CN100381574C - 多年生黑麦草的遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本研究通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，对多年生黑麦草进行遗传转化。用从成熟胚诱导的愈伤组织进行转化。经带有抗生素抗性基因的农杆菌侵染、抗生素筛选，获得抗性植株。经PCR、GUS组织染色和Southern bloting验证，结果表明获得了稳定表达的转基因多年生黑麦草植株。该转化系统的建立，为定向进行分子设计改良黑麦草品种，打下基础。

Description

多年生黑麦草的遗传转化方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地讲，本发明涉及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)遗传转化

背景技术

广泛用作草坪草和牧草的黑麦草属(Lolium L.)植物主要为多年生黑麦草和一年生黑麦草，其栽培品种繁多。多年生黑麦草(Lolium perenne L.)原分布在亚洲、欧洲、北大西洋岛屿和北非的温带地区(Jauhar pp，1993)，现在世界各地均有种植，在我国属于引进栽培。其具有较强的耐践踏、抗寒能力，但对干旱、热的耐受能力较弱。优良黑麦草新品种的培育对于提高饲草产量和品质、提高对不良环境的抗性、以及改良天然草场、建立人工草地、保持水土、防风固沙、改善人类生态环境等都具有十分显著的作用。

黑麦草属单子叶禾本科植物，自交不亲和，这给其遗传改良带来困难(Spangenberg et al，1998)。因此人们探索利用生物技术对黑麦草进行遗传转化，以期获得高品质、农艺性状优良的品种(Spangenberg et al，edited by Y.P.S Bajaj，2000)。

通常人们认为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主(De Cleene and Deley，1976，Toyama Koichi，2002)，相当长时间内由农杆菌介导的单子叶植物遗传转化研究进展缓慢。由于根癌农杆菌对黑麦草侵染困难，所以对其进行转化通常用直接遗传转化法，如原生质体融合法、微粒轰击法(基因枪法)、碳硅纤维介导等方法(Spangenberg et al，1995，2000；Ye XD 1997；Dalton SJ，1999)。但这几种方法存在着难以克服的缺点：如原生质体融合法，转化效率低，原生质体及原生质体再生系统的建立十分困难，且无性系再生植株变异较大；基因枪法转化效率相对较高，但外源基因整合位点及拷贝数难以控制，外源基因的表达水平及遗传稳定性较差等(Hansen G，Wright MS，1999；王关林等，1998)。

近年来对禾本科作物转化已有很大突破，相继在水稻(Hiei，1994)、玉米(Ishida，1996)、小麦(Cheng，1997)、大麦(Tingay，1997)、甘蔗(Arencibia AD，1998)、高梁(Zhao Z-Y，2000)中获得了转基因植株，尤其在水稻上的研究最为深入。农杆菌介导的单子叶植物遗传转化研究重新成为热点(edited by Y.P.S Bajaj，2000)。但对大多数单子叶植物而言，仍处于探索阶段。包括玉米、小麦等的研究，转化方法研究、转化系统优化仍然是研究的重点(B.K.Amoah，etc，2001；Frame B.R，2002；Toyama Koichi，et al，2002 Review；T.Hu et.al，2003；H.Wu etal，2003；Anna P，2004)。

目前国内外有关根癌农杆菌介导的黑麦草遗传转化研究的报道极少。要建立高效的遗传转化系统，仍需探索、简化、优化转化条件，筛选敏感品种，以期获得较高的转化效率和稳定表达的转基因植株，为目的基因如抗旱基因的转移、抗旱新材料的获得奠定基础。

发明内容

本研究力图建立一种根癌农杆菌介导，简单易行、效率较高的多年生黑麦草遗传转化方法，为今后目的基因的转移、新材料的创造和培育打下基础。

本发明提供了一种多年生黑麦草(Lolium perenne L.)的改良方法，其包括采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对多年生黑麦草的愈伤组织进行转化，其中根癌农杆菌含有携带有目的基因和选择抗性基因的质粒，所述的愈伤组织是从多年生黑麦草的成熟胚诱导出来的。

