CN110616182B - 浮萍细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法 - Google Patents

浮萍细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种浮萍细胞的快速悬浮培养方法，包括(1)浮萍叶状体的预培养，(2)浮萍愈伤组织的诱导培养，(3)浮萍愈伤组织的继代培养，以及(4)浮萍细胞的悬浮培养这几个步骤，本发明还提供了一种浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，以前述悬浮培养方法得到的浮萍细胞作为转化材料，利用质粒转化的农杆菌菌株对转化材料进行侵染，然后筛选培养，对筛选培养得到的细胞进行再生诱导培养，对再生诱导培养得到的叶状体进行扩大培养，得到转基因浮萍株系。本发明解决了现有技术尚未建立浮萍悬浮细胞遗传转化体系的问题，能在短时间快速获得大量的浮萍悬浮培养细胞，能高效转化浮萍细胞，获得稳定转基因浮萍株系。

Description

浮萍细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种浮萍细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法。
背景技术
浮萍是世界上最小的开花植物，共有5个属，分为37个种。作为一种广泛分布且形态高度退化的高等植物，其基因组小，以无性繁殖无主，生长速度快，培养条件简单、培养成本低廉。因此，浮萍既可以作为一种理想的模式材料，用于研究植物生长发育机理机制和基因功能等；也可以作为一种理想的植物生物反应器，通过基因工程的途径，将其改造为“分子农场”，再通过大规模培养生产具有高经济价值的产物。为了更好地研究和利用浮萍资源，建立其稳定的遗传转化体系至关重要。
目前，浮萍的遗传转化主要是采用农杆菌介导的愈伤组织转化法。然而，愈伤组织作为遗传转化材料，存在着转化效率低的问题。植物的悬浮细胞由于具有良好的分散性、均一性，而且细胞增殖快，是进行遗传转化的良好材料。甘薯、水稻、烟草和杨树等多个作物上都已报道建立了高效的悬浮细胞遗传转化体系，而浮萍悬浮细胞系的建立和遗传转化目前尚未见报道。在工业生产中，通过浮萍细胞培养是获得浮萍细胞次生代谢药物和提取药理活性因子的有效途径之一。浮萍悬浮细胞系的遗传转化有利于基因工程改造浮萍，可研究浮萍生产发育及分化的机制，遗传变异规律，对浮萍的遗传育种具有特殊的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种浮萍细胞的快速悬浮培养方法，以及一种浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，以解决现有技术尚未建立浮萍悬浮细胞遗传转化体系，以浮萍愈伤组织作为遗传转化材料存在的转化效率低的问题，为通过浮萍细胞培养快速获得活性产物提供有效途径，同时为基因工程改造浮萍奠定基础。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种浮萍细胞的快速悬浮培养方法，包括以下步骤：
(1)浮萍叶状体的预培养
挑取保存于种质保存培养基中的浮萍叶状体，接种至预培养基中进行预培养；预培养条件：温度25±1℃，光周期为(16～12)h:(8～12)h，光照强度为80～180μmol/m2/s，预培养基为添加10～30g/L蔗糖的Hoagland液体培养基，预培养基的pH值为5.0～5.5；
(2)浮萍愈伤组织的诱导培养
将预培养得到的浮萍叶状体在灭菌滤纸上充分吸干水分后接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；诱导培养条件：温度25±1℃，光周期为(16～12)h:(8～12)h，光照强度为40～100μmol/m2/s，愈伤组织诱导培养基为添加1～15mg/L 2，4—二氯苯氧乙酸、1～10μmol/L噻苯隆、5～30g/L蔗糖、3～5g/L组织凝胶的B5基础培养基，愈伤组织诱导培养基的pH值为5～6；
(3)浮萍愈伤组织的继代培养
将愈伤组织接入继代培养基中进行继代培养，直至获得胚性愈伤组织；继代培养的条件：温度25±1℃，光周期为(16～12)h:(8～12)h，光照强度为40～100μmol/m2/s，继代培养基为添加1～15mg/L 2，4—二氯苯氧乙酸、1～10μmol/L噻苯隆、5～30g/L蔗糖、3～5g/L组织凝胶的B5基础培养基，继代培养基的pH值为5～6；
(4)浮萍细胞的悬浮培养
将胚性愈伤组织转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床振荡转速为100～200r/min，细胞悬浮培养基为添加了4～6g/L酸水解酪蛋白、5～30g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.4～5.8。
