CN101063149B

CN101063149B - 农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法

Info

Publication number: CN101063149B
Application number: CN2007100555698A
Authority: CN
Inventors: 刘立侠; 李望丰; 王德利; 贾广和; 金太成; 申玉华; 常青; 马强; 殷东旭; 许守民
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2007-04-25
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2027-04-25
Also published as: CN101063149A

Abstract

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及苜蓿遗传转化方法。建立了两种苜蓿遗传转化方式，一是超声辅助农杆菌介导转化苜蓿下胚轴胚性愈伤的遗传转化方法，即以苜蓿下胚轴诱导的愈伤组织经过悬浮培养方式，超声辅助，在培养基中筛选体胚，由体胚萌发、发芽、生根，最后获得转化植株。二是农杆菌介导转化苜蓿幼嫩真叶遗传转化方式，以苜蓿幼嫩的真叶作为转化受体材料，用农杆菌介导转化，在愈伤诱导培养基中筛选，将抗性愈伤组织接种到分化培养基中诱导出体胚，体胚萌发、发芽、生根，获得转化植株。本发明克服了固体培养基培养下胚轴时获得的胚性愈伤不均一的弊端，也显著的提高了苜蓿的遗传转化效率，缩短了遗传转化周期。

Description

农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及苜蓿遗传转化方法

背景技术

苜蓿的遗传转化研究尽管已经开展了二十多年，但是，建立高效稳定的遗传转化体系一直是制约转基因苜蓿研究和应用的重要因素。在苜蓿的遗传转化中，体胚发生途径是苜蓿再生的主要途径。目前，报道的转基因苜蓿主要通过该途径获得，如Mckersied等(1996)年将Mn-SOD基因应用体胚转化途径转化了苜蓿获得了耐旱的苜蓿。Winicov等(1999)年应用体胚转化途径成功将Alfin1转录因子整合到苜蓿基因组中，获得了耐盐碱苜蓿。体胚再生途径有很多优点，如体胚分化数量大，可以获得大量的转化材料。其次，转化材料中形成嵌合体的几率小，减少后代的筛选纯化工作量。而且，体胚对于抗生素比较敏感，发生抗生素筛选逃逸的材料少等。但是，体胚发生途径也有其一定的弊端，比如体胚发生途径周期长，体胚培养程序复杂，不易掌握，体胚生长状态不均一，高浓度的抗生素严重抑制体胚的发育等。总的来说，体胚发生途径还是适用于苜蓿的遗传转化工作的。体胚发生途径的外植体来源主要包括子叶、真叶和下胚轴等，其中下胚轴和真叶的分化效率最好。研究表明，下胚轴不适合作为农杆菌的直接侵染受体，而下胚轴来源的胚性愈伤组织可以做为农杆菌侵染的优良受体；苜蓿的真叶因其组织体较大，能够对农杆菌有着较强的耐受能力，并且幼嫩的真叶又有较强的分化能力，所以，真叶也是一种优良受体。

发明内容

本发明主要目的是克服苜蓿转化频率低和周期长等制约苜蓿遗传转化效率的技术难题，提高苜蓿的遗传转化效率和缩短遗传转化周期。建立了两种苜蓿遗传转化方法，第一种是超声辅助农杆菌介导转化苜蓿下胚轴胚性愈伤的遗传转化方法，即以苜蓿下胚轴诱导的愈伤组织经过悬浮培养方式，获得高产和生长状态均一的苜蓿胚性愈伤作为转化受体材料，再应用超声辅助农杆菌介导转化胚性愈伤材料，然后在含有抗生素的分化培养基中筛选到具有抗性的体胚，由体胚萌发、发芽、生根，最后获得转化植株。第二种是农杆菌介导转化苜蓿幼嫩真叶遗传转化方法，即以苜蓿幼嫩的真叶作为转化受体材料，用农杆菌介导直接转化真叶，侵染过的真叶在含有抗生素的愈伤诱导培养基中筛选到具有抗性的愈伤组织，然后，将抗性愈伤组织接种到不含有抗生素的分化培养基中诱导出体胚，体胚萌发、发芽、生根，最后获得转化植株。

