背景技术】
植物原生质体包括细胞核、细胞质和细胞膜，是指除去植物细胞壁后得到的有活力的部分。在适合的培养条件下，离体的植物原生质体能够繁殖分化再生成完整的植株。因去掉了细胞壁的保护，细胞膜的流动性能够得以完整的体现，通过植物原生质体融合而进行的植物体细胞杂交育种技术正是依赖于细胞膜的流动性。而且这种育种方法可以缩短育种年限，还可以克服远缘杂交不亲和的障碍。所以植物体细胞杂交育种技术一直是近些年的研究热点，在品种改良中具有广阔的应用前景，为杂交育种带来了无限的可能。
广西作为全中国的甘蔗产量第一大省，是中国最大的甘蔗生产基地，为中国糖料生产做积累和储备。随着生活和社会需求，需要更多的糖料储备，就需要我们提高制糖工业，首要的前提就是甘蔗的产量质量要有质的提高。然而，广西目前还未能培育出高糖高产量，同时又具有抗逆性强的甘蔗品种。新台糖22号是广西甘蔗的当家品种，具有高萌芽率、高分蘖率、高产高糖、高耐旱性等特点的种植性状，但这个品种的耐寒性差，而桂糖28号具有高糖耐寒、抗逆性强、适应性广等特性，研发一种集以上两个甘蔗品种的优良基因于一身的新品种很有必要，目前鲜少有看到甘蔗体细胞融合成功的实验案例。目前，细胞融合虽然取得了一些实质性的成就，但是如何提高一对一融合率仍是努力研究的方向。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种甘蔗体细胞杂交的方法，该方法具有提高甘蔗两个亲本融合率的作用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：
(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；
(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5-7mmol/L的IOA溶液中17-22min，另一种于室温下悬浮于45-55μg/mL的R-6G溶液中17-22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105-6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；
(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.55-0.75mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养10-15min后取出；
(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150-250V·cm-1、交流频率为450-650kHz、持续时间100-300s、直流脉冲场强为1.5-2.5kV·cm-1、脉冲宽度为30-50μs以及脉冲次数1-3个。
在本发明中，进一步的说明，步骤(1)所述亲本制备原生质体的方法为：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.5-0.8g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有4.5-5.5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理27-33min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液；接着用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片2-3次；接着按重量份往两个容器中分别加入4.5-5.5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以35-45r/min的转速酶解3-4h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两种酶解产物分离纯化，收集沉淀物分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I。
在本发明中，进一步的说明，所述分离纯化的方法为：将两种亲本酶解产物分别依次过60-80目筛和180-200目筛，并收集两种亲本的原生质体粗溶液；接着将两种亲本的原生质体粗溶液分别以450-550r/min的速度进行第一次离心处理，离心时间为4-6min，分别收集两种沉淀物，得到第一ROC22甘蔗原生质体沉淀和第一GT28甘蔗原生质体沉淀；按重量份分别往两种亲本的原生质体沉淀物中加入3-5份的9％CPW溶液，混匀后分别进行第二次离心处理，离心时间为4-6min，离心速度为450-550r/min，分别收集两种沉淀物，得到第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀；接着将第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀重复第二次离心的步骤2-3次。
在本发明中，进一步的说明，步骤(2)所述洗涤的方法为：将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别离心洗涤两次，其中，每次离心速度为750-850r/min，离心时间为4-6min。
在本发明中，进一步的说明，步骤(3)中所述硅酸盐水溶液选自硅酸钠水溶液。
在本发明中，进一步的说明，步骤(4)中，在进行电融合前，先使混合原生质体在融合液中预平衡3-4min。
本发明具有以下有益效果：
本发明具有提高甘蔗两个亲本融合率的作用，具体原理为:硅与植物细胞膜表面的糖脂具有很高的亲和力，并且对植物细胞不但无害，还具有诸多益处，基于此，先用硅酸钠水溶液培养其中一种亲本原生质体，再将表面附着硅的亲本原生质体与另一种亲本原生质体混合，两种亲本原生质体在硅的诱导下融合，达到提高原生质体一对一融合率的作用，杂交后代具有ROC22甘蔗高产高糖、高耐旱性的基因，同时具有GT28甘蔗的高糖耐寒基因；同时硅具有促进原生质体表面细胞壁的再生，因而可促使融合后的两亲本原生质体形成细胞壁，形成完整的细胞，从而为后面细胞分裂、原生质体就形成细胞团、再进一步诱导出植株提供良好的基础。试验结果显示，采用本发明的方法ROC22甘蔗和GT28甘蔗的原生质体一对一融合率高达29.46％，相比于原生质体不用硅酸盐水溶液的对照组高出13.29％；完成融合试验后，其原生质体经培养，其植板率达52.18％。
【具体实施方式】
本发明提供了提供一种甘蔗体细胞杂交的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供的甘蔗原生质体电融合的方法如下：
一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：