具体而言，在本发明的方法中可以使用的多年生黑麦草包括，例如，爱神特(Accent)、德比(Derby)、超级德比(Supreme Derby)、金牌美达丽(Gold Medalist)、神枪手(Top Gun)、多福(Duofu)、绿宝石(Green Gem)，这些品种均可购自市场。取出这些黑麦草的成熟胚，在诱导培养基上诱导出愈伤组织。

将诱导出的愈伤组织与根癌农杆菌共同培养，进行愈伤组织的转化。可以使用新鲜诱导出的愈伤组织，也可以使用继代的愈伤组织。如果使用继代的愈伤组织，该愈伤组织最好是继代时间不超过半年的愈伤组织。所述根癌农杆菌对多年生黑麦草的愈伤组织的转化是在经灭菌的含有10-30g/L的麦芽糖、10-30g/L的葡萄糖、3-5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸的MS培养基中将所述根癌农杆菌和多年生黑麦草的愈伤组织于室温2-3天共同培养完成的。优选所述培养基中还含有约100mg/L的维生素C和200μmol/L的乙酰丁香酮。为了提高转化效率，还优选在所述的培养基中添加新鲜的无菌烟草叶片汁。

在转化步骤完成后，本发明的方法进一步包括对转化后的愈伤组织进行恢复除菌培养2-14天的步骤。优选进行恢复除菌培养7-14天。

在恢复除菌培养步骤之后，本发明的方法还包括在一定的选择压力下进行继代选择培养的步骤。当所述根癌农杆菌所携带的质粒含有的选择抗性基因是新霉素磷酸转移酶基因(npt II)的情况下，所述的选择压力可以选自百龙霉素、G418、新霉素、卡那霉素和庆大霉素，其浓度为25-100mg/L培养基。本发明优选采用50mg/L的卡那霉素作为选择压力。

在继代选择培养步骤之后，本发明的方法还可以包括挑选出分化能力强的抗性愈伤组织，在再生选择培养基上使其分化和再生的步骤。所述分化能力强的抗性愈伤组织往往为淡黄色致密的愈伤组织。在本发明的一个具体的实施方案中，所述再生选择培养基为含有30g/L的蔗糖、0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、100mg/L的特美汀和50mg/L的卡那霉素的MS培养基。其中特美汀和卡那霉素是在其它组分配好并灭菌之后添加进去的。

结果，本发明采用从多年生黑麦草的成熟胚诱导出来的愈伤组织，经带有抗生素抗性基因的农杆菌侵染、抗生素筛选，获得了抗性植株。经PCR、GUS组织染色和Southern bloting验证，结果表明获得了稳定表达的转基因多年生黑麦草植株。该转化系统的建立，为定向进行分子设计改良黑麦草品种，打下基础。

附图说明

图1是双元载体质粒pCAMBIA2301表达盒示意图。该质粒携选择基因新霉素磷酸转移酶基因(npt II)和报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)，此二基因受花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35Sp)驱动。

图2是根癌农杆菌介导的黑麦草基因转化技术路线图。

图3是多年生黑麦草愈伤组织照片。

图4显示经过2轮筛选后，大多数愈伤组织褐化死亡，如绿色箭头所示；部分抗性细胞生长成淡黄色致密的愈伤组织，白色箭头所指。

图5是从抗性愈伤中分化再生出的抗性植株的照片。

图6是本发明转基因植株的照片。

图7是抗性愈伤GUS组织染色的照片。蓝色为转基因愈伤组织，黄色为非转基因或假阳性愈伤植株。

图8是转基因植株根GUS组织染色的照片。蓝色为转基因愈伤组织，黄色为非转基因阴性对照。

图9是金牌美达丽抗性植株(9株)PCR检测结果的照片。扩增片段为469bp。1为隐性对照非转基因植株；2、12为阳性对照质粒pCAMBIA2301；3-11为转基因植株(9株)。

