CN105255938A - 一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物生物技术中的植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法。本发明将预培养后的灯盏花无菌苗叶片外植体浸入携带重组质粒的C58C1发根农杆菌菌液中，经侵染、共培养及除菌处理后，将毛状根培养在含潮霉素B(Hyb)的筛选培养基上进行筛选，利用PCR扩增方法进一步鉴定携带目的基因的转基因发根后，液体培养基培养。采用本发明提供的技术方案，可将目的基因导入灯盏花，与聚乙二醇等化学方法的遗传转化相比，减少了原生质体分离和培养的环节；与基因枪等物理方法的遗传转化相比，不需要昂贵的仪器设备，且操作技术简单。

Description

一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根转化方法

技术领域

本发明属于植物生物技术中的植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法。

背景技术

植物细胞的遗传转化是植物基因工程的一个关键环节。自Abel等(1986)将烟草花叶病毒(TMV)衣壳蛋白cDNA导入烟草细胞，获得抗TMV病毒的转基因烟草植株后，先后发展了许多植物遗传转化方法和技术。

灯盏花Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand-Mazz.又名灯盏细辛、短葶飞蓬，是为菊科飞蓬属多年生草本植物。其主要有效成分为灯盏花素，即灯盏乙素和少量灯盏甲素的混合物。灯盏花素具有舒张血管、改善微循环、抑制血小板及红细胞聚集，治疗冠心病、心绞痛、肾衰和高血脂症等疾病等多种作用。但是作为云南最有发展前景的药物之一，却面临着种质退化的严峻挑战。因此，从处于代谢节点处的关键基因着手，改善灯盏花的种质，提高灯盏花素的含量成为亟待解决的问题。

目前尚未有灯盏花遗传转化体系建立的报道。

自1907年Smith和Townsend发现发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)能诱导植物形成毛状根(hairyroot)以来，迄今为止已经有160多种植物成功地利用Ri质粒进行了转化。例如：中国专利CN200910237579.2，申请公布号为CN102057868A，发明名称为“一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法”，公开了一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法：取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(ACCC10060)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。又如：中国专利申请CN201310603423.8，申请公布号为CN103695462A，发明名称为“一种甜叶菊毛状根诱导和培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的方法”，公开了一种采用转基因技术，用发根农杆菌侵染甜叶菊外植体，获得产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的甜叶菊毛状根的方法。

影响发根农杆菌转化成功的因素有很多，包括转化植株的种类、部位、生理状态；发根农杆菌的种类、细胞悬浮液密度；培养基组成和培养条件等等。

不同的植物要通过发根农杆菌诱导形成毛状根，以及以此为基础获得高品质的转基因植株还是要付出艰辛的工作的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过发根农杆菌诱导灯盏花形成毛状根的方法。

本发明提供了一种发根农杆菌C58C1介导的转基因灯盏花毛状根转化方法，本发明为了做到取材方便，直接用灯盏花无菌苗叶作为外植体，在此基础上建立了以叶片为外植体的发根农杆菌C58C1介导的灯盏花转基因毛状根遗传体系的方法，不仅减少所使用仪器的费用，使实验操作技术容易在普通实验室进行，而且也为今后利用转基因技术对灯盏花进行遗传改良提供了技术上的支持。

本发明选择的MS和B5培养基，是植物细胞工程的常用培养基，广泛地应用于植物组织培养，效果良好。本发明所用的植物培养基除培育无菌苗是以MS作为基础培养基外，其余均以B5为基本培养基，根据不同的培养期，特定地添加了不同种类、不同浓度的抗生素。

本发明是将预培养后的灯盏花叶片外植体浸入含有携带目的基因和筛选基因的重组质粒的发根农杆菌菌液中，具体的技术方案如下：

(1)提取携带目的基因的重组PHB-Flag质粒

将含有重组质粒的大肠杆菌Trans1-T1菌检、测序验证后，接种到含75mg/L卡那霉素(Kan)的LB液体培养基(配制试剂购自生工生物公司)中，在37℃、200rpm的条件下过夜培养；用质粒小提试剂盒(购自全式金生物公司)提取重组质粒。该方法属于一般分子生物学常规操作。

