CN102268450A

CN102268450A - 一种多年生黑麦草的遗传转化方法

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Publication number: CN102268450A
Application number: CN 201010193511
Authority: CN
Inventors: 马欣荣; 杨宏; 毛萍; 乔定君
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的黑麦草(Lolium L.)遗传转化方法。包括愈伤组织诱导和继代培养、愈伤组织切碎、根癌农杆菌的培养、根癌农杆菌侵染愈伤组织、根癌农杆菌与愈伤组织共培养、恢复除菌培养、选择培养、分化再生培养、植株继代选择培养，愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；根癌农杆菌浸染愈伤组织时的培养基、根癌农杆菌与愈伤组织共培养的培养基以及浸染后的恢复培养基中均添加硫辛酸；根癌农杆菌浸染愈伤组织过程，是在愈伤组织切碎后立即加入菌液混合均匀；根癌农杆菌是携含目的基因、选择抗性基因和报告基因的植物表达载体质粒。本发明方法能有效抑制共培养后愈伤组织的褐化，操作简单易行，能获得稳定的转化效率。

Description

一种多年生黑麦草的遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的黑麦草(Lolium L.)遗传转化方法。

背景技术

黑麦草属植物中，广泛栽培的是多年生黑麦草(Lolium perenne L.)和一年生黑麦草(Lolium multiflorum L.)，在世界各地均有种植，在我国属于引进栽培。多年生黑麦草是优良的牧草和草坪草，因此利用转基因技术对其进行遗传改良，具有重要意义。

黑麦草属单子叶禾本科植物，对农杆菌不敏感，遗传转化非常困难。由于农杆菌介导的遗传转化具有不可替代的优越性，为获得转基因黑麦草，依然需要不断地优化和改进农杆菌介导的转化方法。在前期工作中，我们建立了一种根癌农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化方法，其关键在于预培养和共培养中添加了50mL/L新鲜无菌烟草汁。用该方法，获得了3个多年生黑麦草品种金牌美达丽、神枪手、多福的转基因植株【马欣荣博士论文，2006，四川大学；专利(马欣荣，CN200510020540.7ZL)】。由于获取50mL/L新鲜无菌烟草汁，其操作过程繁琐，所需要的烟草量大，并且受季节限制，因此我们探索用一种试剂替代烟草汁来改良转化培养基。

目前国内外有关根癌农杆菌介导的黑麦草遗传转化研究的报道较少。Bajaj等建立了一种效率较高的转化方法，但是操作过程及其繁琐，不适宜大规模的遗传转化【Bajaj S等，2006】。因此，探寻一种简化、行之有效的转化方法，非常必要。

单子叶植物如小麦、黑麦草的愈伤组织，在经过与农杆菌共培养后，常发生褐变坏死。这是农杆菌介导的黑麦草遗传转化的瓶颈。硫辛酸(α-Lipoic Aid)是一种强抗氧化剂，可以通过清除自由基、螯合金属离子、再生体内其它抗氧化剂来发挥抗氧化作用【张瓅文等，2009】。因此本发明中在切碎愈伤组织时、共培养、恢复培养中使用了硫辛酸，以增加愈伤组织抗氧化能力，减少褐化和死亡，获得稳定的转化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良的基于根癌农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化方法，为多年生黑麦草目的基因的转移、新材料的创造和培育，以及基因功能研究打下基础。

本发明提供了一种多年生黑麦草遗传转化的改良方法，包括如下几个步骤：愈伤组织诱导和继代培养、愈伤组织切碎、根癌农杆菌的培养、根癌农杆菌侵染愈伤组织、根癌农杆菌与愈伤组织共培养、恢复除菌培养、选择培养、分化再生培养、植株继代选择培养等步骤，其特征是：愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；愈伤组织在切碎的过程中、根癌农杆菌浸染愈伤组织时的培养基、根癌农杆菌与愈伤组织共培养的培养基以及浸染后的恢复培养基中均添加硫辛酸，硫辛酸的浓度在20-150mg/L能有效降低愈伤组织的褐化率，最适浓度为50-100mg/L；根癌农杆菌浸染愈伤组织过程，是在愈伤组织切碎后立即加入菌液混合均匀；根癌农杆菌是携含目的基因、选择抗性基因和报告基因的植物表达载体质粒。