图10是神枪手(第1批)抗性植株(7株)PCR检测结果的照片。扩增片段为469bp。1为阳性对照质粒pCAMBIA2301；2为阴性对照非转基因植株；5、6、8、9为转基因植株(4株)；3、4、7为假阳性非转基因植株。

图11是神枪手(第2批)抗性植株(22株)PCR检测结果的照片。扩增片段为469bp。1为阳性对照质粒pCAMBIA2301；2为隐性对照非转基因植株；4、5、9、11、13-16、18-20、22为转基因植株(12株)；3、6-8、10、12、17、21、23、24为假阳性非转基因植株。

图12是多福(第1批)抗性植株(18株)PCR检测结果的照片。扩增片段为469bp。1为阳性对照质粒pCAMBIA2301；2为隐性对照非转基因植株；3-9、11-20为转基因植株(17株)；10为假阳性非转基因植株。

图13是多福(第2批)抗性植株(19株)PCR检测结果的照片。扩增片段为469bp。1为阳性对照质粒pCAMBIA2301；2为隐性对照非转基因植株；3-5、7-21为转基因植株(18株)；6为假阳性非转基因植株。

具体实施方式

1.材料

多年生黑麦草受试材料主要有爱神特(Accent)、德比(Derby)、超级德比(Supreme Derby)、金牌美达丽(Gold Medalist)、神枪手(Top Gun)、多福(Duofu)、绿宝石(Green Gem)，购自市场。

烟草品种，红花大金元成熟种子，可购自市场。用于提高转化效率。

根癌农杆菌菌株EHA105，具抗生素利福平(Rif)抗性，携双元载体质粒pCAMBIA-2301，其中的表达盒示意图见图1。如图1所示，该质粒携选择基因新霉素磷酸转移酶基因(npt II)和报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)，gusA中含有2个过氧化氢酶内含子，使其不能在农杆菌中表达。这两个基因均受花椰菜花叶病毒35S启动子启动，能在植物细胞中复制和表达，可直接导入农杆菌中转化植物。该质粒主要用于建立转化系统研究。pCAMBIA2301获得了澳大利亚国际农业分子生物学应用研究中心(CAMBIA)使用许可。

gusA基因(下文有时称为GUS基因)作为报告基因，在植物转基因研究中非常有用。自Jefferson从E.coli中分离克隆(1986)并作为标记基因应用于高等植物中(1987)以来，广泛应用于植物转基因研究。GUS组织染色灵敏度很高，植物本身内源干扰很小，因此能准确鉴定转基因材料。愈伤组织和根，因为是浅黄色或白色，GUS染色后便于观察。并且对愈伤组织进行早期鉴定，可以减少后期的选择工作。

