CN102604985B - 一种农杆菌介导的胚性愈伤转化培育石竹转基因植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于观赏植物转基因技术领域，具体地，本发明涉及石竹转基因植株的培育方法。公开了一种农杆菌介导的，以石竹胚性愈伤为材料培育转基因石竹的方法，其步骤包括胚性愈伤的诱导、遗传转化、筛选再生、GUS染色检测和PCR检测。其特征在于，通过农杆菌介导将GUS报告基因和ACO目的基因导入受体石竹胚性愈伤中，对影响胚性愈伤转化的不同因素进行筛选，利用卡那霉素或潮霉素作为选择剂，对转化后的胚性愈伤进行筛选，通过GUS染色，PCR检测等辅助方法筛选得到转基因石竹植株。本发明为石竹遗传转化创新种质资源提供了新的技术平台。

Description

一种农杆菌介导的胚性愈伤转化培育石竹转基因植株的方法

技术领域

本发明属于观赏植物组织培养和遗传转化技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的胚性愈伤转化培育石竹转基因植株的方法。

背景技术

石竹属植物共有17种1亚种9变种，多为花卉产业、园林绿化及城市美化中的重要材料。其中石竹为多年生植物，常作一二年生栽培。国内外有关石竹的遗传转化是以叶片和幼嫩植株为受体，以幼嫩植株为受体，切去植株顶部即在顶芽部形成伤口，用微注射器吸取根癌农杆菌悬浮液注射在伤口上，该方法所取材料幼嫩，容易在转化感染过程中死去。而以叶片为受体再生率较低，且石竹叶片较小，农杆菌侵染前对叶片的处理较难，特别是将叶片划伤以利于菌液的侵染，划伤程度不易掌握，另外，农杆菌侵染时间不易控制，时间稍长则叶片易受伤害，时间过短则转化不易成功，即阳性植株不易获得。

胚性愈伤转化简单，并可大量繁殖以供转化使用，是一种理想的转化受体。有关石竹转化的研究报道较多，但是，以胚性愈伤为受体进行遗传转化获得转基因植株的研究还未见报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，针对遗传转化中的石竹受体材料难以成活、转化率低、侵染后的再生率低、侵染时间不易把握等，提供一种更加高效、简便的遗传转化获得转基因植株的方法。

本发明的技术方案如下所述。

一种农杆菌转化石竹胚性愈伤的方法，其步骤包括胚性愈伤诱导、遗传转化和植株鉴定，本发明的要点是，采用石竹花瓣或花丝为材料诱导胚性愈伤，采用诱导出的胚性愈伤作为遗传转化受体材料，经农杆菌侵染、共培养、选择培养、分化培养和生根培养，将GUS报告基因或ACO目的基因导入石竹胚性愈伤，利用卡那霉素或潮霉素对转化后的胚性愈伤进行筛选，通过GUS染色和PCR检测筛选得到转基因胚性愈伤和转基因植株；

其步骤如下：

1)将长度为7.0-8.5cm的石竹花蕾，放入垫有湿润滤纸的培养皿内，置于4℃冰箱中冷藏处理4-6d；

2)胚性愈伤诱导：将步骤1)冷藏处理后的花蕾，灭菌后置于超净工作台上剥出花瓣及花丝，接种于胚性愈伤诱导培养基上，诱导胚性愈伤；

3)侵染：将步骤2)诱导获得的胚性愈伤置于农杆菌菌液中进行侵染13-15min，期间每2-3分钟摇动一次；

4)共培养：将步骤3)中胚性愈伤从农杆菌液中取出，用无菌滤纸吸干，接入共培养培养基中；在26±1℃黑暗条件下培养4d；

5)选择培养：将步骤4)中共培养后的胚性愈伤转入选择培养基上，筛选3次，每月更换一次新鲜选择培养基，得到抗性胚性愈伤；

6)抗性芽分化及生根：将步骤5)得到的抗性胚性愈伤转移至分化培养基上诱导，得到抗性芽；将该抗性芽切下转移至生根培养基上使其生根，得到再生植株；

7)对步骤6)所得的转GUS基因或ACO目的基因胚性愈伤和植株进行GUS化学染色和PCR检测，验证获得的转基因胚性愈伤和转基因植株；

培养基组分及配比如下：

胚性愈伤诱导培养基：MS，附加2，4-D 2.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

胚性愈伤继代培养基：MS，附加蔗糖60g/L和琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

共培培养基：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；乙酰丁香酮1000umol/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