上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案中，步骤(4)中悬浮培养时，优选将胚性愈伤组织以20～25g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行悬浮培养。
上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案中，步骤(4)中所述细胞悬浮培养基的pH值优选为5.4～5.6，更进一步优选为5.4。
上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案中，步骤(1)所述浮萍叶状体来源于包括绿萍M0157在内的浮萍。
上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案中，步骤(3)中继代培养时，继代频率优选为2～4周一次。
上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案中，步骤(1)中预培养至叶状体达到后续步骤所需要的量即可，根据浮萍株系、浮萍叶状体的状态等因素进行具体确定，通常，步骤(1)中预培养的时间为7～14天。
上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案中，浮萍叶状体在种质保存培养基中的培养条件为：温度25±1℃，光周期为(16～12)h:(8～12)h，光照强度为40～80μmol/m2/s，种质保存培养基为添加3～15g/L蔗糖，7～15g/L琼脂的MS基础培养基，种质保存培养基的pH值为5.0～5.5。将采集的浮萍叶状体经去离子水洗净，采用1wt.％～5wt.％的次氯酸钠浸泡1～5min，用无菌去离子水清洗后在灭菌滤纸上充分吸干水分，最后接种至浮萍种质保存培养基上进行保种，即得保存于种质保存培养基中的浮萍叶状体。
上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案中，光周期为(16～12)h:(8～12)h是指一天之中，光照时间为16～12小时，相应地，黑暗时间为8～12小时。
以上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法的技术方案为基础，本发明还提供了一种浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，该方法以上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法培养得到的浮萍细胞作为转化材料，利用质粒转化的农杆菌菌株对转化材料进行侵染，然后筛选培养，对筛选培养得到的细胞进行再生诱导培养，对再生诱导培养得到的叶状体进行扩大培养，得到转基因浮萍株系。
更进一步地，上述浮萍细胞的高效遗传转化方法的技术方案包括以下步骤：
(1)将质粒转化到农杆菌菌株中，挑选转化成功的单菌落，接种于LB液体培养基中，在28±1℃黑暗条件下振荡培养至OD600为0.8～1.2，然后在28±1℃离心去除上清液，用B5液体培养基重新悬浮菌株，得到重悬菌液；
将经过上述浮萍细胞的快速悬浮培养方法细胞悬浮培养得到的浮萍细胞离心、去上清，用重悬菌液浸泡离心收集到的浮萍细胞团，侵染，然后静置收集侵染后的浮萍细胞团并放入含有滤纸的培养皿中在25±1℃黑暗条件下共培养2～4天，所述滤纸采用共培养基润湿，共培养基为含有100～200μmol/L乙酰丁香酮的B5基础培养基；
(2)将共培养得到的浮萍细胞团转入筛选培养基中筛选培养30～50天；筛选培养条件为：温度25±1℃，光周期为(16～12)h:(8～12)h，光照强度为40～80μmol/m2/s，筛选培养基为添加1～15mg/L 2，4—二氯苯氧乙酸、1～10μmol/L噻苯隆、5～20mg/L G418、100～500mg/L头孢霉素的B5基础培养基；
(3)将筛选培养后存活的浮萍细胞团接种至再生诱导培养基中进行再生诱导培养，直到再生出叶状体；再生诱导培养时条件为：温度25±1℃，光周期为(16～12)h:(8～12)h，光照强度为40～80μmol/m2/s，再生诱导培养基为B5基础培养基；
(4)将再生出的叶状体接种至Hoagland液体培养基中使其形成完整的转基因浮萍株系。
上述浮萍细胞的高效遗传转化方法的技术方案中，所述农杆菌菌株包括GV3101。
上述浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法的技术方案中，步骤(2)筛选培养时，优选每隔10～20天更换一次筛选培养基；步骤(3)再生诱导培养时，优选每隔10～20天更换一次再生培养基。