具体而言，在本发明的方法中可以使用的黑麦草包括，例如，多年生黑麦草品种5个，多福、雅晴、顶峰、匹克、百舸，这些品种均可购自市场。取出这些黑麦草的成熟胚，在诱导培养基上诱导出愈伤组织。

将诱导出的愈伤组织与根癌农杆菌共同培养，进行愈伤组织的转化。可以使用新鲜诱导出的愈伤组织，也可以使用继代的愈伤组织。如果使用继代的愈伤组织，该愈伤组织是继代时间不超过3个月的愈伤组织。所述根癌农杆菌对黑麦草愈伤组织的转化是在愈伤组织切碎后立即加入菌液混合均匀，切碎过程是在添加了50-100mg/L的硫辛酸的液体共培养基上完成的。然后在无菌的含有50-100mg/L的硫辛酸、30g/L的麦芽糖、10/L的葡萄糖、100mg/L的维生素C、200μmol/L的乙酰丁香酮、3mg/L的2，4-D的MS培养基中，将所述根癌农杆菌和多年生黑麦草的愈伤组织于25℃黑暗下共同培养3天完成的。

在转化步骤完成后，本发明的方法进一步包括对转化后的愈伤组织进行恢复除菌培养7天的步骤。恢复培养过程中，培养基中添加50-100mg/L的硫辛酸。

硫辛酸的浓度在20-150mg/L能有效降低愈伤组织的褐化率。硫辛酸最适浓度为50-100mg/L，能使农杆菌浸染后愈伤组织存活率达到40-60％。

在恢复除菌培养步骤之后，本发明的方法还包括在一定的选择压力下进行继代选择培养的步骤。当所述根癌农杆菌所携带的质粒含有的选择抗性基因是新霉素磷酸转移酶基因(nptII)的情况下，所述的选择压力使用氨基糖苷类抗生素，可以选自巴龙霉素、G418、新霉素，其浓度为10-50mg/L培养基。本发明优选采用10-50mg/L的巴龙霉素作为选择压力。所使用的选择培养基中用琼脂粉作为凝固剂。

在继代选择培养步骤之后，本发明的方法还包括挑选出抗性愈伤组织，在再生选择培养基上使其分化和再生的步骤。在本发明的一个具体的实施方案中，所述再生选择培养基为含有30g/L的蔗糖、0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.1mg/L的2，4-D、100mg/L的特美汀和10-50mg/L的巴龙霉素的MS培养基。其中特美汀和巴龙霉素是在其它组分配好高压灭菌后，冷却至45-55℃时添加进去的。

结果，本发明采用从多年生黑麦草成熟胚诱导出来的愈伤组织，经带有植物表达载体的农杆菌侵染、抗生素筛选，获得了抗性植株。经PCR、GUS组织染色验证，表明获得了稳定表达的转基因黑麦草植株。

单子叶植物如小麦、黑麦草的愈伤组织，在经过与农杆菌共培养后，常发生褐变坏死。这是农杆菌介导的黑麦草遗传转化的瓶颈。硫辛酸(α-Lipoic Aid)是一种强抗氧化剂。转化过程中，在培养基中添加50-100mg/L硫辛酸能有效地降低愈伤组织的褐化，显著提高愈伤组织的成活率。在没有添加硫辛酸的培养基中，愈伤组织与农杆菌共培养后，90％以上发生褐化坏死；而在添加了50-100mg/L硫辛酸中，只有40-60％的愈伤组织发生褐化坏死，并且在恢复培养的过程中能较快使愈伤组织恢复正常生长，显著提高了农杆菌侵染后愈伤组织的存活率，从而获得稳定的转化效率。

