CN103387954A - 用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基、试剂盒及其用途，其中该培养基包含：愈伤组织诱导培养基，其为添加了0.1mg/L KT、0.05mg/L 2,4-D和1.5g/L gelrite的MSB培养基；胚性愈伤组织诱导培养基，其为添加了1.9g/L KNO₃和2.0g/L gelrite的MSB培养基；以及胚性愈伤组织增殖培养基，其为添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和1.8g/L gelrite的MSB培养基。利用本发明的培养基制备棉花尤其是陆地棉的胚性愈伤组织，能够显著提高出愈率和胚性愈伤组织发生率，减少畸形胚的发生，且胚性愈伤组织的增殖量非常大。

Description

用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基、试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及棉花再生体系的建立及棉花转基因技术领域，具体地，本发明涉及用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基、试剂盒及其用途。更具体地，本发明涉及用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基、试剂盒及其用途、制备棉花胚性愈伤组织的方法、制备棉花再生植株的方法以及制备转基因棉花植株的方法。

背景技术

棉花作为世界性重要的经济作物，其遗传改良工作一直倍受世人关注。然而，棉花再生体系的建立是制约棉花转基因技术能否成功的关键。现阶段，棉花的组织培养，以及通过体细胞胚胎发生和植株再生依然比较困难，这主要表现为其对基因型的依赖性强﹑从愈伤组织高效率地转化为胚性愈伤组织过程复杂、周期长﹑胚发生率很低、再生品种少、畸形苗多、生根困难、基因转化率低和转基因棉花农艺性状的变异等限制因子。上述限制因子使得目前的棉花转基因育种研究的发展只能依赖转化效率及遗传稳定性均不够理想的花粉管通道法。因此建立一个高效、优良的棉花再生体系是促进转基因技术在棉花育种中广泛应用的先决条件。

陆地棉种植面积占全球棉花种植面积的90%以上，其以色泽洁白、纺纱品质较好而深受纺织企业及消费者青睐。新疆是我国最大的陆棉种植基地，其棉花产量占到全国棉花产量40%以上。但是，由于水资源短缺乏，气候极易造成土地的沙漠化、盐碱化等种种原因，目前新疆棉花的可持续发展受到了严重的限制。因而，陆地棉再生体系的建立和优化，以及遗传改良意义重大。然而，棉花尤其是陆地棉的再生体系的建立和转基因植株获得的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种建立棉花尤其是陆地棉的再生体系的手段。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一组用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含：愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基为添加了0.1mg/L KT、0.05mg/L2,4-D和1.5g/L gelrite的MSB培养基；胚性愈伤组织诱导培养基，所述胚性愈伤组织诱导培养基为添加了1.9g/L KNO₃和2.0g/L gelrite的MSB培养基；以及胚性愈伤组织增殖培养基，所述胚性愈伤组织增殖培养基为添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和1.8g/L gelrite的MSB培养基。由此，利用本发明的培养基制备棉花尤其是陆地棉的胚性愈伤组织，能够显著提高出愈率和胚性愈伤组织发生率，减少畸形胚的发生，且胚性愈伤组织的增殖量非常大。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种用于制备棉花胚性愈伤组织的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的一组培养基。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒制备棉花尤其是陆地棉的胚性愈伤组织，能够显著提高出愈率和胚性愈伤组织发生率，减少畸形胚的发生，且胚性愈伤组织的增殖量非常大。