本发明所述目的基因可以依实验目的不同而不同，在本发明的具体实施例中以CHI(查尔酮异构酶基因)为例；也可选择CHS(查尔酮合成酶基因)、F3H(类黄酮3’-羟化酶基因)等目的基因。

本发明所述的筛选基因是指PHB-Flag质粒自身携带的潮霉素(Hyb)抗性基因。

(2)准备遗传转化使用的灯盏花外植体

将灯盏花种子用0.1％升汞消毒10min后，无菌水漂洗3-5次，用无菌吸水纸吸除残留水分，接种到MS培养基上，在温度25±1℃、光照强度4000lx、光周期为16h光照8h黑暗的条件下培养45-60天，获得灯盏花无菌苗。

将灯盏花无菌苗叶片剪成0.5-1cm²大小的叶盘，接种到预培养培养基上，在25±1℃条件下暗培养2天，作为遗传转化的受体。

培养灯盏花无菌苗的培养基为：MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。pH5.6-5.8；

叶盘预培养培养基为：B5+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。pH5.8-6.0。

(3)含携带目的基因CHI的PHB-Flag重组质粒的C58C1发根农杆菌工程菌的获得

将提取的重组质粒通过冻融法导入C58C1发根农杆菌中，再经抗生素抗性筛选及PCR菌检鉴定，获得含有重组质粒的发根农杆菌。

(4)灯盏花叶片外植体的遗传转化

将用含40mg/L利福平(Rif)(C58C1发根农杆菌抗性)和75mg/L卡那霉素(Kan)(PHB-Flag载体抗性)的YEB培养基活化培养至OD₆₀₀为0.6±0.1的C58C1发根农杆菌工程菌，室温下5000rpm离心10min，无菌条件下去上清，用等体积新鲜的含100μmol/L乙酰丁香酮(As)的B5液体培养基重悬菌体。28℃，100rpm振荡孵育30min后，将预培养好的叶盘在超净工作台中于菌液中浸染10min，期间不断轻轻摇晃使其浸染充分。取出外植体，用无菌滤纸吸除残留菌液，接种于共培养培养基，25℃，暗培养2天。

将共培养的外植体转移到除菌培养基上于25℃无光条件下进行除菌培养，待毛状根长出至2-3cm长后，将其剪下，连续转接至新的除菌培养基中，以除去发根农杆菌。

共培养培养基为：B5+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

除菌培养基为：B5+500mg/L，300mg/L，100mg/L头孢霉素(Cef)+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0。

(5)筛选培养转基因毛状根

将除菌完全，生长状况良好的毛状根转移至筛选培养基，25℃，暗培养至少15天。

筛选培养基为：B5+5mg/L潮霉素B(Hyb)+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

(6)PCR扩增鉴定毛状根

取在筛选培养基上仍然生长良好的毛状根一小段，用CTAB法提取总DNA，以此DNA为模板，进行PCR检测，鉴定是否含转入的目的基因CHI以及C58C1发根农杆菌特有的rolB、rolC基因。引物根据目的基因CHI和PHB-Flag表达载体以及农杆菌rolB、rolC特异序列设计。

目的基因CHI扩增引物为：

PHB-CHI-F:5’-CTCAAGCTTGGATCCATGGCTGCC-3’(SEQIDNO:1)

PHB-CHI-R:5’-CGATACCGTCACTAGTCAAACCATA-3’(SEQIDNO:2)

rolB基因扩增引物为：

rolB-F:5’-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3’(SEQIDNO:3)

rolB-R:5’-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3’(SEQIDNO:4)

rolC基因扩增引物为：

rolC-F:5’-TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3’(SEQIDNO:5)

rolC-R:5’-CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3’(SEQIDNO:6)