该转化系统的建立，为定向进行分子设计改良黑麦草品种，打下基础。

本发明方法的优点：能在一定程度上有效抑制共培养后愈伤组织的褐化。操作简单易行，能获得稳定的转化效率。

附图说明

图1是双元载体质粒p23-iHCp表达盒示意图。该质粒携选择基因新霉素磷酸转移酶基因(npt II)、报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)和一个来自黑麦草花叶病毒的基因片段，这三个基因分别受花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35Sp)驱动。

图2是多年生黑麦草愈伤组织照片。

图3是从抗性愈伤中分化再生出的抗性植株的照片。

图4是转基因材料GUS组织染色的照片。深蓝色为转基因组织，黄色为非转基因或假阳性组织。1A野生型愈伤组织，部分愈伤组织呈浅兰色，1B为转基因愈伤组织；2A野生型植株根，2B为转基因植株根；3A野生型植株叶，3B为转基因植株叶。

图5是PCR扩增转基因植株中选择基因npt II；M Marker DL 2000；1阳性；2阴性；3-7转基因植株。

图6是PCR扩增转基因植株中目的基因HCp；M Marker DL 2000；1阳性；2阴性；3-9转基因植株。

图7是本发明转基因植株的照片。

具体实施方式

下面实施例用于本发明的进一步说明，但是这些具体实验是示例性的，不能将它们视为对本发明的限制。

一、硫辛酸对共培养后多年生黑麦草愈伤组织的影响

1.材料

选用多年生黑麦草品种多福(Tove)，购自市场。

根癌农杆菌菌株EHA105，具抗生素利福平(Rif)抗性，携双元载体质粒p23-iHCp，其中的表达盒示意图见图1。如图1所示，该质粒携选择基因新霉素磷酸转移酶基因(npt II)、报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)和一个来自黑麦草花叶病毒(RgMV)的基因片段HCp。gusA中含有2个过氧化氢酶内含子，使其不能在农杆菌中表达。其中gusA基因含有内含子，只有在其整合到真核生物基因组中后，才能表达。它的表达，可以确定外源基因是否整合到了植物基因组中。这3个基因均受花椰菜花叶病毒35S启动子启动，能在植物细胞中复制和表达，可直接导入农杆菌中转化植物。

2.方法

2.1黑麦草愈伤组织的诱导、培养

愈伤组织诱导、继代培养的方法基本与我们已经获得的专利“多年生黑麦草的遗传转化方法(CN200510020540.7ZL)”相同，但是将培养基的凝固剂将6mg/L琼脂粉替换成2.4g/L结冷胶。具体操作如下：

愈伤组织由成熟种子胚诱导(1个月)、继代培养(2次，1次/2周)后，选取生长致密、浅黄色愈伤组织用于转化。成熟胚诱导愈伤组织及其继代培养，方法如下：

①将黑麦草的成熟种子用70％(V/V)乙醇漂洗1min，然后浸泡于活性氯含量2-4％的次氯酸钠溶液中，振荡15min，之后用无菌水洗涤4-5次；

②无菌水中室温浸泡4-6hr；

③超净台上剥取成熟胚，接种于诱导培养基上，23℃-25℃暗培养；

④1个月后，将生长良好的愈伤组织置于继代培养基中培养，23℃-25℃暗培养；继代2次，1次/2周。

2.2农杆菌浸染愈伤组织

①农杆菌的培养

取液氮中甘油保存的菌液接种到含20μg/mL利福平，50mg/L卡那霉素的5ml LB(50ml三角瓶)中，28℃、200rpm培养过夜；取1mL培养过夜的菌液，转入20mL新配制的不加抗生素的浸染培养基于28℃、200rpm培养3-5hr至O.D值约0.6，即可用于转化。

②愈伤组织切碎、浸染及共培养

愈伤组织在培养皿中加入液体共培养基切碎成直径1-3mm的小块，立即加入适量上述农杆菌菌液混合均匀5min，取出愈伤组织置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，立即置于共培养基上25℃暗培养3天。在这个过程中，分别在培养基中添加0、20、50、75、100、150mg/L硫辛酸。不同浓度的处理，愈伤组织数均为100个。