根据本发明的第三方面，本发明提供了前面所述根据本发明实施例的一组培养基和试剂盒在制备棉花胚性愈伤组织中的用途。如前所述，发明人发现，利用本发明的培养基和试剂盒制备棉花尤其是陆地棉的胚性愈伤组织，能够显著提高出愈率和胚性愈伤组织发生率，减少畸形胚的发生，且胚性愈伤组织的增殖量非常大。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种制备棉花胚性愈伤组织的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用愈伤组织诱导培养基对棉花无菌苗的下胚轴进行培养，以便获得愈伤组织；利用胚性愈伤组织诱导培养基对所述愈伤组织进行培养，以便获得初性胚性愈伤组织；以及利用胚性愈伤组织增殖培养基对所述初性胚性愈伤组织进行培养，以便使所述初性胚性愈伤组织增殖，获得胚性愈伤组织，其中，所述愈伤组织诱导培养基为添加了0.1mg/L KT、0.05mg/L2,4-D和1.5g/L gelrite的MSB培养基，所述胚性愈伤组织诱导培养基为添加了1.9g/L KNO₃和2.0g/L gelrite的MSB培养基，所述胚性愈伤组织增殖培养基为添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和1.8g/L gelrite的MSB培养基。由此，利用本发明的制备棉花胚性愈伤组织的方法制备棉花尤其是陆地棉的胚性愈伤组织，棉花无菌苗的下胚轴出愈率高，胚性愈伤组织发生率较高，畸形胚减少，胚性愈伤组织增殖量非常大。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种制备棉花再生植株的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的本发明的制备棉花胚性愈伤组织的方法，制备棉花胚性愈伤组织；利用分化培养基对所述棉花胚性愈伤组织进行培养，以便使所述棉花胚性愈伤组织分化形成子叶胚；利用成苗培养基对所述子叶胚进行培养，以便获得再生苗；以及将所述再生苗嫁接于棉花实生苗上，以便获得所述棉花再生植株，其中，所述分化培养基为去除NH₄NO₃并添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天门冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和2.0g/L gelrite的MSB培养基，所述成苗培养基为添加了2.0g/L gelrite的MSB培养基。根据本发明的实施例，利用本发明的制备棉花再生植株的方法制备棉花再生植株，出胚速度较快，胚胎分化率较高，子叶胚根系发达，成苗率高，且获得的再生植株成活率较高。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种制备转基因棉花植株的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的本发明的制备棉花胚性愈伤组织的方法，制备棉花胚性愈伤组织；以及利用农杆菌介导法，对所述棉花胚性愈伤组织进行基因转化，以便获得转基因棉花植株。由此，利用本发明的制备转基因棉花植株的方法能够有效制备获得导入了目的基因的转基因棉花植株。

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种转基因棉花植株。根据本发明的实施例，该转基因棉花植株是通过前面所述的制备转基因棉花植株的方法制备获得的。由此，能够获得导入了目的基因的转基因棉花植株，进而基于目的基因的过表达，能够使转基因棉花植株获得相应的优良性状，例如抗旱、抗盐碱等。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了实施例1中不同胚性愈伤组织增殖培养基上胚性愈伤组织的增殖结果图；

图2显示了实施例1中B2培养基上增殖获得的胚性愈伤组织；

图3显示了实施例1中，添加不同浓度gelrite的分化培养基上子叶胚的发生率结果；

图4显示了实施例1中，添加不同凝固剂的成苗培养基上子叶胚的生长情况，其中，

图4A显示了以琼脂粉作为凝固剂的成苗培养基上子叶胚的生长情况，

图4B显示了以gelrite作为凝固剂的成苗培养基上子叶胚的生长情况；以及

图5显示了实施例2中制备获得的转基因棉花植株的PCR检测结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

培养基、试剂盒

需要说明的是，在进行棉花组织培养和植株再生实验探索过程中，发明人发现，愈伤组织诱导培养基中KT和2,4-D的浓度过高或过低都不能达到最好的效果。具体地，发明人发现，KT浓度低于0.1mg/L时，出愈率明显降低，高于0.1mg/L时，愈伤组织易于分化，只有浓度为0.1mg/L时，愈伤组织保持生长而不分化；2,4-D浓度低于0.05mg/L时，出愈率明显降低，高于0.05mg/L时，愈伤组织呈稀泥状，继代培养后很难分化，只有浓度为0.05mg/L时，出愈率较高且愈伤组织质地疏松便于后续继代培养。同时，发明人还发现，胚性愈伤组织增殖培养基中天冬酰胺、谷氨酰胺浓度低于0.1g/L时，初性胚性愈伤组织会逐渐褐化死亡，高于0.1g/L时，营养物质过多造成不必要的浪费，只有其浓度为0.1g/L时，既可以保证营养物质供应充足，又使得胚性愈伤组织为黄色，呈颗粒状，易于形成良好的悬浮系统，且增殖量达到最大值。

为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一组用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含：愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基为添加了0.1mg/L KT、0.05mg/L2,4-D和1.5g/L gelrite的MSB培养基；胚性愈伤组织诱导培养基，所述胚性愈伤组织诱导培养基为添加了1.9g/L KNO₃和2.0g/L gelrite的MSB培养基；以及胚性愈伤组织增殖培养基，所述胚性愈伤组织增殖培养基为添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和1.8g/L gelrite的MSB培养基。由此，利用本发明的培养基制备棉花尤其是陆地棉的胚性愈伤组织，能够显著提高出愈率和胚性愈伤组织发生率，减少畸形胚的发生，且胚性愈伤组织的增殖量达到最大值。

