CN102174565A

CN102174565A - 一种水稻快速遗传转化的方法

Info

Publication number: CN102174565A
Application number: CN 201110040681
Authority: CN
Inventors: 江海洋; 张小辉; 朱苏文; 唐秀丽; 周玉琼
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2011-02-20
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明公开了一种水稻快速遗传转化的方法，在光照条件下培养水稻成熟种子诱导愈伤组织，选用初级愈伤组织作为农杆菌浸染的受体，直接在选择培养基上筛选获得抗性愈伤组织，抗性愈伤组织分化出抗性植株，炼苗、移栽获得转基因水稻。本发明大大缩短了水稻转基因的周期，比原有方法转化时间减少2个月左右。本发明简化了水稻遗传转化的步骤，采用30℃下全光照培养，不需要更换培养条件，简化流程，省时省力。本发明对水稻品种的依赖性不强，不仅对粳稻的转化适用，同时对籼稻的转化同样适用。

Description

一种水稻快速遗传转化的方法

技术领域

本发明是水稻转基因技术领，具体是利用水稻成熟胚初级愈伤组织进行农杆菌转化，大大缩短水稻转基因周期的方法。

背景技术

水稻既是一种重要的农作物，同时又是植物研究中的模式生物，自1984年世界上第一例转基因烟草取得成功以来，水稻的转基因工作一直成为科学家们努力的目标，直到1994年第一例农杆菌转化水稻才用确凿的证据证实取得了成功，水稻的农杆菌转化之所以起步很晚，主要是因为单子叶植物象水稻、玉米不是农杆菌的天然宿主，自然条件下农杆菌不能够浸染水稻，但是经过数十年的努力，转化方法和体系的不断优化，特别是在培养基中添加了酚类物质乙酰丁香酮（AS），使农杆菌转化水稻取得了成功。目前水稻已经成为研究植物遗传转化的模式植物，水稻转基因得到了很大的发展，为水稻和其他生物的功能基因组研究提供了强有力的工具。但是到目前为止，水稻的这种经典农杆菌介导转基因方法，都是从愈伤组织诱导开始，仍然需要5-6个月的时间，这个周期对于研究者来说是十分漫长的，转基因水稻工作还是一个长期、复杂的过程，并且转化效率很大程度上依赖于水稻的基因型，特别是中国广泛栽培的籼稻，大部分品种的遗传转化还是十分困难。另外对于对多个基因同步转化工作来说，常规的转化方法需要很大的空间以及转化成本都大大的增加，因此建立一种周期短，基因型依赖小的遗传转化方法将对水稻的遗传提供有力保障。

近些年来，已经有文献报道通过一些方法的改进可以缩短水稻农杆菌遗传转化的时间。但是这种遗传转化大部分针对一些较容易转化的品种,实验方法只限于少数一些品种，特别是对籼稻的转化比较困难，又或者是操作步骤复杂，并没有被广大研究者所接受和推广。但是对于从事水稻转基因工作的科研者来说，缩短转基因水稻的周期，不仅仅可以节省空间和实验成本，更可以大大减少实验工作量和加快实验进程。因为本实验室需要转化大量的表达载体，而且转化的品种又是一般的普感水稻品种，实验的性质需要一种快速的、便捷的农杆菌转化方法。

发明内容

本发明提供一种通过农杆菌浸染培养时间较短的愈伤组织，直接进行选择筛选培养，最后分化成苗的水稻快速遗传转化的方法。

本方法主要通过以下技术方案实现：一种水稻快速遗传转化的方法，在光照条件下培养水稻成熟种子诱导愈伤组织，选用初级愈伤组织作为农杆菌浸染的受体，直接在选择培养基上筛选获得抗性愈伤组织，抗性愈伤组织分化出抗性植株，炼苗、移栽获得转基因水稻。

包括以下具体步骤：

（1）首先剥去水稻种子颖壳，利用次氯酸钠和酒精对种子进行消毒；

（2）在光照条件下，在诱导培养基上诱导水稻成熟胚愈伤组织；

（3）在诱导8-12d后，初级愈伤组织直接作为农杆浸染的受体；

（4）在光照培养下，愈伤组织转移到选择培养基上继续培养；

（5）获得抗性愈伤组织，不经过继代培养，直接把抗性愈伤组织转入分化培养基；

（6）将产生抗性植株再进行生根培养，然后炼苗、移栽，即可获得转基因水稻植株。

作为本发明的优选方案，培养条件为30℃全光照。

在步骤（1）中用2.5%的次氯酸钠（含0.1%的吐温20），倒去消毒液，然后70%酒精消毒2min，无菌水洗4-6次。初级愈伤侵染后经30d潮霉素抗性筛选，获得的抗性愈伤组织直接进行分化培养30d。