③恢复除菌培养

共培养后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于恢复培养基上，无选择培养7天；培养基中分别添加相应浓度的硫辛酸。

2.3愈伤组织存活数统计

恢复培养后，统计褐化及存活的愈伤组织数，比较不同浓度的硫辛酸对农杆菌浸染后愈伤组织的影响。结果表明，在不添加硫辛酸的对照组中，90％以上发生褐化坏死，存活率仅为5-10％；而在分别添加了20、50、75、100、150mg/L硫辛酸中，愈伤组织褐化率降低，存活率增加，存活率分别为26％、49％、47％、52％、22％。并且在恢复培养的过程中能较快使愈伤组织恢复正常生长，显著提高了农杆菌侵染后愈伤组织的存活率。

表1.不同浓度硫辛酸(mg/L)对农杆菌浸染后愈伤组织的影响

因此，硫辛酸最适浓度为50-100mg/L。在进一步的实施例中，采用50mg/L硫辛酸。

二、最适浓度的硫辛酸在多年生黑麦草遗传转化中应用

1.材料

多年生黑麦草品种5个，多福(Tove)、雅晴、顶峰、匹克、百舸，购自市场和百绿国际草业有限公司。转化过程中用多福设立对照，比较50mg/L硫辛酸对转化效率的影响。

根癌农杆菌菌株EHA105，具抗生素利福平(Rif)抗性，携双元载体质粒p23-iHCp，其中的表达盒示意图见图1。如图1所示，该质粒携选择基因新霉素磷酸转移酶基因(npt II)、报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)和一个来自黑麦草花叶病毒(RgMV)的基因片段HCp。gusA中含有2个过氧化氢酶内含子，使其不能在农杆菌中表达。其中gusA基因含有内含子，只有在其整合到真核生物基因组中后，才能表达。它的表达，可以确定外源基因是否整合到了植物基因组中。

这3个基因均受花椰菜花叶病毒35S启动子启动，能在植物细胞中复制和表达，可直接导入农杆菌中转化植物。gusA基因(下文有时称为GUS基因)作为报告基因，在植物转基因研究中非常有用。GUS组织染色灵敏度很高，植物本身内源干扰很小，能准确鉴定转基因材料。愈伤组织和根，因为是浅黄色或白色，GUS染色后便于观察。并且对愈伤组织进行早期鉴定，可以减少后期的选择工作。成熟叶片染色后用95％乙醇脱色并保存。

2.方法

2.1黑麦草愈伤组织的诱导、培养

⑤将黑麦草的成熟种子用70％(V/V)乙醇漂洗1min，然后浸泡于活性氯含量2-4％的次氯酸钠溶液中，振荡15min，之后用无菌水洗涤4-5次；

⑥无菌水中室温浸泡4-6hr；

⑦超净台上剥取成熟胚，接种于诱导培养基上，23℃-25℃暗培养；

⑧1个月后，将生长良好的愈伤组织置于继代培养基中培养，23℃-25℃暗培养；继代2次，1次/2周。

2.2转化程序

④农杆菌的培养

⑤愈伤组织切碎、浸染及共培养

愈伤组织在培养皿中加入液体共培养基切碎成直径1-3mm的小块，立即加入适量上述农杆菌菌液混合均匀5min，取出愈伤组织置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，立即置于共培养基上25℃暗培养3天。在这个过程中，除对照组外，均添加50mg/L硫辛酸。

⑥恢复除菌培养

共培养后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于恢复培养基上，无选择培养7天；培养基中添加50mg/L硫辛酸。对照组不加硫辛酸。