根据本发明的实施例，本发明的培养基尤其适合陆地棉，特别是新陆早39号、新陆早42号以及中棉所44号。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种用于制备棉花胚性愈伤组织的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的一组培养基。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒制备棉花尤其是陆地棉的胚性愈伤组织，能够有效提高出愈率和胚性愈伤组织发生率，减少畸形胚的发生，且胚性愈伤组织的增殖量达到最大值。

根据本发明的实施例，本发明的试剂盒尤其适合陆地棉，特别是新陆早39号、新陆早42号以及中棉所44号。

根据本发明的一些具体示例，所述愈伤组织诱导培养基、所述胚性愈伤组织诱导培养基和所述胚性愈伤组织增殖培养基分别设置在不同的容器中。

用途

根据本发明的第三方面，本发明还提供了前面所述的培养基和试剂盒在制备棉花胚性愈伤组织中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明的培养基和试剂盒制备棉花胚性愈伤组织，可以有效提高出愈率和胚性愈伤组织发生率，减少畸形胚的发生，且胚性愈伤组织的增殖量达到最大值。根据本发明的实施例，所述棉花为陆地棉，优选新陆早39号、新陆早42号以及中棉所44号。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种制备棉花胚性愈伤组织的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用愈伤组织诱导培养基对棉花无菌苗的下胚轴进行培养，以便获得愈伤组织；利用胚性愈伤组织诱导培养基对所述愈伤组织进行培养，以便获得初性胚性愈伤组织；以及利用胚性愈伤组织增殖培养基对所述初性胚性愈伤组织进行培养，以便使所述初性胚性愈伤组织增殖，获得胚性愈伤组织，其中，所述愈伤组织诱导培养基为添加了0.1mg/L KT、0.05mg/L2,4-D和1.5g/L gelrite的MSB培养基，所述胚性愈伤组织诱导培养基为添加了1.9g/L KNO₃和2.0g/L gelrite的MSB培养基，所述胚性愈伤组织增殖培养基为添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和1.8g/L gelrite的MSB培养基。由此，利用本发明的制备棉花胚性愈伤组织的方法制备棉花胚性愈伤组织，棉花无菌苗的下胚轴出愈率高，胚性愈伤组织发生率较高，畸形胚的发生减少，胚性愈伤组织增殖量达到最大值。

根据本发明的实施例，本发明的制备棉花胚性愈伤组织的方法尤其适合陆地棉，特别是新陆早39号、新陆早42号以及中棉所44号。

其中，需要说明的是，上述愈伤组织诱导培养基中各成分的浓度是基于发明人的下列发现而确定的：发明人在实验过程中发现，愈伤组织诱导培养基中KT和2,4-D的浓度过高或过低都不能达到最好的效果，KT浓度低于0.1mg/L时，出愈率明显降低，KT浓度高于0.1mg/L时，愈伤组织易于分化，只有KT浓度为0.1mg/L时，愈伤组织保持生长而不分化；2,4-D浓度低于0.05mg/L时，出愈率明显降低，2,4-D浓度高于0.05mg/L时，愈伤组织呈稀泥状，继代培养后很难分化，只有2,4-D浓度为0.05mg/L时，出愈率较高且愈伤组织质地疏松便于后续继代培养。而上述胚性愈伤组织增殖培养基中各成分的浓度是基于发明人的下列发现而确定的：发明人惊奇地发现，胚性愈伤组织增殖培养基中天冬酰胺、谷氨酰胺浓度低于0.1g/L时，初性胚性愈伤组织会逐渐褐化死亡，高于0.1g/L时，营养物质过多造成不必要的浪费，只有其浓度为0.1g/L时，既可以保证营养物质供应充足，又使得胚性愈伤组织为黄色，呈颗粒状，易于形成良好的悬浮系统，且增殖量达到最大值。

根据本发明的一些实施例，棉花组织培养的继代时间不受特别限制，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的实施例，对所述棉花无菌苗的下胚轴进行愈伤组织诱导培养时，每隔25～30天继代一次；对所述愈伤组织进行胚性愈伤组织诱导培养时，每隔25～30天继代一次；对所述初性胚性愈伤组织进行胚性愈伤组织增殖培养时，每隔30天继代一次。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种制备棉花再生植株的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的本发明的制备棉花胚性愈伤组织的方法，制备棉花胚性愈伤组织；利用分化培养基对所述棉花胚性愈伤组织进行培养，以便使所述棉花胚性愈伤组织分化形成子叶胚；利用成苗培养基对所述子叶胚进行培养，以便获得再生苗；以及将所述再生苗嫁接于棉花实生苗上，以便获得所述棉花再生植株，其中，所述分化培养基为去除NH₄NO₃并添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天门冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和2.0g/L gelrite的MSB培养基，所述成苗培养基为添加了2.0g/L gelrite的MSB培养基。由此，利用本发明的制备棉花再生植株的方法制备棉花再生植株，出胚速度较快，胚胎分化率较高，子叶胚根系发达，成苗率高，且获得的再生植株成活率较高。