与已有技术相比，本发明的优点体现在：

1.本发明大大缩短了水稻转基因的周期，常规的水稻转基因体系，一般经过30d的诱导，45d的继代培养，45d的选择和30d的分化培养，整个周期耗时150d左右，而本发明转化周期只需90d左右，比原有方法转化时间减少2个月左右。

本发明简化了水稻遗传转化的步骤，常规的水稻遗传转化，一般都是26℃下暗培养，然后再进行26℃光培养，比较繁琐，本发明采用30℃下全光照培养，不需要更换培养条件，简化流程，省时省力。

本发明对水稻品种的依赖性不强，不仅对粳稻的转化适用，同时对籼稻的转化同样适用。

具体实施方式

1.种子的消毒方法

用2.5%的次氯酸钠（含0.1%的吐温20），倒去消毒液，然后70%酒精消毒2min，无菌水洗4-6次。把不同消毒方法消毒后的种子分别放置在相同的YN诱导培养基上，然后在30℃全光照进行培养，5d后进行污染瓶数的统计，10d天后观察记录愈伤组织的诱导情况。升汞消毒后的种子，芽生长的很旺盛，但是愈伤组织却长的很小，有些种子没有形成愈伤组织，只是有绿苗出现。但是次氯酸钠消毒以后，大部分的种子都已经形成膨大的愈伤组织，种子萌发的芽苗已经萎缩，变的很小。同时对诱导率进行了统计，同时接种200粒种子，升汞消毒后的愈伤组织诱导率是42.9%，而次氯酸钠消毒后的诱导率是70.5%，两者差异十分显著。所以综合污染率和愈伤组织诱导率两种因素，选择2.5%次氯酸钠（添加0.1%吐温20）消毒15min、70%酒精消毒2min为适宜的消毒方式。所以在愈伤组织的诱导过程中，次氯酸钠与酒精的复合消毒更加彻底，可以显著减少污染。

2.转化体系所用的培养基

表1. 所用的培养基成分

培养基Media	组成（mg/L） Composition
		YN	N6+2，4-D2.5+CH500+Pro300+3%Sucrose+0.3%Phytagel， pH6.0
GN	N6+2，4-D 2 +CH1000+0.15%Sucrose+0.15%glucose+100uMAS+0.6%Phytagel， pH 5.6
		NGN	N6+2，4-D 2 +CH1000+0.15%Sucrose+0.15%glucose+100uMAS， pH 5.4
XFM	MS+6-BA2+KT2+IBA0.2+IAA0.2++CH1000+Cn500+Hn50+3%Sucrose+0.6%Phytagel，pH6.0
		FM	MS+6-BA2+KT2+IBA0.2+IAA0.2++CH1000+3%Sucrose+0.6%Phytagel， pH 6.0
GM	1/2MS+3%Sucrose+0.3%Phytagel， pH 6.0

注：CH 为水解酪蛋白，PRO为L脯氨酸，Cn为羧苄青霉素，Hn为潮霉素，AS乙酰丁香酮

水稻种子经过剥皮消毒后，接种在YN培养基上30℃进行持续光照培养，10d左右后挑取已经愈伤组织的种子与农杆菌进行浸染30min，其间在摇床上晃动，然后无菌滤纸吸干菌液，转入GN培养基，22℃黑暗培养3天。然后取出种子无菌水清洗5次，在含有羧苄青霉素的无菌水中摇晃30min后，取出愈伤无菌滤纸吸干水分。转入NGN培养基上，30℃进行持续光照培养。30d后挑取黄豆大小脱落的愈伤组织转入XFM培养基进行分化培养，15d后挑取愈伤组织转入FM培养基，待分化苗长至5cm左右时，把小苗移到GM进行生根培养，根系形成完全后，可进行炼苗和移栽到大田。