⑦选择培养

将愈伤组织转移到含巴龙霉素的选择培养基上进行选择培养，3轮选择，每2周为一轮，巴龙霉素的浓度分别为：第一轮10mg/L，第二轮25mg/L，第三轮50mg/L。

⑧分化培养

经过选择，将抗性愈伤组织置于植株再生选择培养基上，25℃光照培养，光周期为16hr光照/8hr暗进行分化；此时可分别取来自不同克隆系的抗性愈伤部分组织进行GUS组织染色。

⑨植株培养

将分化出的抗性植株置于植株继代选择培养基上培养，至苗约10cm高，生根后，移至盆碎。

经过多次实验，优化出的培养基，在原有基础上有改进，见表1。

表2.农杆菌、组织培养及转化中使用的培养基

说明：若配制固体培养基，加6g/L琼脂粉或者2.4g/L结冷胶。巴龙霉素、特美汀、维生素C(VC)，过滤灭菌；乙酰丁香酮(AS)甲醇配制，无需灭菌；硫辛酸乙醇配制，无需灭菌。这些成份在培养基高压灭菌后加入。

2.3转化子鉴定

①GUS检测

GUS染液配制采用常规方法，配制50mL，配方如下：

0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0) 25mL

去离子水 18.5mL

0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆] 0.25mL

0.1mol/L K₄[Fe(CN)₆]3H₂O 0.25mL

0.5mol/L Na₂EDTA(pH 8.0) 1.0mL

10mg/mL 5-溴4-氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷酸/甲醇溶液 5mL

配制好后，分装，于-20℃避光保存。

0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)的配制详见‘分子克隆实验指南’。

GUS活性检测：将组织材料切成小块，浸入GUS染液中，37℃温育过夜显色。染成蓝色为转基因材料，未显色、与阴性对照相同的为非转基因材料。

②PCR检测

常规CTAB方法提取转化植株基因组DNA(王关林，2002)，进行外源基因PCR鉴定。根据npt II基因序列，设计1对引物扩增其片段，扩增片段长度为469bp；根据RgMV基因HCp片段序列，设计引物扩增目的基因片段，扩增片段长度为410bp。

扩增npt II基因片段引物：上游引物npt-1：5’-TCCGGCCgCTTGGGTGGAGAg-3’

下游引物npt-2：5’-CTGGCGCGAGCCCCTGATGCT-3’

扩增RgMV基因片段引物：

上游引物HCp-1：5’-TTGGAAAGGAAGATGAAAGGTGG-3’

下游引物HCp-2：5’-ATTCGGTTTTCCGCTCGTATG-3’

反应体系：见Takara商品目录2008-2009p E-7。

反应条件：预变性94℃5min，94℃30sec、58℃45sec、72℃45sec 35个循环，最后72℃5min。

3.结果

3.1愈伤组织的诱导

用上述诱导黑麦草愈伤组织的方法，诱导率可以达到50％以上，为转化的进行提供了材料保证。

3.2愈伤组织的继代培养

诱导后的愈伤组织，通常疏松、色泽浅。经过2-3次，1次/2周的继代培养后长成致密、奶黄色的具有良好分化能力的愈伤组织。为保证愈伤组织的分化能力和稳定的转化效率，最好使用不超过3个月的愈伤组织进行转化。图2示多年生黑麦草愈伤组织照片。

3.3转化及选择

在以前的研究中，愈伤组织切成直径约5mm的小块。在本研究中，将愈伤组织切成1-3mm的小块，增加了愈伤组织与农杆菌的附着面积。切碎及浸染过程中添加强抗氧化剂硫辛酸，防止了愈伤组织的氧化褐变。共培养及恢复培养过程中，亦添加了硫辛酸，有效防止了农杆菌浸染后造成的愈伤组织褐变坏死，降低褐变效率达到40-60％，并且在恢复培养的过程中能较快使愈伤组织恢复正常生长。