根据本发明的实施例，本发明的制备棉花再生植株的方法尤其适合陆地棉，特别是新陆早39号、新陆早42号以及中棉所44号。

其中，需要说明的是，上述分化培养基中各成分的浓度是基于发明人的下列发现而确定的：发明人惊奇地发现，分化培养基中gelrite的浓度过高或过低都达不到最好的效果，gelrite的浓度低于2.0g/L时，子叶胚数量明显降低，gelrite的浓度高于2.0g/L时，子叶胚发生率降低，且分化初期的体细胞胚胎停止生长，导致成苗率降低，只有浓度为2.0g/L时，可以最大可能的促进体细胞胚的成熟，使得子叶胚的数量达到最大。

根据本发明的一个实施例，利用上述成苗培养基进行生根培养，能够有效减轻根的褐化情况，促进白色粗壮的根形成，有利于提高成苗率。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种制备转基因棉花植株的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的本发明的制备棉花胚性愈伤组织的方法，制备棉花胚性愈伤组织；以及利用农杆菌介导法，对所述棉花胚性愈伤组织进行基因转化，以便获得转基因棉花植株。由此，利用本发明的制备转基因棉花植株的方法可以获得导入了目的基因的转基因棉花植株。

根据本发明的实施例，本发明的制备转基因棉花植株的方法尤其适合陆地棉，特别是新陆早39号、新陆早42号以及中棉所44号。

根据本发明的一些实施例，根据本发明的制备转基因棉花植株的方法，利用农杆菌介导法，对所述棉花胚性愈伤组织进行基因转化进一步包括：利用携带目的基因和药物抗性基因的农杆菌菌液对所述棉花胚性愈伤组织进行浸染，以便获得经过农杆菌浸染的胚性愈伤组织；利用共培养培养基对所述经过农杆菌浸染的胚性愈伤组织进行共培养，以便获得经过共培养的胚性愈伤组织；利用筛选培养基对所述经过共培养的胚性愈伤组织进行筛选，以便获得抗性愈伤组织；利用分化培养基对所述抗性愈伤组织进行培养，以便使所述抗性愈伤组织分化形成抗性子叶胚；以及利用成苗培养基对所述抗性子叶胚进行培养，以便获得转基因棉花植株。由此，本发明的制备转基因棉花植株的方法操作简单，对设备没有特殊要求，转化率高，可转移较长的基因片段，遗传稳定性好，基因沉默现象少，成本低，转育周期短，后代多数符合孟德尔遗传定律。

根据本发明的一些实施例，所述共培养培养基的成分不受特别限制，只要有利于农杆菌与胚性愈伤组织的共培养，能够有效获得获得经过共培养的胚性愈伤组织即可，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一个具体示例，所述共培养培养基为添加了1.5g/L gelrite的MSB培养基。

根据本发明的实施例，所述筛选培养基的成分不受特别限制，只要能够有效筛选出抗性愈伤组织即可，本领域技术人员可以根据具体情况进行选择。根据本发明的一个具体示例，所述筛选培养基为添加了50mg/L卡那霉素，以及1.9g/L KNO₃和1.8g/L gelrite的MSB培养基。由此，能够有效抑制非转化细胞的生长，而对转化细胞无影响，进而提高筛选的准确率。

根据本发明的实施例，所述分化培养基的成分不受特别限制，只要能够高效地获得抗性子叶胚即可，本领域技术人员可以根据具体情况进行选择。根据本发明的一个具体示例，所述分化培养基为去除NH₄NO₃并添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天门冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和2.0g/L gelrite的MSB培养基。由此，可以提高子叶胚发生频率。

根据本发明的实施例，所述成苗培养基不受特别限制，只要有利于抗性子叶胚生长成幼苗即可，本领域技术人员可以根据具体情况进行选择。根据本发明的一个具体示例，所述成苗培养基为添加了2.0g/L gelrite的MSB培养基。由此，能够有效促进白色粗壮的根形成，提高成苗率。