选择培养基-1：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；卡那霉素50mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

选择培养基-2：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；潮霉素5mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

分化培养基：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

生根培养基：MS，附加活性炭0.2g/L，蔗糖60g/L和琼脂9.0g/L；用蒸馏水定容至1L。

其中：

步骤5)所述的选择培养还包括：转GUS报告基因时所用的培养基为选择培养基-1；转ACO目的基因时所用的培养基为选择培养基-2。

更详细的技术方案如《具体实施方式》。

本方法具有以下优点：

1、本发明是在国内外首次利用石竹胚性愈伤转化获得石竹转基因植株，为今后石竹的遗传改良如利用转基因技术培育抗热(生物和非生物逆境)种质资源提供了新的技术平台。

2、本发明的受体材料易于获得，增殖效率高。石竹花期有大量的花蕾可供采集，花蕾可用升汞消毒，接种后容易脱菌；由花瓣或花丝诱导出的胚性愈伤，增殖容易。

3、转化效率高。胚性愈伤繁殖系数大，成苗容易，外源基因更容易侵入，在基因组中的稳定性也较好。

4、操作简便。叶盘法转化需将叶片划出伤口再进行侵染，但石竹叶片较小，划伤不易操作，叶片在侵染前的伤害过大，侵染后容易死亡。而用胚性愈伤进行转化，只需将愈伤团散开，既减少了对外植体的伤害，又更加简便省时。

5、本发明再生率高。该方法侵染后的愈伤即可进行增殖，增殖效率高，且增殖后的的再生效率高，达到31.5％以上。

6、转化植株纯合性高。经转化获得的植株嵌合体少，可为石竹的交育种提供丰富的种植资源。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是HPT(潮霉素磷酸转移酶)基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是GUS(β-葡萄糖苷酸酶)报告基因核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是ACO(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶)基因核苷酸序列。

图1：本发明技术路线。

图2：是本发明应用的一个报道的质粒pPI121的物理图谱。

图3：是本发明应用的表达载体pMACO1的物理图谱。

图4：本发明实施例中由花瓣或花丝诱导的愈伤组织。

图5：本发明的实施例中转化GUS报告基因，预培养0d、侵染5min、10min后黑暗条件下共培养4d后的瞬时表达结果。

图6：本发明实施例中胚性愈伤的不同状态：图6A是在选择培养基上的抗性愈伤；图6B是在选择培养基上，未转入基因的胚性愈伤褐化死亡的状态；图6C是抗性胚性愈伤的待分化状态；图6D是抗性胚性愈伤分化出芽，长成植株的状态。

图7：本发明实施例中转化GUS报告基因所得的阳性植株，提取其叶片的基因组DNA进行GUS报告基因的PCR检测结果。

图8：本发明实施例中转化ACO目的基因所得的阳性植株，提取其叶片的基因组DNA进行HPT基因的PCR检测结果。

图9：本发明实施例中转化ACO目的基因，潮霉素对石竹胚性愈伤成活率的影响。

具体实施方式

以下具体实施方式进一步定义本发明。

实施例1石竹胚性愈伤的诱导和继代

1)材料的采集和低温处理，在天气晴朗、干燥的上午9时左右，采集田间生长的长度为7.0-8.5cm的石竹花蕾，放入垫有湿润滤纸的培养皿内，置于4℃冰箱冷藏4-6d。

2)材料消毒与接种，将步骤1)的花蕾，先用洗衣粉水清洗，再置于自来水下流水冲洗1h左右，后在超净工作台上进行消毒处理。过程如下：首先，将花蕾置于70％的乙醇的三角瓶中浸泡1min，无菌水清洗2次；再用0.1％浓度的升汞消毒10-12min，此过程要不断轻轻摇动瓶体，以使花蕾与升汞液充分接触；然后再用无菌水冲洗3-5次，取出消毒过的花蕾置于无菌滤纸吸干水分，取花瓣或花丝作为外植体备用。