与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明建立了浮萍细胞的快速悬浮培养方法，通过该方法的愈伤组织诱导条件能高效诱导出浮萍愈伤组织，得到的浮萍愈伤组织具有生长旺盛、不褐化等特点，可长期继代保存，对所得浮萍愈伤组织进行悬浮培养，能在短时间快速获得大量的浮萍悬浮培养细胞。通过浮萍细胞培养可获得浮萍细胞次生代谢药物、以及提取药理活性因子，以本发明建立的浮萍细胞的快速悬浮培养方法为基础，在工业上可实现有效成分含量高的浮萍细胞培养物的规模化和快速生产。
2.以本发明建立的浮萍细胞的快速悬浮培养方法为基础，本发明还提供了浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，该方法能高效转化浮萍细胞，获得稳定转基因浮萍株系，该方法为基因工程改造浮萍奠定了基础，可用于研究浮萍生产发育及分化的机制，遗传变异规律，对浮萍的遗传育种具有特殊的意义。
附图说明
图1是不同培养基对绿萍M0157愈伤组织的诱导效率结果。
图2是不同浮萍株系的愈伤组织诱导效率结果。
图3是激素添加水平对绿萍M0157悬浮细胞系生长的影响结果。
图4是酸水解酪蛋白水平对绿萍M0157悬浮细胞系生长的影响结果。
图5是胚性愈伤组织接种量对绿萍M0157悬浮细胞系生长的影响结果。
图6是不同侵染材料的GUS阳性率结果。
图7是不同农杆菌侵染绿萍M0157悬浮细胞的GUS阳性率结果。
图8绿萍M0157悬浮细胞的GUS染色结果，其中，A、B图分别为染色前和染色后的照片。
图9是转基因绿萍M0157的GUS染色结果，其中，A、B图分别为染色前和染色后的照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的浮萍细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
下述各实施例和对比例中，所述MS基础培养基的配方及配制方法如下：
Figure BDA0002229314100000041
Figure BDA0002229314100000051
下述各实施例和对比例中，所述Hoagland液体培养基的配方及配制方法如下：
Figure BDA0002229314100000052
Figure BDA0002229314100000061
下述各实施例和对比例中，所述B5基础培养基的配方及配制方法如下：
Figure BDA0002229314100000062
下述各实施例和对比例中，所述LB液体培养基的配方如下：
Figure BDA0002229314100000063
下述各实施例和对比例中，所述2，4—二氯苯氧乙酸(2,4-D)购自索莱宝公司(中国，北京)，货号为D8100；噻苯隆(TDZ)购自索莱宝公司(中国，北京)，货号为T8050，酸水解酪蛋白购自索莱宝公司，货号为C8221；其余基础试剂均购自西亚试剂(中国，山东)。农杆菌菌株GV3101、EHA105、LBA4404及C58C1可以从天恩泽公司(中国，北京)购买得到。
2,4-D母液配制方法：称取1g 2,4-D用乙醇溶解，用去离子水定容至100mL，即配制成10mg/mL的2,4-D母液，采用0.22μm头抽滤灭菌后，在-20℃分装保存。
TDZ母液配制方法：称取0.11g TDZ用乙醇溶解，用去离子水定容至100mL，即配制成5mmol/L的TDZ母液，采用0.22μm头抽滤灭菌后，在-20℃分装保存。
下述各实施例和对比例中，基础培养基均采用高压灭菌的方式进行灭菌，灭菌条件为120℃，15min或115℃，20min。
下述各实施例和对比例中，所述2,4-D，TDZ和酸水解酪蛋白不能采用高压灭菌的方式，均采用抽滤灭菌的方式，且需在基础培养基温度低于60℃后才可加入基础培养基中。
下述实施例和对比例中，采用的浮萍为绿萍M0157，属于Lemnagibba。
下述实施例和对比例中，细胞增殖生长的计算方式如下：
在细胞悬浮培养结束后，在转速为5000r/min的离心机上离心10min，倒掉上清液，称重，即为鲜重：
细胞增殖倍数＝(收获鲜重-接种鲜重)/接种量鲜重；
细胞生长速率(g/L/d)＝(收获鲜重-接种鲜重)/培养天数。
下述实施例和对比例中，GUS染色鉴定时，采用中科瑞泰GUS组织化学检测试剂盒(中国，北京)进行GUS染色鉴定。
实施例1：不同诱导培养基对浮萍愈伤组织的诱导效率比较
本实施例中，考察不同的诱导培养基对浮萍愈伤组织诱导效率的影响，选择合适的浮萍愈伤组织诱导培养基，步骤如下：
(1)无菌绿萍叶状体的获取
绿萍M0157(Lemnagibba)叶状体长期保存于本实验室，具体保存在种质保存培养基中，在种质保存培养基中的培养条件为：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为50μmol/m2/s，种质保存培养基为添加15g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基，种质保存培养基的pH值为5.0～5.5。
(2)绿萍叶状体的预培养