本发明技术方案是：

1.应用超声辅助农杆菌介导转化苜蓿下胚轴胚性愈伤的遗传转化方法：

1)以苜蓿下胚轴为外植体，在固体诱导培养基中诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织接种到液体诱导愈伤培养基中悬浮培养，诱导出大量的和均一的胚性愈伤；

2)以超声辅助农杆菌介导苜蓿的胚性愈伤，在含有抗生素的分化培养基中筛选到具有抗性的体胚；

3)体胚在萌发培养基中萌发出转化植株；

4)PCR和Southern blot方法检测转基因苜蓿植株。

2.农杆菌介导苜蓿幼嫩真叶遗传转化方法

1)以苜蓿幼嫩的真叶为外植体，农杆菌介导转化真叶，然后在含有抗生素的固体愈伤培养基中诱导出抗性愈伤组织；

2)将抗性愈伤组织接种到不含有抗生素的分化培养基中诱导出成熟的体胚；

3)体胚在萌发培养基中萌发出转化植株；

4)PCR和Southern blot方法检测转基因苜蓿植株。

本发明以苜蓿下胚轴为转化受体，在固体培养基中诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织接种到液体培养基中，悬浮培养出大量的、均一的胚性愈伤组织，再以该组织作为转化受体，以超声辅助农杆菌介导转化该受体。该方法克服了固体培养基培养下胚轴时获得的胚性愈伤不均一的弊端，也显著的提高了苜蓿的遗传转化效率，在超声辅助农杆菌介导转化中，瞬时转化效率可以达到46％，稳定表达效率可以达到15.4％。此外，该方法也显著缩短了苜蓿体胚转化周期，应用常规的直接转化下胚轴愈伤组织获得转化苗大约需要7-8个月的时间，而采用本发明的方法需要为5-6个月，即可以获得大量的转化植株。

本发明以苜蓿真叶为转化受体，经过农杆菌侵染后的真叶在含有较低浓度抗生素的愈伤培养基中诱导出愈伤组织，然后，将愈伤组织转到撤掉抗生素的分化培养基中进行分化。该方法适度的降低了愈伤培养基中的抗生素浓度，缩短了抗性愈伤组织的诱导周期，获得的抗性愈伤组织在不含抗生素的分化培养基中能够很快的分化出体胚来，这使常规的真叶遗传转化周期的7-8个月缩短为5-6个月，而且，真叶的遗传转化效率也高达13.5％。

具体实施方式

实施例1：

应用超声辅助农杆菌介导苜蓿下胚轴遗传转化方法

1材料：

1)苜蓿种子为公主岭1号，购于吉林省农业科学研究院。

2)菌株和质粒：农杆菌菌株LBA4404和转化载体pBI121均购自北京鼎国生物技术有限公司；含有目的基因SsNHX1(碱蓬的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因)的转化载体pBI121由东北师范大学生命科学学院保存和构建，能够公开获得。该目的基因和转化载体pBI121在美国NCBI数据库中收录号分别为AF370358和AF485783。

2方法：

1)苜蓿种子首先要经过细砂纸打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡处理10分钟，倒掉酒精后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％升汞处理20分钟，倒掉升汞用无菌水冲洗5-6次，最后将无菌种子接种到发芽培养基(Ms盐+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8)中，在25℃条件下，弱光培养1天。

2)待下胚轴长出时用手术刀将其切下，大约长度为0.5毫米左右，然后将下胚轴接种到固体诱导培养基(Ms盐+UM有机+CH2克+2.4-D2毫克/L+KT0.25毫克/L+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8)中培养20-30天左右，当愈伤组织生长成组织密实、颜色浅绿时为宜。

3)将合适的愈伤组织接种到液体诱导培养基(Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖，pH5.8)中悬浮培养，每间隔5-7天换一次新鲜的培养基，摇床转速维持在150转为宜，需要适当补充光照。大约20-30天左右时，大量的、均一的胚性愈伤组织生长成熟。

4)在含有目的基因的农杆菌LBA4404平板中挑取单菌落接种到3毫升YEB液体培养基中，过夜培养，再取1毫升转到50毫升的YEB液体培养基中培养，待生长到光密度值为0.6左右时，离心4000转，10分钟，收集菌体，待用。