(1)制备原生质体：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.5g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有4.5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理27min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液；接着用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片2次；接着按重量份往两个容器中分别加入4.5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以35r/min的转速酶解3h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两种酶解产物分离纯化，收集分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I，其中，所述分离纯化的方法为：将两种亲本酶解产物分别依次过60目筛和180目筛，并收集两种亲本的原生质体粗溶液；接着将两种亲本的原生质体粗溶液分别以450r/min的速度进行第一次离心处理，离心时间为4min，分别收集两种沉淀物，得到第一ROC22甘蔗原生质体沉淀和第一GT28甘蔗原生质体沉淀；按重量份分别往两种亲本的原生质体沉淀物中加入3份的9％CPW溶液，混匀后分别进行第二次离心处理，离心时间为4min，离心速度为450r/min，分别收集两种沉淀物，得到第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀；接着将第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀重复第二次离心的步骤2次。
(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5mmol/L的IOA溶液中17min，另一种于室温下悬浮于45μg/mL的R-6G溶液中17min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别离心洗涤两次，其中，每次离心速度为750r/min，离心时间为4min，洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；
(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.55mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养10min后取出。其中，所述硅酸盐水溶液选自硅酸钠水溶液。
(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中预平衡3min，再进行电融合，融合的参数为：交流场强为150V·cm-1、交流频率为450kHz、持续时间100s、直流脉冲场强为1.5kV·cm-1、脉冲宽度为30μs以及脉冲次数1个。
实施例2
本发明提供的甘蔗原生质体电融合的方法如下：
一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：
(1)制备原生质体：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.6g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理30min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液；接着用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片2次；接着按重量份往两个容器中分别加入5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以40r/min的转速酶解3.5h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两种酶解产物分离纯化，收集分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I，其中，所述分离纯化的方法为：将两种亲本酶解产物分别依次过70目筛和180目筛，并收集两种亲本的原生质体粗溶液；接着将两种亲本的原生质体粗溶液分别以500r/min的速度进行第一次离心处理，离心时间为5min，分别收集两种沉淀物，得到第一ROC22甘蔗原生质体沉淀和第一GT28甘蔗原生质体沉淀；按重量份分别往两种亲本的原生质体沉淀物中加入4份的9％CPW溶液，混匀后分别进行第二次离心处理，离心时间为5min，离心速度为500r/min，分别收集两种沉淀物，得到第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀；接着将第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀重复第二次离心的步骤2次。
(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于6mmol/L的IOA溶液中20min，另一种于室温下悬浮于50μg/mL的R-6G溶液中20min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别离心洗涤两次，其中，每次离心速度为800r/min，离心时间为5min，洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为5×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；
(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.65mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养13min后取出。其中，所述硅酸盐水溶液选自硅酸钠水溶液。
(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中预平衡3min，再进行电融合，融合的参数为：交流场强为200V·cm-1、交流频率为550kHz、持续时间200s、直流脉冲场强为2.0kV·cm-1、脉冲宽度为40μs以及脉冲次数2个。
实施例3
本发明提供的甘蔗原生质体电融合的方法如下：
一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：