2.方法

2.1黑麦草愈伤组织的诱导、培养

愈伤组织由成熟种子胚诱导(1个月)、继代培养(2次，1次/2周)后，选取生长致密、浅黄色愈伤组织用于转化。成熟胚诱导愈伤组织及其继代培养，方法如下：

1)将黑麦草的成熟种子用70％(V/V)乙醇漂洗1min，

2)然后浸泡于活性氯含量2-4％的次氯酸钠溶液中，振荡15min，之后用无菌水洗涤4-5次；

3)无菌水中室温浸泡4-6hr；

4)超净台上、解剖镜下剥开种子，取出成熟胚，纵向从正中间用解剖刀一分为二，接种于诱导培养基上，23℃-25℃暗培养；

5)1个月后，将生长良好的愈伤组织置于继代培养基中培养，23℃-25℃暗培养；继代2次，1次/2周。

2.2烟草无菌苗的培养

1)将烟草成熟种子用70％(V/V)乙醇漂洗1min；

2)然后浸泡于活性氯含量2-4％的次氯酸钠溶液中，振荡15-20min，之后用无菌水洗涤4-5次；

3)超净台上，接种于MS基本培养基上，20℃-25℃，光周期16hr光照培养/8hr暗培养。

4)萌发生长出无菌苗后待用。

经过多次实验，优化出如下培养基，见表1。

表1.农杆菌、植物培养及转化中使用的培养基

若配制固体培养基，加6g/L琼脂粉。抗生素、维生素C(VC)，过滤灭菌；乙酰丁香酮(AS)无需灭菌，甲醇配制，培养基高压灭菌后加入。

2.3转化程序

1)农杆菌的培养：

a.取-70℃甘油保存的菌液接种到含20μg/mL Rif，50mg/L卡那霉素的5ml LB(50ml三角瓶)中，28℃、200rpm培养过夜；

b.取200μL培养过夜的菌液，转入20mL新配制的不加抗生素的侵染培养基于28℃、200rpm培养3-5hr至O.D值约0.6，再加入1mL新鲜无菌烟草汁，即可用于转化；

2)愈伤组织预培养：愈伤组织切成直径约0.5cm的小块，在预培养培养基上培养过夜；

3)侵染：超净工作台上，将菌液倒入无菌培养皿(直径6cm)中，然后将愈伤组织放入菌液中浸泡5-20min；取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液；

4)共培养：将浸染过的外植体接种在共培养基上25℃暗培养2-3天；

5)恢复除菌培养：共培养后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于恢复培养基上，无选择培养7天；

6)选择培养：将愈伤组织转移到含卡那霉素50mg/L的选择培养基上进行选择培养，每2周继代1次，3-4轮选择；

7)分化培养：经过选择，将抗性愈伤组织置于植株再生选择培养基上，25℃光照培养，光周期为14hr光照/10hr暗进行分化；此时可分别取来自不同克隆系的抗性愈伤部分组织进行GUS组织染色；

8)植株培养：将分化出的抗性植株置于植株继代选择培养基上培养，至苗约10cm高，生根后，即可移至盆砵；

9)转基因植株鉴定。

3转化子鉴定

3.1GUS检测：

1)GUS染液配制(50ml)

0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)    25mL

去离子水                        18.5mL

甲醇                            5mL

0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆]            0.25mL

0.1mol/L K₄[Fe(CN)₆]3H₂O        0.25mL

0.5mol/L Na₂EDTA(pH 8.0)        1.0mL

5-溴4-氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷酸    50mg

配制好后，分装，于-20℃避光保存。

0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)的配制详见‘分子克隆实验指南’。

2)GUS活性检测：将组织材料切成小块，浸入GUS染液中，37℃温育过夜显色。染成蓝色为转基因材料，未显色呈自然色、与阴性对照相同的为非转基因材料。

3.2PCR检测

常规SDS方法提取转化植株基因组DNA(王关林，2002)，进行外源基因PCR鉴定。根据npt II基因序列，设计引物扩增其片段鉴定转基因植株。扩增片段长度为469bp。

上游引物：5’-TCCggCCgCTTgggTggAgAg-3’，

下游引物：5’-CTggCgCgAgCCCCTgATgCT-3’，

反应体系：见Takara商品目录2004-2005 p E-7。

反应条件：94℃ 5min

72℃ 7min

3.3 Southern杂交检测

基因组DNA10μg用限制性内切酶BamH I 37℃酶切3-5hr，0.8％琼脂糖凝胶电泳，碱变性，转移DNA至尼龙膜上，与地高辛标记的npt II基因探针杂交。操作见‘分子克隆实验指南’和宝灵曼Dig Nucleic acid Detection Kit试剂盒。

4.转基因植株T-DNA侧翼序列分析

通过连接接头，应用巢式PCR(nested-PCR)技术，采用大连宝生物试剂盒TaKaRa LA PCR^TM in vitro Cloning Kit，据T-DNA左右边界内序列各设计两条引物，扩增3株金牌美达丽转基因植株侧翼。操作见Takara 2004-2005年商品目录。