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种转基因棉花植株。根据本发明的实施例，该转基因棉花植株是通过前面所述的制备转基因棉花植株的方法制备获得的。由此，能够获得导入了目的基因的转基因棉花植株，进而基于目的基因的过表达，能够使转基因棉花植株获得相应的优良性状，例如抗旱、抗盐碱等。

需要说明的是，本发明的用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基、试剂盒及其用途，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作才发现以及完成的。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1棉花再生体系建立

采用新陆早39号和新陆早42号两个陆地棉品种，进行以下实验，分别确定各步骤的具体条件，以便建立本发明的棉花再生体系：

1、棉花无菌苗的获得

采用新陆早39号和新陆早42号两个陆地棉品种，按照以下步骤获得棉花无菌苗：

先将种子经浓硫酸（H₂SO₄）脱绒后，用水冲洗干净晾干。接着取适量的种子用75%的无水乙醇溶液消毒30s，依次用30%过氧化氢消毒4～5h，无菌水冲洗5～6次，无菌水浸种16～24h至露白。然后在无菌条件下剥去种皮，将种仁接种于1/2MS培养基（1/2MS大量+4.5g/L琼脂粉pH=7.0）上进行萌发，先在28±1℃的温度下暗培养3d，再在光照16h，暗培养8h的条件下继续培养3d，获得6d龄棉花无菌苗。

2、棉花愈伤组织诱导

将上述获得的棉花无菌苗下胚轴中部切为0.5～0.8cm大小的小段，将下胚轴小段平放于愈伤组织诱导培养基上进行培养，每25～30d继代1次，统计30d时出愈率。其中，愈伤组织诱导培养基由基本培养基MSB（MS无机+B5有机物+30g/L葡萄糖+0.75g/L MgCl₂）+1.5g/L gelrite辅以不同浓度的KT和2,4-D组成。愈伤组织诱导培养基的不同激素组合如下表1所示。

表1棉花愈伤组织诱导培养基的不同激素组合

处理	2，4-D(mg/L)	KT(mg/L)
			A1	0.05	0.05
A2	0·05	0.1
			A3	0.1	0.05
A4	0.1	0.1

注：Al-A4分别代表4种激素配比水平

实验结果如下表2所示。由表2可以看出，2个品种均以A4激素组合下诱导效率最高，新陆早39号和新陆早42号诱导率分别是78%和86%。当2,4-D浓度为0.l mg/L时新陆早39号和新陆早42号愈伤组织呈稀泥状，继代培养后很难分化。因而，A2激素组合为新陆早39号和新陆早42号两个陆地棉品种愈伤组织最佳诱导条件。由此，可以保持较高的出愈率，且愈伤组织质地便于后续进行胚性愈伤组织诱导实验。

表2不同浓度的激素处理对愈伤组织的诱导效应

3、棉花胚性愈伤组织诱导

将上述获得的愈伤组织从下胚轴上剥离转接到愈伤组织分化培养基（MSB+2.0g/Lgelrite+1.9g/L KNO₃）上进行分化培养，每隔25～30d继代1次，直至胚性愈伤组织出现。每30d统计分化率，统计结果如下表3所示。

表3不同棉花品种在愈伤组织分化培养基上的分化率

注：表中不同字母表示通过F检测P<005，差异显著

由实验结果可以看出，2个棉花品种都具有体细胞胚胎发生的能力，相对新陆早39号陆地棉，新陆早42号陆地棉愈伤组织分化时间较快，分化率较高，即体细胞胚胎发生能力较强。

4、棉花胚性愈伤组织扩繁

将上述获得的不同棉花品种的初性胚性愈伤组织从大块的愈伤组织团上剥离下来，继代到胚性愈伤组织增殖培养基上进行扩繁培养，30d继代一次，统计继代30d胚性愈伤组织增殖数量。其中，对于胚性愈伤组织的扩繁试验设置4种不同的培养基，用于胚性愈伤组织的增殖。4种培养基的组成如下表4所示。

表4胚性愈伤组织扩繁的不同培养基

处理	培养基成分
		B1	MSB+1.9g/LKNO3
B2	MSB+1.9g/LKNO3+0.1g/LAsn+0.1g/LGln
		B3	MSB(NH4NO3减半)+1.9g/LKNO3+O.1g/LAsn+0.1g/LGln
B4	MSB(去除NH4NO3)+1.9g/LKNO3+0.1g/LAsn+0.1g/LGln

