CN101265481B

CN101265481B - 一种提高小麦成熟胚再生率的培养基及其根癌农杆菌转化方法

Info

Publication number: CN101265481B
Application number: CN2008101062584A
Authority: CN
Inventors: 叶兴国; 殷桂香; 王艳丽; 陶丽莉; 徐明星; 徐惠君; 杜丽璞; 王道文; 辛志勇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-05-09
Filing date: 2008-05-09
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2028-05-09
Also published as: CN101265481A

Abstract

本发明公开了一种提高小麦成熟胚再生率的根癌农杆菌介导的转化方法及其专用培养基。本发明所提供的提高小麦成熟胚再生率的根癌农杆菌介导的转化方法，包括下述步骤：1)将小麦种子灭菌后在无菌水中浸泡15-18小时，将浸泡后的小麦种子上的成熟胚刮碎后接种于预培养的培养基中，23-25℃的培养温度下黑暗培养7天；2)用目的根癌农杆菌侵染经过步骤1)处理的小麦成熟胚、进行共培养，将目的根癌农杆菌中的目标基因导入小麦成熟胚。利用上述农杆菌介导的转化方法将外源基因导入小麦中，经测定，用本发明的培养基及其转化方法，小麦成熟胚再生率得到提高。

Description

一种提高小麦成熟胚再生率的培养基及其根癌农杆菌转化方法

技术领域

本发明涉及一种提高小麦成熟胚再生率的培养基及其根癌农杆菌转化方法。

背景技术

到目前为止，小麦组织培养成功的外植体包括幼胚、幼穗、花药和成熟胚等，其中，幼胚再生最为容易，花药培养次之，成熟胚培养最难。所以，幼胚一直被认为是最理想的组织培养外植体材料，其愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高，迄今获得的转基因小麦基本上都是以幼胚作为外植体。而小麦幼胚的取材受时间、空间和季节的限制，合适的取材时期难以把握，所取材料的生理状态和发育阶段的一致性也无法保障，这在一定程度上制约了转基因小麦的应用；而小麦成熟胚取材方便，不受季节和植株发育阶段等因素的限制，能保证不同个体间生理状态的一致性，是研究小麦遗传转化最为方便实用的受体材料。

在成熟胚处理方面，不同研究者所采取的方式也不尽相同，如完整胚接种、胚乳支撑接种、成熟胚碎片组织接种和成熟胚切割接种等，其植株再生率最高为10％左右。在小麦成熟胚培养过程中，培养基和小麦的基因型是关键的影响因素，其中，激素作为培养基中必不可少的组分，对调节组织和细胞培养中胚状体的发生具有举足轻重的作用。国内外学者对小麦成熟胚组织培养中诱导培养基和分化培养基中所添加的激素的种类及其浓度进行了比较研究。其中，2，4-D是小麦成熟胚培养中应用最广泛的生长调节剂，每升培养基中添加2～8mg的2，4-D即能够诱导愈伤组织，但其具体浓度与成熟胚的培养方式密切相关。碎片组织和整粒切胚诱愈法一般用2mg/L的2，4-D，胚乳支撑法则以8mg/L的2，4-D为宜。高浓度2，4-D能有效抑制胚发芽，但对愈伤组织的分化不利；细胞分裂素KT在某种程度上能够拮抗高浓度2，4-D对愈伤组织分化的抑制作用，但对愈伤组织有一定的毒害作用。研究者们还发现，在成熟胚愈伤组织诱导的起始阶段2，4-D起着非常重要的作用，之后需降低2，4-D浓度或不添加2，4-D才更有利于胚性愈伤组织的产生。

相对于其他单子叶植物，小麦基因工程育种研究远远滞后。限制小麦转基因研究发展的首要因素是缺乏有效的受体材料及其再生体系。小麦幼胚虽然再生性能比较强，但在取材的时间和空间上受到很大的限制，适宜转化的生理状态对培养条件的要求比较严格，转化周期比较长。而小麦成熟胚则取材方便，生理状态一致，不受生长季节限制，是组织培养和遗传转化的理想外植体。另外，以小麦成熟胚作为遗传转化的受体，不但可以节省时间、空间和能源，提高工作效率，而且更经济、方便、实用。然而，小麦成熟胚的离体培养比较困难，再生率比较低。如何诱导小麦成熟胚产生高质量的愈伤组织及提高愈伤组织诱导率是小麦成熟胚转化的关键。探索小麦成熟胚处理方法，优化小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基和农杆菌转化方法，建立高频率再生体系，对小麦转基因研究将有巨大的推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高小麦成熟胚再生率的培养基。