扩增左侧翼引物：LS1：5′-TCAGTACATTAAAAACGTCCGCA-3′

LS2：5′-CGTCCGCAATGTGTTATTAAGTT-3′

扩增右侧翼引物：RS1：5′-GATCAGATTGTCGTTTCCCG-3′

RS2：5′-TAGTCAGATCTGTCGTTTCCCGCCT-3′

结果

1.愈伤组织的诱导

在禾谷类转基因研究中，通常使用幼胚或幼穗或从它们诱导的愈伤组织进行转化，以期能获得较高的转化效率。但取材往往受季节的限制。并且黑麦草幼胚非常小，难于取得。从成熟胚诱导愈伤组织，既不受时间限制，又可以大量提供成熟胚供愈伤组织诱导和转化需要。成熟胚愈伤组织诱导率至少可以达到50％以上，为转化的进行提供了材料保证。

在试验中我们采用高浓度2，4-D(5mg/L)(Altpeter F，2000)，并将胚均分纵切，以利诱导。我们观察到，如果将完整胚直接接种于诱导培养基中，很容易生长出苗。表2是一组诱导率测试结果，不同品种诱导率至少可达50％以上。金牌美达丽、神枪手、多福，诱导率明显高于其他品种，可能是由于这3个品种种子较其他品种饱满。

表2.成熟种子胚诱导愈伤组织

2.愈伤组织的分化再生

诱导后的愈伤组织，通常疏松、色泽浅。经过2-3次，1次/2周的继代培养后长成致密、奶黄色的具有良好分化能力的愈伤组织。但随着继代时间的增加，分化能力降低，并且白化苗增多。黑麦草愈伤组织本身具有较强的再生力，研究表明，继代时间不超过6个月、生长良好、致密的愈伤组织通常都能分化再生出植株。见图3-图6。

3.转化子筛选和转基因植株的获得：

共培养及恢复培养后，未感菌的愈伤组织转入选择继代培养基进行筛选。植株细胞获得npt II基因并表达后，即具有抗氨基葡萄糖苷类抗生素抗性，如抗百龙霉素、G418、新霉素、卡拉霉素等。但如果抗生素对植物细胞毒性太大，在短期内很快杀死植物细胞，造成转化细胞难以存活。转化子的筛选优选用卡那霉素(50mg/L)进行。尽管卡那霉素筛选会有一些逃逸出去的假阳性植株，但可在后期的检测中进一步鉴定筛选。如果选用高浓度百龙霉素作选择剂，获得转基因植株的几率就很低。尽管卡拉霉素筛选会有一些愈伤组织逃逸而产生假阳性，但在后期的鉴定中可以再次筛选。因此在使用抗生素作筛选时，应选用植物细胞对其有一定的敏感性，但毒性又不能太大，这样能抑制非转化细胞的生长、发育，而转化细胞由于携带抗性基因能正常生长、分化，从而获得转基因植株。

7天之后部分愈伤组织开始褐化，而抗性细胞开始生长。经过2轮筛选，绝大多数愈伤组织褐化死亡，少部分抗性细胞生长成淡黄色、致密的愈伤组织，见图4。经过3-4轮筛选后，可以分别取抗性愈伤的一部分进行GUS组织染色鉴定，染成蓝色的为转基因愈伤组织，假阳性或非转基因愈伤组织仍为浅黄色，见图7。其他抗性愈伤组织转入植株再生选择培养基中进行分化，再生出抗性植株，见图5。如果假阳性从愈伤组织筛选中逃逸，在分化选择中将会进一步选择，非转基因植株根难以分化生长而被淘汰。

待植株长出根后即可转入盆钵中，置于温室培养。

到目前为止，只有金牌美达丽、神枪手、多福获得了转基因植株。至少可以证明这3种材料对农杆菌比较敏感。

4.烟草汁的影响

在转化中，加入或不加入烟草汁，均获得转基因植株，表明烟草汁的加入，不是必需的。但分析转化效率，结果表明在预培养、侵染和共培养中加入新鲜研磨的无菌烟草汁，可以提高转化效率。目前进行的转化中，转化效率最高可达4.3％。可能是由于烟草中含有多种能诱导和活化农杆菌的酚类物质，从而促进转化。