(1)制备原生质体：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.8g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有5.5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理33min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液；接着用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片3次；接着按重量份往两个容器中分别加入5.5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以45r/min的转速酶解4h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两种酶解产物分离纯化，收集分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I，其中，所述分离纯化的方法为：将两种亲本酶解产物分别依次过80目筛和200目筛，并收集两种亲本的原生质体粗溶液；接着将两种亲本的原生质体粗溶液分别以550r/min的速度进行第一次离心处理，离心时间为6min，分别收集两种沉淀物，得到第一ROC22甘蔗原生质体沉淀和第一GT28甘蔗原生质体沉淀；按重量份分别往两种亲本的原生质体沉淀物中加入5份的9％CPW溶液，混匀后分别进行第二次离心处理，离心时间为6min，离心速度为550r/min，分别收集两种沉淀物，得到第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀；接着将第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀重复第二次离心的步骤3次。
(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于7mmol/L的IOA溶液中22min，另一种于室温下悬浮于55μg/mL的R-6G溶液中22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别离心洗涤两次，其中，每次离心速度为850r/min，离心时间为6min，洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；
(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.75mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养15min后取出。其中，所述硅酸盐水溶液选自硅酸钠水溶液。
(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中预平衡4min，再进行电融合，融合的参数为：交流场强为250V·cm-1、交流频率为650kHz、持续时间300s、直流脉冲场强为2.5kV·cm-1、脉冲宽度为50μs以及脉冲次数3个。
对比例1
本对比例提供的甘蔗原生质体电融合的方法如下：
一种甘蔗体细胞杂交的方法，按实施例1的步骤得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III后，所述ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III均不用硅酸盐水溶液培养，而是直接混合后进行电融合，其余与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供的甘蔗原生质体电融合的方法如下：
一种甘蔗体细胞杂交的方法，按实施例2的步骤得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III后，所述ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III均不用硅酸盐水溶液培养，而是直接混合后进行电融合，其余与实施例2相同。
对比例3
本对比例提供的甘蔗原生质体电融合的方法如下：
一种甘蔗体细胞杂交的方法，按实施例3的步骤得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III后，所述ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III均不用硅酸盐水溶液培养，而是直接混合后进行电融合，其余与实施例3相同。
效果验证
为了进一步说明本发明提供的甘蔗原生质体电融合的进步性，分别准备等量的ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶，并分别平均分为6份，每一份ROC22甘蔗幼苗嫩叶和一份GT28甘蔗幼苗嫩叶作为一组作为亲本材料，共有6组，将这6组亲本材料分别按实施例1-3和对比例1-3的方法进行原生质体融合试验，分别统计每个组的总融合率以及一对一融合率，并分别记录于表1中。其中，原生质体总融合率＝(视野中融合的原生质体总数/视野中原生质体的总数)×100％；一对一融合率＝(视野中一对一紧密靠近融合的原生质体数/视野中原生质体的总数)×100％。结果如下：
表1
试验例采用的融合方法 总融合率 一对一融合率
实施例1 57.44％ 28.71％
实施例2 58.83％ 29.46％
实施例3 56.83％ 27.85％
对比例1 46.92％ 16.57％
对比例2 50.21％ 17.33％
对比例3 47.32％ 16.17％
上表1中，实施例1-3采用本发明的融合方法，对比例1-3分别为实施例1-3的对照例，对比例中在进行电融合的过程中，从两个亲本制得的原生质体均不用硅酸盐水溶液培养。从上表中的数据看出，其中一种亲本原生质体经用硅酸盐水溶液培养后再进行融合的试验组，一对一融合率均得到很大的提高，证明两种亲本原生质体在硅的诱导下融合，从而达到提高一对一融合率的作用。
以上完成原生质体融合试验后，分别从每一个试验组中取等量的原生质，分别采用平板培养法进行培养，以植板率作为对硅影响原生质体表面细胞壁形成的评判依据，其中，6个试验组置于同一条件下分别培养，15天之后分别统计每一个试验组的植板率并记录于表2中。其中，原生质体植板率＝原生质体再生细胞形成的细胞团数/接种的原生质体总数。结果如下：
表2
Figure GDA0003195403000000081
Figure GDA0003195403000000091