反应体系均为(20μL)：ddH2O7μL,TemplateDNA1μL,ForwardPrimer(10μM)1μL，ReversePrimer(10μM)1μL,2×rTaqPCRSuperMix10μL。

PCR反应条件为：94℃5min，35个循环(94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec)，72℃5min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolB的扩增条带大小为423bp，rolC为626bp，目的基因CHI为714bp(如图1)。

本发明所述的CTAB法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法，CTAB法能够提取植物基因组DNA，属于一般分子生物学常规操作。

本发明所述的PCR是“聚合酶链式反应”，是本领域技术人员公知的实验方法，根据PCR引物及PCR反应条件，本领域技术人员可依据常识和经验确定PCR反应体系，扩增出目的基因。

本发明提供了一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根转化方法，该方法是将预培养后的灯盏花叶片外植体浸入含有目的基因和筛选基因质粒的发根农杆菌菌液中，具体包括以下步骤：

a.将灯盏花种子用0.1％升汞消毒10min后，无菌水漂洗3-5次，吸除残留水分，接种到MS培养基上，在温度25±1℃、光照强度4000lx、光周期为16h光照8h黑暗的条件下培养45-60天，获得灯盏花无菌苗。从灯盏花无菌苗上剪取0.5-1cm²大小的叶盘，接种到预培养培养基上，25℃暗培养2天，作为遗传转化的受体；

所述MS培养基为：MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.6-5.8。

所述预培养培养基为：B5+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

b.挑取含有携带目的基因的表达载体的发根农杆菌单菌落，接种到1ml含40mg/L利福平(Rif)及75mg/L卡那霉素(Kan)的YEB培养基，于28℃，200rpm振荡培养12-14h后，从中取200μL菌液接种到30ml上述YEB培养基中，于28℃下，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6±0.1。常温下，5000rpm，离心10min，无菌条件下去上清，加30ml浸染培养基重悬菌体，28℃，100rpm振荡孵育30min；

所述浸染培养基为：B5+30g/L蔗糖+100μM乙酰丁香酮，pH5.8-6.0；

c.将步骤a中获得的叶盘外植体浸入步骤b中获得的发根农杆菌菌液中，浸染10min(一般不超过12min)，期间不断轻轻摇晃使浸染充分。

d.使用无菌滤纸吸除步骤c中外植体上的多余菌液，转移到共培养培养基上，25℃无光条件下共培养2天；

所述共培养培养基为：B5+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

e.步骤d获得的外植体转入除菌培养基上，进行除菌培养，开始时用B5+500mg/L头孢霉素(Cef)+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0的除菌培养基，之后，待毛状根长出至2-3cm长后，将其剪下，于新的含500mg/L头孢霉素的除菌培养基培养，若未溢菌，则每隔12-15天转移至新的除菌培养基，培养基其他成分不变，Cef浓度由之前的500mg/L降至300mg/L，再降至100mg/L，最后降至0mg/L(无抗)，直至除菌完全；

f.将步骤e所得的外植体转入筛选培养基中，培养至少15天后，将长势仍然良好的毛状根剪取一小段，采用CTAB法提取总DNA，以总DNA为模板PCR鉴定是否含rolB、rolC基因和目的基因CHI，所用特异性引物根据rolB、rolC基因序列和所转目的基因及载体设计；

所述筛选培养基为：B5+5mg/L潮霉素B(Hyb)+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

g.将步骤f中PCR鉴定为阳性的毛状根，转移至液体培养基中，于25℃，无光条件，100rpm振荡培养60-90天，期间每隔12-15天更换一次液体培养基；

所述液体培养基为：B5+30g/L蔗糖，pH5.8-6.0。

本发明所述的C58C1发根农杆菌含有携带目的基因CHI的PHB-Flag重组质粒。含有重组质粒的发根农杆菌是通过以下方法获得的：

将带有BamHI和SacI酶切位点的目的基因CHI和PHB-Flag表达载体通过BamHI和SacI两种限制性内切酶双酶切后，将CHI基因与PHB-Flag表达载体用T₄连接酶连接之后，对其进行测序，测序正确则载体构建成功。用冻融法将构建好的携带目的基因的表达载体导入C58C1发根农杆菌，经抗生素抗性筛选及PCR菌检鉴定，获得含重组质粒的发根农杆菌。