从种质保存培养基中挑取少量绿萍M0157叶状体，接种至预培养基中进行7～14天的预培养，直到绿萍M0157叶状体预培养至实验所需要的叶状体量；预培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为110μmol/m2/s，预培养基为添加15g/L蔗糖的Hoagland液体培养基，预培养基的pH值为5.0～5.5。
(3)绿萍愈伤组织的诱导培养
将预培养得到的绿萍M0157叶状体在灭菌滤纸上充分吸干水分后接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；诱导培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s。该步骤一共分7组同时进行，各组采用的愈伤组织诱导培养基分别采用如下表1所述。
表1愈伤组织诱导培养基
Figure BDA0002229314100000081
计算各组绿萍M0157愈伤组织的诱导效率，结果如图1所示，由图1可知，绿萍M0157采用Y3培养基，愈伤组织诱导效率高达97.5％±2.5％，采用Y1培养基，愈伤组织诱导效率不超过40％，采用Y7培养基，愈伤组织诱导效率接近40％，而Y2、Y4、Y5和Y6培养基不能诱导出愈伤组织，说明适用于其他物种或其他浮萍株系的愈伤组织诱导培养基并不适用于绿萍M0157。
实施例2：不同浮萍株系的愈伤组织的诱导效率比较
本实施例中，在采用Y3培养基作为愈伤组织诱导培养基的基础上，考察不同浮萍株系的愈伤组织的诱导效率的差异，步骤如下：
(1)浮萍叶状体的预培养
该步骤中，以十个不同的浮萍株系为实验材料，这十个浮萍株系分别为：ZH0051、ZH0043、ZH0097、D0151、D0158、M0157、ZH0036、ZH0004、ZH1073以及D0136。以上十个浮萍株系的叶状体长期保存于本实验室，具体保存在种质保存培养基中，在种质保存培养基中的培养条件为：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为50μmol/m2/s，种质保存培养基为添加15g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基，种质保存培养基的pH值为5.0～5.5。
从种质保存培养基中分别挑取少量上述十个浮萍株系的叶状体，分别接种至预培养基中进行7～14天的预培养，直到浮萍叶状体预培养至实验所需要的叶状体量；预培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为110μmol/m2/s，预培养基为添加15g/L蔗糖的Hoagland液体培养基，预培养基的pH值为5.0～5.5。
(3)浮萍愈伤组织的诱导培养
将预培养得到的十个浮萍株系的叶状体在灭菌滤纸上充分吸干水分，分别接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；诱导培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s，愈伤组织诱导培养基为实施例1中的Y3培养基。
计算各浮萍株系愈伤组织的诱导效率，结果如图2所示，由图2可知，相同的愈伤组织诱导培养基和相同的诱导培养条件对不同株系的浮萍的愈伤组织的诱导效果存在显著差异，Y3培养基对于浮萍M0157愈伤组织的诱导效果最好，愈伤组织诱导效率达到100％，远高于其他浮萍株系。
对比例1：浮萍细胞悬浮培养
本实施例中，提供浮萍细胞的快速悬浮培养方法，步骤如下：
(1)无菌绿萍叶状体的获取
绿萍M0157(Lemnagibba)叶状体长期保存于本实验室，具体保存在种质保存培养基中，在种质保存培养基中的培养条件为：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为50μmol/m2/s，种质保存培养基为添加15g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基，种质保存培养基的pH值为5.0～5.5。
(2)绿萍叶状体的预培养
从种质保存培养基中挑取少量绿萍M0157叶状体，接种至预培养基中进行7～14天的预培养，直到绿萍M0157叶状体预培养至实验所需要的叶状体量；预培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为110μmol/m2/s，预培养基为添加15g/L蔗糖的Hoagland液体培养基，预培养基的pH值为5.0～5.5。
(3)绿萍愈伤组织的诱导培养
将预培养得到的绿萍M0157叶状体在灭菌滤纸上充分吸干水分后接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；诱导培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s，愈伤组织诱导培养基为添加10mg/L 2,4-D、5μmol/L TDZ、10g/L蔗糖、3.5g/L组织凝胶的B5基础培养基，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。