由以上表2中的数据可看出，从上表中的数据看出，实施例1-3在由于进行电融合的过程中，其中一种亲本原生质体经用硅酸盐水溶液培养后再进行融合，完成融合试验后，其原生质体的植板率均比各自的对照组高，证实在细胞融合的过程中硅对原生质体表面细胞壁的形成有促进作用，为诱导出植株提供良好的基础。
以上数据证实本发明的进步性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种甘蔗体细胞杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；
(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5-7mmol/L的IOA溶液中17-22min，另一种于室温下悬浮于45-55μg/mL的R-6G溶液中17-22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105-6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；
(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.55-0.75mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养10-15min后取出；
(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150-250V·cm-1、交流频率为450-650kHz、持续时间100-300s、直流脉冲场强为1.5-2.5kV·cm-1、脉冲宽度为30-50μs以及脉冲次数1-3个；
步骤(1)所述亲本制备原生质体的方法为：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.5-0.8g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有4.5-5.5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理27-33min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液；接着用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片2-3次；接着按重量份往两个容器中分别加入4.5-5.5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以35-45r/min的转速酶解3-4h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两种酶解产物分离纯化，收集沉淀物分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；
所述分离纯化的方法为：将两种亲本酶解产物分别依次过60-80目筛和180-200目筛，并收集两种亲本的原生质体粗溶液；接着将两种亲本的原生质体粗溶液分别以450-550r/min的速度进行第一次离心处理，离心时间为4-6min，分别收集两种沉淀物，得到第一ROC22甘蔗原生质体沉淀和第一GT28甘蔗原生质体沉淀；按重量份分别往两种亲本的原生质体沉淀物中加入3-5份的9％CPW溶液，混匀后分别进行第二次离心处理，离心时间为4-6min，离心速度为450-550r/min，分别收集两种沉淀物，得到第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀；接着将第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀重复第二次离心的步骤2-3次；
步骤(2)所述洗涤的方法为：将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别离心洗涤两次，其中，每次离心速度为750-850r/min，离心时间为4-6min；
步骤(3)中所述硅酸盐水溶液选自硅酸钠水溶液；
步骤(4)中，在进行电融合前，先使混合原生质体在融合液中预平衡3-4min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN113462633B (zh) * 2021-08-16 2023-05-05 广西大学 甘蔗幼叶不同发育时期原生质体分离及提取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0902838A1 (en) * 1996-05-20 1999-03-24 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging van Aardappelmeel en Derivaten 'AVEBE' B.A. Methods for producing and transforming cassave protoplasts
CN102273409A (zh) * 2011-06-28 2011-12-14 蔡明� 一种甘蔗种的组培方法
CN102899282A (zh) * 2012-10-16 2013-01-30 福建农林大学 甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0902838A1 (en) * 1996-05-20 1999-03-24 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging van Aardappelmeel en Derivaten 'AVEBE' B.A. Methods for producing and transforming cassave protoplasts
CN102273409A (zh) * 2011-06-28 2011-12-14 蔡明� 一种甘蔗种的组培方法
CN102899282A (zh) * 2012-10-16 2013-01-30 福建农林大学 甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
植物原生质体融合技术的研究进展;黄国文;《湖南科技学院学报》;20111231;第32卷(第12期);第2-3节 *
甘蔗原生质体分离与培养体系的建立和优化;史晓朋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20180125;第1-4章 *
甘蔗原生质体的融合和细胞块的形成;麦洁葵;《甘蔗糖业》;19781127(第37期);第51-52页 材料和方法，结果和讨论 *

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