本发明所述的步骤c中将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的发根农杆菌中的步骤是，将预培养后的外植体浸泡于步骤b获得的C58C1发根农杆菌菌液中，不断轻轻摇晃使浸染充分，时间为10min(不超过12min)。

本发明所述方法中包括共培养诱导生出毛状根的步骤。

本发明所述步骤e中除菌培养基头孢霉素(Cef)浓度是逐步降低的，若在转移至下一梯度Cef浓度的新培养基后出现溢菌现象(毛状根周围出现水渍状菌斑)，则将毛状根用无菌水清洗，无菌滤纸吸除残留水分后，重新接回上一个Cef浓度的新除菌培养基。如在含300mg/LCef的脱菌培养基上出现溢菌现象，则将毛状根用无菌水清洗，吸除多于水分后，再置于含500mg/LCef的脱菌培养基上继续25℃无光培养。

本发明的方法也可应用于其他双子叶植物的转基因毛状根遗传转化体系。

本发明的有益效果是：

本发明是以灯盏花无菌苗叶为外植体建立的发根农杆菌介导的遗传转化系统，在较短时间内可培养出灯盏花转基因发根，所需设备简单，操作技术容易掌握。

附图说明

图1：毛状根PCR扩增鉴定，其中A为发根农杆菌特有的rolB、rolC基因；B为载体携带的目的基因CHI。

图2：液培生长，可用作后续分析的灯盏花毛状根。

图3：灯盏花毛状根诱导流程图。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：提取携带目的基因的重组质粒

将携带目的基因CHI的PHB-Flag重组质粒的Trans1-T1大肠杆菌活化后挑取单菌落于含75mg/L卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。采用质粒抽提试剂盒(碱裂解法)(试剂盒购自全式金生物公司)，参照其说明书提取重组质粒，得到纯化的重组质粒。

实施例2：发根农杆菌介导的遗传转化及转基因发根诱导

实施例中使用的MS和B5培养基购自PhytoTechnologyLaboratoties公司、YEB培养基配制试剂购自生工生物有限公司，蔗糖购自国药集团化学试剂有限公司，琼脂粉购自上海稼丰园艺用品有限公司。

本发明的方法如图3所示，该实施例所有操作均在无菌条件下进行，所述步骤与图3图片顺序对应。

1.将灯盏花种子用0.1％升汞消毒10min后，无菌水漂洗3-5次，吸除残留水分，接种到MS培养基上，在温度25±1℃、光照强度4000lx、光周期为16h光照8h黑暗的条件下培养45-60天，获得灯盏花无菌苗。

2.从步骤1获得的灯盏花无菌苗叶片剪取成0.5-1cm²大小的叶盘，接种到预培养培养基上，25℃暗培养2天，作为遗传转化的受体；

所述的预培养培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

3.挑取用冻融法转化获得的含有携带重组质粒的C58C1发根农杆菌单菌落，接种到1ml含40mg/L利福平(Rif)(C58C1发根农杆菌抗性)及75mg/L卡那霉素(Kan)(PHB-Flag载体抗性)的YEB培养基，于28℃，200rpm振荡培养12-14h后，从中取200μL菌液接种到30ml上述YEB培养基中，于28℃下，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6±0.1；常温下，5000rpm，离心10min，无菌条件下去上清，加30ml浸染培养基重悬菌体，28℃，100rpm振荡孵育30min；