5)收集菌体用共培养液体培养基(Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖，pH5.8)50毫升重悬两次。

6)将胚性愈伤组织10个为一批装到2.0毫升的小离心管中，管中盛有600微升液体共培养培养基(Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖，pH5.8)，将装有胚性愈伤组织的小离心管放到超声仪中，参数为100mHz处理8秒中，然后，快速将管中的液体培养基吸出，迅速加入1毫升的农杆菌重悬液，侵染30分钟。

7)将浸染过的胚性愈伤组织平放在半固体共培养基(Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖+0.4％琼脂，pH5.8)中暗培养3-5天，温度为25℃。

8)将共培养后的胚性愈伤组织接种到分化培养基(Ms盐+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升+卡那霉素50毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8)培养50-60天，胚性愈伤组织经过四个胚期生长成成熟的体胚。在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基。

9)将成熟的体胚外植体再转入萌发培养基(Ms盐+头孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58琼脂，pH5.8)中萌发。培养条件为25℃，18：6光周期。大约20-30天左右，体胚生长出完整地转化植株，当植株长到10厘米左右时炼苗移栽。

3结果：

1)本技术使用了150个苜蓿下胚轴作为外植体，共获得了468块均一的胚性愈伤组织，胚性愈伤组织的得率高达312％。

2)在超声辅助介导农杆菌转化中，其中Gus瞬时表达率为46％，远远高于对照的8％，外源基因的稳定表达也高达15.4％。

3)应用本技术也缩短了苜蓿的遗传转化周期，比传统的以子叶、真叶作为外植体直接侵染的方法的7-8个月，可以缩短到5-6个月。

4)提取转化材料嫩叶进行PCR扩增检测，证明外源基因已经整合到苜蓿基因组中。

实施例2：

农杆菌介导苜蓿真叶遗传转化方法

1材料：

1)苜蓿种子公主岭1号，购于吉林省农业科学研究院。

2方法：

1)苜蓿种子首先要经过细砂纸打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡处理10分钟，倒掉酒精后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％升汞处理20分钟，倒掉升汞用无菌水冲洗5-6次，最后将无菌的种子接种到发芽培养基(Ms盐+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8)中，在25℃条件下，培养4-5天，真叶刚刚展开为宜。

2)在含有目的基因的农杆菌LBA4404平板中挑取单菌落接种到3毫升YEB液体培养基中，过夜培养，再取1毫升转到50毫升的YEB液体培养基中培养，待生长到光密度值为0.6左右时，离心4000转，10分钟，收集菌体，待用

3)收集菌体用共培养液体培养基(Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖，pH5.8)50毫升重悬两次，然后用共培养液体培养基将农杆菌稀释3倍。

4)用剪刀将真叶剪下来，然后将真叶侵染到农杆菌中，侵染30分钟，然后，将将浸染过的真叶的远轴面放在半固体共培养基(成分：Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖，0.4％琼脂，pH5.8)中暗培养3-5天，温度为25℃。

5)将共培养后的真叶接种到含有抗生素的愈伤培养基(Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升+卡那霉素30毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8)培养50-60天后，抗性愈伤组织诱导出来。在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基。

6)将抗性愈伤组织接种到分化培养基(Ms盐+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8)培养50-60天，胚性愈伤组织经过四个胚期生长成成熟的体胚。在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基。

7)将成熟的体胚外植体再转入萌发培养基(Ms盐+头孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58琼脂，pH5.8)中萌发。培养条件为25℃，18：6光周期。大约20-30天左右，体胚生长出完整地转化植株，当植株长到10厘米左右时炼苗移栽。

3结果：

1)本技术使用了650个苜蓿真叶作为受体，共获得了72块抗性愈伤组织，抗性愈伤组织的得率高达11.1％。

2)在72块抗性愈伤组织中，其中来自68块愈伤中的植株为PCR阳性植株。

Claims

1.农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法，其特征是应用超声辅助农杆菌介导苜蓿下胚轴遗传转化方法：

应用材料：

1)苜蓿种子为公主岭1号；

2)菌株和质粒：农杆菌菌株LBA4404和转化载体pBI121均购自北京鼎国生物技术有限公司；含有目的基因：碱蓬的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SsNHX1的转化载体pBI121由东北师范大学生命科学学院保存和构建，能够公开获得；