本发明所提供的提高小麦成熟胚再生率的培养基是含有MS基本培养基的大量元素、MS基本培养基的微量元素、MS基本培养基的铁盐、B5基本培养基的维生素、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、AgNO₃、AS、MgCl₂、半胱氨酸、维生素C、水解酪蛋白、谷氨酰胺和Dicamba的固体培养基，所述培养基中葡萄糖的浓度为10-15g/L，所述培养基中甘露醇的浓度为0-15g/L，所述培养基中的山梨醇的浓度为0-15g/L，所述培养基中AgNO₃的浓度为0-8mg/L，所述培养基中AS的浓度为0-40mg/L，所述培养基中MgCl₂的浓度为0-1.75g/L，所述培养基中半胱氨酸的浓度为0-40mg/L，所述培养基中维生素C的浓度为0-100mg/L，所述培养基中水解酪蛋白的浓度为0-100mg/L，所述培养基中谷氨酰胺的浓度为0-500mg/L，所述培养基中Dicamba的浓度为1-3mg/L。

上述培养基中葡萄糖的浓度优选为12g/L、甘露醇的浓度优选为15g/L、山梨醇的浓度优选为15g/L、AgNO₃的浓度优选为4mg/L、AS的浓度优选为39mg/L、MgCl₂的浓度优选为0.75g/L、半胱氨酸的浓度优选为40mg/L、维生素C的浓度优选为100mg/L、水解酪蛋白的浓度优选为100mg/L、谷氨酰胺的浓度优选为5mg/L、Dicamba的浓度优选为2mg/L。

本发明的另一个目的是提供一种根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚的方法。

本发明所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚的方法，包括下述步骤：

1)将小麦种子灭菌后在无菌水中浸泡15-18小时，将浸泡后的小麦种子上的成熟胚刮碎后接种于上述培养基中，23-25℃的培养温度下黑暗培养7天；

2)用目的根癌农杆菌侵染经过步骤1)处理的小麦成熟胚刮碎组织、进行共培养，将根癌农杆菌中的目的基因导入小麦成熟胚刮碎组织。

上述培养温度优选为24℃，上述根癌农杆菌为含有目标基因的根癌农杆菌。

上述根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚的方法中还包括将经过共培养的小麦成熟胚刮碎组织进行诱导愈伤组织的步骤。

上述方法中还包括将得到的愈伤组织进行分化培养并进行生根的步骤。

利用本发明的培养基及其转化方法，成熟胚刮碎组织的再生率得到提高。其中，轮选987成熟胚刮碎组织的再生率为84％，邯6172成熟胚刮碎组织的再生率为46％，Bobwhite成熟胚刮碎组织的再生率为42％，郑9023成熟胚刮碎组织的再生率为34％，石4185成熟胚刮碎组织的再生率为34％，济麦20成熟胚刮碎组织的再生率为32％。

附图说明

图1为小麦轮选987成熟胚刮碎组织在Adi预培养培养基上的生长情况

图2为小麦轮选987的愈伤组织在XCFH分化培养基上的分化效果

图3为小麦邯6172的愈伤组织在XCFH分化培养基上的分化效果

图4为小麦Bobwhite成熟胚的愈伤组织与农杆菌共培养的情况

图5为小麦Bobwhite成熟胚抗性愈伤组织及其在XCFH分化培养基上的分化效果

图6为小麦Bobwhite T₀代转基因植株的PCR检测情况

图7为小麦Bobwhite T₁代转基因植株的Southern blot检测情况

具体实施方式

下述实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、农杆菌转化法转化小麦成熟胚

一、培养基的配制和灭菌

Adi培养基：10×MS大量100ml、100×MS微量10ml、200×MS铁盐5ml、B5基本培养基的维生素14mg(维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg)、MgCl₂ 0.75g、甘露醇15g、山梨醇15g，定容至950ml，然后调节pH至6.0，再加入琼脂8g，以上成分采用121℃高压湿热灭菌20分钟；均匀混合下面的几种成分：5mg谷氨酰胺、水解酪蛋白0.5g、葡萄糖12g、乙酰丁香酮(AS)39mg、B5基本培养基的维生素14mg、3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(Dicamba)2mg、AgNO₃ 4mg、半胱氨酸40mg和维生素C 100mg，定容至50ml，过滤灭菌后加入到上述高压灭菌后的培养基中。