4.1GUS组织染色：对获得的抗性愈伤和抗性苗根进行组织染色，蓝色为转基因材料，没染上色的为阴性对照或假阳性。如图7、图8所示：

4.2PCR检测

PCR技术是快速检测外源基因行之有效的方法。筛选出的抗性植株进行PCR扩增npt II基因片段为阳性鉴定，即转基因植株能扩增出469bp的特异条带，而非转基因或假阳性植株不能。结果参见图9-图13。对三种受试材料获得的转基因植株数进行统计，结果列入表3。PCR结果与GUS染色结果一致，证明获得了转基因植株，外源基因已稳定整合到植物基因组中并表达。

表3.获得的转基因植株数

4.3 Southern-bloting：对正常生长的3株金牌美达丽转基因植株进行Southern杂交分析，结果表明2株为单拷贝，1株为两个拷贝。外源基因拷贝数低，有利于其稳定遗传和表达。这是农杆菌介导的遗传转化的重要优势。

5.转基因植株T-DNA侧翼序列分析

通过连接接头、巢式PCR，扩增正常生长的3株金牌美达丽转基因植株侧翼。已获得2个左侧翼序列。比对分析此2序列没有同源性，表明插入位点至少有2个。进一步将扩增右翼序列，分析结果，设计引物，分离克隆插入位点序列。这对寻找分子标记，从分子水平上筛选敏感材料提供快捷的方法。同时可分析T-DNA在黑麦草中的整合位点和方式。

虽然结合具体的实验对本发明的方法进行了说明，但是这些具体实验是示例性的，不能将它们视为对本发明的限制。本发明的范围由权利要求书界定。

Claims (1)

1.一种多年生黑麦草Lolium perenne L.的遗传转化方法，包括愈伤组织诱导和继代培养、愈伤组织预培养、根癌农杆菌侵染愈伤组织、根癌农杆菌与愈伤组织共培养、恢复除菌培养、选择培养、分化再生培养、植株继代选择培养，其特征是：愈伤组织诱导所用的材料是多年生黑麦草的成熟种子胚；根癌农杆菌侵染愈伤组织培养基、根癌农杆菌与愈伤组织共培养的培养基中均含新鲜无菌烟草叶片汁；根癌农杆菌是携带含目的基因的双元载体质粒的根癌农杆菌；各步骤所用培养基的组分如下：

愈伤组织诱导培养基：MS+麦芽糖30g/L+2，4-D 5mg/L，pH＝5.8，6g/L琼脂粉；高压蒸气灭菌15磅，15分钟；

愈伤组织继代培养基：MS+麦芽糖30g/L+2，4-D 3mg/L，pH＝5.8，琼脂粉6g/L；高压蒸气灭菌15磅，15分钟；

预培养培养基：MS+麦芽糖30g/L+葡萄糖10g/L+2，4-D 3mg/L，pH＝5.8，琼脂粉6g/L；高压灭菌后加入VC和AS，终浓度分别为100mg/L和200umol/L；

侵染培养基：成份同预培养培养基，但不加琼脂粉，为液体；

共培养培养基：成份同预培养培养基；

恢复除菌培养基：成份同愈伤组织继代培养基，高压灭菌后加入200mg/L的特美汀Timentin；

选择继代培养基：成份同愈伤组织继代培养基，高压灭菌后加入200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素；

植株再生选择培养基：MS+蔗糖30g/L+6-BAP 0.5mg/L+2，4-D0.1mg/L，pH＝5.8，琼脂粉6g/L，高压灭菌后加入100mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素；

植株继代选择培养基：MS+蔗糖30g/L+6-BAP 0.5mg/L+2，4-D

0.1mg/L，pH＝5.8，琼脂粉6g/L，高压灭菌后加入100mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素。

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