3)胚性愈伤诱导培养：将步骤2)的外植体花蕾接种于胚性愈伤诱导培养基上，该培养基组成如下：MS，附加2，4-D2.0mg/L；6-BA1.0mg/L；蔗糖30g/L；琼脂7.0g/L；pH5.8，在121℃的高压蒸汽下灭菌20min。培养条件：温度25±1℃，相对湿度50％～60％，光强2000～3000lux，光照/黑暗为16h/8h，得到石竹胚性愈伤。

将未达到胚性愈伤要求的材料转入新鲜的上述胚性愈伤诱导培养基上，使其发育成胚性愈伤，供周年使用。

实施例2 利用农杆菌介导方法将GUS报告基因转化石竹胚性愈伤

将实施例1获得的石竹胚性愈伤，用GUS报告基因作标记进行转化试验。具体步骤如下：

1)在超净工作台的无菌环境下，取实施例1的石竹胚性愈伤于灭菌的滤纸上，用镊子将其压碎，散开；挑取其中呈亮黄色、组织紧凑、颗粒性强的胚性愈伤作为转化的材料。

2)在超净工作台上将步骤1)获得的胚性愈伤接种于预培养培养基中，进行侵染前的预培养，培养条件为：温度25±1℃，相对湿度50％～60％，光强2000～3000lux，光照/黑暗为16h/8h。将预培养处理的胚性愈伤放入含有50ml农杆菌菌液(OD₆₀₀＝0.25)的锥形瓶(容积为100ml)中进行侵染13-15min，期间轻轻摇动瓶体，以使菌液与外植体充分接触，侵染结束后倒出菌液，将侵染过的胚性愈伤置于无菌滤纸上吸干多余菌液，再转移至共培培养基上进行共培养，培养条件：温度25±1℃，相对湿度50％～60％，黑暗条件培养4d。共培养后，将胚性愈伤接种于含有卡那霉素和头孢霉素(见后所述)的选择培养基中进行脱菌、筛选，之后进行分化培养。待诱导出不定芽之后，转移至生根培养基上进行生根诱导。对抗性植株进行筛选，从而获得候选基因抗性植株。

本实施例涉及的培养基组分及配比如下：

胚性愈伤诱导培养基：MS(为报道的常规MS培养基，内含MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、MS有机成分，即维生素和氨基酸，下同，为描述简洁，在本发明中以“MS”指代括号内所述的成分，为本领域常用表示方法)；附加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2.0mg/L；6-苄基氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L；蔗糖30g/L；琼脂7.0g/L；将上述成分配齐后用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min；备用。

胚性愈伤继代培养基：MS，附加蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；将上述成分配齐后用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min；备用。

预培养培养基：MS，附加6-BA 2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；将上述成分配齐后用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min；备用。

选择培养基-1：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；卡那霉素50mg/L；头孢霉素400mg/L；后用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min；备用。

共培培养基：MS，附加6-BA2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；乙酰丁香酮(简称：AS)1000umol/L；将上述成分配齐后用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min；备用。

分化培养基：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min；备用。

生根培养培养基：MS，附加活性炭0.2g/L；蔗糖60g/L；琼脂9.0g/L；将上述成分配齐后用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min；备用。

3)GUS表达检测：将步骤2)中共培养2-5d后的胚性愈伤放入GUS染液中，在培养箱中恒温37℃过夜，观察染色结果，此为GUS瞬时表达结果。之后每隔两周取受体材料进行染色观察(处理方法同第一次)，即为稳定表达结果。

GUS染色瞬时表达试验结果表明：以色泽亮黄，颗粒性强且紧凑的胚性愈伤组织侵染后的状态最佳；侵染时间10-13min的愈伤活性较高；共培养4d后的瞬时表达率最高。因此宜挑取颗粒性强、亮黄色的胚性愈伤组织进行10-13min的侵染，共培养4d，为最佳的转化方案。结果见表1。