3.优化浸染的愈伤组织诱导时间

种子在诱导培养基上1d后就可以出现萌动，2d后种子周围出现淡黄色初级愈伤组织，随着培养天数增加,愈伤组织在不断的膨大，为了研究适宜的水稻初级愈伤组织的浸染效果和缩短转化的时间。种子消毒以后在诱导培养基诱导愈伤组织，选择诱导时间为2d，4d，6d，8d，10d，12d，然后挑取其愈伤组织分别用于农杆菌的浸染，其他培养条件相同，然后在30℃全光照进行培养，在选择培养一个月以后统计抗性愈伤组织出现的频率。结果显示，种子在诱导培养基上培养2d、4d时，浸染后选择培养没有得到任何抗性愈伤组织，其中8d-12d的可以形成抗性愈伤组织，其中诱导12d的愈伤组织浸染后抗性率最高，这说明8d-12d的愈伤组织最适宜于农杆菌的转化。

4.优化农杆菌菌液浓度

采用了植物转基因中最常用的三种农杆菌菌株LBA4404、AGL-1、EHA105，不同的农杆菌菌株对转化的效率有很大的影响，因此我们选择同样的培养条件，只有农杆菌菌株差异来进行遗传转化，以研究农杆菌菌株对快速浸染方法的影响。另外，菌液浓度对浸染效率也是一个重要的影响因素，因此以EHA105为菌株，用相同的悬浮培养液配制不同的农杆菌菌液浓度，OD值为0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，其他培养条件相同，用同样的状态的愈伤组织进行浸染，选择培养一个月左右，统计抗性愈伤组织的数目，筛选出适合的农杆菌菌液浓度。在农杆菌介导的水稻遗传转化过程中，农杆菌菌液浓度是一个非常重要的因素。参考其他人的研究，设置了6种不同的农杆菌菌液浓度，以籼稻Co39为浸染材料，成熟胚诱导10d为标准，光照培养下抗生素选择培养一个月，统计抗性愈伤组织的频率，抗性愈伤率从9%-16%。其中抗性愈伤率并不是随着OD值的增大而增大，农杆菌菌液OD值为0.6时，得到了较高的抗性愈伤率。

5. GUS基因表达的组织化学法检测

对该方法获得抗性植株进行转基因鉴定，将抗性愈伤组织或者抗性苗叶片放入GUS染色液（0.5mM的 K3Fe（CN）₆，0.5mM K ₄Fe（CN）₆，1M磷酸钠缓冲掖（pH7.0），10mM的EDTA，10%Triton X-100，1mM的X-Gluc），然后37℃水浴8h以上，观察愈伤组织或者叶片的颜色，然后70%酒精脱色24h。GUS染色能比较直观，有效的检测转基因植物，而且需要的材料少，对转基因植株本身影响较小。剪取的叶片是分化不久的幼嫩叶片，叶片的大部分都已经染成蓝色，说明GUS基因在叶片里已经表达，未经过转化的叶片染色没有蓝色，因为GUS染色的假阳性率几乎没有出现过。因此，对试管内的抗性苗检测，GUS染色是一种快速、准确的方法。

6.转基因植株的PCR检测

剪取一定量的转基因植株叶片，CTAB法提取基因组DNA，然后设计GUS基因引物，扩增GUS基因的特异性片段。在6个独立的转基因植株里都扩增出了唯一的片段，片段纯化以后进行测序分析，发现该片段确实是GUS基因的序列，同时未转化植株的PCR反应没有扩增出任何片段，可以说明GUS基因已经整合到水稻的基因组中，也可以证明目的基因整合到水稻基因组中。说明了该方法可以得到转基因的植株。

Claims

1.一种水稻快速遗传转化的方法，其特征在于，在光照条件下培养水稻成熟种子诱导愈伤组织，选用初级愈伤组织作为农杆菌浸染的受体，直接在选择培养基上筛选获得抗性愈伤组织，抗性愈伤组织分化出抗性植株，炼苗、移栽获得转基因水稻。

2.根据权利1所述的水稻快速遗传转化的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

3.根据权利1或2所述的水稻快速遗传转化的方法，其特征在于，培养条件为30℃全光照。

4.根据权利2所述的水稻快速遗传转化的方法，其特征在于，在步骤（1）中用2.5%的次氯酸钠，2.5%的次氯酸钠中含0.1%的吐温20，倒去消毒液，然后70%酒精消毒2min，无菌水洗4-6次。

5.根据权利2所述的水稻快速遗传转化的方法，其特征在于，初级愈伤侵染后经30d潮霉素抗性筛选，获得的抗性愈伤组织直接进行分化培养30d。