所述的浸染培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+100μM乙酰丁香酮(As)，pH5.8-6.0；

将步骤2中获得的外植体叶盘无菌条件下浸入携带重组质粒的C58C1发根农杆菌菌液中，不断轻轻摇晃浸染10min；

4.用无菌吸水纸吸除步骤3中外植体上的多余菌液，转移到共培养培养基上，25℃无光条件下共培养2天；

所述的共培养培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

5.步骤4获得的外植体转入除菌培养基上，25℃无光条件进行除菌培养至长出毛状根。

所述的除菌培养基为：B5培养基+500mg/L头孢霉素(Cef)+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

6.待毛状根长出至2-3cm长后，将其剪下，于除菌培养基中25℃暗培养；若未溢菌，则每隔12-15天转移至新的除菌培养基，所述新的除菌培养基其他成分不变，头孢霉素(Cef)浓度呈梯度降低，即由刚开始的500mg/L先降至300mg/L，再降至100mg/L，最后降至0mg/L(无抗)，直至除菌完全；

若除菌培养过程中出现溢菌现象(即毛状根周围有水渍状农杆菌生长)，则将毛状根用无菌水清洗，吸除残留水分后，重新移至前一个头孢霉素(Cef)浓度的新的除菌培养基继续培养。如在含300mg/L头孢霉素(Cef)的脱菌培养基上出现溢菌现象，则将毛状根用无菌水清洗，吸除多于水分后，再置于含500mg/L头孢霉素(Cef)的脱菌培养基上继续25℃暗培养；

将脱菌完全的毛状根转入筛选培养基中，培养15天以上。将长势仍然良好的毛状根剪取一小段，采用CTAB法提取总DNA，以总DNA为模板PCR鉴定是否含C58C1发根农杆菌特有的rolB、rolC基因和目的基因CHI；

目的基因CHI扩增引物为：

PHB-CHI-F:5’-CTCAAGCTTGGATCCATGGCTGCC-3’

和PHB-CHI-R:5’-CGATACCGTCACTAGTCAAACCATA-3’

rolB基因扩增引物为：

rolB-F:5’-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3’

和rolB-R:5’-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3’

rolC基因扩增引物为：

rolC-F:5’-TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3’

和rolC-R:5’-CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3’

反应体系均为(20μL)：ddH2O7μL,TemplateDNA1μL,ForwardPrimer(10μM)1μL，ReversePrimer(10μM)1μL,2×rTaqPCRSuperMix10μL。

PCR反应条件为：94℃5min，35个循环(94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec)，72℃5min。

PCR反应结束后，将扩增产物在琼脂糖凝胶板中电泳。将琼脂糖凝胶板置于凝胶成像仪下，观察到与rolB、rolC基因及目的基因大小一致的条带，结果如图1所示，表明筛选获得的是由C58C1发根农杆菌诱导的含目的基因的毛状根。

所述的筛选培养基为：B5培养基+5mg/L潮霉素B(Hyb)+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

7.将步骤6中PCR鉴定为阳性的毛状根，转移至液体培养基中，于25℃，100rpm暗培养60-90天，期间每隔12-15天更换一次液体培养基，所述的液体培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖，pH5.8-6.0。

最终获得可供后续分析的毛状根。如图2所示。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根转化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a.从灯盏花无菌苗上剪取0.5-1cm²大小的叶盘，接种到预培养培养基上，25℃暗培养2天，作为遗传转化的受体；

所述的预培养培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

b.挑取含有携带目的基因的PHB-Flag表达载体的C58C1发根农杆菌单菌落，接种到1ml含40mg/L利福平及卡那霉素的YEB培养基，于28℃，200rpm振荡培养12-14h后，从中取200μL菌液接种到30ml上述YEB培养基中，于28℃下，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6±0.1；常温下，5000rpm，离心10min，无菌条件下去上清，加30ml浸染培养基重悬菌体，28℃，100rpm振荡孵育30min；