Adi培养基的特点是去除了MS基本培养基中的有机成分，添加了B5基本培养基的维生素、甘露醇、山梨醇、AgNO₃、AS、MgCl₂、半胱氨酸、维生素C、水解酪蛋白和谷氨酰胺，用葡萄糖取代了蔗糖，用Dicamba取代了2，4-D。

WCCAg4培养基：10×MS大量10ml、100×MS微量1ml、200×MS铁盐0.5ml、麦芽糖40g、MgCl₂ 0.75g、乙磺酸(MES)1.95g，定容至975ml，然后调节pH至5.4，以上成分采用121℃高压湿热灭菌20分钟；均匀混合下面的几种成分：100×MS维生素10ml、谷氨酰胺0.5g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、100mg/ml维生素C 1ml、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)2.2mg、乙酰丁香酮(AS)39mg，定容至25ml，过滤灭菌后加入到上述高压灭菌后的培养基中；待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时，再加入过滤灭菌后的Dicamba 2mg和AgNO₃ 4mg。

愈伤组织诱导培养基IESDI2：10×MS大量100ml、100×MS微量10ml、200×MS铁盐5ml、100×MS维生素10ml、蔗糖20g，定容至1000ml，然后调节pH至6.0，再加入琼脂8g，以上成分采用121℃高压湿热灭菌20分钟；待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时，加入过滤灭菌后的AgNO₃ 4mg和Dicamba 2mg。

IESDI2培养基的特点是在MS培养基的基础上添加了AgNO₃，用Dicamba取代了2，4-D。

愈伤组织分化培养基XCFH：10×MS大量100ml、100×MS微量10ml、200×MS铁盐5ml、蔗糖30g、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、谷氨酰胺5mg、吲哚乙酸(IAA)0.2mg、琼脂8g，定容至1000ml，然后调节pH至6.0，121℃高压湿热灭菌20分钟。

二、农杆菌转化法转化小麦成熟胚

1、预培养

将以下基因型的小麦种子(轮选987、邯6172、郑9023、石4185、Bobwhite和济麦20，来自中国国家种质资源库)灭菌后在无菌水中浸泡15-18小时，用接种刀分别在各基因型的小麦种子上将成熟胚刮碎，然后接种在Adi培养基上，25℃黑暗条件下培养7天。小麦轮选987成熟胚刮碎组织在Adi预培养培养基上的生长情况如图1所示。

2、侵染

将携带有nptII基因的pBI121质粒转入根癌农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术有限公司)中，将得到的包含pBI121质粒的根癌农杆菌命名为C58C1-121。

挑取根癌农杆菌C58C1-121的单菌落接种到YEP液体培养基中，28℃条件下250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0。

将上述OD₆₀₀值为0.6-1.0的根癌农杆菌C58C1-121的菌液于室温条件下4500rpm离心10min收集，沉淀重悬于上述WCCAg4液体培养基中，将上述预培养的小麦轮选987、邯6172、郑9023、石4185、Bobwhite和济麦20的成熟胚刮碎组织分别放入重悬菌液中浸泡30min，期间轻轻摇动。

3、共培养

取出根癌农杆菌C58C1-121侵染后的小麦轮选987、邯6172、郑9023、石4185、济麦20和Bobwhite的成熟胚刮碎组织，分别置于无菌滤纸上，25℃黑暗条件下共培养3天。其中，小麦Bobwhite成熟胚经农杆菌C58C1-121侵染后的培养效果图4所示。

4、诱导抗性愈伤组织

分别将上述共培养后的小麦轮选987、邯6172、郑9023、石4185、济麦20和Bobwhite的成熟胚刮碎组织转移到每升培养基中补充10.0mg G418和250.0mg羧苄青霉素的IESDI2培养基上，25℃弱光条件下培养15天诱导抗性愈伤组织。