表1浸染时间、共培养时间与瞬间表达结果关系统计表

4)PCR检测：用报道的CTAB法提取筛选后的阳性植株叶片的DNA，检测后稀释至适宜浓度，对GUS报告基因进行PCR扩增，以农杆菌质粒DNA作为阳性对照，以未转化的无菌苗DNA作为阴性对照。

PCR检测的引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-CACACCGATACCATCAGCGATC-3’

反向引物：5’-TCACCGAAGTTCATGCCAGTCC-3’

反应体系为：

去离子水         13.2μl

dNTP(2mM)        0.4μl；

Primer1(10mM)    0.5μl；

Primer2(10mM)    0.5μl；

10XBuffer        2.4μl

Taq酶(5U/L)      1μl；

模板DNA(20ng/μl)1μl；

总体积           20μl；

PCR循环反应参数：94℃变性4分钟，然后依次在94℃变性40秒，55℃复性40秒，72℃延伸40秒，循环30次后在72℃保温5分钟。PCR扩增产物在含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。

PCR扩增结果如图7所示，质粒DNA扩增出现预期大小的片段，未转化的植株基因组未出现PCR特异扩增片段，转基因植株经PCR扩增，均得到与质粒DNA扩增产物大小一样的片段，其中基因片段大小为431bp(见图7)(见序列表SEQ ID NO：2)。

实施例3 利用农杆菌介导的方法将反义ACO基因转化石竹胚性愈伤

将实施例1获得的石竹胚性愈伤，进行反义ACO基因(登录号为gi|520801|，见序列表SEQ ID NO：3)的转化实验。其步骤如下：

1)在超净工作台的无菌环境下，取实施例1的胚性愈伤于灭菌的滤纸上，用镊子将其压碎，散开；挑取其中呈亮黄色、组织紧凑、颗粒性强的胚性愈伤组织为转化的材料。

2)胚性愈伤潮霉素(Hyg)敏感性筛选：取步骤1)的胚性愈伤分别接种于6种预先设计的MS培养基中。这6种培养基均以MS为基本培养基(即MS)，附加6-BA1.0mg/L；NAA0.1mg/L；蔗糖30g/L；琼脂7.0g/L，pH5.8。在进行抗生素的浓度梯度筛选试验时，分别向所述的MS中附加Hyg 0mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L，每种处理3次重复，每重复接种20个愈伤，培养条件：温度25±1℃，相对湿度50％～60％，光强2000～3000lux，光照/黑暗为16h/8h，培养时间为40-45d。结果表明：在潮霉素浓度为5mg/L的条件下石竹胚性愈伤完全褐化，失去活性。

3)遗传转化：在超净工作台上将步骤1)获得的胚性愈伤置于已活化的反义ACO菌液(OD600＝0.25)中进行侵染，期间要不断轻摇使菌液与受体充分接触，10-13min后，倒出菌液将侵染后的胚性愈伤置于滤纸上吸干附着菌液，接种于共培培养基上，培养条件：温度25±1℃，相对湿度50％～60％，黑暗条件，共培养4d；后转入筛选培养基中，两周换一次培养基，抗性愈伤能在含有潮霉素和卡那霉素的选择培养基-2(MS，附加6-BA 2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；潮霉素(简称：Hyg)5mg/L+头孢霉素400mg/L；将上述成分配齐后用蒸馏水定容至1L；pH5.8；在121℃高压蒸汽下灭菌30min)中存活并分化出芽，非抗性愈伤很快褐化死亡。将筛选出的抗性胚性愈伤转入胚性愈伤分化培养基，待分化出芽后转入生根培养基进行生根培养。

4)转基因植株的检测：用报道的CTAB法提取阳性植株叶片的DNA，将所提DNA进行检测后加以稀释，根据表达载体上的HPT基因设计引物，进行特异PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。

正向引物：5’-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3’