所述的浸染培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+100μM乙酰丁香酮，pH5.8-6.0；

c.将步骤a中获得的外植体叶盘浸入步骤b中获得的发根农杆菌菌液中；

d.吸除步骤c中外植体上的多余菌液，接种到共培养培养基上，25℃无光条件下共培养2天；

所述的共培养培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

e.步骤d获得的外植体转入除菌培养基上，25℃无光条件进行除菌培养，所述的除菌培养基为：B5培养基+500mg/L头孢霉素+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

待毛状根长出至2-3cm长后，将其剪下，于除菌培养基中25℃暗培养；若未溢菌，则每隔12-15天转移至新的除菌培养基，所述新的除菌培养基其他成分不变，仅头孢霉素浓度呈梯度降低，即由刚开始的500mg/L先降至300mg/L，再降至100mg/L，最后降至0mg/L，直至除菌完全；

若除菌培养过程中出现溢菌现象，则将毛状根用无菌水清洗，吸除残留水分后，重新移至前一个头孢霉素浓度的新的除菌培养基继续培养；

f.将步骤e所得的脱菌完全的毛状根转入筛选培养基中，培养15天以上，将长势仍然良好的毛状根剪取一小段，采用CTAB法提取总DNA，以总DNA为模板PCR鉴定是否含C58C1发根农杆菌特有的rolB、rolC基因和目的基因；

所述的筛选培养基为：B5培养基+5mg/L潮霉素B+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；

g.将步骤f中PCR鉴定为阳性的毛状根，转移至液体培养基中，于25℃，100rpm暗培养60-90天，期间每隔12-15天更换一次液体培养基；

所述的液体培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖，pH5.8-6.0。

2.根据权利要求1所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法，其特征在于，所述目的基因为查尔酮异构酶基因CHI。

3.根据权利要求2所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法，其特征在于，所述的含有携带目的基因的PHB-Flag表达载体的C58C1发根农杆菌是通过以下方法构建获得的：

将带有BamHI和SacI两个酶切位点的目的基因CHI和PHB-Flag表达载体都利用BamHI和SacI两种限制性内切酶双酶切,再将CHI用T₄连接酶与PHB-Flag表达载体连接之后，对其进行测序，测序正确则载体构建成功；

用冻融法将构建好的重组质粒导入C58C1发根农杆菌，经抗性筛选及PCR菌检鉴定，获得含有携带目的基因的PHB-Flag表达载体的C58C1发根农杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法，其特征在于，步骤a灯盏花无菌苗的获得方法如下：

将灯盏花种子用0.1％升汞消毒10min后，无菌水漂洗3-5次，吸除残留水分，接种到MS培养基上，在温度25±1℃、光照强度4000lx、光周期为16h光照8h黑暗的条件下培养45-60天，获得灯盏花无菌苗；

所述MS培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH5.6-5.8。

5.根据权利要求1所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法，其特征在于，所述的步骤c为，

将步骤a获得的外植体叶盘浸入步骤b中获得的发根农杆菌菌液中，不断轻轻摇晃使浸染充分，时间为10min左右，不超过12min。

6.根据权利要求2所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法，其特征在于，步骤f中以总DNA为模板PCR鉴定是否含C58C1发根农杆菌特有的rolB、rolC基因和目的基因的扩增引物如下：

目的基因CHI扩增引物为：

PHB-CHI-F:5’-CTCAAGCTTGGATCCATGGCTGCC-3’(SEQIDNO:1)

PHB-CHI-R:5’-CGATACCGTCACTAGTCAAACCATA-3’(SEQIDNO:2)

rolB基因扩增引物为：

rolB-F:5’-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3’(SEQIDNO:3)

rolB-R:5’-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3’(SEQIDNO:4)

rolC基因扩增引物为：

rolC-F:5’-TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3’(SEQIDNO:5)

rolC-R:5’-CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3’(SEQIDNO:6)。