不同培养基上胚性愈伤组织的增殖量如图1所示。实验结果表明，继代到B1培养基上的初性胚性愈伤组织会逐渐褐化死亡，继代到B4培养基上的胚性愈伤组织能够扩繁，但生长速度较慢，B2和B3比较适宜使胚性愈伤组织扩繁，其中B2培养基上胚性愈伤颜色都为黄色，呈颗粒状，且增殖量达到最大值，为胚性愈伤组织扩繁的最佳条件。B2培养基上增殖获得的胚性愈伤组织如图2所示。

5、棉花胚性愈伤组织分化

取上述获得的同一时期、发育状态较为一致的胚性愈伤组织接种于体细胞胚胎分化培养基(MSB(除去NH₄NO₃)+1.9g/L KNO₃+0.1g/L Asn+0.1g/L Gln）上，并添加不同浓度（1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L）的gelrite，以便进行分化培养，其中继代时在培养基表面铺垫滤纸，30d后计数子叶胚数量。

实验结果如图3所示。由图3可以看出，不同浓度的凝固剂gelrite对体细胞胚的成熟有促进作用，2个陆地棉品种的子叶胚数在凝固剂gelrite浓度为2g/L时均为最多，子叶胚发生率达均到20%以上。当降低或增加凝固剂gelrite浓度时，子叶胚发生率逐渐减小，发明人发现凝固剂gelrite浓度为3g/L时会抑制体细胞胚的正常发育，分化初期的体细胞胚胎停止生长，导致体细胞胚停止发育，子叶胚数量减少，因而选择凝固剂gelrite浓度为2g/L为最佳浓度。由此，可以有效地提高子叶胚发生率又不影响体细胞胚的正常发育。

6、子叶胚成苗培养

将上述获得的子叶胚，接种于添加不同凝固剂的成苗培养基上，进行成苗培养，并观察子叶胚的成苗情况。

成苗率如下表5所示，不同凝固剂成苗培养基上子叶胚的生长状况如图4所示。由实验结果可知，用琼脂粉作为培养基的凝固剂，虽然有正常的根的形成，但是有严重的褐化情况（图4A），随着培养时间延长叶片呈现黄色，而以凝固剂gelrite作为培养基的凝固剂，根的褐化情况有所降低，有白色粗壮的根形成（图4B），子叶胚在成苗培养基上培养1个月可以长出6～8片真叶，因而选择凝固剂gelrite为成苗培养基的凝固剂，效果优于琼脂。由此，子叶胚根系发达，成苗率高。

表5

注：+表示褐变，+越多表示褐变程度越深

7、棉花再生苗嫁接

按照以下步骤将上述获得的再生苗嫁接到性状优良﹑健壮的棉花实生苗上，具体如下：

1）将棉花种子经脱绒后浸泡在30%H₂O₂中，4～5h后换无菌水浸泡直至种子露白；

2）将露白的种子种在松土或蛭石的花盆中，每盆3～4颗，长出的棉花幼苗作为砧木，待砧木子叶展平或长出3～4片真叶时，进行嫁接；

3）从每盆中选择一株生长状态良好、无病害的幼苗植株作为试验嫁接砧木，用刀片除去实生苗的顶部和多余的叶片，保留1～2个叶芽节位，再用刀片将砧木主茎倾斜切开至1.0～1.4cm；然后在灭过菌的培养皿中将实施例6中获得的再生苗从上段切下，长度为2～3cm，作为接穗；用刀片将接穗上多余的叶片去掉，只留下两片最小的子叶，接着用镊子将接穗放在准备好的砧木切口上，用细塑料绳绑紧，以防水分散失。然后用去底盖、清洁并且良好的透光性塑料瓶将嫁接植株罩住，接着浇水，将其周边盖土密封，以便保温保湿防止接穗萎蔫。

4）嫁接后及时浇水，每次浇水应当尽可能浇透。

5）待7～10d后，去除塑料瓶，解去绑缚，将嫁接植株移植到温室大田中。

不同陆地棉品种再生苗嫁接处理的成活率如下表6所示。从表6可以看到，新陆早39号和新陆早42号嫁接后的成活率分别达到38%和43%，而棉花的再生苗直接移植到土壤或蛭石中成活率很低，一般只有在20%左右，由此表明，采用嫁接处理棉花再生植株的成活率显著提高。