(4)绿萍愈伤组织的继代培养
将绿萍M0157愈伤组织接入继代培养基中进行继代培养，继代频率为2～4周一次，直至获得胚性愈伤组织；继代培养的条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s，继代培养基为添加10mg/L 2,4-D、5μmol/L TDZ、10g/L蔗糖、3.5g/L组织凝胶的B5基础培养基，继代培养基的pH值为5.8。该步骤得到的胚性愈伤组织呈黄色松散颗粒状，无褐化。
(5)绿萍细胞的悬浮培养
将绿萍M0157胚性愈伤组织以15g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床的振荡转速为180r/min，细胞悬浮培养基为添加了10mg/L 2,4-D、5μmol/L TDZ、10g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.8。
细胞悬浮培养6天后，取悬浮培养的绿萍M0157细胞在转速为5000r/min的离心机上离心10min，倒掉上清液之后称重，将该重量记作鲜重，按照以下两式计算细胞增殖倍数和细胞生长速率。
细胞增殖倍数＝(收获鲜重-接种鲜重)/接种量鲜重
细胞生长速率(g/L/d)＝(收获鲜重-接种鲜重)/培养天数
结果为：绿萍M0157的细胞增殖倍数为0.82±0.23，细胞生长速率为5.93±1.46g/L/d，这表明在本对比例的细胞悬浮培养条件下，绿萍M0157愈伤组织经过细胞悬浮培养后，绿萍M0157的细胞增殖，但增殖较为缓慢，需要进一步优化细胞悬浮培养条件。
实施例3：激素水平对浮萍细胞悬浮生长的影响
本实施例中，考察浮萍细胞悬浮培养时激素水平对浮萍细胞悬浮生长的影响，操作方法与对比例1基本相同，不同之处仅在于步骤(5)中细胞悬浮培养基中的激素水平不同，具体步骤如下：
步骤(1)～(4)与对比例1的步骤(1)～(4)相同。
步骤(5)，绿萍细胞的悬浮培养。该步骤中，设计A～E五个实验组，各实验组的差异仅在于细胞悬浮培养基中激素水平不同，细胞悬浮培养基中的其他组分的含量相同，细胞悬浮培养基为添加了2,4-D、TDZ、10g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.8，A～E五个实验组中2,4-D和TDZ的激素水平具体如下：
实验组A：0mg/L 2,4-D,0μmol/L TDZ
实验组B：2.5mg/L 2,4-D,1.25μmol/L TDZ
实验组C：5mg/L 2,4-D,2.5μmol/L TDZ
实验组D：7.5mg/L 2,4-D,3.75μmol/L TDZ
实验组E：10mg/L 2,4-D,5μmol/L TDZ
将绿萍M0157胚性愈伤组织以15g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床的振荡转速为180r/min。细胞悬浮培养6天后，计算细胞增殖倍数和细胞生长速率。
结果如图3所示，由图3可知，随着植物激素浓度的增加，绿萍M0157细胞的生长速率和增殖倍数都逐渐降低，说明2,4-D和TDZ的加入，对悬浮细胞的生长会产生抑制作用，不添加2,4-D和TDZ的细胞悬浮培养基最适合绿萍M0157的细胞悬浮培养。同时，实验过程观察发现，随着2,4-D和TDZ在细胞悬浮培养基中浓度的增加，悬浮细胞或细胞团会褐化，影响悬浮细胞的生长。
实施例4：浮萍细胞悬浮培养条件优化
本实施例中，对绿萍M0157细胞悬浮培养条件进行优化，筛选出更适合M0157的细胞悬浮培养条件，操作方法与实施例3基本相同，不同之处仅在于步骤(5)中细胞悬浮培养时的操作条件有所不同，具体步骤如下：
步骤(1)～(4)与对比例1的步骤(1)～(4)相同。
步骤(5)，绿萍细胞的悬浮培养
该步骤中，分别优化细胞悬浮培养基中酸水解酪蛋白的浓度、细胞悬浮培养基的pH值，以及细胞悬浮培养时摇床的振荡转速和接种量等培养条件。
①设计A～F六个实验组，各实验组的差异仅在于细胞悬浮培养基中酸水解酪蛋白的浓度不同，细胞悬浮培养基中的其他组分的含量相同，细胞悬浮培养基为添加了酸水解酪蛋白和10g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.8，实验组A～F中，细胞悬浮培养基中的酸水解酪蛋白浓度依次为：0、2、4、6、8、10g/L。
将绿萍M0157胚性愈伤组织以15g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床的振荡转速为180r/min。细胞悬浮培养6天后，计算细胞增殖倍数和细胞生长速率。
实验结果如图4所示，由图4可知，在细胞悬浮培养基中添加酸水解酪蛋白可有效缓解绿萍M0157细胞团褐化，当酸水解酪蛋白的添加量为4～6g/L时，可进一步促进绿萍M0157悬浮细胞系的生长。