反向引物：5′-GAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′

反应体系为：

去离子水          19μl；

dNTP(2mM)         0.5μl；

Primer1(10mM)     0.5μl；

Primer2(10mM)     0.5μl；

10XBuffer         2.5μl；

Taq酶(5U/L)       1μl；

模板DNA(20ng/μl) 1μl；

总体积            25μl；

PCR循环反应参数：94℃变性4分钟，然后依次在94℃变性40秒，55℃复性40秒，72℃延伸40秒，循环30次后在72℃保温5分钟。PCR扩增产物在含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。

PCR扩增结果如图8所示，扩增出现预期大小的片段，未转化的植株基因组未出现PCR特异扩增片段，转基因植株经PCR扩增，均得到与HPT基因扩增产物大小一样的片段，其中基因片段大小为730bp(见图8，其序列见序列表SEQ ID NO：1)。

附录说明：

MS培养基参考沈海龙主编，《植物组织培养》第45-48页，中国林业出版社出版。该培养基是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是一种用于植物组织培养的经典培养基。其特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。

MS培养基基本配方：大量元素、微量元素、铁盐、有机成分(维生素和氨基酸)。

GUS染色检测表达采用组织化学染色法。GUS染色液的基本配方为(王关林，方宏筠.2002，植物基因工程.科学出版社)，具体配比如下：

(1)X-Gluc  50mg；

(2)50mmol磷酸缓冲液80ml(从A、B混合液中取)

A：NaH₂PO₄·2H₂O  3.12g加蒸馏水定容至100ml；

B：Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g加蒸馏水定容至100ml；

从A、B液中分别取39ml和61ml混合定容至400ml；PH调至7.0；

(3)20％甲醇           20ml；

(4)0.5mol EDTA        2ml；

(5)1％Triton X-100    1ml；

(6)双蒸水定容至100ml。

Claims (1)

1.一种农杆菌转化石竹胚性愈伤的方法，其步骤包括胚性愈伤诱导、遗传转化和植株鉴定，其特征在于，采用石竹花瓣或花丝为材料诱导胚性愈伤，采用诱导出的胚性愈伤作为遗传转化受体材料，经农杆菌侵染、共培养、选择培养、分化培养和生根培养，将GUS报告基因或ACO目的基因导入胚性愈伤，利用卡那霉素或潮霉素对转化后的胚性愈伤进行筛选，通过GUS染色和PCR检测筛选得到转基因胚性愈伤和转基因植株；其步骤如下：

1)将长度为7.0-8.5cm的石竹花蕾，放入垫有湿润滤纸的培养皿内，置于4℃冰箱中冷藏处理4-6d；

2)胚性愈伤诱导：将步骤1)冷藏处理后的花蕾，灭菌后置于超净工作台上剥出花瓣及花丝，接种于胚性愈伤诱导培养基上，诱导胚性愈伤；

3)侵染：将步骤2)诱导获得的胚性愈伤置于农杆菌菌液中进行侵染13-15min，期间每2-3分钟摇动一次；

4)共培养：将步骤3)中胚性愈伤从农杆菌液中取出，用无菌滤纸吸干，接入共培培养基上；在26±1℃黑暗条件下培养4d；

5)选择培养：将步骤4)中共培养后的胚性愈伤转入选择培养基上，其中转GUS报告基因所用的培养基为选择培养基-1，转ACO目的基因所用的培养基为选择培养基-2，筛选3次，每月更换一次新鲜选择培养基，得到抗性胚性愈伤；

6)抗性芽分化及生根：将步骤5)得到的抗性胚性愈伤转移至分化培养基上诱导，得到抗性芽；将该抗性芽切下转移至生根培养基上使其生根，得到再生植株；

7)对步骤6)所得的抗性芽和再生植株以及步骤5)所得的胚性愈伤进行GUS化学染色和PCR检测；

培养基组分及配比如下：

胚性愈伤诱导培养基：MS，附加2，4-D2.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

共培培养基：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；乙酰丁香酮1000umol/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

选择培养基-1：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；卡那霉素50mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

选择培养基-2：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；潮霉素5mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

分化培养基：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

生根培养基：MS，附加活性炭0.2g/L，蔗糖60g/L和琼脂9.0g/L；用蒸馏水定容至1L。

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