表6不同品种再生植株嫁接处理的成活率

品种	再生植株数	成活植株数	成活率(％)
				新陆早39号	13	5	38
新陆早42号	16	7	43

实施例2转基因棉花植株制备

按照实施例1中胚性愈伤组织诱导及扩繁的方法，制备陆地棉品种中棉所44号的胚性愈伤组织，然后利用常规质粒pBI121，通过农杆菌介导法制备转基因棉花植株。其中，质粒寄主农杆菌菌株为EHA105，该质粒携带的目的基因为CarNAC5基因，其T-DNA区含有在植物中表达的GUS基因和卡那霉素抗性基因，基因的表达均是由rd29A启动子驱动。其中，基因转化方法具体如下：

1、实验材料：

培养基：实验中用到的培养基如下表7所示：

表7

2、实验方法：

胚性愈伤组织制备：采用陆地棉品种中棉所44号，根据实施例1中相应的操作方法，制备获得中棉所44号胚性愈伤组织，然后预培养12d，备用。

农杆菌的培养及活化：取少量含有目的基因表达载体的根癌农杆菌菌液含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平平板划线，28℃暗培养24～36h，然后选取农杆菌质粒单菌落转接到5mL含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃，250r/min条件下过夜培养，获得已活化农杆菌菌液。

农杆菌浸染：将已活化菌液于3000rpm条件下离心10min，弃去上清。再加入适量的MSB基本培养基轻轻悬浮菌体，然后利用紫外可见分光光度计（Thermo Scientific，NanoDropND1000）在600nm波长下测定菌液浓度，用液体MSB培养基将菌液浓度调至OD₆₀₀为0.5左右。取预培养12d的中棉所44号胚性愈伤组织接入灭过菌的培养皿中，然后将调好浓度的农杆菌菌液适量的倒入培养皿中，浸染10min，期间不断振荡。接着倒去农杆菌菌液，将胚性愈伤组织用无菌水清洗3～5次后置于灭过菌的滤纸上吸干表面菌液。然后将胚性愈伤组织接入共培养培养基MS1，暗培养24h后再将胚性愈伤组织转入筛选培养基MS2中，筛选出抗性愈伤组织。再将在筛选培养基上存活下来的抗性胚性愈伤组织接入分化培养基MS3，促进体细胞胚发生，培养期间及时将萌发的子叶胚接种在MS4培养基中，以便获得完整转基因植株。

实施例3转基因植株PCR分子检测

按照以下步骤对实施例2中获得的转基因植株进行PCR分子检测：

1、溶液配置：1）DNA提取液：50mmol/L tris-HCI（pH=8.0），100mmol/L EDTA（pH=8.0），1.5mmol/L NaCl，1%SDS，1%PVP40，30μLβ-Mer；2）DNA裂解缓冲液：50mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），100mmol/L EDTA（pH=8.0），1.5mmol/L NaCl，3%CTAB，3%PVP40；3）电泳缓冲液：10×TBE：48.4g/L Tris碱，11.42mL冰乙酸，20mL的0.5mol/L EDTA（工作缓冲液为1×TBE)。

2、转基因植株基因组DNA抽提：1）称取0.2g幼苗叶片，研磨充分后放入2.0mL离心管中，加入800μL预冷至4℃的提取液，30μLβ-羟基乙醇，剧烈振荡均匀，于4℃、1200rpm条件下离心15min，倒去上清；2）加入600mL预热到65℃的裂解缓冲溶液，并迅速搅拌均匀，混匀后于65℃下水浴30-60min，每隔10min轻轻振动数次；3）于室温、12000rpm条件下离心10min，取上清液至新管；4）加入500mL等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻振动直至混匀为一相后，于室温、12000rpm条件下离心10min，将上清转至另一离心管中；5）重复上一步；6）用75%乙醇浸泡，可换1～2次后倒出乙醇，风干DNA；7）加入30μL TE（pH=8.0）溶解DNA。

3、PCR检测：根据CarNAC5基因序列，用引物设计软件Primer Premier5.0设计特异引物，对再生植株总DNA进行PCR检测，引物序列如下表8所示。具体的，扩增程序为94℃预变形5min；94℃变形30s；54℃退火30s；72℃延伸1min；32个循环；72℃延伸8min；PCR反应体系如下表9所示。

表8引物序列

表9PCR反应体系（25μL）

成分	加样体积(μL)
		模板DNA	1
10×Buffer	2.5
		dNTP(10mM)	1
引物F(10μM)	1
		引物R(10μM)	1
Taq酶(5U/μL)	0·25
		H2O	18.25

实验结果显示：共有13株扩增出了与阳性对照一致的目的片段（CarNAC5），大小为987bp，其中部分PCR检测结果见图5。图5的结果表明目的基因CarNAC5已经整合到中棉所44号的基因组中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一组用于制备棉花胚性愈伤组织的培养基，其特征在于，包含：

愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基为添加了0.1mg/L KT、0.05mg/L2,4-D和1.5g/L gelrite的MSB培养基；

胚性愈伤组织诱导培养基，所述胚性愈伤组织诱导培养基为添加了1.9g/L KNO₃和2.0g/L gelrite的MSB培养基；以及

胚性愈伤组织增殖培养基，所述胚性愈伤组织增殖培养基为添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和1.8g/L gelrite的MSB培养基，

任选地，所述棉花为陆地棉。

2.一种用于制备棉花胚性愈伤组织的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的一组培养基，

任选地，所述棉花为陆地棉。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基、所述胚性愈伤组织诱导培养基和所述胚性愈伤组织增殖培养基分别设置在不同的容器中。

4.权利要求1所述的培养基，或者权利要求2或3所述的试剂盒在制备棉花胚性愈伤组织中的用途，

任选地，所述棉花为陆地棉。

5.一种制备棉花胚性愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用愈伤组织诱导培养基对棉花无菌苗的下胚轴进行培养，以便获得愈伤组织；

利用胚性愈伤组织诱导培养基对所述愈伤组织进行培养，以便获得初性胚性愈伤组织；以及

利用胚性愈伤组织增殖培养基对所述初性胚性愈伤组织进行培养，以便使所述初性胚性愈伤组织增殖，获得胚性愈伤组织，

其中，

所述愈伤组织诱导培养基为添加了0.1mg/L KT、0.05mg/L2,4-D和1.5g/L gelrite的MSB培养基，

所述胚性愈伤组织诱导培养基为添加了1.9g/L KNO₃和2.0g/L gelrite的MSB培养基，

所述胚性愈伤组织增殖培养基为添加了1.9g/L KN0₃、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和1.8g/L gelrite的MSB培养基，

任选地，所述棉花为陆地棉。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

对所述棉花无菌苗的下胚轴进行培养时，每隔25～30天继代一次；

对所述愈伤组织进行培养时，每隔25～30天继代一次；

对所述初性胚性愈伤组织进行培养时，每隔30天继代一次。

7.一种制备棉花再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

根据权利要求5或6所述的制备棉花胚性愈伤组织的方法，制备棉花胚性愈伤组织；

利用分化培养基对所述棉花胚性愈伤组织进行培养，以便使所述棉花胚性愈伤组织分化形成子叶胚；

利用成苗培养基对所述子叶胚进行培养，以便获得再生苗；以及

将所述再生苗嫁接于棉花实生苗上，以便获得所述棉花再生植株，

其中，

所述分化培养基为去除NH₄NO₃并添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天门冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和2.0g/L gelrite的MSB培养基，

所述成苗培养基为添加了2.0g/L gelrite的MSB培养基，

任选地，所述棉花为陆地棉。

8.一种制备转基因棉花植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

根据权利要求5或6所述的制备棉花胚性愈伤组织的方法，制备棉花胚性愈伤组织；以及

利用农杆菌介导法，对所述棉花胚性愈伤组织进行基因转化，以便获得转基因棉花植株，

任选地，所述棉花为陆地棉。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用农杆菌介导法，对所述棉花胚性愈伤组织进行基因转化进一步包括：

利用携带目的基因和药物抗性基因的农杆菌菌液对所述棉花胚性愈伤组织进行浸染，以便获得经过农杆菌浸染的胚性愈伤组织；

利用共培养培养基对所述经过农杆菌浸染的胚性愈伤组织进行共培养，以便获得经过共培养的胚性愈伤组织；

利用筛选培养基对所述经过共培养的胚性愈伤组织进行筛选，以便获得抗性愈伤组织；

利用分化培养基对所述抗性愈伤组织进行培养，以便使所述抗性愈伤组织分化形成抗性子叶胚；以及

利用成苗培养基对所述抗性子叶胚进行培养，以便获得转基因棉花植株，

任选地，

所述共培养培养基为添加了1.5g/L gelrite的MSB培养基，

所述筛选培养基为添加了所述药物抗性基因的标的药物，以及1.9g/L KNO₃和1.8g/Lgelrite的MSB培养基，

所述分化培养基为去除NH₄NO₃并添加了1.9g/L KNO₃、0.1g/L天门冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺和2.0g/L gelrite的MSB培养基，

所述成苗培养基为添加了2.0g/L gelrite的MSB培养基。

10.一种转基因棉花植株，其是通过权利要求8或9所述的方法制备的。

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