②设计A～E五个实验组，各组实验的差异仅在于细胞悬浮培养基pH值不同，细胞悬浮培养基为添加了6g/L酸水解酪蛋白、10g/L蔗糖的B5基础培养基，实验组A～E中，细胞悬浮培养基pH值依次为：5.0、5.4、5.8、6.2、6.6。
将绿萍M0157胚性愈伤组织以15g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床的振荡转速为180r/min。细胞悬浮培养6天后，计算细胞增殖倍数和细胞生长速率。
实验结果表明，绿萍M0157悬浮细胞系在pH＝5.0～6.6的条件下都能保持生长，当pH值为5.4时，绿萍M0157悬浮细胞系的生长速率最快。
③设计A～E五个实验组，各实验组的差异仅在于细胞悬浮培养时摇床的振荡转速不同，细胞悬浮培养基为添加了6g/L酸水解酪蛋白、10g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.4，实验组A～E中，摇床的振荡转速依次为：50、100、150、200、250r/min。
将绿萍M0157胚性愈伤组织以15g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床的振荡转速如上。细胞悬浮培养6天后，计算细胞增殖倍数和细胞生长速率。
实验结果表明，在细胞悬浮培养时，摇床的振荡转速为150r/min时，绿萍M0157悬浮细胞系的增值速度最快，摇床的振荡转速低于100r/min或高于200r/min时，绿萍M0157悬浮细胞系的增殖较慢。
④设计A～E五个实验组，各实验组的差异仅在于细胞悬浮培养时，胚性愈伤组织在细胞悬浮培养基中的接种量不同，细胞悬浮培养基为添加了6g/L酸水解酪蛋白、10g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.4，实验组A～E中，胚性愈伤组织在细胞悬浮培养基中的接种量依次为：10、20、30、40、50g/L。
将绿萍M0157胚性愈伤组织转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床的振荡转速为150r/min。细胞悬浮培养6天后，计算细胞增殖倍数和细胞生长速率。
实验结果如图5所示，由图5可知，当绿萍M0157胚性愈伤组织的接种量为20g/L时，细胞生长速率最大，随着接种量的进一步增加，细胞生长速率有所下降。
综上，确定优化后的绿萍M0157细胞悬浮培养条件为：细胞悬浮培养基中酸水解酪蛋白的浓度为4～6g/L，细胞悬浮培养基的pH值为5.4～5.8，优选为5.4～5.6，摇床的振荡转速为100～200r/min，胚性愈伤组织在细胞悬浮培养基中的接种量为20～25g/L。
实施例5：浮萍细胞的快速悬浮培养
本实施例中，提供浮萍细胞的快速悬浮培养方法，步骤如下：
(1)无菌绿萍叶状体的获取
绿萍M0157(Lemnagibba)叶状体长期保存于本实验室，具体保存在种质保存培养基中，在种质保存培养基中的培养条件为：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为50μmol/m2/s，种质保存培养基为添加15g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS基础培养基，种质保存培养基的pH值为5.0～5.5。
(2)绿萍叶状体的预培养
从种质保存培养基中挑取少量绿萍M0157叶状体，接种至预培养基中进行7～14天的预培养，直到绿萍M0157叶状体预培养至实验所需要的叶状体量；预培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为110μmol/m2/s，预培养基为添加15g/L蔗糖的Hoagland液体培养基，预培养基的pH值为5.0～5.5。
(3)绿萍愈伤组织的诱导培养
将预培养得到的绿萍M0157叶状体在灭菌滤纸上充分吸干水分后接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；诱导培养条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s，愈伤组织诱导培养基为添加10mg/L 2,4-D、5μmol/L TDZ、10g/L蔗糖、3.5g/L组织凝胶的B5基础培养基，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。
(4)绿萍愈伤组织的继代培养
将绿萍M0157愈伤组织接入继代培养基中进行继代培养，继代频率为2～4周一次，直至获得胚性愈伤组织；继代培养的条件：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s，继代培养基为添加10mg/L 2,4-D、5μmol/L TDZ、10g/L蔗糖、3.5g/L组织凝胶的B5基础培养基，继代培养基的pH值为5.8。该步骤得到的胚性愈伤组织呈黄色松散颗粒状，无褐化。