具体步骤如下：

1)苜蓿种子首先要经过细砂纸打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡处理10分钟，倒掉酒精后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％升汞处理20分钟，倒掉升汞，用无菌水冲洗5-6次，最后将无菌种子接种到成份为Ms盐+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的发芽培养基中，在25℃条件下，弱光培养1天；

2)待下胚轴长出时用手术刀将其切下，大约长度为0.5毫米左右，然后将下胚轴接种到成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/L+KT0.25毫克/L+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的固体诱导培养基中培养20-30天，当愈伤组织生长成组织密实、颜色浅绿时为宜；

3)将合适的愈伤组织接种到成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖，pH5.8的液体诱导培养基中悬浮培养，每间隔5-7天换一次新鲜的培养基，摇床转速维持在150转为宜，需要适当补充光照，20-30天时，大量的、均一的胚性愈伤组织生长成熟；

4)在含有目的基因的农杆菌LBA4404平板中挑取单菌落接种到3毫升YEB液体培养基中，过夜培养，再取1毫升转到50毫升的YEB液体培养基中培养，待生长到光密度值为0.6左右时，离心4000转，10分钟，收集菌体，待用；

5)收集菌体用成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，pH5.8共培养液体培养基50毫升重悬两次；

6)将胚性愈伤组织10个为一批装到2.0毫升的小离心管中，管中盛有成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，pH5.8，600微升的共培养液体培养基，将装有胚性愈伤组织的小离心管放到超声仪中，参数为100mHz处理8秒钟，然后，快速将管中的液体培养基吸出，迅速加入1毫升的农杆菌重悬液，侵染30分钟；

7)将浸染过的胚性愈伤组织平放在成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+0.4％琼脂，pH5.8的半固体共培养基中暗培养3-5天，温度为25℃；

8)将共培养后的胚性愈伤组织接种到成份为Ms盐+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升+卡那霉素50毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8的分化培养基培养50-60天，胚性愈伤组织经过四个胚期生长成成熟的体胚，在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基；

9)将成熟的体胚外植体再转入成份为Ms盐+头孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58琼脂，pH5.8的萌发培养基中萌发，培养条件为25℃，18∶6光周期，20-30天，体胚生长出完整的转化植株，当植株长到10厘米左右时炼苗移栽。

2.农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法，其特征是农杆菌介导的苜蓿真叶遗传转化方法：应用材料：

1)苜蓿种子为公主岭1号；

具体步骤如下：

1)苜蓿种子首先要经过细砂纸打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡处理10分钟，倒掉酒精后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％升汞处理20分钟，倒掉升汞，用无菌水冲洗5-6次，最后将无菌的种子接种到成份为Ms盐+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的发芽培养基中，在25℃条件下，培养4-5天，真叶刚刚展开为宜；

2)在含有目的基因的农杆菌LBA4404平板中挑取单菌落接种到3毫升YEB液体培养基中，过夜培养，再取1毫升转到50毫升的YEB液体培养基中培养，待生长到光密度值为0.6时，离心4000转，10分钟，收集菌体，待用；

3)收集菌体用成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，pH5.8的共培养液体培养基50毫升重悬两次，然后用共培养液体培养基将农杆菌稀释3倍；

4)用剪刀将真叶剪下来，然后将真叶侵染到农杆菌中，侵染30分钟，然后，将侵染过的真叶的远轴面放在成分为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，0.4％琼脂，pH5.8的半固体共培养基中暗培养3-5天，温度为25℃；

5)将共培养后的真叶接种到含有抗生素的成分为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升+卡那霉素30毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8的愈伤培养基培养50-60天后，抗性愈伤组织诱导出来，在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基；

6)将抗性愈伤组织接种到成分为Ms盐+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8的分化培养基培养50-60天，胚性愈伤组织经过四个胚期生长成成熟的体胚，在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基；

7)将成熟的体胚外植体再转入成分为Ms盐+头孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58琼脂，pH5.8的萌发培养基中萌发，培养条件为25℃，18∶6光周期，20-30天，体胚生长出完整的转化植株，当植株长到10厘米时炼苗移栽。