5、愈伤组织分化

将小麦轮选987、邯6172、郑9023、石4185、济麦20和Bobwhite的抗性愈伤组织分别转移到每升培养基中补充25.0mg G418和250.0mg羧苄青霉素的愈伤组织分化培养基XCFH中，25℃条件下进行分化培养。轮选987成熟胚愈伤组织在分化培养基XCFH上的分化情况如图2所示，邯6172成熟胚愈伤组织在分化培养基XCFH上的分化情况如图3所示，小麦Bobwhite成熟胚刮碎组织经农杆菌C58C1侵染后产生的抗性愈伤组织在分化培养基XCFH上的分化情况如图5所示。

6、生根培养

当从小麦轮选987、邯6172、郑9023、石4185、济麦20和Bobwhite的成熟胚抗性愈伤组织分化出的抗性再生芽高度达2-3cm时，分别转到生根培养基上，3周左右长出不定根，当不定根长到3-4cm时，取出植株，彻底清除根部培养基，移入土壤中培养。分别测定小麦轮选987、邯6172、郑9023、石4185、济麦20和Bobwhite的成熟胚刮碎组织的再生率(成熟胚刮碎组织的再生率指实验用成熟胚个数与再生植株数的百分比)。结果表明，轮选987成熟胚刮碎组织的平均再生率为84％，邯6172成熟胚刮碎组织的平均再生率为46％，Bobwhite成熟胚刮碎组织的再生率为42％，郑9023成熟胚刮碎组织的平均再生率为34％，石4185成熟胚刮碎组织的平均再生率为34％，济麦20成熟胚刮碎组织的平均再生率为32％。

7、转基因植株分子检测

培养抗性再生植株至分蘖-孕穗期，从叶片中提取其基因组DNA，并以其为模板，以5’-TCGGCAAGCAGGCATCGCCA-3’和5’-TGTTCCGGCTGT CAGCGCAG-3’为引物，扩增抗性再生植株中的nptII基因。PCR反应条件为：先94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，58℃复性30sec，72℃延伸1min 30sec，共计30个循环，最后再72℃延伸10min。对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，小麦Bobwhite的T₀代转基因植株的PCR检测情况如图6所示。其中，M为DNA分子量标准，1为携带有nptII基因的pBI121质粒的PCR扩增结果，2为未转基因的小麦Bobwhite的PCR扩增结果，3-9为小麦Bobwhite的T₀代转基因植株的PCR扩增结果。结果表明获得了476bp的PCR括增产物。

对小麦Bobwhite的T₁代转基因植株进行Southern blot检测，以nptII基因全长序列为探针。小麦Bobwhite的T₁代转基因植株的Southern blot检测情况如图7所示。其中，1-10为小麦Bobwhite的T₁代转基因植株的Southern blot检测情况，11为未转基因的小麦Bobwhite的Southern blot检测情况，12为携带有nptII基因的pBI121质粒的Southern blot检测情况。

Claims

1.根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚用培养基，是按照如下方法配制的：10×MS大量100ml、100×MS微量10ml、200×MS铁盐5ml、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、MgCl₂ 0.75g、甘露醇15g、山梨醇15g，定容至950ml，然后调节pH至6.0，再加入琼脂8g，以上成分采用121℃湿热灭菌20分钟；均匀混合下面的几种成分：5mg谷氨酰胺、水解酪蛋白0.5g、葡萄糖12g、乙酰丁香酮39mg、维生素B110mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸2mg、AgNO₃ 4mg、半胱氨酸40mg和维生素C 100mg，定容至50ml，过滤灭菌后加入到所述湿热灭菌后的培养基中，得到根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚用培养基。

2.一种根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚的方法，包括下述步骤：

1)将小麦种子灭菌后在无菌水中浸泡15-18小时，将浸泡后的小麦种子上的成熟胚刮碎后接种于权利要求1所述的培养基中，25℃的培养温度下黑暗培养7天；

2)用目的根癌农杆菌侵染经过步骤1)处理的小麦成熟胚、进行共培养，将目的根癌农杆菌中的目标基因导入小麦成熟胚。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述目的根癌农杆菌中含有目标基因。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将经过共培养的小麦成熟胚刮碎组织进行诱导愈伤组织的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将得到的愈伤组织进行分化培养的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括在所述分化培养后进行生根的步骤。