(5)绿萍细胞的悬浮培养
将绿萍M0157胚性愈伤组织以20g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1℃，零光照，摇床的振荡转速为150r/min，细胞悬浮培养基为添加了6g/L酸水解酪蛋白、10g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.4。细胞悬浮培养14天后，计算细胞生长速率，结果为16.2g/L/d(FW)。
实施例6：浮萍悬浮细胞的遗传转化
本实施例中，提供浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，步骤如下：
(1)绿萍M0157悬浮细胞的农杆菌转化
该步骤中，设计A～D四个实验组，各实验组的差异仅采用的农杆菌菌株不同，实验组A～D中采用的农杆菌菌株分别为：GV3101、EHA105、LBA4404和C58C1。
将质粒pCambia2301-GUS转化到农杆菌菌株中，质粒pCambia2301-GUS中含有选择标记基因NPTII和报告基因GUS，挑选转化成功的单菌落，接种于LB液体培养基中，在28±1℃黑暗条件下振荡培养至OD600为1.0，然后在28±1℃以5000r/min的转速离心5min，去除上清液，用B5液体培养基重新悬浮菌株，得到重悬菌液。
将实施例5中细胞悬浮培养14天后的绿萍M0157细胞以4000r/min的转速离心3min，去上清，用重悬菌液浸泡离心收集的绿萍M0157细胞团，侵染20min，然后静置收集侵染后的绿萍M0157细胞团，将其放入含有滤纸的培养皿中，在25±1℃黑暗条件下共培养3天，所述滤纸采用共培养基润湿，共培养基为含有100μmol/L乙酰丁香酮的B5基础培养基。
(2)绿萍M0157愈伤组织的农杆菌转化
为了比较采用绿萍M0157愈伤组织和悬浮细胞作为侵染材料时，农杆菌转化的成功率，本实施例中设计了该步骤。
将质粒pCambia2301-GUS转化到农杆菌菌株GV3101中，质粒pCambia2301-GUS中含有选择标记基因NPTII和报告基因GUS，挑选转化成功的单菌落，接种于LB液体培养基中，在28±1℃黑暗条件下振荡培养至OD600为1.0，然后在28±1℃以5000r/min的转速离心5min，去除上清液，用B5液体培养基重新悬浮菌株，得到重悬菌液。
用重悬菌液浸泡绿萍M0157愈伤组织(实施例5步骤(3)中得到的愈伤组织)，侵染20min，然后静置收集侵染后的绿萍M0157愈伤组织，将其放入含有滤纸的培养皿中，在25±1℃黑暗条件下共培养3天，所述滤纸采用共培养基润湿，共培养基为含有100μmol/L乙酰丁香酮的B5基础培养基。
(3)绿萍M0157悬浮细胞和愈伤组织GUS染色鉴定
取部分步骤(1)和(2)中共培养后的绿萍M0157悬浮细胞和愈伤组织进行GUS染色检测，计算GUS阳性率，计算方法如下：
GUS阳性率＝GUS染色为蓝色的细胞团或愈伤组织数量/侵染细胞团或愈伤组织总数量
采用质粒pCambia2301-GUS转化的农杆菌菌株GV3101侵染绿萍M0157悬浮细胞和愈伤组织的结果如图6所示，由图6可知，采用质粒pCambia2301-GUS转化的农杆菌菌株GV3101侵染绿萍M0157悬浮细胞的GUS阳性率明显提高，高达100％。全部被侵染的绿萍M0157细胞团都染为蓝色，见图8，而侵染愈伤组织的GUS阳性率仅为26.7％±3％。
采用质粒pCambia2301-GUS转化的农杆菌菌株GV3101、EHA105、LBA4404及C58C1侵染绿萍M0157悬浮细胞的结果如图7所示，由图7可知，采用质粒pCambia2301-GUS转化的农杆菌菌株GV3101侵染绿萍M0157悬浮细胞的GUS阳性率高达百分之百，显著高于其他几种质粒转化的农杆菌菌株。
(4)筛选培养
将步骤(1)实验组A共培养后的部分绿萍M0157细胞团转入筛选培养基中筛选培养一个月，筛选培养时每隔两周更换一次筛选培养基；筛选培养条件为：温度25±1℃，光周期为16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s，筛选培养基为添加10mg/L 2,4-D、5μmol/L TDZ、10mg/L G418、200mg/L头孢霉素的B5基础培养基。
(5)再生诱导
将筛选培养后存活的绿萍M0157细胞团接种至再生诱导培养基中进行再生诱导培养，每两周更换一次再生培养基直到再生出叶状体；再生诱导培养时条件为：温度25±1℃，光周期16h:8h，光照强度为80μmol/m2/s，再生诱导培养基为B5基础培养基。
(6)扩大培养
将再生出的叶状体接种至Hoagland液体培养基中使其形成完整的转基因绿萍M0157株系，待叶状体繁殖至一定量后进行后续检测实验。
GUS染色鉴定：将扩大培养得到的叶状体进行后续GUS染色检测，结果如图9所示，由图9可知，成功转化后的绿萍M0157悬浮细胞能够顺利再生出转基因叶状体，最终能获得稳定遗传的阳性株系。