愈伤组织细胞获得npt II基因并表达后，即具有抗氨基葡萄糖苷类抗生素抗性，如抗巴龙霉素、G418、新霉素、卡拉霉素等。本研究中选用巴龙霉素进行筛选。由于转化细胞是极少数，选择压过大，可能造成非转化细胞及转化细胞均死亡。因此在首轮筛选中，巴龙霉素的浓度较低，为10mg/L，能抑制非转化细胞生长，但不会短期内杀死细胞。此时能让抗性的转化细胞较充分地生长。在第二轮、第三轮筛选中，逐渐增加巴龙霉素的浓度，分别为25mg/L、50mg/L，此时转化细胞的数量已经增多，能抵抗较高的选择压，而非转化细胞逐渐褐化死亡。

经过3轮筛选后，抗性愈伤组织转入植株再生选择培养基中进行分化，再生出抗性植株，见图3。如果假阳性从愈伤组织筛选中逃逸，在分化选择中将会进一步选择，非转基因植株根难以生长而被淘汰。

待植株长出根后即可转入盆钵中，置于温室培养。

3.4鉴定及获得转基因植株

GUS组织染色：从独立的抗性愈伤中分别取出部分组织进行染色；待植株成苗后，进行根及叶片GUS检测，蓝色为转基因材料，没染上色或者着色很浅的为阴性对照或假阳性，如图4所示。

PCR检测

PCR检测抗性试管苗HCp基因片段及npt II基因片段，扩增片段分别为410bp和469bp，能扩增出特异片段的是转基因植株，图5、图6所示。结果显示，获得了转基因植株，与GUS染色结果一致。图7示本发明中转基因植株照片。

对5种受试材料获得的转基因植株数进行统计，结果列入表3。

表3.50mg/L硫辛酸对多年生黑麦草转化效率的影响

到目前为止，从多年生黑麦草品种多福、雅晴、顶峰、匹克、百舸中均获得独立的转基因株系。尽管转化效率在1.0％～2.2％之间，但是能获得稳定的转化效率。与对照相比较，差异显著。在后来的三次重复中，均获得类似结果。

Claims

1.一种多年生黑麦草的遗传转化方法，包括愈伤组织诱导和继代培养、愈伤组织切碎、根癌农杆菌的培养、根癌农杆菌侵染愈伤组织、根癌农杆菌与愈伤组织共培养、恢复除菌培养、选择培养、分化再生培养、植株继代选择培养步骤，其特征是：愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；根癌农杆菌浸染愈伤组织时的培养基、根癌农杆菌与愈伤组织共培养的培养基以及浸染后的恢复培养基中均添加硫辛酸；根癌农杆菌浸染愈伤组织过程，是在愈伤组织切碎后立即加入菌液混合均匀；根癌农杆菌是携含目的基因、选择抗性基因和报告基因的植物表达载体质粒。

2.根据权利要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：

愈伤组织与农杆菌共培养的培养基成分为：MS基本培养基+麦芽糖30g/L+葡萄糖10g/L+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg/L+结冷胶2.4g/L+维生素C 100mg/L+乙酰丁香酮200μmol/L+硫辛酸20-150mg/L；pH 5.2；

恢复培养基为：MS基本培养基+麦芽糖30g/L+葡萄糖10g/L+2，4-D 3mg/L+结冷胶2.4g/L+维生素C 100mg/L+乙酰丁香酮200μmol/L+硫辛酸20-150mg/L+抗生素特美汀(Timentin)200mg/L；pH 5.8；

维生素C、乙酰丁香酮、硫辛酸和特美汀的添加时间为：培养基在15磅、15分钟蒸汽高压灭菌后，冷却至45-55℃时添加。

3.根据权力要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：培养基中添加20-150mg/L硫辛酸。

4.根据权力要求3所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：培养基中添加硫辛酸的浓度为50-100mg/L。

5.根据权力要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：共培养前，将愈伤组织切成直径1-3mm的组织块。

6.根据权力要求5所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：在添加了硫辛酸、不加凝固剂的液体共培养基中进行切碎愈伤组织。

7.根据权力要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：根癌农杆菌浸染愈伤组织过程，是在愈伤组织切碎后立即加入菌液混合均匀。