Claims (6)

1.一种浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）浮萍叶状体的预培养
挑取保存于种质保存培养基中的绿萍叶状体，接种至预培养基中进行预培养；预培养条件：温度25±1 ℃，光周期为（16~12）h :（8~12）h，光照强度为80~180 μmol/m2/s，预培养基为添加10~30 g/L蔗糖的Hoagland液体培养基，预培养基的pH值为5.0~5.5；
（2）浮萍愈伤组织的诱导培养
将预培养得到的浮萍叶状体在灭菌滤纸上充分吸干水分后接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；诱导培养条件：温度25±1 ℃，光周期为（16~12）h :（8~12）h，光照强度为40~100 μmol/m2/s，愈伤组织诱导培养基为添加1~15 mg/L 2，4—二氯苯氧乙酸、1~10 μmol/L 噻苯隆、5~30g/L蔗糖、3~5 g/L组织凝胶的B5基础培养基，愈伤组织诱导培养基的pH值为5~6；
（3）浮萍愈伤组织的继代培养
将愈伤组织接入继代培养基中进行继代培养，直至获得胚性愈伤组织；继代培养的条件：温度25±1 ℃，光周期为（16~12）h :（8~12）h，光照强度为40~100 μmol/m2/s，继代培养基为添加1~15 mg/L 2，4—二氯苯氧乙酸、1~10 μmol/L 噻苯隆、5~30 g/L蔗糖、3~5 g/L组织凝胶的B5基础培养基，继代培养基的pH值为5~6；
（4）浮萍细胞的悬浮培养
将胚性愈伤组织转接到细胞悬浮培养基中进行细胞悬浮培养；细胞悬浮培养条件：温度25±1 ℃，零光照，摇床振荡转速为100~200 r/min，细胞悬浮培养基为添加了4~6 g/L酸水解酪蛋白、5~30 g/L蔗糖的B5基础培养基，细胞悬浮培养基的pH值为5.4~5.8；
（5）将质粒转化到农杆菌菌株中，挑选转化成功的单菌落，接种于LB液体培养基中，在28±1 ℃黑暗条件下振荡培养至OD600为0.8~1.2，然后在28±1 ℃离心去除上清液，用B5液体培养基重新悬浮菌株，得到重悬菌液；所述农杆菌菌株为GV3101；
将细胞悬浮培养得到的浮萍细胞离心、去上清，用重悬菌液浸泡离心收集到的浮萍细胞团，侵染，然后静置收集侵染后的浮萍细胞团并放入含有滤纸的培养皿中在25±1℃黑暗条件下共培养2~4天，所述滤纸采用共培养基润湿，共培养基为含有100~200 μmol/L乙酰丁香酮的B5基础培养基；
（6）将共培养得到的浮萍细胞团转入筛选培养基中筛选培养30~50天；筛选培养条件为：温度25±1 ℃，光周期（16~12）h :（8~12）h，光照强度40~100 μmol/m2/s，筛选培养基为添加1~15 mg/L 2，4—二氯苯氧乙酸、1~10 μmol/L 噻苯隆、5~20 mg/L G418、100~500 mg/L头孢霉素的B5基础培养基；
（7）将筛选培养后存活的浮萍细胞团接种至再生诱导培养基中进行再生诱导培养，直到再生出叶状体；再生诱导培养时条件为：温度25±1 ℃，光周期（16~12）h :（8~12）h，光照强度40~100 μmol/m2/s，再生诱导培养基为B5基础培养基；
（8）将再生出的叶状体接种至Hoagland液体培养基中使其形成完整的转基因浮萍株系。
2.根据权利要求1所述浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤（4）中悬浮培养时，将胚性愈伤组织以20~25 g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中进行悬浮培养。
3.根据权利要求1或2所述浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中继代培养时，继代频率为2~4周一次。
4.根据权利要求1或2所述浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）中预培养的时间为7~14天。
5.根据权利要求1或2所述浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，浮萍叶状体在种质保存培养基中的培养条件为：温度25±1 ℃，光周期为（16~12）h :（8~12）h，光照强度为40~80 μmol/m2/s，种质保存培养基为添加3~15 g/L蔗糖，7~15 g/L琼脂的MS基础培养基，种质保存培养基的pH值为5.0~5.5。
6.根据权利要求1所述浮萍悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤（6）筛选培养时，每隔10~20天更换一次筛选培养基，步骤（7）再生诱导培养时，每隔10~20天更换一次再生培养基。
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